CN114015719A - 一种fars2基因敲除或敲低的非人动物模型及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种FARS2基因敲除或敲低的非人动物及非人动物模型、一种FARS2相关疾病治疗药物筛选模型及其构建方法和在生物医药领域的应用。本发明构建的FARS2基因敲除或敲低非人动物或FARS2相关疾病非人动物模型可以应用于识别FARS2疾病的潜在病理机制，进而在筛选、验证、评价或制备FARS2突变抑制剂以及FARS2相关疾病的药物筛选与制备方面发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明属于生物模型技术领域，具体地说，涉及一种FARS2基因敲除或敲低的非人动物模型及其构建方法和应用。
背景技术
氨酰tRNA合成酶(ARSs)是一个酶家族，催化氨基酸与其同源的tRNA连接以保持翻译保真度。人类基因组编码的ARS基因有37个，其中17个位于细胞质，17个作用于线粒体，3个同时存在于细胞质和线粒体。除了它们在tRNA充电中的典型作用外，这些酶在细胞内也具有非常规功能，如转录和翻译调节、信号转导、炎症、血管生成和肿瘤发生。自从在Charcot-Marie-Tooth(CMT)病患者中首次发现glycyl-tRNA合成酶(GARS) 变异以来，许多ARS基因座的致病性变体已经被报道。在这些变异中，线粒体ARS编码基因(ARS2)的突变与多种线粒体疾病有关，并导致具有高代谢需求的组织的表型，包括中枢神经系统。尽管这些ARS2基因普遍表达，但某些ARS2突变导致组织特异性表型。这些与各种ARS2突变相关的人类疾病的表型和组织类型变异表明个体ARS2和疾病变体的功能多样性。由于这些酶在不同物种间高度保守，对它们在不同模式生物中的功能的研究已经对这些基因的生理作用以及相关疾病的病理机制产生了重要的见解。
FARS2(phenylalanyl-tRNA synthetase2)可以编码一种线粒体苯丙氨酸-tRNA合成酶 (mtPheRS)，其功能是将苯丙氨酸连接到线粒体tRNAPhe。FARS2属于Ⅱ类氨基酰tRNA合成酶家族，由一个N端线粒体定位信号、一个催化结构域、一个连接区和一个C端反密码子结合域组成。2012年，有报道FARS2基因突变可导致伴有乳酸酸中毒的致命婴儿癫痫性脑病。到目前为止，已经发现25个家庭中的37个个体携带FARS2突变，FARS2 基因不同的点突变会引起不同的表型，因此，FARS2突变的分子机制、致病机理和治疗手段的研究具有重要的临床意义。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。非专利文献“利用CRISPR/Cas9技术构建FARS2基因定点突变的大鼠模型”公开了一种FARS2定点突变的大鼠模型(神经解剖学杂志,2018, 34(06):93-97.)，然而大鼠较长生命周期(需要养殖约40天才能作为实验模型)和高成本等缺点阻碍了模型在线粒体疾病研究中的广泛应用，而且其他FARS2相关动物模型在人类癫痫性脑病、发育迟缓和痉挛性截瘫疾病中的应用研究至今仍未被报道。
果蝇生长繁殖迅速，培养成本低，可作为高通量筛选的实验模型。此外，果蝇和人类的遗传物质还具有同源性(基因组序列同源性高达60％，人体75％的已知致病基因与果蝇的相似，CN111621521A)，并且已有多个果蝇模型助力了帕金森病、登革热、氨基酸代谢异常、轴突型腓骨肌萎缩症等重大疾病的防治研究(CN111424053A、 WO2020187104A1、CN110495426A、CN109880806A)。尽管果蝇可为研究人类基因和疾病变体的功能提供强大的模型系统，但FARS2基因突变导致的果蝇幼体致死性的问题目前为止仍然没有被解决。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一个FARS2基因敲除或敲低的非人动物及其模型、构建方法和应用，此模型对于探究FARS2相关疾病的潜在病理机制以及治疗药物的开发具有重要意义。进一步此模型可以用来研究果蝇苯丙氨酸 -tRNA合成酶同源物dFARS2的功能及其在人类相关的FARS2疾病中的应用。除此之外， FARS2基因敲除及敲低模型还可以清晰揭示线粒体氨基酰化系统功能紊乱与病理的关系，对于FARS2相关疾病的潜在病理机制、筛选FARS2突变抑制因子以及具有治疗FARS2 疾病的药物具有重要意义。
本发明的第一方面，提供了一种FARS2基因敲除非人动物的构建方法，所述的构建方法包括敲除FARS2基因的1号外显子；优选的，所述的非人动物为昆虫；进一步优选的，所述的昆虫为双翅目昆虫；更优选的，所述的双翅目昆虫为果蝇。
优选的，所述的构建方法包括删除FARS2基因1号外显子上的第264位核苷酸，并在删除位置引入随机插入片段。
优选的，随机插入片段为GGGGCAAGGGG。
优选的，所述的非人动物苯丙氨酰-tRNA合成酶表达降低或缺失。
优选的，所述FARS2基因敲除非人动物的线粒体tRNAPhe氨基酰化水平降低。
优选的，所述FARS2基因敲除非人动物的线粒体氧化磷酸化复合物包括复合物I，复合物II，复合物III，复合物IV，复合物V。
优选的，所述FARS2基因敲除非人动物的线粒体氧化磷酸化复合物I亚基，复合物III亚基，复合物IV亚基，复合物V亚基稳态水平降低，所述FARS2基因敲除非人动物的线粒体氧化磷酸化复合物I，复合物III，复合物IV，复合物V含量降低。
优选的，所述FARS2基因敲除非人动物的氧化磷酸化复合物活性降低，所述FARS2基因敲除非人动物线粒体氧化磷酸化复合物I，复合物III，复合物IV，复合物V活性降低。
优选的，所述FARS2基因敲除非人动物具有幼体致死性。
