CN110117615A - 一种psmd11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents
一种psmd11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法及其应用。本发明中的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,是通过将PSMD11基因的第5外显子敲除,从而实现失活整个基因,首次获得了PSMD11基因条件性敲除小鼠模型。PSMD11在调节蛋白酶体组装及活性方面都起到非常关键的作用,而且PSMD11蛋白还被证明能够抑制胰腺癌细胞急性凋亡,本发明构建得到的PSMD11基因条件性敲除小鼠模型为进一步研究PSMD11基因的生物学功能奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法及其应用,属于生物医学技术领域。
背景技术
条件性基因敲除小鼠模型是近年来在生命科学研究领域发展起来的一项新技术,它是在胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)技术和同源重组技术的基础上发展起来的,通过利用Cre-loxP重组系统,可以实现条件性基因敲除,是开展基因功能研究的重要工具。
PSMD11是26S蛋白酶体复合物的成分之一,该复合体负责进行ATP依赖的泛素化蛋白降解。蛋白酶体通过消除错误折叠的、受损的蛋白或者某些功能已经不再被需要的蛋白,在维持蛋白动态平衡方面发挥重要作用。因此,蛋白酶体参与细胞周期进展,细胞凋亡或者DNA损伤修复等多个过程。26S蛋白酶体包括一个20S的核心微粒(CP),和两个19S的调控亚基(RP)。调控亚基是由一个由9个亚基(包括PSMD11蛋白)组成的盖子以及6个ATP酶和少量的附加成分组成的基底组成的。在蛋白酶体中,PSMD11在调节蛋白酶体组装及活性方面都起到非常关键的作用,它的高表达或磷酸化都可以促进26S蛋白酶体的组装及活性。另外PSMD11蛋白还被证明能够抑制胰腺癌细胞急性凋亡,提示该蛋白具有多种生物学功能。为了进一步探讨PSMD11蛋白的生物学功能,目前急需建立一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型,目前有关小鼠PSMD11基因的敲除还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法及其应用,进一步探讨PSMD11的生物学功能。
本发明的技术方案如下:
一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,所述小鼠模型为PSMD11基因杂合敲除的小鼠,其特征在于,包括步骤如下:
构建PSMD11基因条件性敲除的重组载体;线性化上述重组载体并转染胚胎干细胞;筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆;将上述筛选出的胚胎干细胞克隆显微注入C57BL/6供体小鼠的囊胚;将含有胚胎干细胞克隆的囊胚移植到假孕小鼠的子宫,生产出嵌合体小鼠;将上述嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠回交生出杂合子小鼠;将上述杂合子小鼠与全身性表达Cre酶的小鼠交配,获得PSMD11基因条件性敲除小鼠模型。
根据本发明优选的,所述PSMD11基因条件性敲除的重组载体的构建方法,步骤如下:
(1)提取含有PSMD11基因的细菌人工染色体;
(2)以步骤(1)提取到的细菌人工染色体为模板,PCR扩增三段同源重组片段,分别为长臂、短臂、及条件性敲除区,PCR的引物序列分别为:
长臂的PCR引物为LA-F:5’-GGACTAGTCAATGGCTCACCACTGTCAG-3’和LA-R:5’-CGGGATCCGAGGAGAGGGAAGAGGGAGG-3’,
短臂的PCR引物为SA-F:5’-ACGCGTCGACAGGAACGTGAGTTACAGACG-3’和SA-R:5’-GGAATTCCAGGAGAGCTACACAGAGAAA-3’,
条件性敲除区的PCR引物为cKO-F:5’-CGGGATCCTCTCGCAACATTGTCTTATTC-3’和cKO-R:5’-GCTCTAGAGAGTATCCAACACCCTCACA-3’,
