BR112020014315A2 - Inibidores de dna-pk - Google Patents

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BR112020014315A2
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John Patrick Maxwell
Katrina Lee Jackson
Qing Tang
Mark A. Morris
Steven M. Ronkin
Jinwang Xu
Kevin M. Cottrell
Paul S. Charifson
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Vertex Pharmaceuticals Incorporated
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Abstract

a presente invenção refere-se a compostos úteis como inibidores de dna-pk. a invenção também provê composições farmaceuticamente aceitáveis compreendendo os ditos compostos e métodos de uso das composições no tratamento de várias doenças, condições ou distúrbios.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBI- DORES DE DNA-PK'".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Pa- tente Provisório U.S. No. 62/618.339, depositado em 17 de janeiro de 2018, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi eletronicamente apresentada em formato ASCII e é dessa maneira incorporadas a título de referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 6 de janeiro de 2019, é chamada 14390-688 Sequence lis- ting ST25.txt e tem 5 KB de tamanho.
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção se refere a compostos úteis como ini- bidores de proteína cinase dependente de DNA (DNA-PK). A invenção também provê composições farmaceuticamente aceitáveis compreen- dendo os compostos da invenção e métodos de uso das composições no tratamento de câncer, e para aumento da eficiência de edição de genoma através da administração de um inibidor de DNA-PK e um sis- tema de edição de genoma a uma célula(s).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] Radiação ionizante (IR) induz uma variedade de danos a DNA dos quais quebras de filamento duplo (DSBs) são as mais citotó- xicas. Essas DSBs podem levar à morte celular através de apoptose e/ou catástrofe mitótica se não reparadas rapidamente e completa- mente. Em adição à IR, certos agentes quimioterapêuticos incluindo inibidores de topoisomerase Il, bleomicina e doxorrubicina também causam DSBs. Essas lesões a DNA disparam um conjunto complexo de sinais através da rede de resposta de dano a DNA que funciona para reparar o DNA danificado e manter a viabilidade celular e estabi-
lidade genômica. Em células de mamífero, a via de reparo predomi- nante para DSBs é a Via de União das Extremidades Não homólogas (NHEJ). Essa via funciona sem importar a fase do ciclo celular e não requer um modelo para religar as extremidades quebradas do DNA. NHEJ requer coordenação de muitas proteínas e vias de sinalização. O maquinário de NHEJ de núcleo consiste no heterodímero Ku70/80 e na subunidade catalítica de proteína cinase dependente de DNA (DNA-PKcs ou DNA-PK), que juntos compreendem o complexo de en- zima DNA-PK ativa. DNA-PKcs é um membro da família cinase relaci- onada à fosfatidilinositol 3-cinase (PIKK) de serina/treonina proteínas cinases que também inclui ataxia telangiectasia mutada (ATM), ataxia telangiectasia Rad3 relacionada (ATR), mMTOR e quatro isoformas de PI3K. No entanto, enquanto DNA-PKcs está na mesma família de pro- teína cinase que ATM e ATR, essas últimas cinases funcionam para reparar dano a DNA através da via de Recombinação Homóloga (HER) e são restritas a fases S e G2 do ciclo celular. Enquanto ATM é também recrutada para sítios de DSBs, ATR é recrutada para sítios de quebras de DNA de filamento simples.
[005] NHEJ é pensada prosseguir através de três etapas-chave: reconhecimento da DSBs, processamento de DNA para remover ex- tremidades não ligáveis ou outras formas de dano nos terminais, e fi- nalmente ligação das extremidades do DNA. Reconhecimento da DSB é realizada através de ligação do heterodímero Ku às extremidades irregulares de DNA seguido por recrutamento de duas moléculas de DNA-PKCcs para lados adjacentes da DSB; isso serve para proteger os terminais quebrados até que enzimas de processamento adicionais sejam recrutadas. Dados recentes dão suporte à hipótese que DNA- PKcs fosforilam a enzima de processamento, Artemis, bem como a si mesmos para preparar as extremidades do DNA para processamento adicional. Em alguns casos, polimerase de DNA pode ser requerida para sintetizar extremidades novas antes da etapa de ligação. A auto- fosforilação de DNA-PKcs é acreditada induzir uma mudança confor- macional que abre a cavidade de ligação de DNA central, libera DNA- PKcs de DNA e facilita a religação final das extremidades do DNA.
[006] Já se sabe há algum tempo que camundongos DNA-PK" são hipersensíveis aos efeitos de IR e que alguns inibidores de molé- cula pequena não seletivos de DNA-PKcs podem radiossensibilizar uma variedade de tipos de célula de tumor em todo um amplo conjunto de bases genéticas. Embora seja esperado que inibição de DNA-PK vá radiossensibilizar células normais até certo ponto, isso tem sido ob- servado a um grau menor do que com células de tumor provavelmente devido ao fato que células de tumor possuem níveis basais maiores de estresse de replicação endógeno e dano a DNA (estresse de replica- ção induzido por oncogene) e mecanismos de reparo de DNA são me- nos eficientes em células de tumor. Mais importante, uma janela tera- pêutica melhorada com economia maior de tecido normal será conce- dida a partir da combinação de um inibidor de DNA-PK com avanços recentes em administração precisa de IR focada, incluindo RT guiada por imagem (IGRT) e RT modulada por intensidade (IMRT).
[007] Inibição de atividade de DNA-PK induz efeitos em ambas as células de ciclagem e não ciclagem. Isso é altamente significante uma vez que a maioria das células em um tumor sólido não está repli- cando ativamente em qualquer dado momento, o que limita a eficácia de muitos agentes se direcionando ao ciclo celular. Igualmente intri- gante são relatos recentes que sugerem uma conexão forte entre inibi- ção da via de NHEJ e a habilidade em matar células-tronco cancero- sas (CSCs) tradicionalmente radiorresistentes. Foi mostrado em algu- mas células de tumor que DSBs em CSCs dormentes ativam predomi- nantemente reparo de DNA através da via de NHEJ; é acreditado que CSCs estejam geralmente na fase quiescente do ciclo celular. Isso po-
de explicar o motivo pelo qual metade de pacientes com câncer pode sofrer relapso de tumor local ou distante apesar de tratamento uma vez que estratégias atuais não são capazes de efetivamente se direci- onar a CSCs. Um inibidor de DNA-PK pode ter a habilidade em sensi- bilizar essas células progenitoras metastáticas potenciais para os efei- tos de IR e selecionar agentes quimioterapêuticos de indução de DSB.
[008] Dado o envolvimento de DNA-PK em processos de reparo de DNA, uma aplicação de fármacos inibidores de DNA-PK específicos seria agir como agentes que aumentarão a eficácia de ambas quimio- terapia e radioterapia para câncer. Desta maneira, seria desejável de- senvolver compostos úteis como inibidores de DNA-PK.
[009] Ainda, tecnologias de direcionamento a genoma precisas são necessárias para permitir engenharia sistemática de variações ge- néticas. O uso de sistemas de edição de genoma, especificamente tecnologia de edição de genoma baseada em endonuclease de Repe- tições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente Interespaçadas (CRISPR), cresceu exponencialmente nos últimos anos. O sistema imune inato bacteriano CRISPR-Cas9 tipo |l emergiu como uma ferra- menta de edição de genoma efetiva para modificação direcionada do genoma humano (Wiedenheft, B. 2012; Hsu, P.D. eta. 2014). Recen- temente, sistemas de edição de genoma CRISPR-Cpf foram descritos. Edição de genoma baseada em endonuclease de CRISPR é depen- dente, em parte, das vias de união de extremidades não homólogas (NHEJ) e reparo direcionado por homologia (HDR) para reparar que- bras de filamento duplo de DNA. Mecanismo de reparo celular favore- ce NHEJ em relação a HDR.
[0010] Embora a obtenção de inserção ou deleções (indels) a par- tir de NHEJ seja até 70% eficaz em alguns relatos, a eficiência de HDR permanece desafiadora, com taxas em menos de 1%.
[0011] Portanto, existe uma necessidade de aumento da eficiência de edição de genoma, em particular, eficiência de HDR. Uma outra aplicação de fármacos inibidores de DNA-PK específicos seria agir como agentes que aumentarão a eficácia de sistemas de edição de genoma.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] Foi constatado que compostos da presente invenção, e composições farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, são eficazes como inibidores de DNA-PK. Portanto, em um aspecto, a invenção re- fere-se a compostos representados pela Fórmula (1): e x N R' SI O ' S O (1) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que cada um de R', R?, X, Anel A, Anel B e Anel C é in- dependentemente como definido em um outro ponto aqui.
[0013] Em uma modalidade, os compostos da invenção são repre- sentados pela Fórmula (1) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que: o Anel A é um sistema de anel aromático selecionado de o x XX É í ou : ; o Anel B é um Sistema de anel selecionado de Ç - ÇI o” ou N J em que o anel B é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em —F, -OH e C14 alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em —F, -CI, -
OH e -—OC71.2 alquila;
o Anel C é um grupo Ca, cicloalquila, heteroarila de 5-6 membros ou fenila, em que o Anel C é opcionalmente substituído mais com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em halogênio, C1-2 alquila, -OH e -OC7-2 alquila;
X é -NH-, -O-, -OC14 alquila-, -S- ou -CH>2-;
cada um de R' e R? é, independentemente, hidrogênio, - C(O)NHRº, -C(O0)JORº, -NHC(OJ)Ri, -NHC(O0)ORº, -NHC(O)NHRI, - NHS(O)2Rº, -NHRº, -C14 alquil-NHRº, -ORº ou R? em que R' e R2 não podem ser simultaneamente hidrogênio;
cada R? independentemente é hidrogênio, -C1-2alquila, ha- logênio, -OC1-2alquila, -C(O0)OH, -C(0)OC1.-2alquila, -CN, -C(O)NHC1- 2alquila, -C(O)NH>2, Ca cicloalquila ou -NRR', em que cada uma da dita R3 alquila e cicloalquila independentemente é opcionalmente subs- tituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistin- do em -F, -Cl, -OH e -OC1-2 alquila;
cada Rº independentemente é hidrogênio, Ci4alquila, Ca-4 alquenila, C24 alquinila, C3-10 cicloalquila, arila de 6-10 membros, hete- roarila de 5-10 membros ou heterociclila de 4-10 membros, em que cada um dos ditos grupos Rº é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -Br, -Cl, -F, Ci-4alquila, CN, NO>2, Ca-4alquenila, Ca-4alquinila, Ca-ecicloalquila, Co-a alquil-C3-5 cicloalquila, Cos alquil-O-C1-4 alquila, Co-s alquil-O-Co4 alquil- C3-5 cicloalquila, C(O0)OC14 alquila, C(O0)JOCo+ alquil-C3-5 cicloalquila, Cos alqui-C(ONH2, C(O)NHC 4 alquila C(O)N(Cia alquila)?, C(O)NH(Co4 alquil-C3-.5 cicloalquila), CH2OR”, Cos alquil-C(O)Rº, Cos alquil-C(O)N(R5)2, Co-4 alquil-C(O0)ORS, Co-4 alquil-NHC(O)R5, Co alquil- N(Rº)2, heterociclila de 5-6 membros, -O(C1-4 alquil)ORS, -OR* e oxo, e em que cada um dos ditos substituintes Rº opcionais é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes sele-
cionados do grupo consistindo em -F, -Cl, Cisalquila, -OH, -OC71- 4alquila, -SC1.4alquila, -C(O)C14 alquila, -C(0)OC1- alquila e -C(0)OC».- 4 alquil-C3-5 cicloalquila; e cada Rº independentemente é hidrogênio, Cialquila, feni- la, heteroarila de 5-6 membros ou heterociclila de 4-7 membros, em que cada Rº independentemente é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -F, -CI, C1- 2alquila, -CH2O0H, -CN, -OH, -OC7.2alquila, heteroarila de 5-6 membros e heterociclila de 4-7 membros, ou dois grupos Rº junto com o átomo de nitrogênio interveniente formam opcionalmente um anel morfolina, anel azetidina, anel pirrolidina, anel piperidina ou anel piperazina; e Rº é hidrogênio ou C1.4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em - F, -Cl, -CH20H, -CN, -OH e -OC1.2alquila; R' é arila de 6-10 membros, heteroarila de 5-10 membros ou heterociclila de 4-7 membros, cada uma das quais é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em -F, -ClI, C1-2alquila, -CH2O0H, -CN e -OR; e cada um de R e R' independentemente é hidrogênio ou C1- 4alquila ou R e R' junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados formam opcionalmente um anel morfolina, anel azetidina, anel pirrolidina, anel piperidina ou anel piperazina, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde cada um de R', R?, X, Anel A, Anel B e Anel C é como definido em algum outro ponto aqui.
[0014] A invenção também provê composições farmacêuticas que incluem um composto de Fórmula (1) e um veículo, adjuvante ou veícu- lo farmaceuticamente aceitável. Esses compostos e composições far- macêuticas são úteis para tratamento ou diminuição da severidade de câncer.
[0015] Os compostos e composições providos pela presente in- venção são também úteis para o estudo de DNA-PK em fenômenos biológicos e patológicos; o estudo de vias de transdução de sinal intra- celular mediadas por tais cinases; e a avaliação comparativa de novos inibidores de cinase.
[0016] A presente invenção também pode melhorar a eficiência de HDR através da supressão de enzimas de NHEJ tal como DNA-PK usando inibidores de DNA-PK.
[0017] Em algumas modalidades, a invenção provê um método de edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo, o método inclui admi- nistrar a uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômi- cas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto represen- tado pela Fórmula (1): e
JS O N Rº ' o o (1) ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mes- mo, onde cada um de R', R?, Anel B, Anel B e Anel C é independen- temente como definido em algum outro ponto aqui.
[0018] O Anel A é um sistema de anel aromático selecionado de
E Px XX É í ou : ;
OSGO o Anel B é um sistema de anel selecionado de “O, “O, 0, ,o
O ou “N , em que o Anel B é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em —F, -OH e Ci4 al- quila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecio- nados do grupo consistindo em —F, -Cl, -OH e -OC1-2alquila;
o Anel C é uma Ca cicloalquila, heteroarila de 5-6 mem- bros ou grupo fenila, em que o Anel C é opcionalmente substituído ainda com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em halogênio, C1-2 alquila, -OH e -OC1-2alquila;
X é -NH-, -O-, -OC14 alquil-, -S- ou -CH>2-;
cada um de R' e R? é, independentemente, hidrogênio, - C(O)NHRº, -C(0)JORº, -NHC(O)Rº, -NHC(O0)OR, -NHC(O)NHR?, - NHS(O)2R?, -NHRº, -C1.4 alquil-NHRº, -OR? ou R? em que R' e R? não podem ser simultaneamente hidrogênio;
cada R? independentemente é hidrogênio, -C1-alquila, ha- logênio, -OC1-2alquila, -C(O0)OH, -C(0)OC1.2alquila, -CN, -C(O)NHC?1- 2alquila, -C(O)NH>2, C34 cicloalquila ou -NRR', em que cada uma da dita R$ alquila e cicloalquila independentemente é opcionalmente subs- tituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistin- do em -F, -Cl, -OH e -OC1-2alquila;
cada Rº independentemente é hidrogênio, Ci4alquila, Ca4 alquenila, C24 alquinila, C3-10º cicloalquila, arila de 6-10 membros, hete- roarila de 5-10 membros ou heterociclila de 4-10 membros, em que cada um dos ditos grupos Rº é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -Br, -CI, -F, Cri4alquila, CN, NO>, C24 alquenila, C2.4 alquinila, Ca-.6 cicloalquila, Co alquil-C3.5 cicloalquila, Co-s alquil-O-C1-4 alquila, Co alquil-O-Co4 alquil- C3.5 cicloalquila, C(O0)OC14 alquila, C(0)OCo4 alquil-C3.5 cicloalquila, Cos alqui-C(O)NH2, C(ONHC4 alquila C(O)N(C1a alquila)>, C(O)NH(Co4 alquil-C3-5 cicloalquila), CH2OR”, Co alquil-C(O)Rº, Cos alquil-C(O)N(R$)2, Cos alquil-C(O0)ORS, Cos alquil-NHC(O)RS, Cos alquil- N(R$)2, heterociclila de 5-6 membros, -O(C1-4 alquila)ORS, -ORº e oxo,
e em que cada um dos ditos substituintes Rº opcionais é opcionalmen- te e independentemente substituído com um ou mais substituintes se- lecionados do grupo consistindo em -F, -Cl, C14 alquila, -OH, -OC14 alquila, -SC1-4 alquila, -C(O)C14 alquila, -C(0)OC1- alquila e -C(0)OC»- 4 alquil-C3.5 cicloalquila; e cada Rº independentemente é hidrogênio, Ci.4alquila, feni- la, heteroarila de 5-6 membros ou heterociclila de 4-7 membros, em que cada Rº independentemente é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -F, -CI, C1- 2alquila, -CH2O0H, -CN, -OH, -OC7.2 alquila, heteroarila de 5-6 membros e heterociclila de 4-7 membros ou dois grupos R$ junto com o átomo de nitrogênio interveniente formam opcionalmente um anel morfolina, anel azetidina, anel pirrolidina, anel piperidina ou anel piperazina; e Rº é hidrogênio ou C1.4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em - F, -Cl, -CH2O0H, -CN, -OH e -OC7-2alquila; R' é arila de 6-10 membros, heteroarila de 5-10 membros ou heterociclila de 4-7 membros, cada uma das quais é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em -F, -CI, Ci .2alquila, -CH2O0H, -CN e -OR; e cada um de R e R' independentemente é hidrogênio ou C14 alquila ou R e R' junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados formam opcionalmente um anel morfolina, anel azetidina, anel pirrolidina, anel piperidina ou anel piperazina.
