CN109679953B - 利用CRISPR-Cas9系统制得基因点突变动物模型胚胎的靶序列组、载体和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR‑Cas9系统制得基因点突变动物模型胚胎的靶序列组、载体和方法。本发明方法，包括：目标基因的sgRNA设计；Donor oligo设计；sgRNA表达质粒对的构建；体外转录；原核注射及胚胎移植。本发明方法通过对CRISPR/Cas9系统进行优化，一步获得目标基因点突变小鼠，为目标基因的研究节省时间和成本。同时也给一些致死基因的模型构建提供了一种有效的，节省时间和成本的方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR-Cas9系统制备基因点突变动物模型胚胎的靶序列组、载体和方法。
背景技术
现有技术制备点突变鼠有3种方案：
一是传统ES打靶的方案，其缺点是：(1)需要复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大、耗时较长，且效率低；(2)不同品系的鼠需要不同的ES细胞，目前ES打靶做得比较多的都是常见的C57BL/6品系，其他的品系没看到有相关的报道。例如，点突变模型主要用于研究人类疾病，其经常需要用到特殊的品系，由于没有相关的ES细胞，所以无法采用ES打靶这项技术进行制备。
二是TALEN方案：其缺点是：(1)设计识别20个碱基序列的TALEN蛋白含有一千多个氨基酸，因而可能会引起机体的免疫反应，这将降低TALEN在细胞中的作用；(2)TALEN也存在脱靶的问题，这可能由于细胞中染色体的状态引起的，如TALEN技术对于处于异染色体结构中的基因序列没有效果；(3)TALEN技术是否可以胜任掺入大的片段？目前TALEN技术的应用主要集中在基因敲除方面，但是否适合大片段的基因插入还需进一步研究。最重要的是，目前较先进的ZFN/TALEN技术基于能特异性识别碱基核苷酸来构建基因打靶载体，但打靶载体的构建非常复杂，制备时间长，产生的细胞毒性大，且都不能真正做到同时完成基因组多位点的敲除。
三是CRISPR/Cas9方案。CRISPR/Cas9的方案包括两种，一种是野生型的hCas9,另一种是突变型的Cas9_D10A。野生型的hCas9的缺点：(1)容易造成脱靶效应；(2)对于一些重要基因的重要突变点容易造成致死。突变型的Cas9_D10A的缺点：(1)两种不同的sgRNA对靶位点两侧序列分别进行识别，然后结合单切口Cas9核酸酶，对两条链分别进行剪切，从而提高了靶位点识别特异性，减少了脱靶效应,但由于单切口Cas9核酸酶效率比较低，导致Cas9_D10A方案的阳性率比较低。
CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制：CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂(DSB,double strandbreak)。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：一是低保真性的非同源末端连接途径(NHEJ，Non-homologous endjoining)，此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入(Indel)，从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠、大鼠、猪、灵长类、果蝇等等。第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复(HR,homology-directed repair)，这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
Cas9蛋白含有HNH和RuvC两个带核酸酶活性的结构域，切割DNA时，HNH结构域切割与crRNA向导序列互补的DNA单链，而RuvC结构域则剪切非互补DNA单链，从而形成双链DNA断点。如果将RuvC结构域中一个天冬氨酸突变为丙氨酸(D10A)，则可以使RuvC结构域失去核酸酶活性，导致突变的Cas9蛋白(Cas9_D10A)只能在双链DNA上产生单链缺口(nick)。这样，Cas9的内切酶活性就变为Cas9_D10A的切口酶活性(nickase)。为了在DNA上切割产生双链DNA断点，就需要用Cas9_D10A和一对sgRNA分别在双链DNA的每条单链上切出单链缺口。而只被一个Cas9_D10A切割产生的单链缺口会被高保真性的碱基切除修复途径(baseexcision repair，BER)修复，不会在基因组DNA上造成突变。这时，双链DNA断点的特异性就由两个sgRNA的识别位点共同决定，即在422×422(3.09×1026)个碱基长度的随机DNA序列中才会发现一个同时被两个Cas9_D10A切割的位点。因此，通过用两个Cas9_D10A产生两个单链DNA缺口以造成双链DNA断点的策略，可有效地提高CRISPR/Cas系统的特异性，而且此方法并不降低双链DNA断点产生的效率。
Nedd8基因是一个致死基因，NEDD8主要通过修饰Cullin蛋白而调控Cullin-RINGE3连接酶的活性，进而参与到细胞周期调控、转录与信号传导等生物学过程。有文献报道无法获得敲除小鼠和条件性敲除小鼠，文献如下：Neddylation inhibitor MLN4924 blocksIL-1βmaturation/production in vitro and in vivo.具体链接如下：http://mcb.asm.org/content/35/3/582.full，文献中指出由于这个基因胚胎致死并且参与了细胞稳态，所以普通敲除和条件性敲除都不存在。“Since Nedd8 is embryonic lethal,Nedd8 knockout(KO)mice do not exist.Nedd8 conditional KO also did not yield aproductive model,since Nedd8 is required for cellularhomeostasis.”可见，目前没有这个基因的动物模型。我们利用CRISPR/Cas9技术进行这个基因的模型构建，注射后的代孕鼠做了两种处理，一半代孕鼠在E12.5，E15.5，E18.5进行解剖，解剖结果发现存在大量死胎，另外一半代孕鼠正常饲养，到21天依然没有小鼠出生。可见，如何能获得健康的Nedd8模型动物成为了一个难题。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种利用CRISPR-Cas9系统制备Nedd8基因点突变小鼠靶序列组、载体和方法，通过对CRISPR/Cas9系统进行优化，一步获得Nedd8基因点突变小鼠，为Nedd8基因的研究节省时间和成本。同时也给一些致死基因的模型构建提供了一种有效的，节省时间和成本的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种利用CRISPR-Cas9系统制备点突变动物模型胚胎的方法，包括：
目标基因的sgRNA设计；
Donoroligo设计；
sgRNA表达质粒对的构建；
体外转录；
原核注射。
进一步的，所述方法在体外转录后还包括操作：体内验证sgRNA的切割活性。
进一步的，所述方法在原核注射及胚胎移植后还包括操作：基因打靶小鼠的鉴定。
进一步的，所述利用CRISPR-Cas9系统制备点突变动物模型胚胎的方法可用于制备Casq2基因、Atp6ap2基因、Txn1基因、Ctnna1基因、Ext2基因、Dnajb13基因、Hand2基因、Heyl基因、Cdh2基因、Elovl4基因、Fars2基因等目标基因的点突变动物模型胚胎。
进一步的，所述利用CRISPR-Cas9系统制备点突变动物模型胚胎的方法可用于大鼠、小鼠等物种动物模型的制备。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Nedd8基因点突变小鼠胚胎的方法，包括：小鼠Nedd8基因的sgRNA设计；Donor oligo设计；sgRNA表达质粒对的构建；体外转录；原核注射。
进一步的，上述sgRNA设计包括：小鼠Nedd8基因ATG的上游和下游各50bp的序列和小鼠Nedd8基因K27的上游和下游各50bp的序列的靶标位点设计。上下游各50bp已经囊括了所有包含点突变的gRNA，这样的gRNA都距离需要突变的点比较近，更有利于同源重组，同源重组的效率会更高，阳性率会更高。
进一步的，小鼠Nedd8基因ATG的上游和下游各50bp的序列的靶标位点设计操作包括：提取小鼠Nedd8基因ATG的上游和下游各50bp的序列，如下所示：
agcgggagaagcagcactctagccgcctgcaaccccaacctgggaagaagatgctaattaaagtgaa
ggtgggagcgtttccagactttccaagactcggtgc
设计靶标位点，得到包含ATG的gRNA对共有8对，具体序列如下：
(依次为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：16)
pair1-g1：agcatcttcttcccaggttgggg、pair1-g2:gaagatgctaattaaagtgaagg；
pair2-g3：tagcatcttcttcccaggttggg、pair2-g4：gaagatgctaattaaagtgaagg；
pair3-g5:ttagcatcttcttcccaggttgg、pair3-g6:gaagatgctaattaaagtgaagg；
pair4-g7:ttaattagcatcttcttcccagg、pair4-g8:gaagatgctaattaaagtgaagg；
pair5-g9:agcatcttcttcccaggttgggg、pair5-g10:gatgctaattaaagtgaaggtgg；
pair6-g11:tagcatcttcttcccaggttggg、pair6-g12:gatgctaattaaagtgaaggtgg；
pair7-g13:ttagcatcttcttcccaggttgg、pair7-g14:gatgctaattaaagtgaaggtgg；