其中,下划线为引入的酶切位点;
(3)将步骤(2)扩增得到的三段同源重组片段序贯插入质粒载体中,即得PSMD11基因条件性敲除的重组载体。
进一步优选的,步骤(1)中所述细菌人工染色体为RP23-307G3和RP23-276J12。
进一步优选的,步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为:细菌人工染色体模板2μL,TaqDNA聚合酶25μL,上游引物(10μM)1μL,下游引物(10μM)1μL,ddH2O21μL,共50μL;
PCR扩增的反应条件:94℃预变性5min;94℃变性20s,60℃退火20s,72℃延伸3min,共30个循环;72℃保温10min。
本发明中,长臂(long homology arm,LA)的片段长度为4.93kb,包括第四外显子,为第5外显子的5’同源臂;短臂(the short homology arm,SA)的片段长度为2.85kb,为第5外显子的3’同源臂;条件性敲除区(the conditional knockout region,cKO)包括第5外显子。
进一步优选的,步骤(3)中所述序贯插入质粒载体的方法为:采用一段同源重组片段的酶切位点对同源重组片段和质粒载体分别进行双酶切后连接,连接成功后,采用下一段同源重组片段对应的酶切位点对该同源重组片段和链接成功后的质粒载体分别进行双酶切和连接,以此类推,完成三段同源重组片段的序贯插入。
本发明中的质粒载体由赛业生物科技有限公司提供,三段同源重组片段序贯插入后的重组质粒载体图谱如图1中的打靶载体所示。
根据本发明优选的,所述的胚胎干细胞为C57BL/6来源的胚胎干细胞。
上述PSMD11基因条件性敲除小鼠模型作为PSMD11基因功能研究的模型鼠的用途。
本发明中未详细描述的实验步骤均按照本技术领域常规操作进行。
有益效果
本发明提供了一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,通过将PSMD11基因的第5外显子敲除,从而实现失活整个基因,首次获得了PSMD11基因条件性敲除小鼠模型。PSMD11在调节蛋白酶体组装及活性方面都起到非常关键的作用,而且PSMD11蛋白还被证明能够抑制胰腺癌细胞急性凋亡,本发明构建得到的PSMD11基因条件性敲除小鼠模型为进一步研究PSMD11基因的生物学功能奠定了基础。
附图说明
图1是PSMD11基因条件性敲除重组载体的构建流程,图中,wildtype allele为野生型PSMD11基因,targetingvector为打靶载体,recombinant allele为PSMD11flox-neo基因,conditional KO allele(After Flp recombination)为与Flp小鼠杂交后的PSMD11lox基因,constitutive KO allele(After Cre recombination)为与Cre小鼠杂交后的PSMD11Δ基因;
图2是PSMD11基因条件性敲除重组载体的限制性内切酶图谱;
图3是PSMD11基因条件性敲除重组载体的单酶切验证电泳图,图中,M为DNAMAKER,1为ApaLI的酶切电泳泳道,产生的酶切条带从上到下依次为9.3、3.1、2.9、1.2、0.6、0.1kb,2为DrdI的酶切电泳泳道,产生的酶切条带从上到下依次为4.2、3.8、3.3、2.6、1.9、1.6kb,3为EcoRI的酶切电泳泳道,产生的酶切条带从上到下依次为9.3、6.5、1.5、0.1kb,4为FspI的酶切电泳泳道,产生的酶切条带从上到下依次为8.9、5.7、1.5、1.2kb,5为NotI的酶切电泳泳道,产生的酶切条带从上到下依次为17.3kb;
图4是重组的胚胎干细胞PCR验证电泳图,图中,左面的为区域1的PCR验证电泳图,右面的为区域2的PCR验证电泳图;
图5是重组的胚胎干细胞Southernblot验证图谱;图中,左面的为Nde I限制性内切酶酶切后的杂交结果图,右面的为HindIII限制性内切酶酶切后的杂交结果图;
图6是条件性基因敲除的floxed小鼠的PCR验证电泳图,图中的泳道分别显示PSMD11lox/lox、PSMD11lox/+和野生型小鼠(PSMD11+/+)的PCR鉴定结果;