[0019] Em algumas modalidades, a invenção também provê um método de reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas-alvo através de uma via de reparo direcionado por homolo- gia (HDR), o método inclui administrar a uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de geno- ma e um composto representado pela Fórmula (1) ou sais farmaceuti-
camente aceitáveis do mesmo.
[0020] O sistema de edição de genoma interage com um ácido(s) nucleico(s) das regiões genômicas-alvo, resultando em uma quebra de DNA, e em que a quebra de DNA é reparada pelo menos em parte por meio da via de HDR.
[0021] Em algumas modalidades, a invenção também provê um método de inibição ou supressão de reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas-alvo por meio de uma via de NHEJ, o método inclui administrar a uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto representado pela Fórmula (1) ou sais farmaceuticamen- te aceitáveis do mesmo.
[0022] O sistema de edição de genoma interage com um ácido(s) nucleico(s) da uma ou mais regiões genômicas-alvo, resultando em uma quebra de DNA, e em que reparo da quebra de DNA por meio de uma via de NHEJ é inibido ou suprimido.
[0023] Em algumas modalidades, a invenção também provê um método de modificação da expressão de um ou mais genes ou proteí- nas, o método inclui administrar a uma ou mais células que compreen- dem uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto representado pela Fórmula (1) ou sais farma- ceuticamente aceitáveis do mesmo.
[0024] O sistema de edição de genoma interage com um ácido(s) nucleico(s) da uma ou mais regiões genômicas-alvo de um gene(s)- alvo, resultando em edição da uma ou mais regiões genômicas-alvo e em que a edição modifica expressão de um gene(s) e/ou proteína(s) a jusante associada(s) com o gene(s)-alvo.
[0025] Em algumas modalidades, um estojo ou composição é pro- vido para edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo. Em algu- mas modalidades, o estojo ou composição inclui um sistema de edição de genoma; e um composto representado pela Fórmula (1) ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
[0026] Outros elementos, objetos e vantagens da invenção são aparentes na descrição detalhada que segue. Deve ser compreendido, no entanto, que a descrição detalhada, enquanto indicando modalida- des e aspectos da invenção, é dada por meio de ilustração apenas, não limitação. Várias mudanças e modificações dentro do escopo da invenção se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0027] As FIGURAS 1A-1C são uma série de esquemas e se- quências se relacionando ao uso de um ensaio de repórter de luz de tráfego usado para monitoramento de eficiência de HDR.
[0028] A FIG. 1A mostra o projeto de um construto bicistrônico se direcionando ao locus AAVS1 humano (SB).
[0029] A FIG. 1B mostra a linhagem celular e a região de polinu- cleotídeo direcionada usadas no ensaio de repórter de luz de tráfego para monitoramento da eficiência de HDR.
[0030] A FIG. 1C é um esquema do fluxo de trabalho experimental usado no ensaio de repórter de luz de tráfego para monitoramento da eficiência de HDR.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0031] A menos que de outro modo definido, termos técnicos e ci- entíficos usados em conexão com a presente invenção devem ter os significados que são comumente compreendidos por aqueles de habi- lidade comum na técnica. Em geral, nomenclaturas utilizadas em co- nexão com, e técnicas de, cultura de célula e tecido, biologia molecular e química de proteína e oligo- ou polinucleotídeo e hibridização descri- tas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente usadas no campo. Técnicas padrão são usadas para DNA recombinante, síntese de oli-
gonucleotídeo e cultura e transformação de tecido (por exemplo, ele- troporação, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou co- mo comumente realizado na técnica ou como descrito aqui. As técni- cas e procedimentos acima são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos no campo e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas ou discutidas em todo o presente pedido. Vide, por exemplo, Sambrook e outros. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). As no- menclaturas utilizadas em conexão com, e os procedimentos de labo- ratório e técnicas de, química analítica, química orgânica sintética e químicas medicinal e farmacêutica descritas aqui são aquelas bem co- nhecidas e comumente usadas no campo. Técnicas padrão são usa- das para síntese química, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e administração e tratamento de pacientes. Em geral, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódi- ca de Elementos, versão CAS, e o Handbook of Chemistry and Physics, 75º Ed. 1994. Ainda, princípios gerais de química orgânica são descritos em "Organic Chemistry," Thomas Sorrell, University Sci- ence Books, Sausalito: 1999 e "March's Advanced Organic Chemistry," Se Ed., Smith, M.B. e March, J., eds. John Wiley & Sons, New York: 2001, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência. Como utilizado de acordo com a presente invenção, os termos definidos na descrição, a menos que de outro modo indicado, devem ser compreendidos ter os significados como aqui definido. Compostos da Invenção
[0032] Em uma modalidade, os compostos da invenção são repre- sentados pela Fórmula (1):
A x N
SO : S O) (1) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que as variáveis de Fórmula (1) são, cada uma, indepen- dentemente como descrito abaixo. O primeiro conjunto das variáveis de Fórmula (1) é como segue: o Anel A é um sistema de anel aromático selecionado de Ro
TX XX “o ou j .
[0033] O Anel B é um sistema de anel opcionalmente substituído e
OSSOS selecionado de “O, “O, O, O ou “o , em que o Anel B é op- cionalmente substituído comum ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -F, -OH e C14 alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em — F, -Cl, -OH e -OC1.2 alguila. Em uma modalidade específica, o Anel B é
CIGO opcionalmente substituído e selecionado de “0, “O, O ou O. Em uma outra modalidade específica, o Anel B é opcionalmente subs- ú ttuigo Co”.
[0034] O Anel C é uma Ca cicloalquila, heteroarila de 5-6 mem- bros ou fenila, em que o Anel C é opcionalmente substituído mais com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em halo- gênio, C1.2 alquila, -OH e -OC1-2 alquila. Em uma modalidade especiífi-
ca, o Anel C é Ca. cicloalquila opcionalmente substituída ou heteroarila de 5-6 membros opcionalmente substituída. Em uma modalidade es- pecífica, o Anel C é Cas cicloalquila opcionalmente substituída. Em uma modalidade específica, o Anel C é heteroarila de 5-6 membros opcionalmente substituída ou fenila opcionalmente substituída.
[0035] X é -NH-, -O-, -OC14 alquil-, -S- ou-CH2-. Em uma modali- dade específica, X é -NH-, -O- ou -CH2-. Em uma outra modalidade específica, X é -NH- ou -O-. Em uma outra modalidade específica, X é —O-. Em uma outra modalidade específica, X é -NH-. Em uma outra modalidade específica, X é -OC1-1 alguil-- Em uma outra modalidade específica, X é -CHz-.
[0036] Cada um de R' e R? é independentemente hidrogênio, - C(O)NHRº, -C(O0)JORº, -NHC(O)RI, -NHC(O0)ORº, -NHC(O)NHR?, - NHS(O)2R?, -NHRº, -C1.4 alquil-NHRº, -ORº ou R? em que R' e R? não podem ser simultaneamente hidrogênio. Em uma modalidade específi- ca, pelo menos um de R' e R? é -NHRº ou -ORº. Em uma outra moda- lidade específica, cada um de R' e R? independentemente é hidrogê- nio, -C(O)NHRº, -C(0)ORº, -NHC(O)Rº, -NHC(O)ORÍ, -C14 alquil- NHRº, -NHRº, -ORº ou R7. Em uma outra modalidade específica, R? é hidrogênio e R' é -C(O)NHR?, -C(O0)JOR?, -NHC(OJ)Rº, -NHC(O)ORS, - NHC(O)NHR, -NHS(O)2Rº, -NHRI, -C14 alquil-NHRº, -ORº ou R; e R. Em uma outra modalidade específica, Rº é hidrogênio e Rº é - C(O)NHR, -C(0)OR, -NHC(O)Rº, -NHC(O)OR, -C1.4 alquil-NHRS, - NHR?, -ORº ou R”. Em uma outra modalidade específica, R? é hidro- gênio e R' é -NHRº, -ORº ou R7. Em uma outra modalidade específica, R? é hidrogênio e R' é -NHRº ou -ORº.
[0037] Cada Rº? independentemente é hidrogênio, -Ci-4alquila, ha- logênio, -OC1-2alquila, -C(O0)OH, -C(0)OC7.2alquila, -CN, -C(O)NHC1- 2alquila, -C(O)NH>2, C34 cicloalquila ou -NRR', em que cada uma das ditas R$ alquila e cicloalquila independentemente é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em -F, -Cl, -OH e -OC1-2alquila. Em uma modalidade especiífi- ca, cada Rº independentemente é hidrogênio, -C1-4 alquila, halogênio, - OC1-2 alquila, -CN, -C34 cicloalquila ou -NRR', em que cada uma das ditas Rº alguila e cicloalguila independentemente é opcionalmente substituída. Em uma outra modalidade específica, cada Rº indepen- dentemente é hidrogênio, metila, -CIl, -OCH3, -CN, ciclopropila, - NHCH;3 ou -N(CH;3)2.
[0038] Cada Rº independentemente é hidrogênio, C1-1 alquila, Ca-4 alquenila, C2.4 alquinila, C3-10 cicloalquila, arila de 6-10 membros, hete- roarila de 5-10 membros ou heterociclila de 4-10 membros. Cada um dos grupos Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -Br, - CI, -F, Ci4alquila, CN, NO>, Ca4alquenila, Cas4alquinila, Ca-ecicloalquila, Co-s alquil-Ca-5 cicloalquila, Co-s alquil-O-C1-4 alquila, Co-s alquil-O-Co-s alquil-Ca.5 cicloalquila, C(0)OC14 alquila, C(0)OCo-4 alquil-C3-5 cicloal- quila, Co alquil-C(O)NH2, C(O)NHC14 alquila, C(O)N(C1-1 alquila)>, C(O)NH(Co-4 alquil-Ca-5 cicloalquila), CH2OR”, Co alquil-C(O)R5, Cos alquil-C(O)N(R5)2, Co-4 alquil-C(O)OR*, Co-4 alquil-NHC(OJ)R5, Co-4 alquil- N(R$)2, heterociclila de 5-6 membros, -O(C14 alquila)ORS, -OR$ e oxo. Cada um dos substituintes R* opcionais é opcionalmente e indepen- dentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em-F, -Cl, C14 alquila, -OH, -OC14 alquila, -SC1- al- quila, -C(O)C1-1 alquila, -C(0)OC14 alquila e -C(0)OCo-1 alquil-Ca-5 ci- cloalquila. Exemplos específicos do grupo heteroarila para Rº incluem um pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, fu- nº Pr ev nO ropiridina (por exemplo, e—= —) ou x ), pirimidina, pirimi- dinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina (por exemplo,
nr nº Sr Na O Vo ou = , pirrolpirimidina, benzimidazol, benzotiazol e ben- zoxazol. Em uma modalidade específica, cada uma da C1+4 alquila, C1- aalquila, Ca4alquenila e Ca.,alquinila para Rº é opcionalmente e inde- pendentemente substituída com um ou mais substituintes seleciona- dos do grupo consistindo em -F e -O(C1-4 alquila) e cada um dos gru- pos C3-10 cicloalquila, arila de 6-10 membros, heteroarila de 5-10 mem- bros e heterociclila de 4-10 membros para Rº é opcionalmente e inde- pendentemente substituído com um ou mais Ci4alquila, -O(C1-4 alqui- la), Cos alquil-O-C1-4 alquila, C(O)NHC1+4 alquila, C(O)N(C1-4 alquila)2 ou piperazina, em que cada um dos substituintes Rº opcionais é opcio- nalmente substituído com uma ou mais C1+ alquila.
[0039] Exemplos específicos do grupo heterociclila para Rº inclu- em um tetra-hidrofurano, oxetano, tetra-hidropirano, di-hidroisoxazol, pirimidino-2,4(1H,3H)-diona, — di-hidrofuropirimidina — (por “exemplo, nº Pr nº Rr nº Pr Aa O o ou Í ), di-hidropiranopirimidina (por exemplo, ”), di-hidropirrolpirimidina, tetra-hidropiridopirimidina, di- nr
O hidropiridopirimidina (por exemplo, Z"), di-hidrofuropiridina (por Pr o exemplo, di-hidropiridopiridina, tetra-hidropteridina e idoinso- lino-1,3-diona. Exemplos específicos do grupo heterocíclico para os substituintes Rº incluem um oxetano, azetidina, tetra-hidrofurano, di- hidropirano, tetra-hidropirano, morfolina, piperidina, pirrolidina, pipera- zina, furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol, oxadiazol e tetra- zol.
[0040] Em uma modalidade específica, cada Rº independentemen- te é hidrogênio ou um grupo opcionalmente substituído selecionado de C14 alquila, C24 alquenila, C24 alquinila, Ca-5 cicloalquila ou uma fenila. Em uma outra modalidade específica, cada Rº independentemente é um grupo opcionalmente substituído selecionado de pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolpirimi- dina, benzimidazol, benzotiazol, benzoxazol, tetra-hidrofurano, oxeta- no, tetra-hidropirano, di-hidroisoxazol, pirimidino-2,4(1H,3H)-diona, di- hidrofuropirimidina, — di-hidropiranopirimidina, — di-hidropirrolpirimidina, tetra-hidropiridopirimidina, di-hidropiridopirimidina, di-hidrofuropiridina, di-hidropiridopiridina, tetra-hidropteridina ou isoindol-1,3-diona. Em uma outra modalidade específica, cada Rº independentemente é um grupo opcionalmente substituído selecionado de imidazol, pirazol, pi- rimidina, furopirimidina, oxetano ou di-hidrofuropirimidina.
[0041] Em uma outra modalidade específica, cada Rº independen- temente é hidrogênio ou um grupo opcionalmente substituído selecio- Nx nado de C14 alquila, Rego ou um grupo de anel selecionado de um grupo Cas cicloalquila, pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isoti- azol, oxazol, tetra-hidrofurano, oxetano, tetra-hidropirano, di- hidroisoxazol ou fenila, em que X* é N ou CR; X? é N ou CR”, em que X' e X? não podem ser simultaneamente N; cada um de Rºº , R?º e Rºº independentemente é hidrogênio, F, CI, Br, CN, NO», C14 alquila, Co-4 alquil-Ca-5 cicloalquila, Cos alquil-O-C14 alquila, Cos alquil-O-Co-s alquil-C3-.5 cicloalquila, C24 alquenila, C2.4 alquinila, C(O0)OC1-1 alquila, C(O0)OCo4 alquil-Ca-5 cicloalquila, C(O)NH2, C(O)NHC'1- alquila, C(O)N(C14 alquila)-., C(O)NH(Cos alquil-Ca-5 cicloalquila), um grupo he- terocíclico selecionado de oxetano, azetidina, tetra-hidrofurano, di- hidropirano, tetra-hidropirano, morfolina, piperidina ou piperazina, ou um grupo heteroarila selecionado de um furano, oxazol, oxadiazol, pir- rol, pirazol, triazol ou tetrazol; ou R4c e R4a, ou R4c e R4b, junto com os átomos intervenientes, formam opcionalmente um grupo heterocí- clico di-hidrofurano, di-hidropirano ou tetra-hidropiperidina; e R* é in- dependentemente hidrogênio, F, Cl, Br, CN, NO>, C14 alquila, Co. al- quil-O-C14 alquila, Ca4 alquenila, C24 alquinila, C(O0)OC'14 alquila, C(O)NH>2, C(O)NHC'1+4 alquila ou C(O)N(C14 alquila)=. Cada um dos di- tos grupos heterocíclicos e heteroarila para R*º, R** e R** e para os substituintes de Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em - F, C1-4 alquila, -OH, -C(O)C14 alquila, -C(0)OC14 alquila ou -C(0)OCo-4 alquil-Ca.5 cicloalquila; e cada um dos grupos alquila e cicloalquila para R%º, R*º e R*º e para os substituintes de Rº é opcionalmente e inde- pendentemente substituído com um ou mais substituintes seleciona- dos do grupo consistindo em -F e -OH. Em uma modalidade especiífi- ca, R*º é hidrogênio, CF, CCI ou CC1.2 alquila opcionalmente substituí- da com um ou mais —F.