pair8-g15:ttaattagcatcttcttcccagg、pair8-g16:gatgctaattaaagtgaaggtgg；
进一步的，小鼠Nedd8基因K27的上游和下游各50bp的序列的靶标位点设计操作包括：提取小鼠Nedd8基因K27的上游和下游各50bp的序列，如下所示：
taattctaagcagcctctgaccacttgtttctccaaaggtggagcgaatcaaggagcgtgtggaagaaaaagaagggattcccccccagcagcagcggctcat
设计靶标位点，得到包含K27的gRNA对共有2对，具体序列如下：
(依次为SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：20)
pair9-g17：tccttgattcgctccacctttgg、
pair9-g18：tccaaaggtggagcgaatcaagg；
Pair10-g19：tccttgattcgctccacctttgg(序列同pair9-g17)、
pair10-g20：ggagcgaatcaaggagcgtgtgg；
进一步的，所述Donor oligo设计包括：以Nedd8基因的N端为靶点，两端各60bp为同源臂，设计序列Donor oligo 1，并补充Flag和HA标签蛋白；以Nedd8基因的K27为靶点，突变点K27R(AAG>CGT)，两端各60bp为同源臂，设计序列Donor oligo 2。目前oligo最大合成片段是200bp,片段越接近临界点200bp,合成出现错配的机率越高。同源臂越长同源重组效率越高，将不同长度(分别为30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp)同源臂进行对比实验，30bp的片段没有同源重组，40bp同源重组重组的机率为1.6％，50bp同源重组重组的机率为5％，60bp同源重组重组的机率为13％，70bp和80bp同源重组重组的机率为14％，90bp同源重组重组的机率为15％。所以结合重组的效率和合成工艺问题，优选同源臂为60bp。
进一步的，以Nedd8基因的N端为靶点，两端各60bp为同源臂，下划线处序列为HA序列，加粗字体序列为Flag序列，设计Donor oligo序列并合成：
Donoroligo 1：
Flag标签蛋白为8个氨基酸(序列为：DYKDDDDK)的亲水性多肽，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1.FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利于对融合蛋白进行下游研究；2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高；3.FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定；4.融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除(DDDK)，从而得到特异的目的蛋白。
HA标签蛋白，标签序列为：YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小,容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端，易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。
进一步的，以Nedd8基因的K27为靶点，突变点K27R(AAG>CGT)，两端各60bp为同源臂，下划线加粗字体为突变序列，设计Donor oligo序列并合成：
Donoroligo 2：
进一步的，所述sgRNA表达质粒对的构建，具体操作包括：
合成上述sgRNA靶序列pair1至Pair10的19对特异性引物(其中pair9-g17和Pair10-g19序列相同，引物序列也相同)(金维智生物科技有限公司)：
依次为SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：58
Pair1-g1-F：caccgagcatcttcttcccaggttg
Pair1-g1-R：aaaccaacctgggaagaagatgctc
Pair1-g2-F：caccggaagatgctaattaaagtga
Pair1-g2-R：aaactcactttaattagcatcttcc
Pair2-g3-F：caccgtagcatcttcttcccaggtt
Pair2-g3-R：aaacaacctgggaagaagatgctac
Pair2-g4-F：caccggaagatgctaattaaagtga
Pair2-g4-R：aaactcactttaattagcatcttcc
Pair3-g5-F：caccgttagcatcttcttcccaggt
Pair3-g5-R：aaacacctgggaagaagatgctaac
Pair3-g6-F：caccggaagatgctaattaaagtga
Pair3-g6-R：aaactcactttaattagcatcttcc
Pair4-g7-F：caccgttaattagcatcttcttccc
Pair4-g7-R：aaacgggaagaagatgctaattaac
Pair4-g8-F：caccggaagatgctaattaaagtga
Pair4-g8-R：aaactcactttaattagcatcttcc
Pair5-g9-F：caccgagcatcttcttcccaggttg
Pair5-g9-R：aaaccaacctgggaagaagatgctc
Pair5-g10-F：caccggatgctaattaaagtgaagg
Pair5-g10-R：aaacccttcactttaattagcatcc
Pair6-g11-F：caccgtagcatcttcttcccaggtt
Pair6-g11-R：aaacaacctgggaagaagatgctac
Pair6-g12-F：caccggatgctaattaaagtgaagg
Pair6-g12-R：aaacccttcactttaattagcatcc
Pair7-g13-F：caccgttagcatcttcttcccaggt
Pair7-g13-R：aaacacctgggaagaagatgctaac
Pair7-g14-F：caccggatgctaattaaagtgaagg
Pair7-g14-R：aaacccttcactttaattagcatcc
Pair8-g15-F：caccgttaattagcatcttcttccc
Pair8-g15-R：aaacgggaagaagatgctaattaac
Pair8-g16-F：caccggatgctaattaaagtgaagg
Pair8-g16-R：aaacccttcactttaattagcatcc
Pair9-g17-F：caccgtccttgattcgctccacctt
Pair9-g17-R：aaacaaggtggagcgaatcaaggac
Pair9-g18-F：caccgtccaaaggtggagcgaatca
Pair9-g18-R：aaactgattcgctccacctttgga
Pair10-g20-F：caccgggagcgaatcaaggagcgtg
Pair10-g20-R：aaaccacgctccttgattcgctccc
其中Pair1-g1-F与Pair1-g1-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，连入经BbsI酶切的pX335载体(或者是PX330载体、PX459,载体、HypaCas9载体等)中，获得pX335-sgRNA1载体；其他的18对也按同样的方法构建的得到pX335-sgRNA2至pX335-sgRNA20载体，载体质粒均通过测序验证。
进一步的，所述体外转录sgRNA和Cas9-D10AmRNA，包括：
1)以构建的测序正确的质粒DNA为模板，利用下述引物(Pair1-g1-T7至Pair10-g20-T7，其中pair9-g17和Pair10-g19序列相同，pair9-g17-T7和Pair10-g19-T7引物序列也相同)，通过PCR扩增得到带有T7启动子序列的g1-g20，用MEGAshortscriptTM Kit(Thermo，货号：AM1354)试剂盒体外转录g1-g20，用MEGAclearTM Kit(Thermo，货号：AM1908)试剂盒回收g1-g20的转录产物。
其中，PCR扩增体系为:
PCR反应程序为：
g1-g20的T7转录扩增引物为：
具体序列如下(依次为SEQ ID NO：59至SEQ ID NO：96)：
Pair1-g1-T7-F：gaaattaatacgactcactataggagcatcttcttcccaggttg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair1-g2-T7-F：gaaattaatacgactcactataggaagatgctaattaaagtga
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair2-g3-T7-F：gaaattaatacgactcactataggtagcatcttcttcccaggtt
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair2-g4-T7-F：gaaattaatacgactcactataggaagatgctaattaaagtga
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair3-g5-T7-F：gaaattaatacgactcactataggttagcatcttcttcccaggt
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair3-g6-T7-F：gaaattaatacgactcactataggaagatgctaattaaagtga
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair4-g7-T7-F：gaaattaatacgactcactataggttaattagcatcttcttccc