图7是PSMD11基因敲除杂合小鼠的PCR鉴定电泳图,图中,上面的是以mPSMD11-F1和mPSMD11-R1为引物的鉴定电泳图,下面的是以mPSMD11-F3和mPSMD11-R1为引物的鉴定电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做进一步说明,但本发明所保护范围不限于此。
室温:具有本领域公知的含义,一般是指25±2℃。
G418(生工生物工程(上海)股份有限公司),是由Micromonosporarhodorangea(红橙小单孢菌)产生的一种氨基糖苷类抗生素,结构与庆大霉素B1(gentamycin B1)相似,但与庆大霉素抑制真核细胞多肽合成的机制不同,G418通过与80s核糖体不可逆性结合,从而破坏其校正阅读功能。目前,G418最重要的应用是用于选择携带neo基因的转染细胞。
实施例1.PSMD11基因条件性敲除载体的构建
PSMD11基因条件性敲除载体是将PSMD11基因的第5外显子敲除,从而实现失活整个基因。首先从细菌人工染色体(BAC)RP23-307G3和RP23-276J12片段中扩增3段同源重组片段,三段同源重组片段为长臂、短臂及条件性敲除区,其中长臂(long homology arm,LA)的片段长度为4.93kb,包括第四外显子,为第5外显子的5’同源臂;短臂(the shorthomology arm,SA)的片段长度为2.85kb,为第5外显子的3’同源臂;条件性敲除区(theconditional knockout region,cKO)包括第5外显子。应用高忠实性Taq聚合酶PCR扩增后序贯插入质粒载体,构建得到重组质粒,扩增后经测序验证后备用,其构建流程如图1所示。将重组质粒线性化后转染胚胎干细胞(ES细胞),筛选同源重组的阳性ES克隆;最后利用显微注射技术将ES克隆注入C57BL/6小鼠囊胚,最终得到F1代PSMD11flox-neo/+小鼠,PSMD11flox -neo/+小鼠再与Flp小鼠交配去除Neo基因,得到的PSMD11lox/+小鼠与C57Bl/6野生型小鼠回交10代,获得具有>99.9%C57Bl/6遗传背景的PSMD11lox/+小鼠。
1.含有小鼠PSMD11基因的细菌人工染色体(BAC)的提取
使用Spin Miniprep Kit提取含有PSMD11基因的BAC RP23-307G3和RP23-276J12,具体步骤如下:
(1)将保种的含有PSMD11基因的BAC RP23-307G3和RP23-276J12的细菌(购自美国Children’s Hospital Oakland Research Institute)在含有氯霉素(25μg/mL)的LB固体培养基上划板,37℃培养箱中培养12h;挑取平板上的单克隆接种到含有氯霉素(25μg/mL)的LB液体培养基(5mL)的试管中,37℃摇床中200rpm振荡培养12-16h;
(2)将步骤(1)培养得到的菌液转入1.5mLEP管中,10000rpm离心1min,弃上清收集菌体;
(3)向步骤(2)收集的菌体中加入250μL Plasmid Mini Kit I(购自QIAGEN公司)的试剂P1,将其悬浮;再向管中加入250μL试剂P2轻轻翻转倒置3-5次;向管中加入350μL试剂P3,轻轻翻转倒置3-5次,10000rpm离心10min,轻轻吸取上清(尽量不要吸取蛋白);
(4)将步骤(3)吸取的上清转移入新的1.5mL EP管中,10000rpm离心4min,吸取上清;
(5)将步骤(4)吸取的上清转移入新的1.5mLEP管中,加入750μL异丙醇沉淀DNA,室温下静置10min,11000rpm离心10min,弃上清,收集DNA;
(6)向步骤(5)收集到的DNA中加入1.0mL体积分数为70%的乙醇清洗DNA,干燥后加入50μL Elution缓冲液溶解,即得含有小鼠PSMD11基因的细菌人工染色体(BAC)RP23-307G3和RP23-276J12,-20℃保存备用。
2.三段同源重组片段引物设计
根据实验设计方案,设计扩增三段同源重组片段(长臂,短臂及条件性敲除区)的引物,引物设计软件设计结果见表1,下划线表示相应的酶切位点。
表1.三段同源重组片段扩增引物设计
3.同源重组片段的PCR扩增