[0042] Em uma outra modalidade específica, cada Rº independen- temente é C14 alguila ou um grupo de anel selecionado de C3-5 cicloal-
UH
PÁ É WS ta praia ita cura CL a quila, pirazol, imidazol, oxetano, o ; o ou ; em que a Rº C14 alquila é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -Br, -Cl, -F e - O(C1-1 alquila) e em que cada um dos grupos de anel Rº é opcional- mente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -Br, -Cl, -F, Ci4alquila, -ON, - O(C1-1 alquila), Ca-ecicloalquila, Cos alquil-O-C14 alquila, C(O)NHC1+4a alquila, C(O)N(C14 alquila)o e a piperazina, em que cada um dos subs- tituintes Rº opcionais é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -F, C1-4alquila, -OH e -OCi4alquila. Em uma modalidade específica, a Rº C1.4 alguila é op- cionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -F e -O(C1-« alquila) e cada um dos grupos do anel R? é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em Ci1.4alquila, - O(C1+ alquila), Co alquil-O-C14 alquila, C(O)NHC1-4 alquila, C(O)N(C1+4 alquila), e a piperazina, em que cada um dos substituintes Rº opcio- nais é opcionalmente substituído com um ou mais Ci4alquila.
[0043] Cada Rº é independentemente hidrogênio, C14 alquila, feni- la, heteroarila de 5-6 membros ou heterocíclila de 4-7 membros, em que cada Rº é independentemente opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -F, -CI, C1- 2alquila, -CH2O0H, -CN, -OH, -OC7.2alquila, heteroarila de 5-6 membros e heterociclila de 4-7 membros, ou dois grupos Rº junto com o átomo de nitrogênio interveniente formam opcionalmente uma morfolina, aze- tidina, pirrolidina, piperidina ou piperazina. Exemplos específicos do grupo heteroarila opcionalmente substituído para Rº incluem um imi- dazol, triazol, tiazol, piridina e pirimidina. Exemplos específicos do gru- po heterocíclila opcionalmente substituído para Rº incluem um oxeta- no, tetra-hidrofurano e tetra-hidropirano.
[0044] Rº é hidrogênio ou C1.4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em - F, -Cl, -CH20H, -CN, -OH e -OC1-2alquila. Em uma modalidade especí- fica, Rº é hidrogênio ou metila.
[0045] R' é arila de 6-10 membros, heteroarila de 5-10 membros ou heterociclila de 4-7 membros, cada uma delas é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em -F, -Cl, C1-2alquila, -CH20H, -CN e -OR. Exemplos especí- ficos de R' incluem um pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol,
oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazi- na, quinolona, furopirimidina, pirrolpirimidina, benzimidazol, benzoti- azol, benzoxazol, tetra-hidrofurano, oxetano, tetra-hidropirano, di- hidroisoxazol, pirimidino-2,4(1H,3H)-diona, di-hidrofuropirimidina, di- hidropiranopirimidina, di-hidropirrolpirimidina, tetra- hidropiridopirimidina, di-hidropiridopirimidina, di-hidrofuropiridina, di- hidropiridopiridina, tetra-hidropteridina e isoindol-1,3-diona. Em uma modalidade específica, R' é opcionalmente substituído e selecionado de uma pirimidina, imidazol, pirazol, tiazol, furopirimidina, pirrolpirimidi- na, benzimidazoli benzotiazoli benzoxazol,/ oxetano, di- hidrofuropirimidina ou isoindolino-1,3-diona. Em uma outra modalidade específica, R' é opcionalmente substituído com e selecionado de uma pirimidina, imidazol, pirazol, tiazol, furopirimidina, oxetano, di- hidrofuropirimidina ou isoindolino-1,3-diona. Em ainda uma outra mo- dalidade específica, R' é opcionalmente substituído e selecionado de uma pirimidina, pirazol, furopirimidina, tiazol ou isoindolino-1,3-diona.
[0046] Cada um de R e R' é independentemente hidrogênio ou C7- 4 alquila ou R e R' junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados formam opcionalmente um anel morfolino, anel azetidino, anel pirrolidino, anel piperidina ou anel piperazino. Em uma modalidade es- pecífica, cada um de R e R' é independentemente hidrogênio ou C14 alquila. Em uma outra modalidade específica, cada um de Re R é in- dependentemente hidrogênio ou C1-2 alquila.
[0047] No segundo conjunto de variáveis de Fórmula (1), cada Rº é independentemente hidrogênio, C14 alquila, C24 alquenila, C2.4 alquini- la, C3-10 cicloalquila, uma fenila, um naftaleno, um grupo heteroarila de 5-10 membros selecionado do grupo consistindo em um pirrol, imi- dazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pi- rimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolpirimidina, benzimidazol, benzotiazol e benzoxazol ou um grupo heterociclila de 4-10 membros selecionado do grupo consistindo em um tetra-hidrofurano, oxetano, tetra-hidropirano, di-hidroisoxazol, piri- midino-2,4(1H,3H)-diona, di-hidrofuropirimidina, di- hidropiranopirimidina, di-hidropirrolpirimidina, tetra- hidropiridopirimidina, di-hidropiridopirimidina, di-hidrofuropiridina, di- hidropiridopiridina, tetra-hidropteridina e isoindolino-1,3-diona. Cada um de Rº é opcionalmente e independentemente substituído. Em uma modalidade específica, o grupo heterocíclico para os substituintes Rº é opcionalmente substituído e selecionado de um oxetano, azetidina, tetra-hidrofurano, di-hidropirano, tetra-hidropirano, morfolina, piperidi- na, pirrolidina, piperazina, furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol, oxadiazol ou tetrazol. As variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito no primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (1).
[0048] No terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (1), cada Rº é independentemente hidrogênio ou um grupo opcionalmente substituído selecionado de C1-« alquila, fenila, um grupo heteroarila de 5-6 mem- bros selecionado de um imidazol, triazol, tiazol, piridina ou pirimidina, ou um grupo heterociclila de 4-6 membros selecionado de um oxetano, tetra-hidrofurano ou tetra-hidropirano. Cada Rº é independentemente como descrito no segundo conjunto de variáveis de Fórmula (1). As va- riáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito no primeiro ou segundo conjunto de variáveis de Fórmu- la (1).
[0049] No quarto conjunto de variáveis de Fórmula (1), o Anel C é Ca. cicloalquila opcionalmente substituída ou heteroarila de 5-6 mem- bros opcionalmente substituída; cada um de Rº e Rº é independente- mente como descrito no terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (1); e as variáveis restantes de Fórmula (|) são cada uma independente- mente como descrito em qualquer um dos primeiros a terceiros conjun-
tos de variáveis de Fórmula (1).
[0050] No quinto conjunto de variáveis de Fórmula (1), X é -O- ou —NH-; o Anel C é Ca. cicloalquila opcionalmente substituída ou hetero- arila de 5-6 membros opcionalmente substituída; e as variáveis restan- tes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a quarto conjuntos de variáveis de Fór- mula (1).
[0051] No sexto conjunto de variáveis de Fórmula (1), X é -O- ou — NH-; o Anel C é Ca. cicloalquila opcionalmente substituída ou hetero- arila de 5-6 membros opcionalmente substituída; cada um de Rº e R$ é independentemente como descrito no terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (1); e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a quinto conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0052] No sétimo conjunto de variáveis de Fórmula (1), o Anel B OS6 é opcionalmente substituído e selecionado de 0, “O, o
O ou O ;Xé-O-ou-NH-;e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a sexto conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0053] No oitavo conjunto de variáveis de Fórmula (1), o Anel B
OSS é opcionalmente substituído e selecionado de “O, O, Oo
O ou O ;Xé-O-ou-NH- o Anel C é Cas cicloalquila opcionalmente substituída ou heteroarila de 5-6 membros opcionalmente substituída; cada um de Rº e Rº é independentemente como descrito no terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (1); e as variáveis restantes de Fór- mula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qual- quer um dos primeiro a sétimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0054] No nono conjunto de variáveis de Fórmula (1), cada Rº é independentemente hidrogênio, -C1-1 alquila, halogênio, -OC71-2 alquila, - CN, -C3.4 cicloalquila ou -NRR', em que cada uma da dita Rº alquila e cicloalquila é independentemente opcionalmente substituída; e as va- riáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a oitavo conjuntos de va- riáveis de Fórmula (1).
[0055] No décimo conjunto de variáveis de Fórmula (1), cada Rº é independentemente hidrogênio ou um grupo opcionalmente substituído selecionado de C1-4 alquila, Ca4 alquenila, C2.4 alquinila, Cas cicloalquila ou fenila; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e inde- pendentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a nono conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0056] No décimo primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (1), cada Rº é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado de um pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxa- zol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolpirimidina, benzimidazol, benzotiazol, benzoxazol, tetra-hidrofurano, —oxetano, tetra-hidropirano, di- hdroisoxazol, pirimidino 2,4(1H,3H)-diona, di-hidrofuropirimidina, di- hidropiranopirimidina, di-hidropirrolpirimidina, tetra- hidropiridopirimidina, di-hidropiridopirimidina, di-hidrofuropiridina, di- hidropiridopiridina, tetra-hidropteridina ou isoindolino-1,3-diona; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a décimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0057] No décimo primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (1),
cada Rº é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado de imidazol, pirazol, pirimidina, furopirimidina, oxetano ou di-hidrofuropirimidina; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primei- ro a décimo primeiro conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0058] No décimo terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (1), cada Rº é independentemente hidrogênio ou um grupo opcionalmente Nx substituído selecionado de C1-« alquila, Rego. ou um grupo de anel selecionado de C3-5 cicloalquila, pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, tetra-hidrofurano, oxetano, tetra-hidropirano, di- hidroisoxazol ou fenila, em que X* é N ou CR*º; X? é N ou CRº, em que X' e X? não podem ser simultane- amente N; cada um de R*º , Rº*º e R** é independentemente hidrogê- nio, F, CI, Br, CN, NO>, C1+4 alquila, Co-4 alquil-C3-5 cicloalquila, Co-s al- quil-O-C14 alquila, Co-4 alquil-O-Co-4 alquil-Ca-5 cicloalquila, C2-4 alqueni- la, C2.4 alguinila, C(0)OC'1+4 alquila, C(0)OCo-+a alquil-C3-5 cicloalquila, C(O)NH>2, C(O)NHC1-4 alquila, C(O)N(C1-1 alquila)2, C(O)NH(Co+ alquil- C3-5 cicloalquila), um grupo heterocíclico selecionado de oxetano, aze- tidina, tetra-hidrofurano, di-hidropirano, tetra-hidropirano, morfolina, piperidina ou piperazina ou um grupo heteroarila selecionado de fura- no, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol ou tetrazol; ou R** e Rºº, ou Rºº e R*º, junto com os átomos intervenientes, formam opcionalmente um grupo de anel heterocíclico di-hidrofurano, di-hidropirano ou tetra- hidropiperidina; R*º é independentemente hidrogênio, F, CI, Br, CN, NO», C1-4 alquila, Co-4 alquil-O-C1-4 alquila, C2-4 alquenila, C2.4 alquinila, C(0)OC14 alquila, C(O)NH2, C(O)NHC1+4 alquila ou C(O)N(C1-1 alqui- la)2; cada um dos grupos de anel Rº é opcionalmente e independen- temente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em F, Cl, Br, CN, NO>, C1+4 alquila, Cos alquil-C3a-5 cicloalquila, Co-s alquil-O-C14 alquila, Cos alquil-O-Co-4 alquil-Ca-5 ciclo- alquila, C2.4 alquenila, C2.4 alquinila, C(O0)OC'1+4 alquila, C(0)OCo+ al- quil-C3.5 cicloalquila, C(O)NH2, C(O)NHC'14 alquila, C(O)N(C1-1 alqui- la), C(O)NH(Co+4 alquil-C3-5 cicloalquila), um grupo heterocíclico sele- cionado de oxetano, azetidina, tetra-hidrofurano, di-hidropirano, tetra- hidropirano, morfolina, piperidina ou piperazina e um grupo heteroarila selecionado de furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol ou te- trazol; cada um dos ditos grupos heterocíclico e heteroarila para Rºº, Rº*º” e R*º e para os substituintes de Rº é opcionalmente e independen- temente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -F, C1-4 alquila, -OH, -C(O)C1- alquila, -C(0)OC1- 4 alquila ou -C(0)OCo+4 alquil-C3-5 cicloalquila; e cada um dos ditos gru- pos alquila e cicloalquila para R*º, R*º e R*º* e para os substituintes de Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em —F e -OH. As va- riáveis restantes de Fórmula (|) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a décimo terceiro conjun- tos de variáveis de Fórmula (|).
[0059] No décimo quarto conjunto de variáveis de Fórmula (Il), ca- da Rº é independentemente C14 alquila ou um grupo de anel selecio- 1X
Ê nado de C35 cicloalquila, pirazol, imidazol, oxetano, SP ; (>
CP UH v o ou AZ , em que a dita Rº C14 alquila é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em -Br, -Cl, -F e -O(C14 alquila) e em que cada um dos ditos grupos de anel Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -
Br, -CI, -F, Cialquila, -CN, -O(C1-1 alquila), Ca-ecicloalquila, Cos alquil- O-C14 alquila, C(O)NHC1-+4 alquila, C(O)N(C1-« alquila)> e uma piperazi- na, em que cada um dos ditos substituintes Rº* opcionalmente é opcio- nalmente e independentemente substituído com um ou mais substi- tuintes selecionados do grupo consistindo em -F, Ci4alquila, -OH e - OCi4alquila. As variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e in- dependentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a dé- cimo terceiro conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0060] No décimo quinto conjunto de variáveis de Fórmula (1), ca- da Rº é independentemente como descrito no décimo quarto conjunto de variáveis de Fórmula (1), em que a Rº C14 alquila é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em —F e —O(C1+ alquila), e cada um dos grupos de anel Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em Ci4alquila, -O(C14 alquila), Co4 alquil-O-C14 alquila, C(O)NHC14 alquila, C(O)N(C14 alqui- la)) e uma piperazina, e em que cada um dos substituintes Rº opcio- nais é opcionalmente substituído com um ou mais C14 alquila. As vari- áveis restantes de Fórmula (|) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a décimo quarto conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0061] No décimo sexto conjunto de variáveis de Fórmula (1), cada um de R' e R? independentemente é hidrogênio, -C(O)NHR, - C(0)ORº, -NHC(O)Rº, -NHC(O)OR$, -Co4 alquil-NHRº, -ORº ou Rº. As variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a décimo quinto conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0062] No décimo sétimo conjunto de variáveis de Fórmula (1), Rº é opcionalmente substituído e selecionado de um pirrol, imidazol, pira- zol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pi-
rimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolpirimidi- na, benzimidazol, benzotiazol, benzoxazol, tetra-hidrofurano, oxetano, tetra-hidropirano, di-hidroisoxazol, pirimidino-2,4(1H,3H)-diona, di- hidrofuropirimidina, — di-hidropiranopirimidina, — di-hidropirrolpirimidina, tetra-hidropiridopirimidina, di-hidropiridopirimidina, di-hidrofuropiridina, di-hidropiridopiridina, tetra-hidropteridina ou isoindolino-1,3-diona. As variáveis restantes de Fórmula (|) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a décimo sexto conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0063] No décimo oitavo conjunto de variáveis de Fórmula (1), Rº é opcionalmente substituído e selecionado de uma pirimidina, imidazol, pirazol, tiazol, furopirimidina, pirrolpirimidina, benzimidazol, benzoti- azol, benzoxazol, oxetano, di-hidrofuropirimidina ou isoindolino-1,3- diona. As variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e indepen- dentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a décimo sé- timo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0064] No décimo nono conjunto de variáveis de Fórmula (1), R' é opcionalmente substituído e selecionado de uma pirimidina, pirazol, furopirimidina, tiazol ou isoindolino-1,3-diona; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a décimo oitavo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0065] No vigésimo conjunto de variáveis de Fórmula (1), X é -O-; e as variáveis restantes de Fórmula (|) são cada uma e independen- temente como descrito em qualquer um dos primeiro a décimo oitavo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0066] No vigésimo primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (1), X é -NH-; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e in- dependentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a dé- cimo oitavo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0067] No vigésimo segundo conjunto de variáveis de Fórmula (1), X é -CH7-; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e in- dependentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a dé- cimo oitavo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0068] No vigésimo terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (1), X é -OC14 alquila; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a décimo oitavo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0069] No vigésimo quarto conjunto de variáveis de Fórmula (1), o Anel C é Ca. cicloalquila opcionalmente substituída; e as variáveis res- tantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como des- crito em qualquer um dos primeiro a vigésimo terceiro conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0070] No vigésimo quinto conjunto de variáveis de Fórmula (1), o Anel C é ciclo-hexano opcionalmente substituído; e as variáveis res- tantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como des- crito em qualquer um dos primeiro a vigésimo quarto conjuntos de va- riáveis de Fórmula (1).