优选的，所述构建方法使用基因编辑技术进行非人动物的构建。
优选的，所述构建方法的基因编辑技术至少是胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他基因编辑技术中的一种。
优选的，所述构建方法使用sgRNA进行FARS2基因敲除非人动物的构建。
优选的，所述的sgRNA靶向非人动物的FARS2基因。
优选的，所述的sgRNA的靶位点位于FARS2基因的1号外显子序列上。
优选的，所述的sgRNA序列如SEQ ID NO：1所示。在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将靶向FARS2基因的sgRNA显微注射至胚胎中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得FARS2基因敲除的非人动物。
优选的，所述构建方法的具体步骤为：
(1)得到sgRNA：提供针对FARS2基因的guide RNA序列，然后通过PCR扩增，用正向引物和反向引物合成用于sgRNA转录的DNA模板，用DNA模板转录sgRNA，然后纯化；
(2)将步骤(1)得到的sgRNA转至胚胎中，然后将胚胎生长产生的成年非人动物杂交，获得稳定的FARS2基因敲除非人动物，
(3)步骤(2)获得后代后，提取步骤(2)中亲本DNA，进行PCR扩增，对PCR 产物进行测序以评估靶区域中的突变，筛选出FARS2基因敲除非人动物。
进一步优选的，步骤(2)中进行胚胎显微注射时，sgRNA浓度为20ng/μL-60ng/μL。
本发明的第二方面，提供了一种上述的构建方法获得的FARS2基因敲除非人动物或其子代。
本发明的第三方面，提供了一种FARS2基因敲低非人动物，其特征在于，通过RNAi介导技术获得；
优选的，所述的非人动物为昆虫；进一步优选的，所述的昆虫为双翅目昆虫；更优选的，所述的双翅目昆虫为果蝇。
优选的，所述FARS2基因敲低非人动物通过GAL4/UAS系统进行构建；进一步，优选的，通过将UAS品系非人动物与Gal4品系非人动物杂交，用Gal4驱动UAS品系非人动物转基因表达，使得RNAi介导的表达抑制得以进行。
优选的，所述FARS2基因敲低非人动物的苯丙氨酰-tRNA合成酶表达降低或缺失。
优选的，所述FARS2基因敲低非人动物的线粒体tRNAPhe氨基酰化受损。
优选的，所述FARS2基因敲低非人动物的氧化磷酸化复合物受损。
优选的，所述FARS2基因敲低非人动物的线粒体氧化磷酸化复合物包括复合物I，复合物II，复合物III，复合物IV，复合物V。
优选的，所述FARS2基因敲低非人动物的线粒体氧化磷酸化复合物I亚基，复合物III亚基，复合物IV亚基，复合物V亚基稳态水平降低，更优选的，所述FARS2基因敲低非人动物的线粒体氧化磷酸化复合物I，复合物III，复合物IV，复合物V含量降低。
优选的，所述FARS2基因敲低非人动物的氧化磷酸化复合物活性降低。
优选的，所述FARS2基因敲低非人动物的线粒体氧化磷酸化复合物I，复合物III，复合物IV，复合物V活性降低；
优选的，所述FARS2基因敲低非人动物中的FARS2突变体(即FARS2基因敲低非人动物)和FARS2全身敲低非人动物幼体的早期致死性阻止了表型的详细表征；进一步，优选的，所述的FARS2基因敲低非人动物为组织特异性敲低非人动物。
优选的，所述FARS2基因敲低非人动物的构建方法还包括挽救实验；进一步，优选的，所述的挽救实验为在非人动物中导入FARS2基因座的2.3kb基因组DNA。
优选的，所述的非人动物可以选自线虫、酿酒酵母、果蝇、蟾蜍、斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猪、猴等任何可以进行基因编辑的非人动物。
本发明的第四方面，提供了一种上述的构建方法获得的FARS2基因敲低非人动物或其子代。
本发明的第五方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物FARS2基因；优选的，所述sgRNA的序列在待改变的FARS2基因上的靶序列上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于FARS2基因的1号外显子序列上。
优选的，所述的sgRNA序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述sgRNA通过DNA模板体外转录得到；
优选的，所述的合成DNA模板核苷酸序列如SEQ ID NO：2和3所示。
优选的，所述的非人动物可以选自线虫、酿酒酵母、果蝇、蟾蜍、斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猪、猴等任何可以进行基因编辑的非人动物。
优选的，所述的非人动物为昆虫；进一步，优选的，所述的昆虫为双翅目昆虫；更优选的，所述的双翅目昆虫为果蝇。
本发明的第六方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。
优选的，所述的DNA分子双链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和3所示。
本发明的第七方面，提供了一种增加线粒体DNA水平、减低线粒体氧化磷酸化复合物I、复合物III、复合物IV、复合物V含量及活性或降低线粒体tRNAPhe氨基酰化水平的方法。
优选的，所述的方法包含敲除FARS2基因的1号外显子和/或敲低FARS2基因中的至少一种。
本发明的第八方面，提供了一种非人动物模型的构建方法，所述的构建方法包括上述述FARS2基因敲除非人动物的构建方法或RNAi介导中的至少一种。