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair4-g8-T7-F：gaaattaatacgactcactataggaagatgctaattaaagtga
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair5-g9-T7-F：gaaattaatacgactcactataggagcatcttcttcccaggttg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair5-g10-T7-F：gaaattaatacgactcactataggatgctaattaaagtgaagg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair6-g11-T7-F：gaaattaatacgactcactataggtagcatcttcttcccaggtt
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair6-g12-T7-F：gaaattaatacgactcactataggatgctaattaaagtgaagg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair7-g13-T7-F：gaaattaatacgactcactataggttagcatcttcttcccaggt
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair7-g14-T7-F：gaaattaatacgactcactataggatgctaattaaagtgaagg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair8-g15-T7-F：gaaattaatacgactcactataggttaattagcatcttcttccc
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair8-g16-T7-F：gaaattaatacgactcactataggatgctaattaaagtgaagg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair9-g17-T7-F：gaaattaatacgactcactataggtccttgattcgctccacctt
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair9-g18-T7-F：gaaattaatacgactcactataggtccaaaggtggagcgaatca
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair10-g20-T7-F：gaaattaatacgactcactatagggagcgaatcaaggagcgtg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
2)转录Cas9-D10A载体。使用MEGAshortscriptTM Kit(Thermo，货号：AM1354)试剂盒，将PX335-T7载体(经下述改造方法改造得到)经NotI线性化后，在体外转录成Cas9-D10AmRNA。用MEGAclearTM Kit(Thermo，货号：AM1908)试剂盒回收Cas9-D10AmRNA的转录产物。
PX335-T7改造过程如下：用AgeI和BglII酶切PX335载体，胶回收8111bp的大片段，合成含有T7启动子序列的正向引物PX335-T7-F和反向引物PX335-T7-R。
T7启动子序列：taatacgactcactataggg(SEQ ID NO：97)
PX335-T7-F:ttttcaggttggaccggttaatacgactcactataggggccaccatgtacccatacgatg(SEQ ID NO：98)
PX335-T7-R：tctcgttgctgaagatctcttgcag(SEQ ID NO：99)
以PX335的质粒DNA为模板，用以上引物扩增372bp片段，将扩增的片段与PX335的大片段胶回收产物在infusion酶的作用下，经过转化，涂板，摇菌，抽提质粒等步骤得到没验证PX335-T7质粒，把PX335-T7质粒送去金维智公司进行测序，经测序公司测序验证，结果表明获得了正确的PX335-T7质粒。
PCR反应体系为：
PCR反应程序为：
进一步的，所述方法中，体外转录后，在斑马鱼体内验证以上10对gRNA的切割活性：
1)扩增包含gRNA的小鼠基因DNA片段1和DNA片段2：
PCR扩增体系：
PCR程序:
引物为：
Mouse Nedd8-DNA1-F:cttccggcatagcggtactcact(SEQ ID NO：100)、
Mouse Nedd8-DNA1-R:ggccctcactttcatcagactctaatc(SEQ ID NO：101)；
产物长度:1070bp；退火温度:60℃；
Mouse Nedd8-DNA2-F:accacacctctaatacttcccgttcc(SEQ ID NO：102)、
Mouse Nedd8-DNA2-R:gctctgaaatctgagggcacctgt(SEQ ID NO：103)；
产物长度:937bp；退火温度:60℃。
2)将构建出的Cas9-D10A mRNA，小鼠基因DNA片段1，Pair1-g1和Pair1-g2为一组；Cas9-D10AmRNA，小鼠基因DNA片段1，Pair2-g3和Pair2-g4为一组；Cas9-D10AmRNA，小鼠基因DNA片段1，Pair3-g5和Pair3-g6为一组；以此类推，共注射8组，分别显微注射到40枚斑马鱼受精卵中检测g1-g16活性，(其中用量分别为cas9mRNA：100ng/μL，Pair1-g1：50ng/μL，Pair1-g2：50ng/μL，包含所有gRNA的DNA片段1：100ng/μL)；将构建出的Cas9-D10AmRNA，小鼠基因DNA片段2，Pair9-g17和Pair9-g18为一组；Cas9-D10AmRNA，小鼠基因DNA片段2，Pair9-g17(即Pair10-g19)和Pair10-g20为一组；分别显微注射到40枚斑马鱼受精卵中检测g17-g20活性，(其中用量分别为cas9mRNA：100ng/μL，Pair9-g17：50ng/μL，Pair9-g18：50ng/μL，Pair10-g20：50ng/μL，包含所有gRNA的DNA片段2：100ng/μL)；10组分别取20个斑马鱼胚胎进行PCR鉴定，测序验证突变情况(金维智生物科技有限公司测序)，结果显示Pair4和Pair10活性较高。
验证gRNA活性的PCR引物如下：
Mouse Nedd8-SPF1:ctgacacagaacacgagggcactc(SEQ ID NO：104)、
Mouse Nedd8-SPR1:ctagttcccatcaagcctcgcg(SEQ ID NO：105)；
产物长度:352bp；退火温度:60℃；
Mouse Nedd8-SPF2:caggtgctcagcgtcctttctct(SEQ ID NO：106)、
Mouse Nedd8-SPR2:actgcgaaagagcggcaagc(SEQ ID NO：107)；产物
长度:519bp；退火温度:60℃。
进一步的，所述原核注射及胚胎移植，包括：
1)选4-5周龄发育良好的雌鼠(优选C57BL/6系小鼠)，腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10IU，48小时后注射人绒毛促性腺激素(hCG)10IU；一般会优选用3到4周，体重在17g-20g体重的小鼠作为超排鼠。
2)经过步骤1)的激素超排处理后的(优选C57BL/6系小鼠)雌鼠，与公鼠(优选C57BL/6系小鼠)按1:1合笼，次日清晨挑选检栓成功的雌鼠，从检栓成功的雌鼠得到单细胞受精卵；
3)选8周龄以上的正常雌鼠(优选ICR鼠，适应性强，体格健壮，繁殖力强，生长速度快，实验重复性较好，母性好，吃仔或不带仔的情况很少出现。其他的小鼠也可以，但在母性或繁殖能力方面会相对差一点)与输精管结扎过的公鼠(优选ICR鼠)按1:1合笼，次日选取检栓成功的雌鼠，即为假孕ICR雌鼠；
4)将预混好的Cas9-D10AmRNA、Donor oligo 1与Donor oligo2的混合物利用显微注射方法直接注入单细胞受精卵的一细胞的胞浆内，通过调节半定量仪的注射时间和注射压力来调整合适的注射量，以溶液明显流入胞浆而不至于导致细胞死亡为止；
其中Cas9 mRNA，Donor oligo 1与Donor oligo 2的终浓度分别为40ng/μL-120ng/μL(优选50ng/μL)，40ng/μL-120ng/μL(优选25ng/μL)，40ng/μL-120ng/μL(优选25ng/μL)，三者保持2:1:1的比例关系；等受精卵发育成二细胞，把验证过切割效果较好的sgRNA7，sgRNA8，sgRNA17，sgRNA19的混合物利用显微注射方法直接注入二细胞中；其中sgRNA7，sgRNA8，sgRNA17，sgRNA19的终浓度均在20ng/μL-60ng/μL之间(优选25ng/μL)，即保持1:1:1:1的比例关系；注射后将受精卵放置在含0.5μM-1.5μM(优选1μM)SCR7的KSOM培养基(除SCR7外是还有RS-1和L755507)内培养24h左右，提高Donor oligo同源重组的效率，移植到假孕C57BL/6雌鼠的输卵管内，待产仔后，用PCR方法鉴定阳性小鼠。
理论上，注射样品的浓度越高，注射到体内后相应的DNA被切割的机率越高，相应的阳性率越高，但注射样品的浓度越高对受精卵的伤害越大，所以要选择一个阳性率较高而对受精卵毒害较低的浓度，本实验提供的浓度是经过验证的浓度，不同致死基因模型时，由于致死的程度不一样，注射的浓度也有所不同。
进一步的，所述基因打靶小鼠的鉴定操作包括：
A：待仔鼠长至1周龄剪取2mm左右鼠尾，蛋白酶K，55℃消化后酚仿抽提提取鼠尾基因组；以鼠尾基因组为模板，分别设计针对Nedd8点突变位置的引物，进行PCR扩增，对获得的PCR产物进行测序，如测序结果打靶位点附近出现双峰的情况，则可能为打靶成功，继续下一步鉴定；
