CN112662668B

CN112662668B - 用于cko载体构建的引物组

Info

Publication number: CN112662668B
Application number: CN202011641034.0A
Authority: CN
Inventors: 苏翠
Original assignee: Cyagen Biosciences Inc Suzhou
Current assignee: Cyagen Biosciences Inc Suzhou
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2024-01-16
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112662668A

Abstract

本发明提供了用于CKO载体构建的引物组，其包含Seq ID No.1:5’‑ACGTAAACGGCC ACAAGTTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCACATGAAGCAGCACGACT‑3’，(74bp)划线区域为LoxP序列；Seq ID No.2:5’‑GTGGATTCGGA CCAGTCTGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA‑3’，(74bp)划线区域为LoxP序列。本发明引物序列的突变或缺失率几乎为～0％；且利用本发明的引物组构建CKO载体的周期只需要2～3周。

Description

用于CKO载体构建的引物组

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及高通量构建CKO载体的方法。

背景技术

基因修饰的模型动物在现在医学研究中必不可少，尤其今年新冠疫情的爆发，将基因编辑推到历史高峰。基因编辑技术也在不断更新，从传统的ES打靶技术到核酸酶技术，而核酸酶技术历经锌指核酸酶(ZFN)-转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)-CRISPR/Cas系统三代技术革新后，CRISPR/Cas9核酸酶技术在2020年荣获诺贝尔化学奖，如今在科研界更是一枝独秀。

常规的基因编辑技术有转基因(Transgenic gene)、基因敲除(Knock-out)、基因敲入(Knock-in)、RNA干扰(RNAi)。其中基因敲除技术是功能基因组学研究的重要工具，但是传统的基因敲除模型在胚胎致死基因的研究方便有一定局限性，条件性基因敲除(Conditional Knock-out，简写为CKO)在克服传统基因敲除缺陷的情况下，其能实现时间和空间调控基因删除的优势使得在研究领域颇受欢迎。条件性基因敲除是通过染色体位点特异性重组酶系统来实现的，常用的重组酶系统Cre-LoxP或Flp-Frt，近年Cre家族位点Dre-Rox也应用很多，其中Cre重组酶是最经典的工具，其最佳反应温度是37℃，因此在细胞或动物体内重组反应效率最高，使用也最广。基因敲除把两个LoxP位点放到目的基因一个或几个重要的外显子两端，制备出Flox小鼠，该目的基因表达不受LoxP插入的影响，而当该Flox小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，Cre酶的组织特异性表达可以促进目的基因两侧的LoxP位点发生重组，目的基因完整性被破坏，从而发生基因功能缺失，而该基因在其他组织或细胞表达正常。

CRISPR/Cas9编辑技术以其高效、操作简便、成本低等特点被广泛应用于基因敲除小鼠实验中，条件性基因敲除模型的制备流程：sgRNA位点确定-CKO载体构建-受精卵显微注射-F0嵌合体小鼠-具有生殖遗传的F1小鼠-F1小鼠与组织特异性工具鼠Cre交配获得条件性敲除的Fn小鼠。其中载体设计尤为重要，需要在KO区域的两端引入LoxP位点，常见的方法是在载体骨架上引入该位点，然后再将5’arm、CKO region、3’arm分别构建到骨架上，该方法非常耗时，载体构建周期需要6～8周。

另一种方法是将loxP位点在扩增引物的5’引入，因此扩增好的5’arm、CKOregion、3’arm可以一次性构建至骨架中，将周期缩短至2～3周但是该方法由于要引入LoxP位点和Overlapping序列，因此要合成超长的引物，目前的合成公司大于80bp的引物产量就非常低，而且突变或缺失的比例很高，每次合成的质量都有差异，价格和周期都相应增长。因此研发出一套高通量构建CKO载体的方法尤其重要。