优选的，所述的非人动物选自线虫、酿酒酵母、果蝇、蟾蜍、斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猪、猴等任何可以进行基因编辑的非人动物其中的至少一种。
本发明的第九方面，提供了一种非人动物模型，所述非人动物模型的按照本发明的第七方面所述的构建方法获得。
本发明的第十方面，提供了一种增加线粒体DNA水平、减低线粒体氧化磷酸化复合物I、复合物III、复合物IV、复合物V含量及活性或降低线粒体tRNAPhe氨基酰化水平的方法，优选的，所述的方法包括敲除或敲低FARS2基因。
本发明的第十一方面，提供了一种使用上述方法获得的非人动物模型在生物学中用途，所述生物学用途选自筛选FARS2突变抑制剂、制备FARS2突变抑制剂、验证 FARS2突变抑制剂、评价FARS2突变抑制剂、筛选FARS2相关疾病治疗药物、制备FARS2相关疾病治疗药物、验证FARS2相关疾病治疗药物、评价FARS2相关疾病治疗药物的至少一种。
优选的，所述的FARS2相关疾病选自癫痫性脑病、发育迟缓、痉挛性截瘫的至少一种。
本发明的第十二方面提供了一种FARS2相关疾病治疗药物筛选模型，所述药物筛选模型包含上述非人动物的构建方法、非人动物的构建方法获得的非人动物、非人动物模型中的至少一种。
优选地，所述药物筛选模型采用FARS2相关疾病治疗药物进行处理；
优选的，所述FARS2相关疾病治疗药物选自治疗癫痫性脑病、发育迟缓或痉挛性截瘫药物中的至少一种。
本发明的第十三方面提供了一种FARS2相关疾病治疗药物筛选模型的构建方法，所述构建方法包含上述非人动物的构建方法、非人动物模型构建方法中的至少一种。
优选的，所述FARS2相关疾病治疗药物选自治疗癫痫性脑病、发育迟缓或痉挛性截瘫药物中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一些实例中，提供了一种FARS2基因敲除非人动物的构建方法。
本发明的一些实例中，解决了FARS2基因突变给果蝇带来的幼体致死性的问题，首次构建了FARS2基因敲除及敲低的果蝇模型。
本发明的一些实例中，FARS2基因敲除及敲低非人动物模型可应用于对FARS2相关疾病的潜在病理机制的研究、筛选FARS2突变抑制因子以及具有治疗FARS2相关疾病的药物。
本发明所述的复合物指的是位于线粒体内膜上的五种超大蛋白复合物，分别为复合物 I(NADH脱氢酶)、复合物II(琥珀酸脱氢酶)、复合物III(细胞色素c还原酶)、复合物IV(细胞色素c氧化酶)和复合物V(ATP合酶)。
本发明所述的“非人动物”，不特别限定，可以是线虫、酿酒酵母、果蝇、蟾蜍、斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猪、猴等任何可以进行基因编辑的非人动物；优选为昆虫，进一步优选为果蝇。
本发明所述的果蝇是指昆虫纲(Isecta)双翅目(Diptera)果蝇科(Drosophilidae) 的昆虫。
本发明所述的术语dFARS2是指果蝇FARS2。
本发明所述的术语tRNAPhe，tRNALys，tRNAThr，tRNALeu(CUN)是指携带不同氨基酸的tRNA,如tRNAPhe为转运苯丙氨酸的tRNA。以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：CRISPR/Cas9系统编辑果蝇FARS2(dFARS2)的基因组示意图。
(A)dFARS2基因座的示意图以及靶向sgRNA的相对位置。白框表示编码外显子，黑框表示非编码外显子，箭头表示转录起始位点。GGAGCGTATCGCAACCAA为CRISPR target序列，PAM序列为AGG；(B)野生型(w1118)和dFARS2M1突变体的sgRNA靶向区域的Sanger测序示意图；(C)野生型dFARS2蛋白和截短的dFARS2蛋白的示意图，“-”表示删除，插入序列为GGGGCAAGGGG；(D)dFARS2基因座上的sgRNA靶向区域的 PCR分析；(E)dFARS2M1突变幼虫比野生型(w1118)和突变体(dFARS2M1)第二龄幼虫的dFARS2表达的Western blot分析结果小，可以在挽救动物中恢复；(F)产卵5天后的野生型(w1118)，突变型(dFARS2M1)和挽救后的幼虫的图像。
图2:dFARS2对于线粒体tRNAPhe氨酰化影响趋势图。
(A)对照(w1118)和dFARS2突变体(dFARS2M1)第二龄幼虫中线粒体tRNAPhe氨酰化水平的Northernblot分析。其中，线粒体tRNALys和tRNAThr用作对照，上方条带代表氨酰化的tRNA，下方条带代表未氨酰化的tRNA。AC表示酸性条件，OH表示使tRNA脱酰基的基本条件；(B)A中Northern印迹分析的定量，其中**代表p＜0.001，NS表示不显著；(C)对照(Da>w1118)和dFARS2敲低(Da>dFARS2-RNAi1)幼虫中线粒体tRNAPhe氨基酰化水平的Northern印迹分析；(D)C中Northern印迹分析的定量，其中**代表p ＜0.001，NS表示不显著。
图3:dFARS2缺失或敲低对线粒体tRNA水平的影响趋势图。
(A)对照(w1118)和dFARS2突变体(dFARS2M1)第二龄幼虫在变性条件下线粒体tRNA水平的Northern blot分析；(B)A中Northern印迹分析的定量结果；(C)对照(Da>w1118) 和dFARS2敲低(Da>dFARS2-RNAi1)第二龄幼虫在变性条件下线粒体tRNA水平的 Northernblot分析；(D)C中Northern印迹分析的定量结果，其中，*表示P<0.05,**表示P<0.001,***表示P<0.0001，NS表示不显著。