B：选择双峰的样品再次PCR，产物胶回收后TA克隆至T载体中，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，如测序结果为插入HA-Flag和K27R(AAG>CGT)，则代表Nedd8点突变小鼠构建成功。
进一步的，所述步骤A中针对Nedd8点突变位置的引物序列为：
Mouse Nedd8-SPF1:ctgacacagaacacgagggcactc(SEQ ID NO：108)
Mouse Nedd8-SPR1:ctagttcccatcaagcctcgcg(SEQ ID NO：109)
Mouse Nedd8-SPF2:caggtgctcagcgtcctttctct(SEQ ID NO：110)
Mouse Nedd8-SPR2:actgcgaaagagcggcaagc(SEQ ID NO：111)。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Nedd8基因点突变小鼠的sgRNA组，包括sgRNA1(pair1)至sgRNA10(pair10)(序列见SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：16)中至少一组的sgRNA。
本发明还提供一种含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Casq2基因点突变动物模型胚胎的方法，将第309位氨基酸由D突变成N,具体：D309N(GAC to AAC)，对应到Human CASQ2也是第309位氨基酸D；所述方法包括步骤：
(1)、Casq2基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Casq2基因点突变动物模型胚胎的Casq2基因的sgRNA序列为：
g1：tcaccagaggaaagtcgtctggg、
g2：gacgactttcctctggtgagtgg。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Atp6ap2基因点突变动物模型胚胎的方法，将第279-282位氨基酸由RTIL突变成VTIV,具体：279-282RTIL toVTIV(AGGACCATCCTT toGTGACCATCGTT),对应到HumanATP6AP2也是第279-282位氨基酸RTIL；所述方法包括步骤：
(1)、Atp6ap2基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Atp6ap2基因点突变动物模型胚胎的Atp6ap2基因的sgRNA序列为：
g1:gaagtcaaggaccatccttgagg、
g2:ggtccttgacttcctcacaaggg。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Txn1基因点突变动物模型胚胎的方法，将第81-82位氨基酸由KK突变成EE,具体：KK81-82EE(AAAAAG to GAGGAG),对应到Human TXN1也是第81-82位氨基酸KK；所述方法包括步骤：
(1)、Txn1基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Txn1基因点突变动物模型胚胎的Txn1基因的sgRNA序列为：
g2:tttgaccctttttataaaactgg、
g4:ctcgatttaagagcaccagctgg。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Ctnna1基因点突变动物模型胚胎的方法，将第72位氨基酸由F突变成S,具体：F72S(TTC to TCC)，对应到Human CTNNA1也是第72位氨基酸F；所述方法包括步骤：
(1)、Ctnna1基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Ctnna1基因点突变动物模型胚胎的Ctnna1基因的sgRNA序列为：
g1:aacagatgcagccaaaacatggg、
g4:ctgagaatttcttggaaaagggg。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Ext2基因点突变动物模型胚胎的方法，将外显子7下游的内含子剪切信号位点GT变成GA,具体：c.1173+2T toA，对应到Human EXT2也外显子7下游的内含子剪切信号位点GT；所述方法包括步骤：
(1)、Ext2基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Ext2基因点突变动物模型胚胎的Ext2基因的sgRNA序列为：
g1:tctcttcaatctgcctctgtggg、
g2:gagatgcagagacaggtaagagg。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Dnajb13基因点突变动物模型胚胎的方法，将第36位氨基酸由S突变成P,具体：S36P(TCA to CCA)，对应到Human DNAJB13也是第36位氨基酸S；所述方法包括步骤：
(1)、Dnajb13基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Dnajb13基因点突变动物模型胚胎的Dnajb13基因的sgRNA序列为：
g3:gctcagatgacttcaatgggtgg、
g4:ccattgaagtcatctgagccggg。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Hand2基因点突变动物模型胚胎的方法，精准敲除HCE1，HCE1又名人羧酸酯酶1，羧酸酯酶代表一个多基因家族，它的基因产物定位于许多组织的内质网中，羧酸酯酶主要分布在肝脏中，基因序列成高度同源性，与肝癌的研究有关；所述方法包括步骤：
(1)、Hand2基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Hand2基因点突变动物模型胚胎的Hand2基因的sgRNA序列为：
g3:gaggctcctcacgccaatcccgg、
g4:acgacatatattaacccgagcgg。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Heyl基因点突变动物模型胚胎的方法，使之缺失第462位碱基C,对应到Human HEYL也是第462位碱基C；所述方法包括步骤：
(1)、Heyl基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Heyl基因点突变动物模型胚胎的Heyl基因的sgRNA序列为：
g1:tctctgctgcatagctgttgagg、
g2:caacagctatgcagcagagatgg。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Cdh2基因点突变动物模型胚胎的方法，将第705位氨基酸由S突变成F,具体：S705F(TCC to TTC)，对应到Human CDh2也是第705位氨基酸S；所述方法包括步骤：
(1)、Cdh2基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Cdh2基因点突变动物模型胚胎的Cdh2基因的sgRNA序列为：
g1:attggcaaactttcacacgcagg、
g2:gtttgccaatgtgactccaatgg。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Elovl4基因点突变动物模型胚胎的方法，将第246位氨基酸由W突变成G,具体：W246G(TGG to GGG)，对应到Human ELOVL4也是第246位氨基酸W；所述方法包括步骤：
(1)、Elovl4基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Elovl4基因点突变动物模型胚胎的Elovl4基因的sgRNA序列为：
g1：ccttccccaagtggatgcactgg、g2：gagcccagtgcatccacttgggg；
g1：ccttccccaagtggatgcactgg、g3：cagtgcatccacttggggaaggg。
一种利用CRISPR-Cas9系统制备Fars2基因点突变动物模型胚胎的方法，包括步骤：
(1)、Fars2基因的sgRNA设计；
(2)、Donoroligo设计；
(3)、sgRNA表达质粒对的构建；
(4)、体外转录；
(6)、原核注射及胚胎移植。
利用CRISPR-Cas9系统制备Fars2基因点突变动物模型胚胎的Fars2基因的sgRNA序列为：
pair1-g1:gttgtcccccttcttcctgctgg、
pair1-g2:gggacaactattacttgaatcgg；
pair2-g3:ttgtcccccttcttcctgctggg、
pair2-g4:ggacaactattacttgaatcggg；
pair3-g5:tgtcccccttcttcctgctgggg、
pair3-g6:gacaactattacttgaatcgggg；
pair4-g7:cccccttcttcctgctggggtgg、
pair4-g8:gggacaactattacttgaatcgg。
本发明有益效果：
本发明设计的特异性靶向小鼠Nedd8基因的sgRNA，都是经过在体内验证，效率最高，NEDD8模型无法建立成功的是由于纯合胚胎致死，为了解决纯合胚胎致死的问题，本发明进行二次注射，在单细胞时期注射Cas9 mRNA，Donoroligo 1与Donor oligo 2，等受精卵发育成二细胞，把预混好的sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，sgRNA4的混合物利用显微注射方法直接注入二细胞中，这样的注射方案得到的小鼠只有杂合子和野生型，不会有纯合子，解决了纯合致死的问题。二次注射会导致受精卵受损较为严重，出生率会下降比较严重，由于使用本发明提供gRNA组合，即使出生小鼠数量下降，也能得到足够的阳性繁殖。