以上述步骤1中提取到的含有小鼠PSMD11基因的BAC为模版,使用高忠实性Taq聚合酶扩增三段同源重组片段(长臂,短臂及条件性敲除区)。
PCR反应体系(50μL,全式金,北京)如下:
PCR扩增反应条件:94℃预变性5min;94℃变性20s,60℃退火20s,72℃延伸3min,共30个循环;72℃保温10min。PCR扩增完成后,-20℃保存PCR产物备用。
4.PCR产物纯化
用PCR Purification Kit(全式金,北京)纯化上述步骤3得到的PCR产物(长臂,短臂及条件性敲除区),步骤如下:
(1)取50μL-100μL PCR产物,加入5倍体积的溶液BB,混匀后加入离心柱中(为提高纯化产率可以选择静置1分钟),10,000g离心l分钟,弃去流出液;
(2)加入650μL溶液WB,10,000g离心1分钟,弃去流出液;
(3)10,000g离心1-2分钟,彻底去除残留的WB;
(4)将离心柱置于一干净的离心管中,在离心柱的中央加入30μL-50μL溶液EB或去离子水,(为提高纯化产量,可选择60℃-70℃预热溶液EB或去离子水(pH>7.0))室温静置1分钟,10,000g离心1分钟,洗脱DNA,洗脱出的DNA于-20℃保存。
5.同源重组片段及相应载体质粒的酶切
将纯化后的三段同源重组片段(长臂,短臂及条件性敲除区)按表1所述酶切位点进行双酶切,质粒载体(赛业生物科技有限公司)也依次用对应的酶切位点进行双酶切;即采用一段同源重组片段的酶切位点对该同源重组片段和质粒载体进行双酶切后连接,连接成功后,采用下一段同源重组片段对应的酶切位点对该同源重组片段和连接成功的质粒载体进行双酶切和连接,以此类推,完成三段同源重组片段的序贯插入,序贯插入后的重组质粒载体图谱如图1中的打靶载体所示。
酶切反应条件:37℃水浴2h
酶切反应体系:50μL
10×缓冲液:含60mM Tris-HCL(pH7.9),1.5M NaCl,60mM MgCl2和10mM DTT。
6.凝胶电泳及回收纯化酶切产物
用Quick Gel Extraction Kit(全式金,北京)纯化双酶切产物(长臂,短臂及条件性敲除区和载体质粒),步骤如下:
(1)将上述步骤5得到的酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,电泳条件为120V,150mA,电泳时间为15min;
(2)切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带,放入干净的离心管中称重,如凝胶重100mg,可视为100μL,以此类推;
(3)加入凝胶3倍体积的GSB溶液,于55℃水浴融胶6-10分钟,间断(2-3分钟)混合,确保胶块完全融化,当胶块完全融化后,观察溶液的颜色,如颜色为紫色,加入适量3M醋酸钠溶液(pH5.2),调整颜色和GSB溶液颜色相同(黄色),为增加DNA回收率,可加入1倍体积异丙醇于已融化的凝胶溶液中,如凝胶重为100mg,加入100μL异丙醇,以此类推;
(4)待融化的凝胶溶液降至室温(高温时离心柱结合DNA能力弱),加入离心柱中静置l分钟,10,000g离心l分钟,弃流出液;
(5)加入650μL溶液WB(添加酒精),10,000g离心1分钟,弃流出液;
(6)10,000g离心1-2分钟,彻底去除残留的溶液WB;
(7)将离心柱置于一干净的离心管中,开盖静置1分钟,使残留乙醇挥发干净,在离心柱的中央加入30-50μL EB或去离子水(pH>7.0)(EB或去离子水在60-70℃水浴预热,使用效果更好),室温静置l分钟;
(8)10,000g离心l分钟,洗脱DNA,将洗脱出的DNA于-20℃保存,即得纯化的酶切产物。
7.目的片段与载体质粒连接
分别将长臂,短臂及条件性敲除区片段连入质粒载体。
连接体系(10μL):
10×缓冲液:含660mM Tris-HCl(pH7.6),66mM MgCl2和100mM DTT,1mM ATP。
16℃连接过夜。
8.转化感受态细胞
分别将连接后的产物转化DH5α感受态细胞(ThermoFisher):
(1)取50μLDH5α感受态细胞在冰上融化,加入5μL连接产物轻轻混匀,冰上放置30min;
(2)42℃热激45s,之后迅速转移至冰上静置2min,该过程不要晃动离心管;
(3)加入500μL无抗性LB液体培养基,37℃,200rpm振荡培养1h;