图4：dFARS2缺失或敲低后对线粒体呼吸链复合物的影响趋势图。
(A)具有指定基因型的幼虫蛋白质提取物的Western blot分析,左图展示对照(w1118)和 dFARS2突变体(dFARS2M1)幼虫，右图展示对照(Da>w1118)和dFARS2敲低 (Da>dFARS2-RNAi1)幼虫；(B)BN-PAGE分析从带有所示的基因型的幼虫的线粒体蛋白提取物中的线虫呼吸链复合物,左图显示对照(w1118)和dFARS2突变体(dFARS2M1) 幼虫，右图显示对照(Da>w1118)和dFARS2敲低(Da>dFARS2-RNAi1)幼虫；(C)BN-PAGE 后进行的线粒体蛋白质的Western blot分析。
图5:呼吸链复合物的酶活性水平图。
(A-B)分离自具有所示基因型的幼虫的线粒体中呼吸链复合体I，II，III，IV和V的相对酶活性，其中A为对照(w1118)和dFARS2突变体(dFARS2M1)幼虫，B为对照(Da> w1118)和dFARS2敲低(Da>dFARS2-RNAi1)幼虫，*表示p<0.05，**表示p<0.01，*** 表示p<0.001，****表示p<0.0001，NS表示不显著。
图6:dFARS2敲低成年果蝇不同行为影响水平图。
(A)第20天破蛹后的对照(elav>w1118)和dFARS2敲低(elav>dFARS2-RNAi1)果蝇的百分比，n＝4；(B)对照(elav>w1118)和dFARS2敲低(elav>dFARS2-RNAi1)幼虫的成蛹曲线图，n＝3；(C)对照(elav>w1118)和dFARS2敲低(elav>dFARS2RNAi1)的蛹的破蛹曲线图，n＝4；(D)BS撞击敏感行为测定；(E)具有BS麻痹表型(％BS撞击敏感麻痹)的果蝇的对照(elav＞w1118)和dFARS2敲低(elav＞dFARS2-RNAi1)百分比，n＝4；(F)对照(elav>w1118)和dFARS2敲低(elav>dFARS2-RNAi1)在BS麻痹后恢复的时间,n＝20,****表示p<0.0001，***表示p<0.001。
图7:dFARS2敲低果蝇大脑中线粒体形态异常图。
(A-B’)透射电子显微镜图像显示了对照组(elav>w1118)和dFARS2敲低 (elav>dFARS2-RNAi1)果蝇的大脑组织的非结构化，放大倍数较高的图像显示在底部(A 和B)，比例尺代表0.2μm(顶部)和0.1μm(底部)；(C)显示在对照(elav>w1118)和dFARS2敲低(elav>dFARS2-RNAi1)果蝇脑中形态异常的线粒体百分比,n＝4,***代表p ＜0.001。
图8：dFARS2突变体中人FARS2变体的功能分析图。
(A)野生型人FARS2蛋白的示意图(451个氨基酸)；(B)具有指定基因型的成年果蝇，比例尺为1毫米；(C)野生型FARS2和在dFARS2M1突变体背景中携带p.G309S突变的 FARS2过表达后，存活果蝇相对于理论值的百分比，n＝4；(D)Da>w1118, dFARS2M1；Da>FARS2 anddFARS2M1；Da>FARS2G309S第三龄幼虫的线粒体tRNAPhe氨酰化水平；(E)对D中Northern blot分析的定量；(F)携带野生型FARS2或FARS2 p.G309S 突变带有BS麻痹表型的对照和dFARS2M1突变果蝇的百分比,n＝4；(G)在BS麻痹后的 Da>w1118(n＝9),dFARS2M1；Da>FARS2(n＝9)and dFARS2M1；Da>FARS2G309S(n＝19)成年果蝇的恢复时间的图，*表示p＜0.05，NS表示不显著。
图9：不同物种的FARS2的多序列比对图。从上到下的序列：a.人，NP_006558.1；b.小鼠，NP_077236.1；c.斑马鱼，NP_001099064.1；d.果蝇，NP_477283.1；e.酿酒酵母， NP_015372.2，(*)表示相同的氨基酸残基，(:)表示高度保守的氨基酸残基，在Gonnet PAM 250矩阵中得分>0.5；(.)表示保守性较弱的氨基酸残基，在Gonnet PAM 250矩阵中得分≤0.5。
图10：dFARS2敲低导致幼虫致死性示意图。
(A)在AEL第5天时对照(Da>w1118)和dFARS2敲低(Da>dFARS2-RNAi1和 Da>dFARS2-RNAi2)幼虫的图像，比例尺为1毫米；(B)对照(Da>w1118)和dFARS2 敲低(Da>dFARS2-RNAi1和Da>dFARS2-RNAi2)幼虫中相对dFARS2 mRNA水平的图， dFARS2 mRNA的水平标准化为Rp49的水平，n＝3,***表示P<0.001，****表示P<0.0001； (C)Da>w1118，Da>dFARS2-RNAi1和Da>dFARS2-RNAi2第二龄幼虫的dFARS2表达的 Western blot分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
UAS-dFARS2RNAi1来源Bloomington Drosophila Stock Center编号BDSC64869；
UAS-dFARS2RNAi2来源Vienna Drosophila Resource Center编号VDRC107079；
y1M{vas-int.Dm}ZH-2A w*；M{3xP3-RFP.attP}ZH-86Fb来源BloomingtonDrosophila Stock Center编号BDSC24749；
y1M{vas-Cas9}ZH-2A w1118/FM7c来源Bloomington Drosophila Stock Center编号 BDSC51323；
抗dFARS2抗体购自GenScript，规格1:1000；