本发明通过对CRISPR/Cas9系统各阶段进行优化，一步获得Nedd8基因点突变小鼠，获得更多的单个等位基因突变的嵌合鼠，这些嵌合鼠可以正常成活，为Nedd8基因的研究节省时间和成本。同时也给一些致死基因的模型(其他的致死基因包括：Fkbp10，Rbbp8，Lmna，S1pr4，Dsg2，Actb)构建提供了一种有效的，节省时间和成本的方法。
附图说明
图1为sgRNA表达质粒PX335的图谱。
图2为本发明方案的打靶策略图，在点突变附近选择特异性强的靶序列，构建可表达sgRNA的Cas9-D10A的载体，选择点突变两端合适的长度作为同源臂,两端同源臂加上突变点命名为Donor oligo，合成Donor oligo,将不同浓度的gRNA、Cas9-D10AmRNA与带有突变的donor oligo同时注射到小鼠受精卵细胞内，Cas9-D10A mRNA翻译的Cas9核酸酶会结合gRNA，靶向基因，产生双链断裂，细胞利用同源重组修复机制，以带有突变的donor oligo为模板修复断裂切口时，将突变引入特定位置。通过下游的鉴定，筛选出阳性动物模型。
图3(1-1,1-2至20-1，20-2)为含有目的条带的菌落PCR鉴定图。其中，第一排从左至右依次为marker,1-1、1-2、2-1、2-2、3-1、3-2、4-1、4-2、5-1、5-2、6-1、6-2、7-1、7-2、8-1、8-2、9-1、9-2、10-1、10-2、11-1、11-2、12-1、12-2、第二排从左至右依次为marker、13-1、13-2、14-1、14-2、15-1、15-2、16-1、16-2、17-1、17-2、18-1、18-2、20-1、20-2，其余的为其他项目(于本发明方案无关)
图4为g1-g20的PCR回收后产物。其中，从左至右依次为marker，g1,g2,g3,g4,g5,g6,g7,g8,g9,g10,g11,g12,g13,g14,g15,g16,g17,g18,g20。
图5为g1-g20的转录产物。其中，第一排从左至右依次为g1,g2,g3,g4,g5,g6,g7,g8,g9,g10,marker,第二排从左至右依次为g11,g12,g13,g14,g15,g16,g17,g18,g20,positive control,marker。
图6为g1-g20的回收后产物。其中，第一排从左至右依次为g1,g2,g3,g4,g5,g6,g7,g8,g9,g10,marker,第二排从左至右依次为g11,g12,g13,g14,g15,g16,g17,g18,g20,positive control,marker。
图7为Cas9-D10A mRNA的回收后产物，从左至右依次为Cas9-D10AmRNA,marker。
说明：其中pair9-g17和Pair10-g19序列相同，g17和g19中取其中一组实验即可，故各相关实验结果图中仅有19条带。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例1本发明的利用CRISPR-Cas9系统制备Nedd8基因点突变小鼠方法
具体操作包括：
1、sgRNA靶点设计
在NCBI的数据库中提取小鼠Nedd8基因ATG的上游和下游各50bp的序列，如下所示，设计靶标位点：
agcgggagaagcagcactctagccgcctgcaaccccaacctgggaagaagatgctaattaaagtgaaggtgggagcgtttccagactttccaagactcggtgc
满足5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3'共有13个，因为该基因具有纯合致死性，设计gRNA采用特异性更高的突变型Cas9(Cas9_D10A),减少脱靶导致的致死。Cas9_D10A需要一对头对头的gRNAs才能识别和切割双链DNA，在ATG处插入一段序列，如果设计的gRNA对都不包含ATG，重组之后，gRNA还会继续切割，将拿不到特定的阳性，考虑到这个问题，只能要包含ATG的gRNA对，一共有8对，具体序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：16所示。
在NCBI的数据库中提取小鼠Nedd8基因K27的上游和下游各50bp的序列，如下所示，设计靶标位点：
taattctaagcagcctctgaccacttgtttctccaaaggtggagcgaatcaaggagcgtgtggaagaaaaagaagggattcccccccagcagcagcggctcat
满足5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3'共有28个，考虑到这个基因具有纯合致死性，我们在设计gRNA就打算用特异性更高的突变型Cas9(Cas9_D10A),减少脱靶导致的致死。Cas9_D10A需要一对头对头的gRNAs才能识别和切割双链DNA，我们是做K27处进行突变，如果我们设计的gRNA对都不包含K27，重组之后，gRNA还会继续切割，我们将拿不到特定的阳性，考虑到这个问题，我们只能要包含K27的gRNA对，一共有2对，具体序列如SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：20所示。
2、Donor oligo设计
以Nedd8基因的N端为靶点，两端各60bp为同源臂，下划线处序列为HA序列，加粗字体序列为Flag序列，设计Donor oligo序列并合成：
Donoroligo 1:
以Nedd8基因的K27为靶点，突变点K27R(AAG>CGT)，两端各60bp为同源臂，下划线加粗字体为突变序列，设计Donoroligo序列并合成：
Donoroligo 2:
3.构建可表达sgRNA的Cas9-D10A质粒
(1)在金维智生物科技有限公司合成19对特异性的sgRNA靶序列引物(SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：58所示)：
Pair1-g1-F：caccgagcatcttcttcccaggttg
Pair1-g1-R：aaaccaacctgggaagaagatgctc
Pair1-g2-F：caccggaagatgctaattaaagtga
Pair1-g2-R：aaactcactttaattagcatcttcc
Pair2-g3-F：caccgtagcatcttcttcccaggtt
Pair2-g3-R：aaacaacctgggaagaagatgctac
Pair2-g4-F：caccggaagatgctaattaaagtga
Pair2-g4-R：aaactcactttaattagcatcttcc
Pair3-g5-F：caccgttagcatcttcttcccaggt
Pair3-g5-R：aaacacctgggaagaagatgctaac
Pair3-g6-F：caccggaagatgctaattaaagtga
Pair3-g6-R：aaactcactttaattagcatcttcc
Pair4-g7-F：caccgttaattagcatcttcttccc
Pair4-g7-R：aaacgggaagaagatgctaattaac
Pair4-g8-F：caccggaagatgctaattaaagtga
Pair4-g8-R：aaactcactttaattagcatcttcc
Pair5-g9-F：caccgagcatcttcttcccaggttg
Pair5-g9-R：aaaccaacctgggaagaagatgctc
Pair5-g10-F：caccggatgctaattaaagtgaagg
Pair5-g10-R：aaacccttcactttaattagcatcc
Pair6-g11-F：caccgtagcatcttcttcccaggtt
Pair6-g11-R：aaacaacctgggaagaagatgctac
Pair6-g12-F：caccggatgctaattaaagtgaagg
Pair6-g12-R：aaacccttcactttaattagcatcc
Pair7-g13-F：caccgttagcatcttcttcccaggt
Pair7-g13-R：aaacacctgggaagaagatgctaac
Pair7-g14-F：caccggatgctaattaaagtgaagg
Pair7-g14-R：aaacccttcactttaattagcatcc
Pair8-g15-F：caccgttaattagcatcttcttccc
Pair8-g15-R：aaacgggaagaagatgctaattaac
Pair8-g16-F：caccggatgctaattaaagtgaagg
Pair8-g16-R：aaacccttcactttaattagcatcc
Pair9-g17-F：caccgtccttgattcgctccacctt
Pair9-g17-R：aaacaaggtggagcgaatcaaggac
Pair9-g18-F：caccgtccaaaggtggagcgaatca
Pair9-g18-R：aaactgattcgctccacctttgga
Pair10-g20-F：caccgggagcgaatcaaggagcgtg
Pair10-g20-R：aaaccacgctccttgattcgctccc
(2)取g1-g20的上下游引物(100μM)各5μL，Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)(碧云天，货号：D0251)5μL，补水至255μL，混匀，PCR仪中37℃30min；95℃5min；0.1℃/s降温至25℃退火成双链，分别插入经Bsal酶切好的PX335-Bsal载体中(来自addgene，Plasmid#42335，PX335对应的是突变型的CAS9蛋白Cas9_D10A，对比野生型的hCas9,突变型的Cas9_D10A具有更高的特异性，减少脱靶的可能，减少脱靶到其他重要基因导致致死的可能，提供存活率)，转化，LB固体培养基涂板。次日，分别将连接g1-g20的平板取出，随机各挑2个白色菌落，放入含有20μLLB培养基的EP管中，做菌落PCR，图3(1-1,1-2至20-1，20-2)表示的是含有目的条带的菌落PCR鉴定图。其中，菌落PCR反应体系(TaKaRa TaqTM Version2.0，货号：R004A)：U6Forward0.5μL，每对oligo的Reverse0.5μL，2X MIX10μL，模板1μL，加HO至20μL。PCR反应条件：94℃3min，94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，72℃3min，30个循环。PCR完成后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶验证(2％)，目的条带大小约100bp，将验证正确的克隆菌液，放入LB液体培养基过夜扩大培养，提取过夜培养的菌液质粒，质粒DNA测出浓度均大于为100ng/μL，经测序验证(金维智生物科技有限公司)插入片段大小正确，将正确的g1-g20质粒DNA用作扩增模板。