(4)5000rpm室温离心1min,弃上清并保留100μL上清液,重新悬浮沉淀,然后涂布于含有氨苄抗性(100μg/mL)的固体LB培养基平板上,37℃培养16-20h。
9.细菌培养和质粒提取
(1)挑取平板上的单菌落,加入5mL含氨苄抗性(100μg/mL)的液体LB培养基中,37℃,200rpm培养8-12h;
(2)质粒的提取,使用OMEGA公司E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I试剂盒提取质粒,取1mL培养好的菌液加入1.5mLEP管中,10000g离心1min,弃上清,收集菌体;
(3)向EP管中加入250μL Solution I涡旋悬浮沉淀,加入250μL Solution II,轻轻倒置3-5次,加入350μL Solution III轻轻倒置3-5次,13000g室温离心10min;
(4)轻轻吸取上清液(尽量不要吸入蛋白)加入HiBind Miniprep柱中,10000g室温离心1min;
(5)弃上清,加500μL缓冲液HB于HiBind Miniprep柱中,10000g室温离心1min;
(6)弃上清,加700μL DNA洗涤缓冲液于HiBind Miniprep柱中,10000g室温离心1min;
(7)弃上清,13000g再离心2min,将柱中的残液去除干净;
(8)将HiBind Miniprep柱置入一个新的1.5mL的EP管中,加入50μL洗脱缓冲液,静置2min,13000g离心1min,弃柱,即得重组质粒,所述重组载体的限制性内切酶图谱如图2所示,将含有重组质粒的EP管-20℃保存备用。
10.重组质粒验证
将提取的重组质粒分别应用ApaLI,DrdI,EcoRI,FspI,NotI限制性内切酶进行酶切,根据所产生的片段对重组质粒进行验证,验证结果如图3所示。验证成功的重组质粒即为PSMD11基因条件性敲除载体,保存备用。
酶切反应条件:37℃水浴2h
酶切反应体系:10μL
10×缓冲液:含60mM Tris-HCL(pH7.9),1.5M NaCl,60mM MgCl2和10mM DTT。
实施例2.小鼠PSMD11基因条件性敲除载体的转染和筛选
1.PSMD11基因条件性敲除载体质粒大提
(1)将实施例1保种的含有PSMD11基因条件性敲除载体的菌株DH5α接种在氨苄抗性(100μg/mL)和卡那抗性(100μg/mL)LB固体培养基平板上,37℃培养12h,挑取单菌落接种至10mLLB液体培养基中,37℃,200rpm振荡培养12-16h;
(2)取1mL菌液转接到500mL LB液体培养基中,37℃,200rpm振荡培养12-16h;
(3)6000g,4℃离心10min,弃上清收集菌体;
(4)使用QIAGEN大提试剂盒进行提取,向收集的菌体中加入4mL试剂P1,将细菌悬浮;
(5)再加入4mL试剂P2,轻轻翻转倒置4-6次,室温放置5min;向管中加入4mL预冷试剂P3,轻轻翻转倒置4-6次;
(6)将溶解物倒入QIAfilter Cartridge中,室温放置10min;
(7)将10mLQBT加入QIA-tip100中,液体通过重力作用流出;
(8)将QIAfilter Cartridge的顶帽旋下,小心将活塞插入QIAfilter Cartridge中,过滤出的液体流至平衡好的QIA-tip中,QIA-tip液体通过重力作用流出;
(9)向QIA-tip中加入30mLQC缓冲液清洗两次;加入15mLQF洗脱缓冲液;
(10)向洗脱出的液体中加入10.5mL异丙醇混匀沉淀DNA,4℃,≥15000g,离心30min,小心弃掉上清;
(11)加入5.0mL体积分数为70%的常温乙醇清洗DNA沉淀,≥15000g离心10min,小心弃掉上清;空气干燥5-10min,用适量TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,得PSMD11基因条件性敲除载体,测定浓度,于-20℃保存备用。
2.PSMD11基因条件性敲除载体线性化
PSMD11基因条件性敲除载体用NotI单酶切线性化,酶切产物再进行纯化,步骤如下:
酶切反应条件:37℃水浴酶切1h
酶切反应体系:800μL
10×缓冲液:含60mM Tris-HCl(pH7.9),1.5M NaCl,60mM MgCl2和10mM DTT。