发明内容

本发明所要解决的第一问题在于克服现有技术构建CKO载体，突变或缺失率较高的问题，提供了两条通用序列作为引物，能获得较高正确率以用于CKO载体构建。

为了解决现有技术中的这些问题，在第一个方面，本发明提供的技术方案是：用于CKO载体构建的引物组，包括Seq ID No.1:5’-ACGTAAACGGCCACAAGTTCATAACTTCGTATAGCAT ACATTATACGAAGTTATCCACATGAAGCAGCACGACT-3’，(74bp)划线区域为LoxP序列；

Seq ID No.2:5’-GTGGATTCGGACCAGTCTGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTA TTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA-3’，(74bp)划线区域为LoxP序列。

优选地，所述引物组还包括：

5’arm下游引物Seq ID No.3：5’-GAACTTGTGGCCGTTTACGTGCTAGCAATTN₁…Nx-3’，3’arm上游引物Seq ID No.4：5’-TCAGACTGGTCCGAATCCACGAGCTCAATATTN₁…Nx-3’,CKO-1上游引物Seq ID No.5：5’-TAGCATGAAGCAGCACGACTN₁…Nx-3’CKO-1下游引物Seq ID No.6：5’-TAGTTGCCGTCGTCCTTGAAN₁…Nx-3’,所述N选自ATCG四种碱基中的一种，且x≤30，优选x≤25。上述的引物中，每条引物的一部分是固定序列，另外一部分N₁…Nx则是根据具体打靶基因位点的序列进行设计。

优选地，所述引物组还包括：5’arm上游引物，3’arm下游引物，其是根据具体打靶基因位点的序列进行设计。

本发明的一实施例中，所述引物组还包括：5’arm下游扩增序列Seq ID No.7：5’-GAACTTGTGGCCGTTTACGTGCTAGCAATTGGGTCCAACTCGCTCCAAAGCTCAC-3’，3’arm上游扩增序列Seq ID No.8：5’-TCAGACTGGTCCGAATCCACGAGCTCAATATTGGATGGCCATCCAAAGATGGTG-3’，CKO-1扩增序列Seq ID No.9：5’-TAGCATGAAGCAGCACGACTTGGGAAAACTCCTATGGGAGATGAG-3’，CKO-1扩增序列Seq ID No.10：5’-TAGTTGCCGTCGTCCTTGAATCCTGGTTAAGAACAACTTCTGCAT-3’。

本发明第二方面，还提供用于CKO载体构建的试剂盒，所述试剂盒中包含如下引物：Seq ID No.1:5’-ACGTAAACGGCCACAAGTTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCACATGAAGCAGCACGACT-3’，(74bp)划线区域为LoxP序列；

Seq ID No.2:5’-GTGGATTCGGACCAGTCTGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTA TTAG TTGCCGTCGTCCTTGAA-3’，(74bp)划线区域为LoxP序列。

所述试剂盒还包括：5’arm下游引物Seq ID No.3：5’-GAACTTGTGGCCGTTTACGTGCTAGCAATTN₁…Nx-3’，3’arm上游引物Seq ID No.4：5’-TCAGACTGGTCCGAATCCACGAGCTCAATATTN₁…Nx-3’,CKO-1上游引物Seq ID No.5：5’-TAGCATGAAGCAGCACGACTN₁…Nx-3’CKO-1下游引物Seq ID No.6：5’-TAGTTGCCGTCGTCCTTGAAN₁…Nx-3’,所述N选自ATCG四种碱基中的一种，且x≤30，优选x≤25。上述的引物中，每条引物的一部分是固定序列，另外一部分N₁…Nx则是根据具体修饰的靶基因序列进行设计。

优选地，试剂盒还包括：5’arm上游引物，3’arm下游引物，其是根据具体修饰的靶基因序列进行设计。

本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种CKO载体的构建方法，所述方法中包含使用序列Seq ID No.1和Seq ID No.2扩增的步骤。进一步的，所述方法中包含使用序列Seq ID No.3，Seq ID No.4，Seq ID No.5，Seq ID No.6扩增的步骤。