[0071] No vigésimo sexto conjunto de variáveis de Fórmula (1), R' é -C(O)NHR?, -C(0)ORº, -NHC(OJ)R, -NHC(O0)OR?, -NHC(O)NHR?, - NHS(O)2R$, -Co4 alquil-NHRº, -ORº ou R'; R? é hidrogênio; e as variá- veis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente co- mo descrito em qualquer um dos primeiro a vigésimo quinto conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0072] No vigésimo sétimo conjunto de variáveis de Fórmula (1), cada Rº é independentemente hidrogênio, metila, -Cl, -OCH3, -CN, ci- clopropila, -NHCH3 ou -N(CH3)2; Rº é hidrogênio ou metila; e as variá- veis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente co- mo descrito em qualquer um dos primeiro a vigésimo sexto conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0073] No vigésimo oitavo conjunto de variáveis de Fórmula (1), o Anel C é heteroarila de 5-8 membros opcionalmente substituída; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada e independentemente co- mo descrito em qualquer um dos primeiro a vigésimo sétimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0074] No vigésimo nono conjunto de variáveis de Fórmula (1), o Anel C é fenila opcionalmente substituída; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a vigésimo sétimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0075] No trigésimo conjunto de variáveis de Fórmula (1), o Anel C é fenila opcionalmente substituída; X é -OC14 alquila-; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a vigésimo sétimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0076] Em uma outra modalidade, os compostos da invenção são representados pela Fórmula (II) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos:
ATO i É O (Il), em que as variáveis de Fórmulas (ll) são cada uma independentemente como descrito abaixo.
[0077] No primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (II), cada uma das variáveis de Fórmula (II) é independentemente como descrito aci- ma em qualquer um dos primeiro a vigésimo sétimo conjuntos de vari- áveis de Fórmula (1).
[0078] No segundo conjunto de variáveis de Fórmula (II), R é - C(O)NHRº, -C(0)JORº, -NHC(O)Rº, -NHC(O0)ORº, -NHC(O)NHR?º, - NHS(O)2Rº, -Co.4 alquil-NHRº, -ORº ou R”; e R? é hidrogênio. As variá-
veis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente co- mo descrito em qualquer um dos primeiro a vigésimo sétimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0079] Em uma outra modalidade, os compostos da invenção são representados pela Fórmula (III-A-1), (III-A-2), (III-B-1) ou (I1I-B-2) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos: Rô 1 Rº NOR? Os NR?
S Y o OO O (I1I-A-1) (I11I-B-1), Rô 1 Rº NR? O NR? > vT “O º ST
OS RO CE) (I11-A-2) ou E) (I1I-B-2), em que as variáveis de Fórmula (Il) são cada uma independentemente como descrito abaixo.
[0080] No primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (Ill- A-2), (I1I-B-1) ou (I11-B-2), cada uma das variáveis de (III-A-1), (I11-A-2), (I1I-B-1) ou (II1I-B-2) é independentemente como descrito acima em qualquer um dos primeiro a vigésimo sétimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0081] No segundo conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (Ill- A-2), (III-B-1) ou (I1I-B-2), Rº é -C(O)NHR$, -C(0)ORº, -NHC(OJ)RS, - NHC(O0)ORº, -NHC(O)NHRº, -NHS(O)2Rº, -Cos alquil-NHRº, -ORº ou R'; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e indepen- dentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a vigésimo sétimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0082] No terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (Ill- A-2), (I1I-B-1) ou (I11-B-2), R' é —-C14 alquil-NHRº, -NHRº ou -OR$; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um do primeiro ou segundo conjunto de variáveis de (III-A-1), (I1I-A-2), (I1I-B-1) ou (11I-B-2).
[0083] No quarto conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (III-A- 2), (INI-B-1) ou (I1I-B-2), R' é -NHR$; e as variáveis restantes de Fórmu- la (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a terceiro conjuntos de variáveis de Fórmula (III-A-1), (I1I-A-2), (I1I-B-1) ou (I1I-B-2).
[0084] No quinto conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (III-A- 2), (INI-B-1) ou (I1I-B-2), R' é -OR$; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a quarto conjuntos de variáveis de Fórmula (II1-A-1), (Ill- A-2), (I11-B-1) ou (11I-B-2).
[0085] No sexto conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (III-A- 2), (III-B-1) ou (II1I-B-2), Rº independentemente é hidrogênio, metila, - Cl, -OCH3, -CN, ciclopropila, -NHCH3 ou -N(CH3)2; Rº é hidrogênio ou metila; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e inde- pendentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a quinto conjuntos de variáveis de Fórmula (III-A-1), (III-A-2), (II1I-B-1) ou (III-B- 2).
[0086] Em ainda uma outra modalidade, os compostos da inven- ção são representados pela Fórmula (IV) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos: (IV), em que as variáveis de Fórmula (IV) são ca- da uma e independentemente como descrito abaixo.
[0087] No primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (IV), cada uma das variáveis é independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a décimo terceiro conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0088] No segundo conjunto de variáveis de Fórmula (IV), R' é hi- drogênio, -C(O)NHR%, -C(O0)JOR%, -NHC(OJ)R, -NHC(O)JOR!, - NHC(O)NHRº, -NHS(O)2Rº, -Cos alquil-NHRº, -ORº ou R'; e as variá- veis restantes de Fórmula (IV) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a trigésimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0089] No terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (IV), o Anel B é opcionalmente substituído ÇQ. e as variáveis restantes de Fórmula (IV) são cada uma e independentemente como descrito no primeiro ou segundo conjunto de variáveis de Fórmula (IV).
[0090] Em ainda uma outra modalidade, os compostos da inven- ção são representados pela Fórmula (V-A) ou (V-B) ou sais farmaceu- ticamente aceitáveis dos mesmos: Ro Rº NR? Ro O. N& Rº
AS DS
N N Ç (V-A) ou Ç (V-B), em que cada uma das variáveis de Fórmula (V-A) ou (V-B) é indepen- dentemente como descrito abaixo.
[0091] No primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (V-A) ou (V- B), cada uma das variáveis é independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a trigésimo conjuntos de variáveis de Fórmu- la (1).
[0092] No segundo conjunto de variáveis de Fórmula (V-A) ou (V- B), Rº é hidrogênio, metila, ciclopropila, -F, -Cl, -OC1.2 alquila, -NRR' ou —CN, em que cada uma da dita Rº alquila é opcionamlente substitu- ída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em —F, -OH e —O(C1.2 alquila); cada Rº é independentemente opcio- nalmente substituído com C14 alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em —F, - OH e —O(C12 alquila); e R e R' são cada um e independentemente hi- drogênio ou C1-2 alquila. As variáveis restantes de Fórmula (V-A) ou (V-B) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a trigésimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[0093] No terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (V-A) ou (V- B), cada R? é independentemente hidrogênio, metila, -CI, -OCHs3, -CN, ciclopropila, -NHCH3 ou -N(CH3)2; e Rº é hidrogênio ou metila. As va- riáveis restantes de Fórmula (V-A) ou (V-B) são cada uma e indepen- dentemente como descrito no primeiro ou segundo conjunto de variá- veis de Fórmula (V-A) ou (V-B).
[0094] Em ainda uma outra modalidade, os compostos da inven- ção são representados por qualquer uma das Fórmulas (1), (II), (III-A- 1), (III-A-2), (I11-B-1), (I11-B-2), (IV), (V-A) e (V-B), ou sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos, em que cada uma das variáveis des- sas Fórmulas é independentemente como mostrada nas fórmulas es- truturais das Tabelas 1 e 2.
[0095] Em ainda uma outra modalidade, os compostos da inven- ção são como mostrados nas Tabelas 1 e 2 ou sais farmaceuticamen- te aceitáveis dos mesmos. Em uma modalidade específica, a invenção refere-se a um composto selecionado do grupo de compostos listados na Tabela 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em uma outra modalidade específica, a invenção refere-se a um composto selecionado do grupo de compostos listados na Tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[0096] Como usado aqui, as definições que seguem devem se aplicar a menos que de outro modo indicado. Para propósitos da pre- sente invenção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódica de Elementos, versão CAS, e o Handbook of Chemistry and Physics, 75º ed., 1994. Ainda, princípios gerais de quíi- mica orgânica são descritos em "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999 e "March's Advanced Orga- nic Chemistry," 5" Ed., Smith, M.B. e March, J., eds. John Wiley & Sons, New York: 2001, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência.
[0097] Como descrito aqui, os compostos da invenção podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes, tal como são ilustrados geralmente acima, ou como exemplificado por classes, subclasses e espécies particulares da invenção. Será compreendido que a expressão "opcionalmente substituído" é usada intercomutavel- mente com a expressão "substituído ou não substituído". Em geral, o termo "substituído", seja precedido pelo termo "opcionalmente" ou não, se refere à substituição de um ou mais radicais hidrogênio em uma dada estrutura com o radical de um substituinte especificado. A menos que de outro modo indicado, um grupo opcionalmente substituído pode ter um substituinte em cada posição substituível do grupo. Quando mais de uma posição em uma dada estrutura pode ser substituída com mais de um substituinte selecionado de um grupo especificado, o substituinte pode ser ou igual ou diferente em cada posição.
[0098] Como descrito aqui, quando o termo "opcionalmente substi- tuído" precede uma lista, o dito termo se refere a todos dos grupos substituíveis subsequentes nessa lista. Por exemplo, se X for halogê- nio; C1-3 alguila ou fenila opcionalmente substituída; X pode ser ou al- quila opcionalmente substituída ou fenila opcionalmente substituída.
Da mesma maneira, se o termo "opcionalmente substituído" seguir uma lista, o dito termo também se refere a todos os grupos substituí- veis na lista anterior a menos que de outro modo indicado. Por exem- plo: se X for halogênio, C1-3 alquila ou fenila, em que X é opcionalmen- te substituído por J*“, então ambas C1-3 alquila e fenila podem ser opci- onalmente substituídas por J*. Como é aparente a uma pessoa tendo habilidade comum na técnica, grupos tais como H, halogênio, NO», CN, NH2, OH ou OCF3 não seriam incluídos porque eles não são gru- pos substituíveis. Como será aparente a um versado na técnica, um anel heteroarila ou heterocíclico contendo um grupo NH pode ser op- cionalmente substituído através da substituição do átomo de hidrogê- nio com o substituinte. Se um radical ou estrutura substituinte não for identificado ou definido como "opcionalmente substituído", o radical ou estrutura substituinte é não substituído.
[0099] Combinações de substituintes previstas pela presente in- venção são preferivelmente aquelas que resultam na formação de compostos estáveis ou quimicamente viáveis. O termo "estável", como aqui usado, se refere a compostos que não são substancialmente alte- rados quando submetidos a condições para permitir sua produção, de- tecção e, preferivelmente, sua recuperação, purificação e uso para um ou mais dos propósitos revelados aqui. Em algumas modalidades, um composto estável ou composto quimicamente viável é um que não é substancialmente alterado quando mantido em uma temperatura de 40º C ou menos, na ausência de umidade ou outras condições quimi- camente reativas, por pelo menos uma semana.
[00100] O termo "alquila" ou "grupo alquila", como aqui usado, signi- fica uma cadeia de hidrocarboneto de cadeia reta (isto é, não ramíifica- da) ou ramificada, substituída ou não substituída que é completamente saturada. A menos que de outro modo especificado, grupos alquila contêm 1-8 átomos de carbono. Em algumas modalidades, grupos al-
quila contêm 1-6 átomos de carbono, e em ainda outras modalidades, grupos alquila contêm 1-4 átomos de carbono (representado como "C1- 4 alquila"). Em outras modalidades, grupos alquila são caracterizados como "Co alquila" representando ou uma ligação covalente ou uma cadeia C14 alquila. Exemplos de grupos alquila incluem metila, etila, propila, butila, isopropila, isobutila, sec-butila e terc-butila. O termo "al- quileno", como aqui usado, representa um grupo hidrocarboneto de cadeia reta ou ramificada divalente saturado e é exemplificado por me- tileno, etileno, isopropileno e similar. O termo "alquilideno", como aqui usado, representa um grupo de ligação alquila de cadeia reta divalen- te. O termo "alquenila", como aqui usado, representa grupo hidrocar- boneto de cadeia reta ou ramificada monovalente contendo uma ou mais ligações duplas carbono-carbono. O termo "alquinila", como aqui usado, representa um grupo hidrocarboneto de cadeia reta ou ramifi- cada monovalente contendo uma ou mais ligações triplas carbono- carbono.
[00101] O termo "cicloalquila" (ou "carbociclo") se refere a um hi- drocarboneto C3-Cg monocíclico ou hidrocarboneto Cg-C12 bicíclico que é completamente saturado e tem um ponto de ligação único ao resto da molécula, e em que qualquer anel individual no dito sistema de anel bicíclico tem 3-7 membros. Grupos cicloalquila adequados in- cluem, mas não estão limitados a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila e ciclo-heptila.
[00102] O termo "heterociclo", "heterociclila", "heterocicloalquila" ou "heterocíclico" como aqui usado se refere a um sistema de anel mono- cíclico, bicíclico ou tricícico em que pelo menos um anel no sistema contém um ou mais heteroátomos, que é igual ou diferente, e que é completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de in- saturação, mas que não é aromático, e que tem um ponto de ligação único ao resto da molécula. Em algumas modalidades, o grupo "hete-
rociclo", "heterociclila", "heterocicloalquila" ou "heterocíclico" tem três a quatorze membros no anel em que um ou mais membros do anel são um heteroátomo independentemente selecionado de oxigênio, enxofre, nitrogênio ou fósforo, e cada anel no sistema contém 3 a 8 membros no anel.
[00103] Exemplos de anéis heterocíclicos incluem os, mas não es- tão limitados aos, monociclos que seguem: 2-tetra-hidrofuranila, 3- tetra-hidrofuranila, — 2-tetra-hidrotiofenila, — 3-tetra-hidrotiofenila, — 2- morfolino, 3-morfolino, 4-morfolino, 2-tiomorfolino, 3-tiomorfolino, 4- tiomorfolino, 1-pirrolidinila, — 2-pirrolidinila, — 3-pirrolidinila, — 1-tetra- hidropiperazinila, 2-tetra-hidropiperazinila, 3-tetra-hidropiperazinila, 1- piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 1-pirazolinila, 3-pirazolinila, 4- pirazolinila, 5-pirazolinila, 1-piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4- piperidinila, 2-tiazolidinila, 3-tiazolidinila, 4-tiazolidinila, 1- imidazolidinila, 2-imidazolidinila, 4-imidazolidinila, 5-imidazolidinila; e os biciclos que seguem: 3-1H-benzimidazol-2-ona, 3-(1-alquil) benzimidazol-2-ona, indolinila, tetra-hidroquinolinila, tetra- hidroisoquinolinila, benzotiolano, benzoditiano e 1,3-di-hidro-imidazol- 2-ona.