goat anti-rabbit IgG购自GenScript，货号A00098；
PhosSTOPTM磷酸酶抑制剂购自Roche，货号4906845001；
cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物购自Roche，货号4693132001；
抗NDUFS3购自Abcam，货号ab14711，规格1:1000；
抗UQCRFS1购自Abcam，货号ab14746，规格1:1000；
抗CO3购自Abcam，货号ab110259，规格1:1000；
抗NDUFS1购自Abcam，货号12444-1-AP，规格1:1000；
抗ATP5A购自Abcam，货号ab14748，规格1:1000；
anti-SDHA购自Abcam，货号ab209986，规格1:1000；
Goat anti-mouse IgG购自GenScript，货号A00160；
实施例1、dFARS2敲除果蝇及dFARS2敲低果蝇的制备
为了获得dFARS2敲除果蝇，首先通过CRISPR-Cas9系统生成果蝇dFARS2突变等位基因。通过CRISPR指导RNA分析工具(http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/) 设计针对dFARS2基因的gRNA序列(SEQ ID NO：1)，dFARS2基因座的示意图以及靶向sgRNA的相对位置如图1A所示。根据制造商的协议，通过PCR扩增，使用正向引物(TAATACGACTCACTATAGGAGGAGCGTATCGCAACCAAGTTTTAGAGCTAGAAATA GC)(SEQ ID NO：2)和反向引物 (AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTCACTATTCACTATTCCTATTATTC)(SEQ ID NO：3)合成用于单链引导RNA(sgRNA) 转录的DNA模板，然后使用体外转录T7试剂盒利用DNA模板转录sgRNA，并用
Mini试剂盒纯化。将获得的sgRNA显微注射到BDSC51323胚胎中，经发育后获得成年果蝇并将新产生的成年果蝇分别与If/CyO平衡蝇杂交。提取这些果蝇后代的基因组DNA，通过PCR鉴定突变情况，其中用于PCR的引物的序列是 AACGTAACGCCCAAGAG(SEQ ID NO：4)和AGAGGCTGCTGATTGATGTA(SEQID NO：5)，并且对PCR产物进行测序以评估靶区域中的突变。收集果蝇第二龄幼虫，通过Western blot分析dFARS2表达情况，其中，一抗使用在兔中产生的抗果蝇FARS2的C末端14个氨基酸([C]VDKFKHPKTGKSSV)的抗dFARS2抗体(1:1000；GenScript)，二抗为goat anti-rabbit IgG(GenScript,A00098)。
结果显示，通过CRISPR/Cas9系统生成了dFARS2功能丧失的突变体，并且得到了一个突变型等位基因dFARS2M1(图1B)。序列分析表明，dFARS2M1基因序列缺失1bp，伴有11bp的插入，导致移码和产生101个氨基酸的截短蛋白(图1B和C)，其中，图 1C中线粒体靶向序列的位置(MTS)和结构域边界通过使用MitoProt II (http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)和NCBI的CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)来确定。基因组PCR还证实杂合突变体产生两个条带，而对照野生型和dFARS2纯合突变体仅产生单个条带(图1D)。 Western blot分析证实dFARS2M1突变体中无dFARS2表达(图1E)。dFARS2M1纯合突变体果蝇显示出幼虫致死性，表明dFARS2是必需基因，对dFARS2M1突变体进行挽救实验后发现dFARS2M1突变体的幼虫杀伤力通过覆盖dFARS2基因座的2.3kb基因组DNA的表达得以全面挽救(图1F)。因此，dFARS2M1突变表型归因于dFARS2的丧失。
此外，使用GAL4/UAS系统通过两个独立的RNAi系(UAS-dFARS2RNAi1和 UAS-dFARS2RNAi2分别与Daughterless-Gal4(Da-Gal4)杂交)敲低dFARS2表达，获得 dFARS2敲低果蝇，并收集果蝇第二龄幼虫，提取总RNA进行qRT-PCR分析dFARS2转录情况，同时还通过Western blot分析dFARS2表达情况。类似于在dFARS2基因敲除突变体中观察到的表型，全身性表达的Daughterness-Gal4(Da-Gal4)引起的dFARS2的RNAi 在第二龄期导致的幼虫致死性，进一步证实dFARS2对于果蝇发育至关重要(图10A)。 qRT-PCR进行定量分析，其中，dFARS2 mRNA的水平以Rp49的水平为标准化，RP49 引物序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示，dFARS2引物序列如SEQ ID NO：8 和SEQ ID NO：9所示。RNAi敲低幼虫中的dFARS2转录物水平降低至野生型幼虫的8-22％ (图10B),Western blot分析也证实了RNAi敲除幼虫中dFARS2蛋白水平的降低(图10C)。
表1.qPCR使用的引物
(1)线粒体tRNA氨酰化影响