相比于现有技术中的解决方案，本发明的有益效果是：

(1)引物序列的创新：

现有技术的CKO载体构建的方法中，项目之间PCR片段的长扩增引物都不同，由于成本和周期问题，无法做到每条长引物都严格质控后再使用，因此无法避免引物合成的突变或不稳定性这种现象；且F0/F1小鼠鉴定引物也不同，后续设计工作量大。

而本发明的方法中，将长引物序列就固定在CKO扩增区域，所有条件性敲除的项目都适用，因此只需要对这两条引物严格把控，用TA连接的方式筛选无突变的引物再用于生产；F0/F1小鼠鉴定引物一端固定，后续设计工作少一半。

(2)载体构建技术的创新：

现有技术的CKO载体构建的方法中，操作繁琐，需要3步骤分别连接，构建周期6～8个周，引物合成周期3天以上，且费用较高，至少要350元以上；而本发明的操作简单，只需要一次性的连接，引物合成只需要一天，引物合成费用仅在160元以内。

尤其是，现有技术的CKO载体构建的方法中，引物序列突变或缺失率～10％；而本发明引物序列的突变或缺失率几乎为～0％；且利用本发明的引物组构建CKO载体的周期只需要2～3周。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1显示了本发明中引物组的PCR扩增产物电泳图。

图2显示了本发明中引物组扩增的PCR产物连入T载体的菌检效率。

图3显示了本发明中引物组的TA连接产物的测序验证结果。

图4显示了本发明一实施例的CRISPR/Cas9拼接好的CKO载体示意图。

图5显示了本发明与对照方案的具引物序列的差异以及成本。

图6显示了一步法克隆载体的高效率。

具体实施方式

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，如《分子克隆实验手册》以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级，实验用水经Milli-XQ过滤，各试剂均和材料可以商用渠道获得，具体而言：

所需器械：伯乐PCR仪、电泳槽、水浴锅、培养箱、恒温摇床、Nanodrop2000核酸测定仪。

所需试剂：高保真PCR聚合酶Phusion、dNTP、5xBuffer、TA/Blunt-ZeroCloningKit、Qiagen胶回收试剂盒、琼脂糖、质粒提取试剂盒、化学感受态细胞、蒸馏水、体外重组酶、LB培养基、卡那霉素抗性。

实施例1筛选通用引物组

1.按照以下规格合成引物，分3个批次，合成3份平行样。

表1

2.选定一个用于扩增验证的DNA模板：P08361克隆，该模板含有以上引物组的结合区域，且扩增区域大小为508bp，正好一个测序反应可以测通。序列如下：Seq ID No.11所示。

3.PCR扩增：将3组平行引物组分别以P08361克隆为模板扩增目的条带PCR体系如下表2所示：

表2

PCR程序为：预变性98℃3min；然后变性98℃20sec，退火61℃20sec，延伸72℃30sec，循环27次；最后72℃5min,然后4℃保温。

4.跑电泳并胶回收

电泳条带如图1所示，显示有符合预期的508bp条带，将这508bp三条条带切胶，用胶回收试剂盒纯化并用核酸测定仪测浓度。

5.TA克隆连接

5.1连接

连接体系为：5xTA/Blunt-Zero Cloning Mix 1 μL；PCR纯化产物50ng；最后加入实验用水定容为5μL。

5.2轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体于离心管底，室温(26℃)反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上；