[00104] O termo "heteroátomo" significa um ou mais de oxigênio, enxofre, nitrogênio ou fósforo, incluindo qualquer forma oxidada de ni- trogênio, enxofre ou fósforo; a forma quaternizada de qualquer nitro- gênio básico; ou um nitrogênio substituível de um anel heterocíclico, por exemplo, N (como em 3,4-di-hidro-2H-pirrolila),) NH (como em pir- rolidinila) ou NR* (como em pirrolidinila N-substituída).
[00105] O termo "insaturado", como aqui usado, significa que uma porção tem uma ou mais unidades de insaturação.
[00106] O termo "alcóxi" ou "ticoalquila", como aqui usado, se refere a um grupo alquila, como anteriormente definido, ligado à cadeia de carbono principal através de um átomo de oxigênio ("alcóxi") ou enxo-
fre ("tioalquila").
[00107] Os termos "haloalquila", "haloalquenila" e "haloalcóxi" signi- ficam alquila, alquenila ou alcóxi, conforme for o caso, substituído com um ou mais átomos de halogênio. O termo "halogênio" significa F, CI, Broul.
[00108] O termo "arila" usado sozinho ou como parte de uma por- ção maior como em "aralquila", "aralcóxi" ou "ariloxialquila" se refere a um sistema de anel carbocíclico monocíclico, bicíclico ou tricíclico ten- do um total de seis a quatorze membros no anel, em que o dito siste- ma de anel tem um ponto de ligação único ao resto da molécula, pelo menos um anel no sistema é aromático e em que cada anel no siste- ma contém 4 a 7 membros no anel. O termo "arila" pode ser usado in- tercomutavelmente com o termo "anel arila". Exemplos de anéis arila incluem fenila, naftila e antraceno.
[00109] O termo "heteroarila", usado sozinho ou como parte de uma porção maior como em "heteroalquila" ou "heteroalquilóxi", se refere a um sistema de anel monocíclico, bicíclico ou tricíclico tendo um total de cinco a quatorze membros no anel, em que o dito sistema de anel tem um ponto de ligação único ao resto da molécula, pelo menos um anel no sistema é aromático, pelo menos um anel no sistema contém um ou mais heteroátomos independentemente selecionados de nitro- gênio, oxigênio, enxofre ou fósforo, e em que cada anel no sistema contém 4 a 7 membros no anel. O termo "heteroarila" pode ser usado intercomutavelmente com o termo "anel heteroarila" ou o termo "hete- roaromático".
[00110] Exemplos adicionais de anéis heteroarila incluem os mono- ciclos que seguem: 2-furanila, 3-furanila, N-imidazolila, 2-imidazolila, 4- imidazolila, 5-imidazolila, 3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2- oxazolila, 4-oxazolila, 5-0xazolila, N-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 2- piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2-pirimidinila, 4-pirimidinila, 5-pirimidinila,
piridazinila (por exemplo, 3-piridazinila), 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5- tiazolila, tetrazolila (por exemplo, 5-tetrazolila), triazolila (por exemplo, 2-triazolila e 5-triazolila), 2-tienila, 3-tienila, pirazolila (por exemplo, 2- pirazolila), isotiazolila, 1,2,3-oxadiazolila, 1,2,5-oxadiazolila, 1,2,4- oxadiazolila, 1,2,3-triazolila, 1,2,3-tiadiazolila, 1,3,4-tiadiazolila, 1,2,5- tiadiazolila, pirazinila, 1,3,5-triazinila e os biciclos que seguem: benzi- midazolila, benzofurila, benzotiofenila, indolila (por exemplo, 2-indolila), purinila, quinolinila (por exemplo, 2-quinolinila, 3-quinolinila, 4- quinolinila)») e isoquinolinila (por exemplo, T1-isoquinolinila, 3- isoquinolinila ou 4-isoquinolinila).
[00111] Como descrito aqui, uma ligação desenhada a partir de um substituinte para o centro de um anel dentro de um sistema de anéis múltiplos (como mostrado abaixo) representa substituição do substi- tuinte em qualquer posição substituível em qualquer um dos anéis dentro do sistema de anéis múltiplos. Por exemplo, Estrutura represen- ta substituição possível em qualquer uma das posições mostradas na Estrutura b. x Ê NO x N x " x x Estrutura a Estrutura b
[00112] Isso também se aplica a sistemas de anéis múltiplos fundi- dos a sistemas de anel opcionais (que seriam representados por linhas pontilhadas). Por exemplo, na Estrutura c, X é um substituinte opcional para ambos o anel A e o anel B. Oi» Estrutura c
[00113] Se, no entanto, dois anéis em um sistema de anéis múlti- plos tiverem, cada um, substituintes diferentes desenhados a partir do centro de cada anel, então, a menos que de outro modo especificado,
cada substituinte representa apenas substituição no anel ao qual ele está ligado. Por exemplo, na Estrutura, d, Y é um substituinte opcional para o anel A apenas, e X é um substituinte opcional para o anel B apenas.
Y
A Estrutura d
[00114] O termo "grupo de proteção", como aqui usado, representa aqueles grupos pretendidos proteger um grupo funcional tais como, por exemplo, um álcool, amina, carboxila, carbonila, etc., contra rea- ções indesejáveis durante procedimentos sintéticos. Grupos de prote- ção comumente usados são revelados em Greene e Wuts, Protective Groups In Organic Synthesis, 3º Edição (John Wiley & Sons, New York, 1999), que é aqui incorporado a título de referência. Exemplos de grupos de proteção de nitrogênio incluem grupos acila, aroíla ou carbamila tais como formila, acetila, propionila, pivaloíla, t-butilacetila, 2-cloroacetila, 2-bromoacetila, trifluoracetila, tricloroacetila, ftalila, o- nitrofenoxiacetila, — a-clorobutirila, = benzoíla, 4-clorobenzoíla, 4- bromobenzoíla, 4-nitrobenzoíla e auxiliares quirais tais como D, L ou D, L-aminoácidos protegidos ou não protegidos tais como alanina, leu- cina, fenilalanina e similar; grupos sulfonila tais como benzenossulfoni- la, p-toluenossulfonila e similar; grupos carbamato tais como benziloxi- carbonila, p-clorobenziloxicarbonila, p-metoxibenziloxicarbonila, p- nitrobenziloxicarbonila, 2-nitrobenziloxicarbonila, p- bromobentziloxicarbonila, 3,4-dimetoxibenziloxicarbonila, 3,5- dimetoxibenziloxicarbonila, 2, 4-dimetoxibenziloxicarbonila, 4- metoxibenziloxicarbonila, 2-nitro-4,5-dimetoxibenziloxicarbonila, 3,4,5- trimetoxibenziloxicarbonila, — 1-(p-bifenilil)- 1-metiletoxicarbonila, “ a,a- dimetil-3,5-dimetoxibenziloxicarbonila, benzidriloxicarbonila, t butiloxicarbonila, — di-isopropilmetoxicarbonila, — isopropiloxicarbonila,
etoxicarbonila, metoxicarbonila, alliloxicarbonila, 2,2,2,- tricloroetoxicarbonila, fenoxicarbonila, 4-nitrofenoxi carbonila, fluorenil- 9-metoxicarbonila, ciclopentiloxicarbonila, adamantiloxicarbonila, ciclo- hexiloxicarbonila, feniltiocarbonila e similar, grupos arilalquila tais como benzila, trifenilmetila, benziloximetila e similar e grupos silila tais como trimetilsilla e similar. Grupos de N-proteção preferidos são formila, acetila, benzoíla, pivaloíla, t-butilacetila, alanina, fenilsulfonila, benzila, t-butiloxicarbonila (Boc) e benziloxicarbonila (Cbz). Exemplos de gru- pos de proteção hidroxila incluem éteres, tais como tetra-hidropiranila, terc-butila, benzila, alila e similar; éteres de silila tais como trimetil sili- la, trietil silila, tricisopropilsilila, terc-butil difenil silila e similar; éteres tais como acetila, trifluoracetila e similar; e carbonatos. Grupos de pro- teção hidroxila também incluem aqueles apropriados para a proteção de fenóis.
[00115] A menos que de outro modo mostrado ou declarado, estru- turas mencionadas aqui pretendem incluir todas as formas isoméricas (por exemplo, enantioméricas, diastereoméricas e geométricas (ou conformacionais)) da estrutura, por exemplo, as configurações Re S para cada centro assimétrico, isômeros de ligação dupla (Z) e (E) e isômeros conformacionais (Z) e (E). Sendo assim, isômeros estereo- químicos simples bem como misturas enantioméricas, diastereoméri- cas e geométricas (ou conformacionais) dos presentes compostos es- tão dentro do escopo da invenção. Os compostos que foram desenha- dos com centros estereoquímicos definidos, geralmente através do uso de ligação hachurada («+») ou em negrito (—=), são estereoquimi- camente puros, mas com a estereoquímica absoluta ainda indefinida. Tais compostos podem ter a configuração R ou S. Naqueles casos on- de a configuração absoluta foi determinada, o(s) centro(s) quiral(ais) é/são marcado(s) (R) ou (S) no desenho.
[00116] A menos que de outro modo declarado, todas as formas tautoméricas dos compostos da invenção estão dentro do escopo da invenção. Ainda, a menos que de outro modo declarado, estruturas mostradas aqui também pretendem incluir compostos que diferem apenas na presença de um ou mais átomos isotopicamente enriqueci- dos. Por exemplo, os compostos tendo as presentes estruturas, exceto pela substituição de hidrogênio por deutério ou trítio, ou a substituição de um carbono por um carbono enriquecido em *ºC ou **C, estão den- tro do escopo da presente invenção. Tais compostos são úteis, por exemplo, como ferramentas analíticas, sondas em ensaios biológicos ou como inibidores de DNA-PK com um perfil terapêutico aperfeiçoa- do.
Composições, Formulações e Administração de Compostos da Inven- ção
[00117] Em uma outra modalidade, a invenção provê uma composi- ção farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das fórmulas descritas aqui e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade adicional, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um composto da Tabela 1. Em uma mo- dalidade adicional, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um composto da Tabela 2. Em uma modalidade adi- cional, as composições compreendem ainda um agente terapêutico adicional.
[00118] De acordo com uma outra modalidade, a invenção provê uma composição compreendendo um composto da presente invenção ou um derivado farmaceuticamente aceitável o mesmo e um carrea- dor, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma moda- lidade, a quantidade de composto em uma composição da presente invenção é tal de modo que seja eficaz para inibir mensuravelmente uma DNA-PK em uma amostra biológica ou em um paciente. Em uma outra modalidade, a quantidade de composto nas composições da presente invenção é tal que seja eficaz para inibir mensuravelmente DNA-PK. Em uma modalidade, a composição da presente invenção é formulada para administração a um paciente com necessidade de tal composição. Em uma modalidade adicional, a composição da presente invenção é formulada para administração oral a um paciente.
[00119] O termo "paciente", como aqui usado, significa um animal, preferivelmente um mamífero e sobretudo preferivelmente um huma- no.
[00120] O termo "agente" é usado aqui para denotar um composto químico, uma molécula pequena, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extrato feito de materiais biológi- cos.
[00121] Como aqui usado, "tratamento" ou "tratando" ou "paliativo" ou "melhora" é usado intercomutavelmente. Esses termos se referem a uma abordagem para obtenção de resultados benéficos ou desejados incluindo, mas não limitado a, um benefício terapêutico e/ou um bene- fício profilático. Por benefício terapêutico quer dizer qualquer melhoria em ou efeito terapeuticamente relevante sobre uma ou mais doenças, condições ou sintomas sob tratamento. Para benefício profilático, as composições podem ser administradas a um indivíduo sob risco de desenvolver uma doença, condição ou sintoma particular ou a um indi- víduo reportando um ou mais dos sintomas fisiológicos de uma doen- ça, embora a doença, condição ou sintoma possa não ter ainda se manifestado. Esses termos também significam o tratamento de uma doença em um mamífero, por exemplo, em um humano, incluindo (a) inibir a doença, isto é, parar ou prevenir seu desenvolvimento; (b) ali- viar a doença, isto é, causar regressão do estado da doença; ou (c) curar a doença.
[00122] O termo "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeutica- mente eficaz" se refere à quantidade de um agente que é suficiente para obter resultados benéficos ou desejados. A quantidade terapeuti- camente eficaz pode variar dependendo de um ou mais de: o indivíduo e condição de doença sendo tratados, o peso e idade do indivíduo, a severidade da condição de doença, a maneira de administração e si- milar, que podem ser prontamente determinados por um versado co- mum na técnica. O termo se aplica também a uma dose que proverá uma imagem para detecção através de qualquer um dos métodos de imagem descritos aqui. A dose específica pode variar dependendo de um ou mais de: o agente particular escolhido, o regime de dosagem a ser seguido, se ele é administrado em combinação com outros com- postos, o momento de administração, o tecido a ter imagem feita e o sistema de administração físico em que ela é transportada.
[00123] “Como aqui usado, "administrar" se refere a contatar, injetar, dispensar, administrar ou aplicar um inibidor de DNA-PK a um indiví- duo, um sistema de edição genômica e/ou um inibidor de DNA-PK a uma célula ou indivíduo. Em algumas modalidades, a administração é contatar o sistema de edição genômica e/ou o inibidor de DNA-PK com uma célula(s). Em algumas modalidades, a administração é distribuir um sistema de edição genômica e/ou um inibidor de DNA-PK a uma célula(s). Em algumas modalidades, a administração é aplicar um sis- tema de edição genômica e/ou um inibidor de DNA-PK a uma célu- la(s). Em algumas modalidades, a administração é injeção de um sis- tema de edição genômica e/ou um inibidor de DNA-PK a uma célu- la(s). Administração pode ocorrer in vivo, ex vivo ou in vitro. Adminis- tração de um sistema de edição genômica e um inibidor de DNA-PK a uma célula(s) pode ser feita simultaneamente ou sequencialmente.
[00124] Otermo "adquirir" em referência a uma condição ou doença como aqui usado significa um distúrbio ou condição médica que se de- senvolve pós-fetalmente; em contraste com um distúrbio congênito, que está presente no nascimento. Um distúrbio congênito pode ser antecedente a um distúrbio adquirido.
[00125] O termo condição ou doença "congênita" ou "herdada" é um distúrbio encontrado no genoma de um indivíduo que está presente em um indivíduo no nascimento. O "genoma" como usado aqui inclui todo do material genético no núcleo e no citoplasma, e inclui ainda o genoma mitocondrinal e genoma ribossomal. O congênito ou herdado pode ser expresso em qualquer momento durante a vida do indivíduo, por exemplo, no nascimento ou na vida adulta.
[00126] Otermo "distúrbio genético" ou "doença genética" inclui mu- tações herdadas ou adquiridas no genoma de um indivíduo que cau- sam ou podem causar doença.
[00127] O termo "polimorfismo" ou "variações genéticas" significa formas diferentes de um gene em um locus genético.
[00128] Será também compreendido que certos dos compostos da presente invenção podem existir em forma livre para tratamento ou, onde apropriado, como um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo. De acordo com a presente invenção, um derivado farmaceuti- camente aceitável inclui, mas não está limitado a, profármacos, sais, ésteres, sais de tais ésteres ou qualquer outro aduto ou derivado far- maceuticamente aceitável que quando da administração a um paciente com necessidade seja capaz de prover, diretamente ou indiretamente, um composto como de outro modo aqui descrito, ou um metabolito ou resíduo do mesmo. Como aqui usado, o termo "metabolito ativo inibi- dor ou resíduo do mesmo" significa que um metabolito ou resíduo do mesmo é também um inibidor de DNA-PK.
[00129] Como aqui usado, o termo "sal farmaceuticamente aceitá- vel" se refere àqueles sais que são, dentro do escopo de julgamento médico importante, adequados para uso em contato com os tecidos de humanos e animais inferiores sem toxidez, irritação, resposta alérgica indevida e similar.
[00130] Sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica.
Por exemplo, S.
M.
Berge e outros descrevem sais farmaceu- ticamente aceitáveis em detalhes em J.