首先，从第二龄幼虫中分离出线粒体。在含有PhosSTOPTM磷酸酶抑制剂(Roche，4906845001)和cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche，4693132001)的5mL冰冷的线粒体分离缓冲液[225mM D-甘露醇，75mM蔗糖，30mM Tris-HCl，pH 7.4]中将入混匀约2ml的第二龄幼虫。将匀浆液在4℃下以600×g离心两次各10分钟，每次离心后，将上清液转移至新试管中，并在7000×g下于4℃离心10分钟。将所得沉淀重悬于1mL冰冷的线粒体分离缓冲液中，再将重悬的沉淀再次匀浆，然后在9000×g下于4℃离心10 分钟，最终的含有线粒体的沉淀物被储存在-80℃。
为了评估dFARS2在线粒体tRNA氨酰化中的重要性，使用Northern Blot测量氨酰化的水平。为此，从幼虫中分离出总RNA，并在酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶上分离，该凝胶可将未氨酰化的tRNA与缓慢迁移的氨基酰化tRNA分离。通过与互补寡核苷酸探针杂交来测定mt-tRNA(线粒体tRNA)的存在。表2提供了线粒体tRNAPhe，tRNALys，tRNAThr， tRNALeu(CUN)和5SrRNA的探针序列。作为未氨酰化tRNA的对照，将每个样品的等分试样在碱性条件(OH)下脱酰基，并与未处理的样品(AC)一起在凝胶上分离。其中，在 Northern Blot分析中，100μg总RNA用于对照，50μg总RNA用于突变体。然后计算氨基酰化tRNA的相对丰度，将氨酰化的tRNA水平除以总tRNA水平(氨酰化和未氨酰化 tRNA总和)。然后将突变体的值相对于对照组标准化，并以对照组的百分比表示，实验中的定量基于三个独立的实验。结果显示，与野生型幼虫相比，dFARS2敲除突变体中氨酰化的mt-tRNAPhe(线粒体tRNAPhe)的水平降低了(图2A和2B)。但是，其他两个线粒体 tRNA，mt-tRNALys和mt-tRNAThr在野生型和dFARS2基因敲除突变体幼虫中的氨酰化水平相似(图2A和B)。在dFARS2敲低幼虫中也证实了这些结果并且与对照相比，Da-Gal4 驱动的dFARS2 RNAi导致类似的氨酰化mt-tRNAPhe减少(图2C和D)。这些结果表明 dFARS2是真正编码线粒体tRNAPhe合成酶的基因，其活性丧失导致mt-tRNAPhe的氨酰化反应出现严重缺陷。
表2.用于Northern blot的tRNA探针
(2)线粒体tRNA的稳态水平
为了进一步研究了dFARS2缺失是否影响tRNA的代谢，从第二龄幼虫中分离总RNA，并通过Northern blot进行分析。结果表明，dFARS2的缺失导致所分析的所有四个线粒体tRNA(tRNAPhe，tRNALys，tRNAThr，tRNALeu(CUN))的稳态水平明显增加(图3A和3B)。为了进行比较，通过对参考5S rRNA进行标准化来量化线粒体tRNA的水平。与对照幼虫相比，dFARS2M1突变幼虫中tRNAPhe，tRNALys，tRNAThr，tRNALeu(CUN)的平均值分别为200.9％，166.3％，236.6％和194.0％(图3B)。同样，与对照组幼虫相比，dFARS2 RNAi 幼虫中tRNAPhe，tRNALys，tRNAThr，tRNALeu(CUN)的平均值分别为251.3％，210.1％，185％和200.2％(图3C和3D)。综上所述，这些数据表明dFARS2耗竭导致线粒体DNA水平增加。
(3)线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)复合物的情况
使用Western blot来检测OXPHOS组分的表达情况，孔蛋白用作上样对照，每个样品20μg总蛋白进行10％SDS-PAGE凝胶电泳。其中，使用的一抗包括抗NDUFS3(1： 1000；Abcam，ab14711)，抗UQCRFS1(1：1000；Abcam，ab14746)，抗CO3(1：1000；Abcam，ab110259)，抗NDUFS1(1：1000；Proteintech，12444-1-AP)，抗ATP5A(1： 2000；Abcam，ab14748)，anti-SDHA(1:1000；Abcam,ab209986)，二抗为辣根过氧化物酶偶联的Goat anti-mouse IgG(GenScript,A00160)，结果表明，dFARS2突变体以及dFARS2 RNAi幼虫中的核基因编码的复合物I亚基(NDUFS1和NDUFS3)，复合物III(SDHA) 亚基(UQCRFS1)，复合物V(ATP5A)和mtDNA编码的复合物IV亚基(CO3)的稳态水平降低(图4A)，然而，dFARS2突变体和RNAi幼虫中复合物II亚基的稳态水平均未改变。
然后，检查各个OXPHOS复合物的组装。从第二龄幼虫中分离出线粒体，并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)和Western blot进行分析，其中使用的一抗和二抗与检测OXPHOS组分的表达情况时相同。使用Blue-PAGE凝胶分析时，每个样品检测 100μg线粒体蛋白，并用考马斯亮蓝染色。结果显示，在dFARS2突变体和dFARS2RNAi 幼虫中，组装的OXPHOS复合物I，III，IV和V的含量均降低(图4B)。与BN-PAGE 结果一致，Western blot分析表明dFARS2的缺陷导致除了OXPHOS复合物II以外的复合物I，III，IV和V组分大量减少，并且复合物IV和V亚基中非功能性中间体部分积累(图 4C)。dFARS2缺失显着降低了OXPHOS组分的稳态水平并损害了OXPHOS复合物的组装。
(4)线粒体呼吸复合物I-V活性测定