5.3将5μL连接产物全部加入溶解后的DH10B感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

5.4将冰浴好的感受态，迅速转移至提前调至42℃的水浴锅中热击1min，然后冰浴2min；

5.5然后加入700μL LB液体培养基，37℃恒温震荡培养1小时；

5.6将菌液均匀涂于带有氨苄霉素抗性的平板上，放于培养箱中37℃恒温培养16h。

6.菌检及测序分析

6.1菌落PCR筛选：3块平板各筛选24个单克隆，用M13-F和M13-R骨架引物扩增，结果如图2所示。

6.2各筛选20个阳性克隆安排测序，分析PCR产物是否突变，测序峰图如图3所示，要保证20个克隆的引物组所在区域包含loxP均没有突变，才能投入生产使用。

实施例2引物组用于构建CKO载体的方法

1.引物合成

2.试剂的准备

2.1高保真PCR聚合酶体系：将聚合酶及Buffer和dNTP从冰箱取出，放碎冰上溶解。

2.2DNA模板和引物：将引物用1xTE buffer溶解，DNA模板是质粒需稀释至1ng/ul，小鼠基因组DNA需稀释至100ng/ul，待用。引物模板如图5所示。

2.3In-Fusion克隆酶：等PCR片段准备好后再拿出该酶于冰上放置。

3.PCR反应：

5’arm、CKO-1、3’arm分别用表格1中对应的引物扩增，模板用C57BL/6J鼠尾基因组DNA；(CKO-2：用专用序列F/R，以CKO-1作为模板扩增)

表3 Primerstar酶扩增体系

PCR程序为：预变性98℃3min；然后变性98℃10sec，退火60℃15sec，延伸72℃1kb/min，循环30次；最后72℃5-10min,然后4℃保温。

PCR产物跑电泳确认条带大小无误后，用胶回收试剂盒回收条带，用核酸蛋白测定仪测好浓度待用(当片段加起来大于5kb时，最好将相邻的两个片段做PCR融合，提高构建的成功率)。

4.载体构建

片段连接转化

4.1将片段5’arm、3’arm、CKO-2按照以下浓度混匀，50℃反应15min。连接体系为：线性化骨架50ng，连接片段50ng/50ng/50ng，In-Fusion混合物5μL，最后加入灭菌用水定容到10μL。

4.2反应结束后，吸取5μL至溶解后感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min。

4.3将冰浴好的感受态，迅速转移至提前调至42℃的水浴锅中热击1min，然后冰浴2min。

4.4然后加入700μL LB液体培养基，37℃恒温震荡培养1小时。

4.5将菌液均匀涂于带有卡那霉素抗性的平板上，放于培养箱中37℃恒温培养16-18h。

5.菌落验证

5.1用镊子夹取已灭菌10uL枪头轻轻蘸取单克隆至管内加了20ul灭菌水的96孔板中，混匀作为PCR模板。

5.2PCR体系和程序如上表2、3，反应结束后跑电泳拍胶，确定阳性克隆。

5.3将阳性克隆剩余的菌液接种至2mL加了卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃摇床过夜培养。

6质粒验证

6.1质粒提取：用Qiagen小提质粒提取试剂盒，将质粒提取出来，并测浓度待用。

6.2质粒酶切验证：筛选合适的内切酶用于酶切质粒，按照以下体系配置，之后37℃反应1h(要留意对应的内切酶反应温度)；反应后跑电泳确定酶切条带正确性。如图6所示。

酶切体系为：Buffer 2μL，质粒500ng～800ng，限制性内切酶0.3μL，最后加入灭菌用水，定容到20μL。

6.3质粒测序分析：将酶切验证正确的质粒测序分析，重要调控序列比如启动子、UTR、编码序列、重组位点等都要测序无误方可交付。

效果优点：

采用该高通量方法构建载体，载体总周期降低了50％以上，其中PCR扩增引物成本降低了50％，周期由3天缩短至1天；操作层面上由原来的三步连接改为一步连接，降低了实验成本，同时提高了操作通量。并且克服了长引物合成突变和不稳定行稳定，不需返工，大大提高了载体构建的一次成功率。

该技术广泛应用，更高效的推动了小鼠基因条件性敲除研究的发展。

对比例

A组：常规方法

B组：本发明的高通量方法

从实验组和对照组的数据比较中可见：高通量方法不管是周期还是成本都远低于常规方法；测序克隆少，也减少了质粒提取和测序分析工作，大大提高了通量；而且专用引物的质量可控性强，设计的序列让后期小鼠鉴定引物也能明确，减少了下游小鼠样品DNA鉴定的工作量。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 赛业（苏州）生物科技有限公司