4.体外转录
(1)通过PCR扩增得到带有T7启动子序列的g1-g20，图4为g1-g20的PCR回收后产物。用MEGAshortscriptTM Kit(Thermo，货号：AM1354)试剂盒体外转录g1-g20，图5为g1-g20的转录产物。用MEGAclearTM Kit(Thermo，货号：AM1908)试剂盒回收g1-g20的转录产物，图6为g1-g20的回收后产物。
g1-g20的T7转录扩增引物为(依次为SEQ ID NO：59至SEQ ID NO：96)：
Pair1-g1-T7-F：gaaattaatacgactcactataggagcatcttcttcccaggttg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair1-g2-T7-F：gaaattaatacgactcactataggaagatgctaattaaagtga
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair2-g3-T7-F：gaaattaatacgactcactataggtagcatcttcttcccaggtt
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair2-g4-T7-F：gaaattaatacgactcactataggaagatgctaattaaagtga
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair3-g5-T7-F：gaaattaatacgactcactataggttagcatcttcttcccaggt
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair3-g6-T7-F：gaaattaatacgactcactataggaagatgctaattaaagtga
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair4-g7-T7-F：gaaattaatacgactcactataggttaattagcatcttcttccc
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair4-g8-T7-F：gaaattaatacgactcactataggaagatgctaattaaagtga
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair5-g9-T7-F：gaaattaatacgactcactataggagcatcttcttcccaggttg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair5-g10-T7-F：gaaattaatacgactcactataggatgctaattaaagtgaagg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair6-g11-T7-F：gaaattaatacgactcactataggtagcatcttcttcccaggtt
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair6-g12-T7-F：gaaattaatacgactcactataggatgctaattaaagtgaagg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair7-g13-T7-F：gaaattaatacgactcactataggttagcatcttcttcccaggt
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair7-g14-T7-F：gaaattaatacgactcactataggatgctaattaaagtgaagg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair8-g15-T7-F：gaaattaatacgactcactataggttaattagcatcttcttccc
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair8-g16-T7-F：gaaattaatacgactcactataggatgctaattaaagtgaagg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair9-g17-T7-F：gaaattaatacgactcactataggtccttgattcgctccacctt
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair9-g18-T7-F：gaaattaatacgactcactataggtccaaaggtggagcgaatca
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
Pair10-g20-T7-F：gaaattaatacgactcactatagggagcgaatcaaggagcgtg
T7-R：aaaaaagcaccgactcggtgcc
(2)转录Cas9-D10A载体。使用MEGAshortscriptTM Kit(Thermo，货号：AM1354)试剂盒，将PX335-T7载体(改造方法同前述)经NotI线性化后，在体外转录成Cas9-D10A mRNA。用MEGAclearTM Kit(Thermo，货号：AM1908)试剂盒回收Cas9-D10AmRNA的转录产物，图7为Cas9-D10AmRNA的回收后产物。
5.在斑马鱼体内验证以上10对gRNA的切割活性
(1)扩增包含gRNA的小鼠基因DNA片段1和片段2
Mouse Nedd8-DNA1-F(SEQ ID NO：100)：cttccggcatagcggtactcact
Mouse Nedd8-DNA1-R(SEQ ID NO：101)ggccctcactttcatcagactctaatc
产物长度:1070bp；退火温度:60℃
Mouse Nedd8-DNA2-F(SEQ ID NO：102):accacacctctaatacttcccgttcc
Mouse Nedd8-DNA2-R(SEQ ID NO：103):gctctgaaatctgagggcacctgt
产物长度:937bp；退火温度:60℃
(2)将构建出的Cas9-D10A mRNA，小鼠基因DNA片段1，Pair1-g1和Pair1-g2为一组，Cas9-D10AmRNA，小鼠基因DNA片段1，Pair2-g3和Pair2-g4为一组，Cas9-D10AmRNA，小鼠基因DNA片段1，Pair3-g5和Pair3-g6为一组，以此类推，共注射8组，分别显微注射到40枚斑马鱼受精卵中检测g1-g16活性，(其中用量分别为cas9mRNA：100ng/μL，Pair1-g1：50ng/μL，Pair1-g2：50ng/μL，包含所有gRNA的DNA片段1：100ng/μL)；)。将构建出的Cas9-D10AmRNA，小鼠基因DNA片段2，Pair9-g17和Pair9-g18为一组，Cas9-D10AmRNA，小鼠基因DNA片段2，Pair9-g17(即Pair10-g19)和Pair10-g20为一组，分别显微注射到40枚斑马鱼受精卵中检测g17-g19活性，(其中用量分别为cas9mRNA：100ng/μL，Pair1-g17：50ng/μL，Pair1-g18：50ng/μL，Pair1-g19：50ng/μL，包含所有gRNA的DNA片段2：100ng/μL)；
10组取分别取20个斑马鱼胚胎进行PCR鉴定，测序验证突变情况(金维智生物科技有限公司)，结果鱼卵中突变率如下表，结果显示Pair4和Pair10活性较高。
验证gRNA活性的PCR引物如下：
Mouse Nedd8-SPF1(SEQ ID NO：104):ctgacacagaacacgagggcactc
Mouse Nedd8-SPR1(SEQ ID NO：105):ctagttcccatcaagcctcgcg
产物长度:352bp；退火温度:60℃
Mouse Nedd8-SPF2(SEQ ID NO：106):caggtgctcagcgtcctttctct
Mouse Nedd8-SPR2(SEQ ID NO：107):actgcgaaagagcggcaagc
产物长度:519bp；退火温度:60℃
表1.Pair1-Pair10活性比较
| 名称 | 注射组分 | 胚胎数量 | 突变数量 | 突变率 |
| Pair1 | g1+g2+DNA1+Cas9-D10A | 20 | 3 | 15％ |
| Pair2 | g3+g4+DNA1+Cas9-D10A | 20 | 4 | 20％ |
| Pair3 | g5+g6+DNA1+Cas9-D10A | 20 | 3 | 15％ |
| Pair4 | g7+g8+DNA1+Cas9-D10A | 20 | 7 | 35％ |
| Pair5 | g9+g10+DNA1+Cas9-D10A | 20 | 5 | 25％ |
| Pair6 | g11+g12+DNA1+Cas9-D10A | 20 | 4 | 20％ |
| Pair7 | g13+g14+DNA1+Cas9-D10A | 20 | 6 | 30％ |