(1)取800μL上述酶切产物,加入5倍体积的溶液BB(PCR PurificationKit,北京全式金生物技术有限公司),混匀后加入离心柱中(为提高纯化产量可以选择静置1分钟),10,000g离心l分钟,弃去流出液;
(2)加入650μL溶液WB,10,000g离心1分钟,弃去流出液;
(3)10,000g离心1-2分钟,彻底去除残留的WB;
(4)将离心柱置于一干净的离心管中,在离心柱的中央加入30μL-50μL溶液EB或去离子水(为提高纯化产量,可选择60℃-70℃预热溶液EB或去离子水(pH>7.0)),室温静置1分钟,10,000g离心1分钟,洗脱DNA,洗脱出的DNA于-20℃保存,即得线性化的PSMD11基因条件性敲除载体。
3.将线性化的PSMD11基因条件性敲除载体电转化胚胎干细胞(ES细胞)
(1)37℃水浴快速溶解1管ES细胞(赛业生物科技有限公司,来源于C57BL/6小鼠),分散到铺有饲养层细胞的细胞培养板上,37℃培养,每天更换新鲜培养基;
(2)当细胞铺满70-80%时,更换培养基,至少2h后,用5mLESQ PBS洗两次,加入1.5mL胰蛋白酶(ESQ Trypsin),37℃培养15min;
(3)加入ES细胞培养基重悬细胞形成单细胞悬液,ES细胞转至无菌10mL离心管中,1000rpm离心5min,吸弃上清,加4mLES细胞培养基重悬细胞;
(4)吸取1mL细胞悬液至100mm饲养层细胞培养板上,37℃培养,ES细胞传代48h后用5mL ESQ PBS冲洗培养板2次,每板加入1.5mL ESQ Trypsin,37℃培养20min;
(6)消化后,加入1.5mL ES细胞培养基重悬细胞,单细胞悬液转入15mL离心管中,轻轻吹打制作均一细胞悬液;
(7)1000rpm,离心7min收集细胞,加入ESQ PBS重悬细胞使细胞密度达到11×106个/mL;
(8)将15-20μg线性化的PSMD11基因条件性敲除载体和0.9mL步骤(7)制备的ES细胞悬液加入电转杯中,轻轻吸打混匀,电击(230V,500μF(电场强度575V/cm),时间5.8-7.0ms)后,迅速将电转杯放于冰上;
(9)将电转后的细胞加入15mL离心管中,用1mL ES细胞培养基冲洗,补至8mL,轻轻吸打混匀,将细胞悬液加入培养板中,十字型晃板使细胞均匀分布,37℃至少培养24h选择重组体。
4.阳性细胞克隆筛选,PCR及Southernblot鉴定
(1)电转后24-36h内,弃去培养基,加入10mL新鲜ES细胞培养基,同时加入20-30μL的ESQ G418(终浓度为200mg/mL);
(2)前4d每天更换选择培养基(ESQ G418终浓度为200mg/mL的ES细胞培养基),之后隔天更换一次,10-11d后可清晰的看到细胞克隆,直径大约500μm;
(3)将筛选出的未分化ES细胞克隆挑取至96孔板中,用ESQ Trypsin充分消化,部分细胞冻存,部分细胞粗提基因组DNA用PCR及Southernblot进行鉴定。
根据图1所示的区域1(Region 1)和区域2(Region 2)设计引物,并进行PCR验证,区域1(Region 1)和区域2(Region 2)的引物序列如表2所示。
表2.PCR筛选引物设计
注:WT为野生型片段长度,MT为突变型片段长度。
PCR反应体系(50μL,全式金,北京)如下:
PCR扩增反应条件:94℃预变性5min;94℃变性20s,60℃退火20s,72℃延伸3min,共30个循环;72℃保温10min。PCR扩增完成后,-20℃保存PCR产物备用。
PCR验证结果如图4所示,区域1(Region 1)的扩增长度为6kb,区域2(Region 2)的扩增长度野生型为240bp,突变型为310bp,据此挑选1B11,1D5和2H7三株细胞进一步用Southernblot技术进行鉴定。
Southernblot分析鉴定重组成功的小鼠胚胎干细胞:
(1)PCR分析后,挑选3个潜在的重组成功的克隆1B11,1D5和2H7扩增后,提取基因组DNA;
(2)基因组DNA用内切酶Nde I和Hind III分别进行酶切;
(3)酶切产物用0.4%琼脂糖凝胶电泳分离;
(4)电泳结束后,将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性,室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶;