OXPHOS装配缺陷会降低呼吸链活动，使用已建立的生化分析方法测量单个呼吸道复合物的活性，来测试dFARS2耗竭对氧化磷酸化的影响。首先，在泛醌条件下通过NADH 氧化的速率来测量复合物I的活性；使用二氯苯酚吲哚酚(DCPIP)作为人工电子受体，以琥珀酸为底物，测定核编码的复合物II的活性；使用D-ubiquinol-2作为电子供体，通过细胞色素c还原的速率测量复合物III的活性；复合物IV的活性通过细胞色素c的氧化速率来定量；复合物V的活性通过使用磷酸烯醇丙酮酸作为电子受体，测定NADH氧化的速率来确定。实验结果表明，在dFARS2M1突变体和dFARS2RNAi幼虫中OXPHOS复合物I，III，IV和V的酶活性降低，而复合物II活性未受影响(图5A和B)。为了进行比较，将线粒体复合物活性的水平相对于柠檬酸合酶(CS)的平均含量进行了标准化， dFARS2M1突变体中复合物I，II，III，IV和V活性的平均值相对于对照幼虫中的平均值分别为25.6％，101.8％，40.4％，68.8％和65.7％(图5A)。同样，与对照组幼虫相比， dFARS2 RNAi幼虫中复合物I，II，III，IV和V活性的平均值分别为45.0％，92.6％，32.4％， 41.5％和49.5％。(图5B)。这些分析表明，dFARS2的缺失会导致严重的呼吸链缺乏。
(5)发育迟缓和癫痫发作易感性
使用神经元Gal4驱动elav-Gal4果蝇与UAS-dFARS2RNAi1果蝇交配获得降低神经系统中dFARS2活性的敲低果蝇，并检测神经表型。敲低dFARS2会在蛹期发育过程中造成重大致死性，成年时约有23％的果蝇破蛹成虫(图6A)，并且在幼虫期和蛹期均观察到发育延迟(图6B和C)。
果蝇模型的癫痫发作具有许多与人类癫痫发作相似的特征。BS(Bang-sensitive)撞击敏感性测定法已广泛用于检测果蝇的癫痫发作敏感性(图6D)。在该试验中，记录果蝇在机械应力后自行摆正和移动所需的时间，以确定癫痫发作的敏感性，同时记录具有撞击敏感果蝇数量。对10天大的elav-Gal4驱动的dFARS2敲低果蝇和对照蝇进行测试。在果蝇羽化后第3天，在CO2下收集雌性蝇，并以10个蝇/小瓶的形式饲养至羽化后第10天。然后在行为分析前1小时将果蝇转移到一个空的小瓶中。为了进行测试，将小瓶放置在涡旋混合器以最大速度进行20s的机械刺激。实验过程中，将手机摄像头放在装有蝇的小瓶前面0.2m，记录涡旋后显示BS敏感表型(发作和麻痹)的果蝇数量。这些果蝇还用于分析恢复时间，在涡旋后立马记录每一只对BS 敏感的果蝇恢复正常行为的时间。所有果蝇只进行一次试验，并将同一基因型的结果合并。在强烈的机械压力下，野生型果蝇迅速恢复，而对BS撞击敏感的突变体表现出特征性的癫痫发作模式。结果表明，dFARS2敲低果蝇是BS敏感的，需要很长时间才能从机械刺激中恢复，而对照果蝇能够立即或在几秒钟内纠正自己(图6E和F)。这些数据表明，神经元中dFARS2的减少足以诱导果蝇的发育延迟和癫痫发作。
(6)线粒体的形态影响
使用透射电子显微镜(TEM)检查10天大的elav-Gal4驱动的dFARS2敲低果蝇和同样年龄的对照蝇的大脑中央区域的薄片。解剖果蝇的大脑并用2.5％戊二醛固定，置于1 ×PBS溶液中过夜，然后在每个步骤中用1×PBS洗涤3次，每次15分钟。样品在1×PBS 中用1％OsO4固定1小时，并在每个步骤中用1×PBS洗涤3次，每次15分钟。固定样品在每个步骤中用一系列梯度乙醇(30％，50％，70％，80％，90％和95％)脱水约15 分钟，然后用无水乙醇脱水20分钟，然后转移到无水丙酮中20分钟。将样品用Spurr树脂浸润并包埋。使用超薄切片机切割薄切片，并用乙酸铀酰和柠檬酸碱铅染色。之后，使用型透射电子显微镜检查切片。该分析表明，dFARS2敲低导致线粒体形态发生明显变化，野生型线粒体密密麻麻地包裹着完整的线粒体嵴(图7中的A和A')。相比之下，dFARS2 敲低果蝇显示出松散包装排列的带有杂乱的线粒体嵴的线粒体(图7中的B和B')。线粒体嵴变成圆形，使线粒体呈现蜂窝状外观(图7中的B和B')。在量化了形态异常的线粒体的数量后，还发现在dFARS2敲低果蝇大脑中约有81％的线粒体表现出形态变化(图7 中的C)。dFARS2敲低果蝇的线粒体形态缺陷表明癫痫发作表型可能源于线粒体功能障碍。
实施例2、dFARS2突变果蝇模型在研究人发育迟缓、癫痫发作中的应用
将野生型或突变的人类FARS2表达到dFARS2突变果蝇中，并进行挽救实验以此来利用果蝇dFARS2敲除突变体模型确定在人类患者中发现的疾病变体的功能性结果。
首先选择人类FARS2变体p.G309S进行分析，其中，p.G309S在患有严重的早发性癫痫性脑病的人类患者中被发现，同时p.G309在酵母，果蝇，斑马鱼，小鼠和人类中高度保守，见图8A和9，而该变体以纯合状态携带，表明FARS2功能机制可能丧失。
首先构建携带UAS-human野生型FARS2和FARS2缺失转基因果蝇。构建 pAttB-dFARS2构建体，用表3中相应的引物(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)扩增了包含果蝇FARS2基因的2356bp基因组DNA片段，然后亚克隆到pAttB载体中。为了产生pUAST-FARS2-AttB构建体，用表3中相应的引物(SEQ ID NO：17和SEQ ID NO： 18)扩增人FARS2 CDS片段(1356bp)，然后亚克隆到pUAST-AttB载体中。通过基于 PCR的定点诱变引入c.G925A(p.G309S)突变，产生pUAST-FARS2-p.G309S-AttB构建体，表3中列出了使用的引物(SEQ IDNO：19-20)。使用phi-C31整合酶介导的位点特异性转基因，对所有构建体进行测序并使用phi-C31整合酶介导的位点特异性转基因在第三条染色体的86FB着陆位点(BDSC24749)进行插入。