| Pair8 | g15+g16+DNA1+Cas9-D10A | 20 | 3 | 15％ |
| Pair9 | g17+g18+DNA2+Cas9-D10A | 20 | 5 | 25％ |
| Pair10 | g17+g20+DNA2+Cas9-D10A | 20 | 8 | 40％ |
6、原核注射及胚胎移植
1)选4-5周龄发育良好的C57BL/6雌鼠，腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10IU，48小时后注射人绒毛促性腺激素(hCG)10IU；
2)所述经过步骤1)的激素超排处理后的C57BL/6雌鼠，与C57BL/6公鼠按1:1合笼，次日清晨挑选检栓成功的雌鼠，从检栓成功的雌鼠得到单细胞受精卵；
3)选8周龄以上的正常ICR雌鼠与输精管结扎过的ICR公鼠按1:1合笼，次日选取检栓成功的雌鼠，即为假孕ICR雌鼠；
4)将预混好的Cas9 mRNA、Donor oligo 1与Donor oligo 2的混合物利用显微注射方法直接注入单细胞受精卵的一细胞的胞浆内，通过调节半定量仪的注射时间和注射压力来调整合适的注射量，以溶液明显流入胞浆而不至于导致细胞死亡为止；其中Cas9mRNA，Donor oligo 1与Donor oligo 2的终浓度为50ng/μL，25ng/μL，25ng/μL；等受精卵发育成二细胞，把经验证切割效率较高的sgRNA7，sgRNA8，sgRNA17，sgRNA19的混合物利用显微注射方法直接注入二细胞中。sgRNA7，sgRNA8，sgRNA17，sgRNA19的终浓度分别是25ng/μL，25ng/μL，25ng/μL，25ng/μL；注射后将受精卵放置在含浓度为1μM SCR7的KSOM培养基内培养24h左右，以提高Donor oligo同源重组的效率，移植到假孕C57BL/6雌鼠的输卵管内，待产仔后，用PCR方法鉴定阳性小鼠。
6、基因打靶小鼠的鉴定
A：待仔鼠长至1周龄剪取2mm左右鼠尾，蛋白酶K，55℃消化后酚仿抽提提取鼠尾基因组。以鼠尾基因组为模板，分别设计针对Nedd8点突变位置的引物，序列如下，进行PCR扩增，对获得的PCR产物进行测序，如测序结果打靶位点附近出现双峰的情况，则可能为打靶成功，则继续进一步鉴定。
针对Nedd8点突变位置的引物：
Mouse Nedd8-SPF1(SEQ ID NO：108):ctgacacagaacacgagggcactc
Mouse Nedd8-SPR1(SEQ ID NO：109):ctagttcccatcaagcctcgcg
Mouse Nedd8-SPF2(SEQ ID NO：110):caggtgctcagcgtcctttctct
Mouse Nedd8-SPR2(SEQ ID NO：111):actgcgaaagagcggcaagc。
B：选择双峰的样品再次PCR，产物胶回收后TA克隆至T载体中，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，如测序结果为插入HA-Flag和K27R(AAG>CGT)，则代表Nedd8点突变小鼠构建成功。
实施例2
根据实施例1的步骤制得重组胚胎并移植400个胚胎，最终鉴定得到得到40只founder鼠，阳性率高达10％。这40只阳性小鼠健康状态很好，出生3个星期后依旧存活，且健康状态良好。
对照组1：在单细胞时期显微注射Cas9 mRNA、Donor oligo 1、Donor oligo 2的混合物，同时sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，sgRNA4的混合物利用显微注射方法直接注入。其他操作即相关实验所用材料同实施例1。
对照组2：同对照组1的操作。
表2本发明二次注射和非二次注射的对比结果
| 名称 | 注射卵数(个) | 代孕鼠(只) | 出生小鼠(只) |
| 本发明方法(二次注射) | 400 | 14 | 40 |
| 非二次注射对照组1 | 400 | 14 | 3 |
| 非二次注射对照组2 | 400 | 15 | 0 |
NEDD8(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated8)蛋白是一种能够对底物蛋白进行修饰的类泛素蛋白。它能与其底物蛋白上的赖氨酸共价结合，这一过程称之为neddylation。其对肿瘤细胞的增值、转录因子的调节等起至关重要的作用。neddylation修饰过程与泛素化类似，需要通过一系列的级联反应，包括由NAE1/Uba3二聚体构成的激活酶E1、NEDD8 E2结合酶UBEAM和UBE2F以及多种E3连接酶、Rbx1,、Dcn1等。目前已知，NEDD8主要通过修饰Cullin蛋白而调控Cullin-RING E3连接酶的活性，进而参与到细胞周期调控、转录与信号传导等生物学过程。泛素的7个赖氨酸可以形成不同的泛素链结构，在各种生化过程中发挥重要的作用。NEDD8第27位赖氨酸的突变可以抑制neddylation修饰，其作用机制为K27RNEDD8突变体与结合酶UBE2M形成稳定的共价键，从而无法UBE2M形成硫酯键，进而阻断neddylation的下游进程。K27RNEDD8突变体可以抑制Cullins的neddylation修饰与泛素化修饰，从而影响了Cullin相关E3泛素连接酶的活性及其底物蛋白质的泛素化。K27RNEDD8突变体在研究蛋白质的neddylation修饰的生化功能中可以作为重要的显性突变型。本发明以第二十七号氨基酸赖氨酸突变成精氨酸(即K27R)为研究点，为了后期更好的研究蛋白功能，同时在NEDD8的N端引入HA-Flag。由于Nedd8参与很多生命发育的重要过程，目前已有文献报道(http://mcb.asm.org/content/35/3/582.full)小鼠的Nedd8存在胚胎致死，内容如下：Neddylation inhibitor MLN4924blocksIL-1βmaturation/production in vitro and in vivo.Since Nedd8 is embryoniclethal,Nedd8 knockout(KO)mice do not exist.Nedd8 conditional KO also didnotyield a productive model,since Nedd8 is required for cellular homeostasis。
现有文献并没有公开Nedd8的胚胎致死原理，本发明方案研发过程中，发明人团队采用了CRISPR/Cas9的方案(包括野生型的hCas9和突变型的Cas9_D10A)，注射野生型的hCas9，注射后的代孕鼠做了两种处理：一半的代孕鼠正常生长到代孕鼠产期，但直到过了产期都没有一只小鼠出生；另一半的代孕鼠在E12.5、E15.5、E18.5观察胚胎的发育情况，观察的结果是超过50％都是死胎，并取出胚胎进行PCR测序鉴定，鉴定的结果是观察到是死胚胎的都是两个等位基因都存在突变的纯合子和两个等位基因都存在突变的嵌合体，胚胎正常的是野生型或单个等位基因存在突变；由此确定Nedd8是存在胚胎致死的原因，只要建模方案能产生更多的杂合子和野生型，就可能有小鼠出生。无论是选用野生型的hCas9还是突变型的Cas9_D10A都是有可能产生两个等位基因都突变的情况，只是Cas9_D10A方案需要一对sgRNA分别在双链DNA的每条单链上切出单链缺口，得到两个等位基因都存在突变的情况比野生型hCas9的几率会低点，但还是会有两个等位基因都存在突变的情况存在，而且这个方案是需要突变两个点，两个点之间相距8324bp，只有两个突变点都在同一个等位基因上，才能存活并稳定遗传给下一代。为了得到两个突变点都在同一个等位基因上的小鼠，本发明采取了二次注射的方案，并取得成功，具体为：在小鼠胚胎的一细胞时期(受精卵时期)注射了Cas9 mRNA与donor oligo混合物，而后在两细胞时期，随机地在两细胞的其中一个卵裂球注射sgRNAs。注射后将受精卵放置在含SCR7的KSOM培养基内培养24h左右，提高donoroligo同源重组的效率，然后将这些注射过的胚胎移植到假孕小鼠体内。SCR7是一种特异性DNA Ligase IV抑制剂，其阻断非同源性末端连接(NHEJ)，在小鼠中，Scr7通过瞬时阻断NHEJ，从而增加HDR的发生频率，产生精确的基因组编辑，这样就可以获得更多的单个等位基因突变的嵌合鼠，这些嵌合鼠可以正常成活。
特异性靶向小鼠Nedd8基因的donor oligo，donor oligo实际是一种单链DNA。在真核细胞中，DNA双链断裂的修复机制主要有两种：非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。HDR被认为是更准确的断裂修复机制，但它需要修复模板的存在，同时要求受损DNA和供体DNA链之间具有更高的序列同源性。本发明方案要插入一段表达标签和突变一个位点，需要用到含有同源臂的DNA模板进行修复，DNA模板可以是双链DNA，也可以是单链DNA,但双链DNA存在随机整合到基因组上的风险，因此在精确的基因编辑上的应用非常有限。相比之下，单链DNA随机整合的风险大大降低，主要是插入Cas9/sgRNA复合物所靶定的位点。此外，单链DNA供体模板对细胞的毒性要远低于双链DNA模板。所以单链DNA常作为“Donortemplate”被广泛应用于CRISPR等基因编辑过程中，可实现定点修复和长片段的敲入。所以本发明也用单链DNA作为修复模板，从而减少随机整合的风险，减低对受精卵的毒性，提供定点插入的效率。从而提高本发明的阳性率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 赛业（广州）生物科技有限公司
<120> 利用CRISPR-Cas9系统制得基因点突变小鼠模型胚胎的靶序列组、载体和方法
<130> HPCNP201810182
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gaaattaata cgactcacta tagggagcga atcaaggagc gtg 43
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
aaaaaagcac cgactcggtg cc 22
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