Pharmaceutical Sciences, 66:1-19, 1977, que é aqui incorporado a título de referência.
Sais far- maceuticamente aceitáveis dos compostos da presente invenção in- cluem aqueles derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicos adequados.
Exemplos de sais de adição ácidos não tóxicos, farmaceu- ticamente aceitáveis, são sais de um grupo amino formados com áci- dos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fos- fórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico ou com ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malônico ou usando outros métodos usados na técnica tal como troca iônica.
Outros sais farmaceuticamen- te aceitáveis incluem adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benze- nossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canfor- sulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecolsulfato, etanossulfonato, formiato, fumarato, glucoeptonato, glicerofosfato, glu- conato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, hidroiodeto, 2-hidróxi- etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotina- to, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3- fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succi- nato, sulfato, tartarato, tiocianato, p-toluenossulfonato, undecanoato, sais de valerato e similar.
Sais derivados de bases apropriadas inclu- em sais de metal alcalino, metal alcalinoterroso, amônio e N*(C14 al- quila)a.
A presente invenção também provê a quaternização de quais- quer grupos contendo nitrogênio básicos dos compostos revelados aqui.
Produtos solúveis ou dispersáveis em água ou óleo podem ser obtidos através de tal quaternização.
Sais de metal alcalino ou alcali- noterroso representativos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magné-
sio e similar. Sais farmaceuticamente aceitáveis adicionais incluem, quando apropriado, cátions de amônio, amônio quaternário e amina não tóxicos formados usados contraíons tais como haleto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, C1-8 sulfonato e aril sulfonato.
[00131] Como descrito acima, as composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção compreendem ainda um carreador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável que, como aqui usado, inclui qualquer e todos os solventes, diluentes ou outros veículo líquido, auxiliares de dispersão ou suspensão, agentes tensoativos, agentes isotônicos, agentes de espessamento ou emulsificantes, con- servantes, ligantes sólidos, lubrificantes e similar, conforme adequado para a forma de dosagem particular desejada. Em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21º edição, 2005, ed. D.B. Troy, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia e Enciclopedia of Pharma- ceutical Technology, eds. J. Swarbrick e J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nova York, os conteúdos de cada um são aqui incor- porados a título de referência, são revelados vários carreadores usa- dos em formulação de composições farmaceuticamente aceitáveis e técnicas conhecidas para a sua preparação. Exceto até o ponto que qualquer meio carreador convencional seja incompatível com os com- postos da invenção, tal como através da produção de qualquer efeito biológico indesejável ou de outro modo interagindo de uma maneira prejudicial com qualquer outro(s) componente(s) da composição far- maceuticamente aceitável, seu uso é compreendido estar dentro do escopo da presente invenção.
[00132] Alguns exemplos de materiais que podem servir como car- readores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limita- dos a, trocadores iônicos, alumina, estearato de alumínio, lecitina, pro- teínas do soro, tal como albumina do soro humano, substâncias- tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico ou sorbato de potás-
sio, misturas de glicerídeo parciais de ácidos graxos vegetais satura- dos, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidroge- no fosfato dissódico, hidrogeno fosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolido- na, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno- polioxipropileno, lanolina, açúcares tais como lactose, glicose e saca- rose; amidos tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados tais como carboximetil celulose sódica; etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipien- tes tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; óleos tal co- mo óleo de amendoim, óleo de semente de algodão; óleo de açafrão; óleo de sésamo; óleo de oliva; óleo de milho e óleo de soja; glicóis; tal como propileno glicol ou polietileno glicol; éteres tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes de tamponamento tais como hi- dróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirógeno; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool! de eti- la e soluções tampão de fosfato, bem como outros lubrificantes com- patíveis não tóxicos tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes de coloração, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, saborizantes e de per- fume, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.
[00133] As composições da presente invenção podem ser adminis- tradas oralmente, parenteralmente, através de spray de inalação, topi- camente, retalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente ou por meio de um reservatório implantado. O termo "parenteral" como aqui usado inclui técnicas de injeção ou infusão subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrassinovial, intraesternal, intratecal, in- traocular, intra-hepática, intralesional, epidural, intraespinhal e intra- cranial. Preferivelmente, as composições são administradas oralmen-
te, intraperitonealmente ou intravenosamente. Formas injetáveis esté- reis das composições da presente invenção podem ser suspensão aquosa ou oleaginosa. Essas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas no campo usando agentes de disper- são ou umectantes e agentes de suspensão adequados. A preparação injetável estéril pode também ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente parenteralmente aceitável não tóxi- co, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Dentre os veí- culos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Ainda, óleos fixos, estéreis, são convencionalmente empregados como um meio solvente ou de suspensão.
[00134] Para esse propósito, qualquer óleo fixo suave pode ser em- pregado incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Ácidos graxos, tais como ácido oleico e seus derivados de glicerídeo, são úteis na preparação de injetáveis, bem como óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como óleo de oliva ou óleo de rícino, especialmente em suas versões polioxietiladas. As soluções ou suspensões de óleo po- dem também conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tal como carboximetil celulose ou agentes de dispersão simila- res que são comumente usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões e suspensões. Ou- tros tensoativos comumente usados, tais como Owen, Spans e outros agentes emulsificantes ou aumentadores de biodisponibilidade que são comumente usados na fabricação de formas de dosagem sólidas, líquidas ou outras farmaceuticamente aceitáveis, também podem ser usados para os propósitos de formulação.
[00135] As composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser administradas oralmente em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo, mas não limitado a, cápsulas,
comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. No caso de compri- midos para uso oral, carreadores comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de mag- nésio, também são tipicamente adicionados. Para administração oral em uma forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas são requeridas para uso oral, o ingrediente ativo é combinado com agentes emulsificantes e de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes, saborizantes ou de coloração podem ser também adicionados.
[00136] É Alternativamente, as composições farmaceuticamente acei- táveis da presente invenção podem ser administradas na forma de su- positórios para administração retal. Esses podem ser preparados mis- turando o agente com um excipiente não irritante adequado que é sóli- do em temperatura ambiente, mas líquido em temperatura retal e, por- tanto, derreterá no reto para liberar o fármaco. Tais materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelha e polietileno glicóis.
[00137] As composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção também podem ser administradas topicamente, especial- mente quando o alvo de tratamento inclui áreas ou órgãos prontamen- te acessíveis através de aplicação tópica, incluindo doenças do olho, da pele ou do trato intestinal inferior. Formulações tópicas adequadas são prontamente preparadas para cada uma dessas áreas ou órgãos.
[00138] Aplicação tópica ao trato intestinal inferior pode ser realiza- da em uma formulação de supositório retal (vide acima) ou em uma formulação de enema adequada. Emplastros topicamente- transdérmicos podem ser também usados.
[00139] Para aplicações tópicas, as composições farmaceuticamen- te aceitáveis podem ser formuladas em um unguento adequado con- tendo o componente ativo suspenso ou dissolvido em um ou mais car- readores. Carreadores para administração tópica dos compostos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propileno glicol, polioxietileno, com- posto polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas em uma loção ou creme adequado contendo os componentes ativos sus- pensos ou dissolvidos em um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Carreadores adequados incluem, mas não estão limitados a, óleo mineral, monoestearato sorbitano, polissorbato 60, cera de és- teres de cetila, álcool de cetearila, 2-octildodecanol, álcool de benzila e água.
[00140] Para uso oftálmico, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas, por exemplo, como suspensões mi- cronizadas em solução salina estéril com pH ajustado, isotônica, ou outra solução aquosa, ou, preferivelmente, como soluções em solução salina estéril com pH ajustado, isotônica, ou outra solução aquosa, ou com ou sem um conservante tal como cloreto de benzalcônio. Alterna- tivamente, para usos oftálmicos, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas em um unguento tal como petrolato. As composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção também podem ser administradas através de aerossol nasal ou inala- ção. Tais composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas no campo de formulação farmacêutica e podem ser prepa- radas como soluções em solução salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para au- mentar a biodisponibilidade, fluorcarbonetos e/ou outros agentes de solubilização ou dispersão convencionais.
[00141] Sobretudo preferivelmente, as composições farmaceutica- mente aceitáveis da presente invenção são formuladas para adminis- tração oral.
[00142] Formas de dosagem líquidas para administração oral inclu-
em, mas não estão limitadas a, emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Em adi- ção aos compostos ativos, as formas de dosagem líquidas podem con- ter diluentes inertes comumente usados na técnica tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsi- ficantes tais como álcool de etila, álcool de isopropila, carbonato de etila, acetato de etila, álcool de benzila, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos (em particular óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germe, oliva, rícino e sé- samo), glicerol, álcool de tetra-hidrofurfurila, polietileno glicóis e éste- res de ácido graxo de sorbitano, e misturas dos mesmos. Além de di- luentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvan- tes tais como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de sus- pensão, agentes adoçantes, saborizantes e de perfume.
[00143] Preparações injetáveis, por exemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida usando agentes de dispersão ou umectantes e agentes de suspensão adequados. A preparação injetável estéril po- de também ser uma solução, suspensão ou emulsão injetável estéril em um diluente ou solvente parenteralmente aceitável não tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Dentre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados são água, solução de Ringer, U.S.P. e solução de cloreto de sódio isotônica. Ainda, óleos fixos, estéreis, são convencionalmente empregados como um meio solvente ou de suspensão. Para esse propósito, qualquer óleo fixo su- ave pode ser empregado incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Ainda, ácidos graxos tal como ácido oleico são usados na preparação de injetáveis.
[00144] As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, através de filtragem por um filtro de retenção bacteriana, ou através da incorporação de agentes esterilizantes na forma de compo- sições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril antes do uso.
[00145] A fim de prolongar o efeito de um composto da presente invenção, é frequentemente desejável deixar mais lenta a absorção do composto a partir de injeção subcutânea ou intramuscular. Isso pode ser realizado através do uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com solubilidade em água pobre. A taxa de absor- ção do composto então depende de sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, dissolução ou suspensão do composto em um veí- culo oleoso realiza absorção retardada de uma forma de composto pa- renteralmente administrada. Formas depósito injetáveis são feitas através de formação de matrizes microencapsuladas do composto em polímeros biodegradáveis tal como polilactídeo-poliglicolídeo. Depen- dendo da razão de composto para polímero e da natureza do polímero particular empregado, a taxa de liberação de composto pode ser con- trolada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem po- lifortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis depósito são também preparadas aprisionando o composto em lipossomas ou mi- croemulsões que são compatíveis com tecidos corporais.
[00146] “Composições para administração retal ou vaginal são prefe- rivelmente supositórios que podem ser preparados misturando os compostos da presente invenção com excipientes ou carreadores não irritantes adequados tal como manteiga de cacau, polietileno glicol ou uma cera de supositório que são sólidos em temperatura ambiente, mas líquidos na temperatura corporal e, portanto, derretem no reto ou cavidade vaginal e liberam o composto ativo.
[00147] Formas de dosagem sólidas para administração oral inclu- em cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólidas, o composto ativo é misturado com pelo menos um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio e/ou a) cargas ou extensores tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e ácido silícico, b) ligantes tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gela- tina, polivinilpirrolidona, sacarose e acácia, c) umectantes tal como gli- cerol, d) agentes desintegrantes tal como ágar-ágar, carbonato de cál- cio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos e car- bonato de sódio, e) agentes de retardo de solução tal como parafina, f) aceleradores de absorção tais como compostos de amônio quaterná- rio, (g) agentes umectantes tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerila, h) absorventes tais como caulim e argila bentonita e i) lubrificantes tais como talco, estearato de cálcio, esteara- to de magnésio, polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio e mis- turas dos mesmos. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, a forma de dosagem também pode compreender agentes de tampona- mento.
[00148] “Composições sólidas de um tipo similar podem também ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatina preenchida macia e dura usando excipientes tais como lactose ou açúcar do leite bem como polietileno glicol de alto peso molecular e similar. As formas de dosagem sólidas de comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânu- los podem ser preparadas com revestimentos e coberturas tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Elas podem conter opcionalmente agentes opacificantes e podem também ser de uma composição que elas liberam o(s) ingrediente(s) ativo(s) apenas, ou preferivelmente, em uma certa parte do trato intestinal, opcionalmente, de uma maneira retardada. Exemplos de composições de incorporação que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras. Composições sólidas de um tipo similar podem também ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatina preenchidas macias e duras usando excipientes do tipo tal como lactose ou açúcar do leite bem como polietileno glicóis de peso molecular alto e similar.
[00149] Os compostos ativos também podem estar em forma mi- croencapsulada com um ou mais excipientes como acima menciona- do. As formas de dosagem sólidas de comprimidos, drágeas, cápsu- las, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e co- berturas tais como revestimentos entéricos, revestimentos de controle de liberação e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Em tais formas de dosagem sólidas, o com- posto ativo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte tal como sacarose, lactose ou amido. Tais formas de dosagem podem também compreender, como é prática normal, substâncias adicionais que não diluentes inertes, por exemplo, lubrificantes de formação de comprimido e outros auxiliares de formação de comprimido tais como estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cápsu- las, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem também podem compreender agentes de tamponamento. Elas podem conter opcio- nalmente agentes de opacificação e podem também ser de uma com- posição que elas liberam o(s) ingrediente ativo apenas, ou preferivel- mente, em uma certa parte do trato intestinal, opcionalmente, de uma maneira retardada. Exemplos de composições de incorporação que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras.
[00150] Formas de dosagem para administração tópica ou trans- dérmica de um composto da presente invenção incluem unguentos, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, sprays, inalantes ou em- plastros. O componente ativo é misturado sob condições estéreis com um carreador farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões conforme necessário. Formulações oftálmicas, gotas para os ouvidos e colírios são também compreendidos como estando den- tro do escopo da presente invenção. Ainda, a presente invenção com- preende o uso de emplastros transdermais, que têm a vantagem adici- onada de provisão de administração controlada de um composto ao corpo. Tais formas de dosagem podem ser feitas dissolvendo ou dis- pensando o composto no meio apropriado. Aumentadores de absorção podem ser também usados para aumentar o fluxo do composto atra- vés da pele. A taxa pode ser controlada ou através da provisão de uma membrana de controle de taxa ou através da dispersão do com- posto em uma matriz de polímero ou gel.
[00151] Os compostos da invenção são preferivelmente formulados em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uni- formidade de dosagem. A expressão "forma de dosagem unitária" co- mo aqui usado se refere a uma unidade fisicamente distinta de agente apropriada para o paciente a ser tratado. Será compreendido, no en- tanto, que o uso diário total dos compostos e composições da presente invenção será decidido pelo médico acompanhante dentro do escopo de julgamento médico importante. O nível de dose eficaz específico para qualquer paciente ou organismo particular dependerá de uma va- riedade de fatores incluindo o distúrbio sendo tratado e a severidade do distúrbio; a atividade do composto específico empregado; a compo- sição específica empregada; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o momento de administração, via de administra- ção e taxa de excreção do composto específico empregado; a duração do tratamento, fármacos usados em combinação ou coincidentes com o composto específico empregado, e fatores similares bem conhecidos na técnica médica.
[00152] A quantidade dos compostos da presente invenção que po- dem ser combinados com os materiais carreadores para produzir uma composição em uma forma de dosagem única variará dependendo do hospedeiro tratado, do modo de administração particular. Preferivel- mente, as composições devem ser formuladas de modo que uma do- sagem entre 0,01-100 mg/kg de peso corporal/dia do inibidor possa ser administrada a um paciente recebendo essas composições.
[00153] “Dependendo da condição proliferativa ou câncer particular a ser tratado, agentes terapêuticos adicionais, que são normalmente administrados para tratar ou evitar tal condição, podem também estar presentes nas composições da presente invenção. Como aqui usado, agentes terapêuticos adicionais que são normalmente administrados para tratar ou evitar uma condição proliferativa ou câncer particular são conhecidos como "apropriados para a doença, ou condição, sendo tratada". Exemplos de agentes terapêuticos adicionais são providos infra.