结果显示，由于dFARS2突变体在第二龄幼虫阶段具有致死性，因此先对人类FARS2转基因在dFARS2突变体中挽救致死性的能力进行测试。当在Da-Gal4的控制下表达时，野生型和人FARS2的p.G309S都能够挽救幼虫的致死力，从而达到孟德尔期望成年蝇数量的65％(图8B和C)。此外，我们还使用Northern Blot测量了氨酰化的水平，发现带有野生型人FARS2的dFARS2M1突变幼虫中的氨酰化mt-tRNAPhe的效率与野生型对照中的相似，而带有p.G309S突变与对照组相比降低约14.1％(图8D和E)为了提供有关变体致病性质的进一步证据，还测试了在携带野生型和p.G309S突变体FARS2转基因的成年果蝇存活后的癫痫发作易感性。与野生型对照相比，表达野生型FARS2的dFARS2突变果蝇显示出相当的低水平撞击敏感性(图8F和G)。同时，在表达FARS2 p.G309S突变体后观察到dFARS2突变体中诱导了癫痫发作表型(图8F和G)。
表3 PCR引物序列。
本发明还提供一种FARS2相关疾病治疗药物筛选模型，所述药物筛选模型以FARS2基因敲除或敲低非人动物模型为对象，采用FARS2相关疾病治疗药物进行处理；所述的FARS2相关疾病治疗药物包括治疗癫痫性脑病、发育迟缓或痉挛性截瘫药物中的至少一种；如抗氧化类药物维生素E和AD4(N-acetylcysteine amide)。
本发明还提供一种FARS2相关疾病治疗药物筛选模型的构建方法，所述构建方法包括上述FARS2基因敲除或敲低的非人动物模型或FARS2相关疾病治疗药物筛选模型。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种FARS2基因敲除非人动物的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括敲除FARS2基因的1号外显子；优选的，所述的非人动物为昆虫；进一步优选的，所述的昆虫为双翅目昆虫；更优选的，所述的双翅目昆虫为果蝇；
优选的，所述构建方法包括删除FARS2基因1号外显子上的第264位核苷酸，并在删除位置引入随机插入片段；
优选的，所述随机插入片段为GGGGCAAGGGG。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述构建方法利用基因编辑技术进行非人动物的构建；优选的，所述的基因编辑技术选自胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他基因编辑技术的至少一种；
优选的，所述构建方法利用sgRNA进行FARS2基因敲除非人动物的构建；
优选的，所述sgRNA的浓度为20ng/μL-60ng/μL；
优选的，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1-2任一项所述构建方法，其特征在于，所述非人动物的苯丙氨酰-tRNA合成酶表达降低或缺失。
4.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶位点位于FARS2基因的1号外显子上；优选的，所述sgRNA序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述sgRNA通过DNA模板体外转录得到；
优选的，所述的合成DNA模板核苷酸序列如SEQ ID NO：2和3所示。
5.一种非人动物模型构建方法，其特征在于，所述的构建方法包含权利要求1-3任一项所述FARS2基因敲除非人动物的构建方法或RNAi介导中的至少一种；
优选的，所述的非人动物选自线虫、酿酒酵母、果蝇、蟾蜍、斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猪、猴等任何可以进行基因编辑的非人动物其中的至少一种。
6.一种非人动物模型，其特征在于，所述非人动物模型的按照权利要求5所述的构建方法获得。
7.一种增加线粒体DNA水平、减低线粒体氧化磷酸化复合物I、复合物III、复合物IV、复合物V含量及活性或降低线粒体tRNAPhe氨基酰化水平的方法，其特征在于，所述的方法包含敲除FARS2基因的1号外显子和/或敲低FARS2基因中的至少一种。
8.权利要求1-3任一项所述的构建方法获得的非人动物、权利要求6所述的非人动物模型在生物学中用途，所述生物学用途选自筛选FARS2突变抑制剂、制备FARS2突变抑制剂、验证FARS2突变抑制剂、评价FARS2突变抑制剂、筛选FARS2相关疾病治疗药物、制备FARS2相关疾病治疗药物、验证FARS2相关疾病治疗药物、评价FARS2相关疾病治疗药物的至少一种；
优选的，所述的FARS2相关疾病选自癫痫性脑病、发育迟缓、痉挛性截瘫的至少一种。
9.一种FARS2相关疾病治疗药物筛选模型，其特征在于，所述药物筛选模型包含权利要求1-3任一项所述的构建方法、权利要求1-3任一项所述的构建方法获得的非人动物、权利要求6所述的非人动物模型中的至少一种；
优选地，所述药物筛选模型采用FARS2相关疾病治疗药物进行处理；
优选的，所述FARS2相关疾病治疗药物选自治疗癫痫性脑病、发育迟缓或痉挛性截瘫药物中的至少一种。
10.一种FARS2相关疾病治疗药物筛选模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包含权利要求1-3任一项所述的构建方法、权利要求5所述的非人动物模型构建方法中的至少一种。
优选的，所述FARS2相关疾病治疗药物选自治疗癫痫性脑病、发育迟缓或痉挛性截瘫药物中的至少一种。
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