<120> 用于CKO载体构建的引物组

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 1

acgtaaacgg ccacaagttc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatccacat 60

gaagcagcac gact 74

<210> 2

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 2

gtggattcgg accagtctga ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttattagttg 60

ccgtcgtcct tgaa 74

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 3

gaacttgtgg ccgtttacgt gctagcaatt 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 4

tcagactggt ccgaatccac gagctcaata tt 32

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

tagcatgaag cagcacgact 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 6

tagttgccgt cgtccttgaa 20

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 7

gaacttgtgg ccgtttacgt gctagcaatt gggtccaact cgctccaaag ctcac 55

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 8

tcagactggt ccgaatccac gagctcaata ttggatggcc atccaaagat ggtg 54

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 9

tagcatgaag cagcacgact tgggaaaact cctatgggag atgag 45

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 10

tagttgccgt cgtccttgaa tcctggttaa gaacaacttc tgcat 45

<210> 11

<211> 508

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 11

acgtaaacgg ccacaagttc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatccacat 60

gaagcagcac gactctgaga gctgagctct gaccctgaat ccctctgcct gttccctagc 120

tccctgaatt ggacagaacc cctgatccac tcatcccatc atgggaaacc ctgtggtagg 180

taggtgactg tcctggtgtg actctctttc aggctggacg caacttctac aatgttgaca 240

taagctatct gaagaagctg tgtggcactg tcctgggtgg acccaaactg ccaggaaggt 300

gagtgacaca gcctggagtg gacactgccc ccacatactg gcttgtgaac agtggtgcta 360

gtgttggagt gtagggagag gtagaagaag ccctctctgg attccctagg tgtgtccttc 420

agagactcaa atgcttcaag gacgacggca actaataact tcgtatagca tacattatac 480

gaagttattc agactggtcc gaatccac 508

Claims

1. 用于CKO载体构建的引物组，其特征在于，所述引物组包括cko-2引物、5'arm引物、cko-1引物和3'arm 引物，其中

cko-2引物包括Seq ID No.1:5’-ACGTAAACGGCCACAAGTTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCACATGAAGCAGCACGACT-3’；

Seq ID No.2:

5’-GTGGATTCGGACCAGTCTGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA-3’；

5'arm引物包括5’-CTATAGGGCGAATTGGGTACGGCGCGCCATCTACTGTTGCTCCCACCAGACTC-3’；

5’-GAACTTGTGGCCGTTTACGTGCTAGCAATTGGGTCCAACTCGCTCCAAAGCTCAC-3’；

cko-1引物包括5’-TAGCATGAAGCAGCACGACTTGGGAAAACTCCTATGGGAGATGAG-3’；

5’-TAGTTGCCGTCGTCCTTGAATCCTGGTTAAGAACAACTTCTGCAT-3’；

3'arm 引物包括5’-TCAGACTGGTCCGAATCCACGAGCTCAATATTGGATGGCCATCCAAAGATGGTG-3’；

5’-ATGGGCCCTGGTACCAGAATGCGGCCGCCCTAGATATGCCAATCACACCCCAAC-3’。

2. 用于 CKO 载体构建的试剂盒，所述试剂盒中包含cko-2引物、5'arm引物、cko-1引物和3'arm 引物，其中

Seq ID No.2:

5’-GAACTTGTGGCCGTTTACGTGCTAGCAATTGGGTCCAACTCGCTCCAAAGCTCAC-3’；

cko-1引物包括5’-TAGCATGAAGCAGCACGACTTGGGAAAACTCCTATGGGAGATGAG-3’；

5’-TAGTTGCCGTCGTCCTTGAATCCTGGTTAAGAACAACTTCTGCAT-3’；

5’

-ATGGGCCCTGGTACCAGAATGCGGCCGCCCTAGATATGCCAATCACACCCCAAC-

3’。