[00154] A quantidade de agente terapêutico adicional presente nas composições da presente invenção não será mais do que a quantida- de que seria normalmente administrada em uma composição compre- endendo esse agente terapêutico como o único agente ativo. Preferi- velmente, a quantidade de agente terapêutico adicional nas composi- ções ora reveladas variará de a partir de cerca de 50% a 100% da quantidade normalmente presente em uma composição compreen- dendo esse agente como o único agente terapeuticamente ativo. Usos dos Compostos e Composições da Invenção
[00155] Em uma modalidade, a invenção provê um método de sen- sibilização de uma célula a um agente terapêutico ou um estado de doença que induz uma lesão em DNA compreendendo a etapa de con- tato da célula com um ou mais inibidores de DNA-PK de Fórmulas (I), (11), (IN-A-1), (II-A-2), (I11-B-1), (I11-B-2), (IV), (V-A) e (V-B) ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em uma modalidade espe- cífica, os métodos da invenção empregam um ou mais inibidores de DNA-PK de Fórmulas (1), (II), (III-A-1), (I1I-A-2), (III-B-1) e (I11-B-2) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00156] A invenção provê ainda métodos de potencialização de um regime terapêutico para tratamento de câncer compreendendo a etapa de administrar a um indivíduo com necessidade dos mesmos uma quantidade eficaz de um inibidor de DNA-PK de (1), (II), (III-A-1), (III-A- 2), (III-B-1), (I11I-B-2), (IV), (V-A) e (V-B) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em uma modalidade específica, os métodos da invenção empregam um ou mais inibidores de DNA-PK de Fórmulas (1), (II), (IN-A-1), (I11-A-2), (I11-B-1) e (I11-B-2) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Em um aspecto, o regime terapêutico para tratamento de câncer inclui terapia com radiação.
[00157] Os compostos da invenção são úteis em casos onde tera- pia com radiação é indicada para aumentar o benefício terapêutico de tal tratamento. Ainda, terapia com radiação é indicada frequentemente como um adjuvante para cirurgia no tratamento de câncer. O objetivo da terapia com radiação na configuração adjuvante é reduzir o risco de recorrência e aumentar a sobrevivência livre de doença quando o tu- mor primário foi controlado. Terapia com radiação adjuvante é indicada em várias doenças incluindo cânceres de cólon, retal, pulmão, gastro- esofageal e mama como descrito abaixo.
[00158] A invenção também pode ser praticada incluindo um outro agente quimioterapêutico anticâncer com um composto da invenção em um regime terapêutico para o tratamento de câncer, com ou sem terapia de radiação. A combinação de um composto inibidor de DNA- PK da invenção com outros agentes do tipo pode potencializar o pro- tocolo quimioterapêutico. Por exemplo, o composto inibidor da inven- ção pode ser administrado com etoposídeo ou bleomicina, agentes conhecidos causar quebra de filamento de DNA.
[00159] A invenção refere-se ainda à radiossensibilização de célu- las de tumor utilizando os compostos da invenção, tais como inibidores de DNA-PK de Fórmulas (1), (II), (INI-A-1), (III-A-2), (III-B-1) e (I1I-B-2), ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Os compostos preferidos são aqueles como descrito para as composições farmacêu- ticas da invenção. Um composto que pode "radiossensibilizar" uma célula, como usado aqui, é definido como uma molécula, preferivel- mente uma molécula de peso molecular baixo, administrada a animais em quantidade terapeuticamente eficaz para aumentar a sensibilidade de células à radiação eletromagnética e/ou promover o tratamento de doenças que são tratáveis com radiação eletromagnética (por exem- plo, raios X). Doenças que são tratáveis com radiação eletromagnética incluem doenças neoplásticas, tumores benignos e malignos e células cancerosas.
[00160] A presente invenção também provê métodos de tratamento de câncer em um animal que inclui administrar ao animal uma quanti- dade eficaz de um inibidor de DNA-PK tal como, por exemplo, um composto da invenção. A invenção refere-se ainda a métodos de inibi- ção de crescimento de célula de câncer, incluindo processos de proli- feração celular, invasividade e metástase em sistemas biológicos. Os métodos incluem uso de um composto da invenção como um inibidor de crescimento de célula de câncer. Preferivelmente, os métodos são empregados para inibir ou reduzir crescimento de célula de câncer, invasividade, metástase ou incidência de tumor em animais vivos, tais como mamíferos. Os compostos da invenção podem ser usados, ou sozinhos ou em combinação com o uso de IR ou um ou mais agentes quimioterapêuticos, em tratamento de câncer ou inibição de cresci- mento de célula de câncer. Os métodos da invenção são também prontamente adaptáveis para uso em sistemas de ensaio, por exem- plo, ensaio de crescimento de célula de câncer e suas propriedades, bem como identificação de compostos que afetam o crescimento da célula de câncer.
[00161] Tumores ou neoplasmas incluem crescimentos de células de tecido em que a multiplicação das células é descontrolada e pro- gressiva. Alguns de tais crescimentos são benignos, mas outros são chamados "malignos" e podem levar à morte do organismo. Neoplas- mas malignos ou "cânceres" são distinguidos de crescimentos benig- nos pelo fato que, em adição a exibir proliferação celular agressiva, eles podem invadir tecidos circundantes e metastatizar. Além disso, neoplasmas malignos são marcados por mostrarem uma perda maior de diferenciação ("desdiferenciação" maior) e sua organização em re- lação uns aos outros e seus tecidos circundantes. Essa propriedade é também chamada "anaplasia".
[00162] Neoplasmas tratáveis pela presente invenção também in- cluem tumores sólidos, isto é, carcinomas e sarcomas. Carcinomas incluem aqueles neoplasmas malignos derivados de células epiteliais que infiltram (invadem) os tecidos circundantes e dão origem a metás- tases. Adenocarcinomas são carcinomas derivados de tecido glandu- lar, ou de tecidos que formam estruturas glandulares reconhecíveis. Uma outra categoria ampla de cânceres inclui sarcomas, que são tu- mores cujas células são incrustradas em uma substância fibrilar ou homogênea tal como tecido conectivo embriônico. A invenção também permite tratamento de cânceres do sistema mieloide ou linfoide, inclu- indo leucemias, linfomas e outros cânceres que tipicamente não se apresentam como uma massa de tumor, mas estão distribuídos no sis- tema vascular ou linforreticular.
[00163] Atividade de DNA-PK pode estar associada com várias formas de câncer em, por exemplo, oncologia adulta e pediátrica, crescimento de tumores/malignidades sólidas, carcinoma mixoide e de células redondas, tumores localmente avançados, câncer metastático, sarcomas de tecido mole humano, incluindo sarcoma de Ewing, me- tástases de câncer, incluindo metástases linfáticas, carcinoma de célu-
la escamosa, particularmente da cabeça e pescoço, carcinoma de cé- lula escamosa esofageal, carcinoma oral, malignidades de célula san- guínea, incluindo mieloma múltiplo, leucemias, incluindo leucemia lin- focítica aguda, leucemia não linfocítica aguda, leucemia linfocítica crô- nica, leucemia mielocítica crônica e leucemia de célula pilosa, linfomas de efusão (linfomas baseados na cavidade corporal), câncer de pul- mão de linfoma tímico, incluindo carcinoma de pulmão de pequenas células, linfoma de célula T cutâneo, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer do córtex adrenal, tumores de produção de ACTH, cânceres de não pequenas células, câncer de mama, incluindo carci- noma de célula pequena e carcinoma ductal, cânceres gastrintestinais, incluindo câncer de estômago, câncer de cólon, câncer colorretal, póli- pos associados com neoplasia colorretal, câncer pancreático, câncer de fígado, cânceres urológicos, incluindo câncer de bexiga, incluindo tumores da bexiga superficiais primários, câncer de próstata, maligni- dades do trato genital feminino, incluindo carcinoma ovariano, neo- plasmas epiteliais peritoneais primários, carcinoma cervical, cânceres endometriais uterinos, câncer vaginal, câncer da vulva, câncer uterino e tumores sólidos no folículo ovariano, malignidades do trato genital masculino, incluindo câncer testicular e câncer de pênis, câncer de rim, incluindo carcinoma de célula renal, câncer de cérebro, incluindo tumores cerebrais intrínsecos, neuroblastoma, tumores cerebrais as- trocíticos, gliomas, invasão de célula de tumor metastático no sistema nervoso central, cânceres de osso, incluindo osteomas e osteossar- comas, cânceres de pele, incluindo melanoma maligno, progressão de tumor de queratinócitos de pele humanos, câncer de célula escamosa, câncer da tireoide, retinoblastoma, neuroblastoma, efusão peritoneal, efusão pleural maligna, mesotelioma, tumor de Wilm, câncer da vesí- cula, neoplasmas trofoblásticos, hemangiopericitoma e sarcoma de Kaposi.
Métodos para potencializar tratamento dessas e outras formas de câncer são compreendidos pela invenção.
[00164] A invenção provê um método de inibição de atividade de DNA-PK em uma amostra biológica que inclui contato da amostra bio- lógica com um composto ou composição da invenção. O termo "amos- tra biológica", como aqui usado, significa uma amostra fora de um or- ganismo vivo e inclui, sem limitação, culturas de célula ou seus extra- tos; material que sofreu biópsia obtido de um mamífero ou seus extra- tos; e sangue, saliva, urina, fezes, sêmen, lágrimas ou outros fluidos corporais ou seus extratos. Inibição de atividade de cinase, particular- mente atividade de DNA-PK, em uma amostra biológica é útil para uma variedade de propósitos conhecidos de um versado na técnica. Exemplos de tais propósitos incluem, mas não estão limitados, arma- zenamento de espécime biológico e ensaios biológicos. Em uma mo- dalidade, o método de inibição de atividade de DNA-PK em uma amostra biológica é limitado a métodos não terapêuticos.
[00165] Em algumas modalidades, a presente invenção provê mé- todos, composições e estojos para edição de um genoma-alvo, por exemplo, através da correção de uma mutação. Tais métodos, compo- sições e estojos podem aumentar a eficiência de edição do genoma através do uso de um inibidor de DNA-PK.
[001668] Um sistema de edição genômica pode estimular ou induzir uma quebra(s) de DNA, tal como DSB(s) no /ocus desejado no geno- ma (ou região genômica-alvo). A criação de clivagem de DNA induz as enzimas celulares a reparar o sítio de quebra através ou da via NHEJ propensa a erro ou através da via HDR livre de erro. Em NHEJ, a le- são de DNA é reparada através da fusão das duas extremidades da quebra de DNA em uma série de processos enzimáticos envolvendo heterodímero Ku70/80 e enzimas proteína cinase dependentes de DNA (DNA-PK). O mecanismo de reparo envolve união e alinhamento de duas extremidades de DNA, ressecção, alongamento e ligação
(Rouet e outros: Dexheimer T. DNA repair pathways and mechanisms. Em: Mathews L, Cabarcas S, Hurt E, editors. DNA repair of cancer stem cells. Dordrecht: Springer; 2013. p. 19-32) resultando na forma- ção de mutações de inserção ou deleção pequenas (indels) no sítio de quebra. Indels introduzidas na sequência de codificação de um gene podem causar ou códon de parada prematuro ou mutações de mudan- ça de estrutura que levam à produção de proteínas truncadas, não funcionais. O mecanismo de via de HDR é menos compreendido e en- volve um conjunto diferente de proteínas de reparo tal como Rad51 que estimula invasão de filamento por um modelo de reparo doador para inserção de base ou substituição de gene. Sendo assim, HDR permite introdução de modelo de DNA exógeno para obter um resulta- do desejado de edição de DNA dentro de um genoma e pode ser uma estratégia poderosa para modelagem de doença traducional e edição terapêutica de genoma para restaurar função de gene.
[00167] Das duas vias de reparo de DNA, NHEJ ocorre em uma frequência muito maior e relatos de mais de 70% de eficiência podem ser obtidos mesmo em neurônios (Swiech e outros, "In vivo interrogati- on of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9," Nat Biotechnol. 2015 Jan;33(1):102-62014). A correção de gene de HDR, no entanto, ocorre em uma frequência muito baixa e durante fases S e G2 quando replicação de DNA está terminada e cromátides irmãs es- tão disponíveis para servir como modelos de reparo (Heyer e outros, Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Revi- ew of Genetics 44:113—139, 2010). Uma vez que NHEJ ocorre em to- do o ciclo celular, em competição e é favorecida com relação a HDR durante as fases S e G2, inserção direcionada através da via de HDR permanece um desafio e um foco de estudos continuados.
[00168] A DNA proteína-cinase (DNA-PK) desempenha um papel em vários processos de reparo de DNA. DNA-PK participa em reparo de quebra de filamento de DNA duplo através da ativação da via de união de extremidades não homólogas (NHEJ). NHEJ é pensada prosseguir através de três etapas: reconhecimento de DSBs, proces- samento de DNA para remover extremidades não ligáveis ou outras formas de dano nos terminais, e finalmente ligação das extremidades de DNA. Reconhecimento da DSB é realizado através de ligação do heterodímero de Ku às extremidades de DNA irregulares seguido por recrutamento de duas moléculas de subunidade catalítica de proteína cinase dependente de DNA (DNA-PKcs) para lados adjacentes da DSB; isso serve para proteger os terminais quebrados até que enzi- mas de processamento adicionais sejam recrutadas. Dados recentes suportam a hipótese que DNA-PKCcs fosforilam a enzima de processa- mento, Artemis, bem como a si mesmas, para preparar as extremida- des do DNA para processamento adicional. Em alguns casos, polime- rase de DNA pode ser requerida para sintetizar novas extremidades antes da etapa de ligação. A autofosforilação de DNA-PKCs é acredi- tada induzir uma mudança conformacional que abre a cavidade de |i- gação de DNA central, libera DNA-PKcs do DNA e facilita a religação final das extremidades do DNA.
[00169] Em algumas modalidades, a presente invenção provê mé- todos, composições e estojos para aumentar a edição de gene, em particular aumentar a eficiência de reparo de quebra(s) de DNA por meio de uma via de HDR, ou a eficiência de inibir ou suprimir reparo de quebra(s) de DNA por meio da via de NHEJ, em sistemas de edi- ção de genoma, incluindo reparo de HDR baseado em CRISPR em células. Embora não sendo limitado por nenhuma teoria particular, é acreditado que um sistema de edição de genoma administrado a uma célula(s) interaja com um ácido(s) nucleico(s) do gene-alvo, resultando em ou causando uma quebra de DNA; tal quebra de DNA é reparada por várias vias de reparo, por exemplo, HDR, e um inibidor de DNA-PK administrado a uma célula(s) para inibir, bloquear ou suprimir uma via de reparo de NHEJ, e a frequência ou eficiência de via de reparo de DNA de HDR pode ser aumentada ou promovida.
[00170] A interação entre um sistema de edição de genoma com um ácido(s) nucleico do gene-alvo pode ser hibridização de pelo me- nos parte do sistema de edição de genoma com o(s) ácido(s) nuclei- co(s) do gene-alvo ou qualquer outro reconhecimento do(s) ácido(s) nucleico(s) do gene-alvo pelo sistema de edição de genoma. Em al- gumas modalidades, tal interação é uma interação de proteína-DNA ou hibridização entre pares de base.
[00171] Em algumas modalidades, a presente invenção provê mé- todos de edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo em uma cé- lula(s) através da administração à(s) célula(s) de um sistema de edi- ção de genoma e um inibidor de DNA-PK. A edição pode ocorrer si- multaneamente ou sequencialmente. Edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo inclui qualquer tipo de manipulações genéticas ou en- genharia do genoma de uma célula. Em algumas modalidades, a edi- ção da uma ou mais regiões genômicas-alvo pode incluir inserções, deleções ou substituições de regiões genômicas em uma célula(s). Regiões genômicas compreendem o material genético em uma célu- la(s), tal como DNA, RNA, polinucleotídeos e oligonucleotídeos. Regi- ões genômicas em uma célula(s) também compreendem os genomas da mitocôndria ou cloroplastos contidos em uma célula(s).
[00172] Em algumas modalidades, as inserções, deleções ou subs- tituições podem estar ou em uma região genômica de codificação ou não codificação, em regiões intrônicas ou exônicas ou quaisquer com- binações das mesmas incluindo seus segmentos de sobreposição e não sobreposição. Como aqui usado, uma "região de não codificação" se refere a regiões genômicas que não codificam uma sequência de aminoácido. Por exemplo, regiões de não codificação incluem íntrons.
Regiões de codificação se referem a regiões genômicas que codificam uma sequência de aminoácido. Por exemplo, regiões de codificação incluem éxons.