taatacgact cactataggg 20
<210> 98
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
ttttcaggtt ggaccggtta atacgactca ctataggggc caccatgtac ccatacgatg 60
<210> 99
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
tctcgttgct gaagatctct tgcag 25
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
cttccggcat agcggtactc act 23
<210> 101
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
ggccctcact ttcatcagac tctaatc 27
<210> 102
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
accacacctc taatacttcc cgttcc 26
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gctctgaaat ctgagggcac ctgt 24
<210> 104
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
ctgacacaga acacgagggc actc 24
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
ctagttccca tcaagcctcg cg 22
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
caggtgctca gcgtcctttc tct 23
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
actgcgaaag agcggcaagc 20
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
ctgacacaga acacgagggc actc 24
<210> 109
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
ctagttccca tcaagcctcg cg 22
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
caggtgctca gcgtcctttc tct 23
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
actgcgaaag agcggcaagc 20
Claims (8)
1.一种非诊断和治疗目的地利用CRISPR-Cas9系统制备Nedd8基因点突变小鼠模型胚胎的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1.小鼠Nedd8基因的sgRNA设计，包括：
步骤1.1在NCBI的数据库中提取小鼠Nedd8基因ATG的上游和下游各50bp的序列，如下所示，设计靶标位点：
agcgggagaagcagcactctagccgcctgcaaccccaacctgggaagaagatgctaattaaagtgaaggtgggagcgtttccagactttccaagactcggtgc，得到包含ATG的gRNA对：
pair4-g7：ttaattagcatcttcttcccagg；
pair4-g8：gaagatgctaattaaagtgaagg；
具体序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；
步骤1.2在NCBI的数据库中提取小鼠Nedd8基因K27的上游和下游各50bp的序列，如下所示，设计靶标位点：
taattctaagcagcctctgaccacttgtttctccaaaggtggagcgaatcaaggagcgtgtggaagaaaaagaagggattcccccccagcagcagcggctcat，得到包含K27的gRNA对：
pair9-g17：tccttgattcgctccacctttgg；
pair10-g20：ggagcgaatcaaggagcgtgtgg；
具体序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20所示；
步骤2.Donor oligo设计包括：
步骤2.1以Nedd8基因的N端为靶点，两端各60bp为同源臂，下划线处序列为HA序列，加粗字体序列为Flag序列，设计Donor oligo序列并合成：
Donor oligo 1：
cgaccacagcgggagaagcagcactctagccgcctgcaaccccaacctgggaagaagatgtacccatacgat gttccagattacgctgactacaaagacgatgacgacaagctaattaaagtgaaggtgggagcgtttccagactttccaagactcggtgcagggttggcc；
步骤2.2以Nedd8基因的K27为靶点，突变点K27R(AAG>CGT)，两端各60bp为同源臂，下划线加粗字体为突变序列，设计Donor oligo序列并合成：
Donor oligo 2：
agtatttgtctaattctaagcagcctctgaccacttgtttctccaaaggtggagcgaatccgtgagcgtgtggaagaaaaagaagggattcccccccagcagcagcggctcatctacagtggc；
步骤3.构建可表达sgRNA的Cas9-D10A质粒；
步骤3.1合成上述包含ATG的gRNA对和包含K27的gRNA对靶序列引物：
Pair4-g7-F：caccgttaattagcatcttcttccc；
Pair4-g7-R：aaacgggaagaagatgctaattaac；
Pair4-g8-F：caccggaagatgctaattaaagtga；
Pair4-g8-R：aaactcactttaattagcatcttcc；
Pair9-g17-F：caccgtccttgattcgctccacctt；
Pair9-g17-R：aaacaaggtggagcgaatcaaggac；
Pair10-g20-F：caccgggagcgaatcaaggagcgtg；
Pair10-g20-R：aaaccacgctccttgattcgctccc；
步骤3.2将各对gRNA对靶序列上下游引物退火获得带粘性末端的双链DNA片段，连入经BbsI酶切的pX335-Bsal载体中，测序验证；
步骤4.体外转录sgRNA和Cas9-D10A mRNA；
步骤5.原核注射，包括：
将预混好的Cas9-D10A mRNA和Donor oligo序列的混合物直接注入单细胞受精卵的一细胞的胞浆内，调整合适的注射量，以溶液明显流入胞浆而不至于导致细胞死亡为止；等受精卵发育成二细胞，把预混好的sgRNA混合物直接注入二细胞中；注射后将受精卵放置在含SCR7的KSOM培养基内培养。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述sgRNA表达质粒对的构建，具体操作包括：
合成特异性的sgRNA靶序列引物，退火获得带粘性末端的双链DNA片段，连入经BbsI酶切的pX335载体中，获得pX335-sgRNA载体，载体质粒均通过测序验证。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述体外转录操作为：
1)以构建的正确的质粒DNA为模板，利用引物PCR扩增得到带有T7启动子序列的sgRNA，体外转录，收集产物；
2)转录Cas9-D10A载体。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Cas9 mRNA，Donor oligo 1与Donor oligo 2的终浓度均为40ng/μL-120ng/μL，且三者终浓度保持2：1：1的比例关系。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述sgRNA混合物组成为：sgRNA7、sgRNA8、sgRNA17、sgRNA20，四者终浓度均为20ng/μL-60ng/μL，且总浓度保持1：1：1：1的比例关系。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法在原核注射后还包括胚胎移植和基因打靶小鼠的鉴定；
所述基因打靶小鼠的鉴定操作包括：
待仔鼠长至1周龄鼠尾取样，提取鼠尾基因组；以鼠尾基因组为模板，进行PCR扩增，对获得的PCR产物进行测序；如测序结果打靶位点附近出现双峰的情况，则再次PCR，回收产物TA克隆至T载体中，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，如测序结果为插入HA-Flag和K27R(AAG>CGT)，则代表Nedd8点突变小鼠构建成功。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述针对Nedd8点突变位置的引物序列如SEQ ID NO：108至SEQ ID NO：111所示。
8.一种含有如权利要求1所述的sgRNA组的CRISPR/Cas9打靶载体，所述sgRNA组包括：
pair4-g7：ttaattagcatcttcttcccagg；
pair4-g8：gaagatgctaattaaagtgaagg；
具体序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；
pair9-g17：tccttgattcgctccacctttgg；
pair10-g20：ggagcgaatcaaggagcgtgtgg；
具体序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20所示。
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