0.25MHCl 10-15min,
蒸馏水摇洗5min,
变性液(1.5M NaCl)40min,
蒸馏水摇洗5min,
中和液[1M Tris-HCl,(pH8.0),1.5M NaCl]15min,2次;
(5)在转印迹槽中,倒入20×SSC溶液(NaCl 3M,柠檬酸钠0.3M,pH7.0),槽中置一固相支持物,在固相支持物上从下向上依次置入:两张与凝胶等宽的滤纸,将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中(简称“桥”),底面在上的凝胶,滤膜(与凝胶等大),滤纸(与凝胶等大),吸水纸(略小于滤纸,5-8cm高),400-800g重物。凝胶四周用封口膜包围防止短路;滤膜事先用2×SSC溶液浸湿至少5min,滤纸事先用20×SSC溶液浸湿;转膜4-18小时;
(6)转膜结束后,取出滤膜,边角剪一小角做标记,滤膜于2×SSC溶液摇洗5min,用滤纸吸干;
(7)用紫外交联照射(正面朝上)或于80℃烤箱烘烤0.5-2小时;
(8)预杂交和杂交
1)将杂交膜浸湿于6×SSC溶液2min,同时预热预杂交液(6×SSC,5×Denhardt’s试剂,0.5%SDS,50%(v/v)甲酰胺,ddH2O,100μg/mL鲑鱼精DNA变性后加入)和杂交炉至预杂交温度;
2)杂交膜封于杂交袋,按0.2mL/cm2膜面积加入预杂交液,预杂交至少1小时;
3)弃去预杂交液,将含地高辛标记的靶向Neo cassette的DNA探针的杂交液注入杂交袋,置入杂交炉滚动;
(9)杂交后的洗膜处理过程,顺序如下:
2×SSC(0.5%SDS),15min/次,2次,
0.5×SSC(0.1%SDS),15min/次,2次,
1×SSC(0.1%SDS),3min/次,1次,
1×封阻液(1%BSA,1xTBS,0.001%NP-40,pH with 7.4),60min/次,1次,
抗体液*,30min/次,1次,
1×SSC(0.1%SDS),15min/次,2次,
1×检测液(1×TBS,0.1%Tween 20,pH with 7.4),5min/次,2次,
*抗-地高辛-碱性磷酸酶用1×封阻液稀释10,000倍;
(10)将膜浸于CSPD液(CSPD液用1×检测液稀释100倍,)室温避光静置5min;回收剩余的CSPD液避光保存于4℃可反复应用3-5次;
(11)将膜上残液吸净,用保鲜膜封好于37℃反应15min,然后将膜固定于压片夹,进行曝光。
Southernblot分析鉴定结果如图5所示,显色可见10.1kb和8.3kb两条杂交带,C57Bl/6(B6)鼠系DNA作为野生型对照(WT),证明1B11,1D5和2H7三株细胞均重组成功。
实施例3.利用显微注射技术制作可用于条件性基因敲除的floxed小鼠
将重组成功的胚胎干细胞注射C57BL/6小鼠囊胚,最终得到F1代PSMD11flox-neo/+小鼠,PSMD11flox-neo/+小鼠再与全身性表达Flp的小鼠(赛业生物科技有限公司)交配去除Neo基因,得到的PSMD11lox/+小鼠与C57Bl/6野生型小鼠(济南鹏悦动物繁育有限公司)回交10代,获得具有>99.9%C57Bl/6遗传背景的PSMD11lox/+小鼠。将具有>99.9%C57Bl/6遗传背景的PSMD11lox/+小鼠剪尾提DNA,用实施例2中步骤4所述PCR扩增筛选出阳性小鼠,即为PSMD11基因条件性敲除的floxed小鼠,筛选验证结果如图6所示。
鼠尾DNA提取步骤如下(上海生工):
(1)取米粒大小(约5mg)动物组织加入到1.5mL离心管中。加入100μLQlysis-GReagent和10μL Proteinase K,震荡混匀,65℃水浴5min;
(2)95℃水浴3min;
(3)水浴后向离心管中加入100μL Buffer NST,震荡混匀;
(4)12,000rpm室温离心5min;
(5)取上清液作为模板直接用于PCR检测。
实施例4.PSMD11基因杂合敲除小鼠的获得及表型鉴定
将实施例3制备到的具有>99.9%C57Bl/6遗传背景的PSMD11lox/+小鼠与全身性表达Cre酶的B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn小鼠(集萃药康,南京)交配获得PSMD11+/-杂合敲除小鼠,按照实施例3所述的方法提取鼠尾DNA,并设计表3所示的PCR验证引物,其扩增序列如图1所示。
表3.PCR验证引物:
注:WT为野生型片段长度,MT为突变型片段长度。
PCR反应体系(50μL)如下:
PCR扩增反应条件:94℃预变性2min;94℃变性30s,60℃退火30s,68℃延伸1min,共40个循环。
PCR验证结果如图7所示,其中WT(240bp)和PSMD11Δ(643bp)均为阳性的小鼠即为PSMD11基因敲除杂合小鼠。
Claims (7)
1.一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,所述小鼠模型为PSMD11基因杂合敲除的小鼠,其特征在于,包括步骤如下:
构建PSMD11基因条件性敲除的重组载体;线性化上述重组载体并转染胚胎干细胞;筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆;将上述筛选出的胚胎干细胞克隆显微注入C57BL/6供体小鼠的囊胚;将含有胚胎干细胞克隆的囊胚移植到假孕小鼠的子宫,生产出嵌合体小鼠;将上述嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠回交生出杂合子小鼠;将上述杂合子小鼠与全身性表达Cre酶的小鼠交配,获得PSMD11基因条件性敲除小鼠模型。
2.如权利要求1所述的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,所述PSMD11基因条件性敲除的重组载体的构建方法,步骤如下:
(1)提取含有PSMD11基因的细菌人工染色体;
(2)以步骤(1)提取到的细菌人工染色体为模板,PCR扩增三段同源重组前段,分别为长臂、短臂、及条件性敲除区,PCR的引物序列分别为:
长臂的PCR引物为LA-F:5’-GGACTAGTCAATGGCTCACCACTGTCAG-3’和LA-R:5’-CGGGATCCGAGGAGAGGGAAGAGGGAGG-3’,
短臂的PCR引物为SA-F:5’-ACGCGTCGACAGGAACGTGAGTTACAGACG-3’和SA-R:5’-GGAATTCCAGGAGAGCTACACAGAGAAA-3’,
条件性敲除区的PCR引物为cKO-F:5’-CGGGATCCTCTCGCAACATTGTCTTATTC-3’和cKO-R:5’-GCTCTAGAGAGTATCCAACACCCTCACA-3’,
其中,下划线为引入的酶切位点;
(3)将步骤(2)扩增得到的三段同源重组片段序贯插入质粒载体中,即得PSMD11基因条件性敲除的重组载体。
3.如权利要求2所述的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,步骤(1)中所述细菌人工染色体为RP23-307G3和RP23-276J12。
4.如权利要求2所述的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为:细菌人工染色体模板2μL,TaqDNA聚合酶25μL,上游引物(10μM)1μL,下游引物(10μM)1μL,ddH2O21μL,共50μL;
PCR扩增的反应条件:94℃预变性5min;94℃变性20s,60℃退火20s,72℃延伸3min,共30个循环;72℃保温10min。
5.如权利要求2所述的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,步骤(3)中所述序贯插入质粒载体的方法为:采用一段同源重组片段的酶切位点对同源重组片段和质粒载体分别进行双酶切后连接,连接成功后,采用下一段同源重组片段对应的酶切位点对该同源重组片段和链接成功后的质粒载体分别进行双酶切和连接,以此类推,完成三段同源重组片段的序贯插入。
6.如权利要求1所述的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,所述的胚胎干细胞为C57BL/6来源的胚胎干细胞。
7.按照权利1所述的构建方法构建得到的PSMD11基因条件性敲除小鼠模型作为PSMD11基因功能研究的模型鼠的用途。
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