[00173] Em algumas modalidades, a edição de uma ou mais regi- ões genômicas-alvo pode ocorrer em qualquer uma ou amis regiões- alvo em um genoma de uma célula(s). Em algumas modalidades, a edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo pode ocorrer, por exemplo, em um éxon, um íntron, um sítio de início de transcrição, em uma região promotora, uma região aumentadora, uma região silencia- dora, uma região isolante, um antirrepressor, um elemento regulador pós-traducional, um sinal de poliadenilação (por exemplo, poli A míni- mo), uma região conservada, um sítio de ligação de fator de transcri- ção ou quaisquer combinações dos mesmos.
[00174] Em algumas modalidades, administração a uma célula(s) com um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica resulta em uma eficiência de edição de genoma direcionada aumentada com- parado com condições em que um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica não são administrados a uma célula(s). Em algu- mas modalidades, a eficiência de edição aumentada é cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, em comparação com uma condição em que um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não são administrados a uma célula(s), ou compa- rado com uma condição em que apenas um sistema de edição de ge- noma e não um inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula(s). A eficiência de edição genômica pode ser medida através de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, através de qualquer méto- do que determine a frequência de integração de polinucleotídeo direci- onada ou através da medição da frequência de mutagênese direciona- da. Integrações de polinucleotídeo direcionadas pode também resultar em alteração ou substituição de uma sequência em um genoma, cro- mossoma ou uma região de interesse em cromatina celular. Integra- ções de polinucleotídeo direcionadas podem resultar em mutações di- recionadas incluindo, mas não limitado a, mutações por ponto (isto é, conversão de um par de base único em um par de base diferente), substituições (isto é, conversão de uma pluralidade de pares de base em uma sequência diferente de comprimento idêntico), inserções de um ou mais pares de base, deleções de um ou mais pares de base e qualquer combinação das alterações de sequência mencionadas aci- ma.
[00175] Em algumas modalidades, os métodos de edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo em uma célula(s) envolve administra- ção à célula(s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, a(s) célula(s) é sincronizada na fase de ciclo celular S ou G2. Sincronização da(s) célula(s) na fase de ciclo celular S ou G2 pode ser obtida através de qualquer método co- nhecido na técnica. Como um exemplo não limitante, agentes que po- dem ser usados para sincronizar uma célula(s) na fase de ciclo celular S ou G2 incluem afidicolina, diroxiureia, lovastatina, mimosina, noco- dazol, timidina ou qualquer combinação dos mesmos. (Vide Lin e ou- tros. "Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery," Elife. 2014 Dec 15;3). Em algumas modalidades, os agentes para sincronização de célula podem ser administrados em qualquer momento durante o processo de edi- ção de gene. Em algumas modalidades, uma célula(s) pode ser sin- cronizada na fase S ou G2 do ciclo celular antes, durante ou após ad- ministração a uma célula(s) de um sistema de edição de genoma e/ou um inibidor de DNA-PK.
[00176] Em algumas modalidades, os métodos de edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo em uma célula(s) através da adminis-
tração à(s) célula(s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK resultam em sobrevivência celular aumentada em compa- ração com condições em que um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK não foram administradas a uma célula(s), ou em comparação com condições em que apenas um sistema de edição de gene é contatado ou administrado a uma célula(s) e não um inibidor de DNA-PK.
[00177] Em algumas modalidades, são providos aqui métodos de reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas- alvo por meio de uma via de HDR. A administração a uma célula(s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK resulta em uma quebra de DNA de uma região direcionada do genoma, e a que- bra do DNA é subsequentemente reparada, pelo menos em parte, por uma via de HDR. Esses métodos resultam em quantidades aumenta- das de reparo mediado por HDR (por exemplo, via de HDR) na uma ou mais regiões genômicas-alvo resultando em eficiência maior de reparo mediado por HDR comparado com condições em que um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica não são administrados a uma célula. Em algumas modalidades, a eficiência de reparo mediado pela via de HDR da quebra de DNA é cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 ve- zes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 ve- zes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes em comparação com uma con- dição em que um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de ge- noma não são administrados a uma célula(s), ou comparado com uma condição em que apenas um sistema de edição de genoma e não um inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula(s). A eficiência de re- paro mediado por via de HDR pode ser medida através de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, através da verificação da frequência de integração de polinucleotídeo direcionada ou através da medição da frequência de mutagênese direcionada.
[00178] Em algumas modalidades, os presentes métodos proveem reparo da quebra de DNA através do aumento da eficiência da via de HDR.
[00179] Aviade HDR pode ser "canônica" ou "alternativa". "HDR" (reparo direcionado por homologia) se refere a uma forma especializa- da de reparo de DNA que acontece, por exemplo, durante reparo de quebras de filamento duplo ou um nick de DNA em uma célula(s). HDR de quebras de filamento duplo é geralmente baseada em homo- logia de sequência de nucleotídeo, usa uma molécula "doadora" para reparo de modelo de uma molécula-"alvo" (por exemplo, a que sofre quebra de filamento duplo) e pode levar à transferência de informação genética a partir do doador para o alvo. HDR canônica de quebras de filamento duplo é geralmente baseada em BRCA2 e RAD51 e empre- ga tipicamente uma molécula doadora de dsDNA. HDR não canônica ou "alternativa" é um mecanismo de HDR que é suprimido por BRCA2, RADS51 e/ou genes funcionalmente relacionados. HDR alternativa pode usar um ssSDNA ou molécula doadora de dsDNA com nick. Vide, por exemplo, WO 2014172458.
[00180] Em algumas modalidades, os métodos de reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas-alvo por meio de uma via de HDR através da administração à(s) célula(s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK resulta tem sobrevi- vência celular aumentada em comparações com condições em que um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK não são ad- ministrados a uma célula(s) ou em comparação com condições em que apenas um sistema de edição de gene é administrado a uma célu- la(s) e não um inibidor de DNA-PK.
[00181] Em algumas modalidades, são providos aqui métodos de inibição ou supressão de reparo mediado por NHEJ de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas-alvo em uma célula(s). Em algumas modalidades, a inibição ou supressão de reparo mediado por NHEJ de uma quebra de DNA é realizada através da inibição ou su- pressão da via de NHEJ. A via de NHEJ pode ser ou clássica ("canô- nica") ou uma via de NHEJ alternativa (alt-NHEJ ou união de extremi- dade mediada por micro-homologia (MMEJ)). A via de NHEJ ou via alt- NHEJ é suprimida em uma célula(s) através da administração a uma célula(s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA- PK.
[00182] A via de reparo de NHEJ clássica é uma via de reparo de quebra de filamento duplo de DNA em que as extremidades da quebra de filamento duplo são ligadas sem homologia extensiva. Reparo de NHEJ clássico usa vários fatores, incluindo heterodímero KU70/80 (KU), XRCCA4, Ligase IV e subunidade catalítica de DNA proteínas ci- nases (DNA-PKcs). AIt-NHEJ é uma outra via para reparo de quebras de filamento duplo. AIt-NHEJ usa uma sequência micro-homóloga de 5-25 pares de base durante alinhamento de extremidades quebradas antes da união das extremidades quebradas. AIt-NHEJ é bastante in- dependente de heterodímero KU70/80 (KU), XRCCA, Ligase |V, subu- nidade catalítica de DNA proteína cinase (DNA-PKcs), RAD52 e ERCC1. Vide, Bennardo e outros, "Alternative-NHEJ is a Mechanisti- cally Distinct Pathway of Mammalian Chromosome Break Repair," PLOS Genetics, Junho 27, 2008.
[00183] Em algumas modalidades, os métodos de inibição ou su- pressão de reparo mediado por NHEJ de uma quebra de DNA por meio da via de NHEJ em uma ou mais regiões genômicas-alvo em uma célula(s) através da inibição ou subpressão da via de NHEJ atra- vés da administração a uma célula(s) de um sistema de edição genô- mica e um inibidor de DNA-PK resulta em eficiência aumentada de ini- bição ou supressão do reparo mediado por NHEJ da quebra de DNA em comparação com uma célula(s) que não recebeu um sistema de edição genômica e um inibidor de DNA-PK ou em comparação com uma condição em que a(s) célula(s) recebe(m) um sistema de edição genômica e não um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, a eficiência aumentada de inibição ou supressão de reparo de uma que- bra de DNA por meio da via de NHEJ através de contato de uma célu- la(s) com um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma é cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 ve- zes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, em comparação com uma condição em que um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não é administrado a uma célula(s) ou comparado com uma condição em que apenas um sistema de edi- ção de genoma e não um inibidor de DNA-PK é administração a uma célula(s). A eficiência de inibição ou supressão de reparo de uma que- bra de DNA por meio da via de NHEJ pode ser medida através de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, verificando a fre- quência de integração de polinucleotídeo direcionada ou através da medição da frequência de mutagênese direcionada.
[00184] Em algumas modalidades, os métodos de inibição ou su- pressão de reparo mediado por NHEJ de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas-alvo em uma célula(s) através de inibição ou supressão da via de NHEJ através da administração a uma célu- la(s) de um sistema de edição genômica e um inibidor de DNA-PK re- sulta em sobrevivência de célula aumentada em comparação com condições em que um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK não foram contatados ou administrados a uma célula(s) ou em comparação com condições em que apenas um sistema de edição de gene é contatado ou administrado a uma célula(s) e não um inibidor de DNA-PK.
[00185] A quebra de DNA pode ser uma quebra de filamento duplo (DSB) ou duas quebras de filamento simples (por exemplo, dois nicks de DNA). A DSB pode ser de extremidade cega ou ter ou uma sobre- posição 5' ou 3', se os filamentos forem cada um clivados muito distan- tes, as sobreposições continuarão a anelar uma para a outra e existir como dois nicks, não uma DSB.
[00186] Em algumas modalidades, são providos aqui métodos de modificação da expressão de um ou mais genes (um gene(s)-alvo), e/ou proteínas correspondentes ou a jusante, através da administração a uma célula(s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma pode criar, por exemplo, inserções, deleções, substituições, modifica- ção ou rompimento em uma região(s) genômica(s)-alvo de um gene- alvo da(s) célula(s), resultando em expressão modificada do gene(s)- alvo. Em algumas modalidades, a inserções, deleções, substituição, modificação ou rompimento podem resultar em expressão direcionada de uma proteína específica, ou grupo de proteínas, ou de proteínas a jusante. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma pode criar inserções, deleções ou substituições em regiões de não co- dificação ou regiões de codificação. Em algumas modalidades, o sis- tema de edição de genoma pode criar inserções, deleções, substitui- ções, modificação ou rompimento em uma região promotora, região aumentadora e/ou qualquer outro elemento regulador de gene, incluin- do um éxon, um íntron, um sítio de início de transcrição, uma região silenciadora, uma região isolante, um antirrepressor, um elemento re- gulador pós-traducional, um sinal de poliadenilação (por exemplo, poli A mínimo), uma região conservada, um sítio de ligação de fator de transcrição ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas moda- lidades, o sistema de edição de genoma pode criar as inserções, dele- ções, substituições, modificação ou rompimento em mais de uma regi- ào-alvo, simultaneamente ou sequencialmente. Em algumas modali- dades, administração a uma célula(s) com um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK pode permitir expressão de gene modificada direcionada na(s) célula(s). Tal expressão de gene modifi- cada direcionada pode levar à expressão de proteínas específicas e suas proteínas a jusante.
[00187] Em algumas modalidades, a expressão de um gene e/ou proteína a jusante é aumentada em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1, 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação com uma condição em que um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não é administração a uma célula(s) ou comparado com uma condição em que apenas um sistema de edição de genoma e não um inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula(s).
[00188] Em algumas modalidades, a expressão de gene de um ge- ne e/ou proteína a jusante é diminuída em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em comparação com uma condição em que um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não é administrado a uma célula(s) ou comparado com uma condição em que apenas um sistema de edi- ção de genoma e não um inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula(s).
[00189] A célula dos presentes métodos pode ser qualquer célula. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de vertebrado. Em algumas modalidades, a célula de vertebrado é uma célula de mamiífe- ro. Em algumas modalidades, a célula de vertebrado é uma célula de humano.
[00190] A célula pode ser qualquer tipo de célula em qualquer está- gio de desenvolvimento. Em algumas modalidades, a célula pode ser uma célula diferenciada, uma célula-tronco totipotente, uma célula- tronco pluripotente, uma célula-tronco embriônica, uma célula germina- tiva embriônica, uma célula-tronco adulta, uma célula precursora, uma célula-tronco pluripotente induzida ou qualquer combinação das mes- mas. Uma célula diferenciada é uma célula especializada que realiza uma função específica em um tecido. Uma célula-tronco totipotente é uma célula não diferenciada de um embrião, feto ou adulto que pode se dividir por períodos prolongados e tem a capacidade de diferenciar em qualquer tipo de célula de qualquer uma das três camadas germi- nativas de um organismo. Uma célula-tronco pluripotente é uma célula não diferenciada de um embrião, feto ou adulto que pode se dividir por períodos prolongados e tem a capacidade de diferenciar em qualquer tipo de célula de um organismo exceto tecido extraembriônico ou a placenta. Uma célula-tronco embriônica é uma célula-tronco não dife- renciada que é encontrada na massa celular interna de um embrião e tem a capacidade de diferenciar em qualquer tipo de célula de qual- quer uma das três camadas germinativas. Uma célula germinativa em- briônica é uma célula embriônica que pode dar origem a células repro- dutoras, tais como células de espermatozoide ou células de óvulos. Uma célula-tronco adulta é uma célula não diferenciada que é encon- trada em tecido diferenciado, é capaz de autorrenovação e pode dife- renciar em qualquer uma das células do tecido em que ela reside. Uma célula precursora ou progenitora é uma célula parcialmente dife- renciada que pode tipicamente apenas diferenciar em um tipo de célu- la (por exemplo, uma célula unipotente). Uma célula-tronco pluripoten- te induzida é um tipo de célula-tronco pluripotente que é gerada a par- tir de uma célula adulta diferenciada ou parcialmente diferenciada. Vi- de, por exemplo, WO/2010/017562.
[00191] “Como aqui usado, a forma singular "um", "uma" e "o", "a" incluem referências no plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas. Por exemplo, "uma ou mais célu- las" e "uma célula(s)" são intercomutavelmente usados aqui. Similar-
mente, "uma ou mais regiões genômicas-alvo" e "uma região(ões) ge- nômica(s)-alvo" são intercomutavelmente usadas aqui.
[00192] Os termos "aproximadamente" e "cerca de" são usados in- tercomutavelmente aqui. O termo "aproximadamente" ou "cerca de", conforme aplicado a um ou mais valores de interesse, se refere a um valor que é similar a um valor de referência declarado. Em certas mo- dalidades, o termo "aproximadamente" ou "cerca de" se refere a uma faixa de valores que se encaixam dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos em qualquer direção (maior do que ou me- nor do que) o valor de referência declarado a menos que de outro mo- do declarado ou de outro modo evidente a partir do contexto (exceto onde tal número excedesse 100% de um valor possível).
[00193] Os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo", "sequência de nucleotídeo", "ácido nucleico" e "oligonucleotídeo" são usados inter- comutavelmente. Eles se referem a uma forma polimérica de nucleotí- deos de qualquer comprimento, ou desoxirribonucleotídeos (DNA) ou ribonucleotídeos (RNA) ou análogos dos mesmos. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. O que segue são exem- plos não limitantes de polinucleotídeos: regiões de codificação ou não codificação de um gene ou fragmento de gene, loci (locus) definidos a partir de análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mMRNA), RNA de transferência, RNA ribossomal, RNA de interferência curto (SiRNA), RNA grampo-de-cabelo curto (ShRNA), micro-RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e inici- adores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotí- deos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nu-
cleotídeo. Se presentes, modificações na estrutura de nucleotídeo po- dem ser comunicadas antes ou após montagem do polímero. A se- quência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeo. Um polinucleotídeo pode ser modificado mais após poli- merização, tal como através de conjugação com um componente de marcação. O termo "ssDNA" significa uma molécula de DNA de fila- mento simples. O termo "ssODN" significa oligodesoxinucleotídeos de filamento simples.
[00194] O termo "nucleotídeos de ocorrência natural" referido aqui inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotí- deos modificados" referido aqui inclui nucleotídeos com grupos açúcar modificados ou substituídos e similar. O termo "ligações de oligonucle- otídeo" referido aqui inclui ligações de oligonucleotídeo tais como fos- forotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodisselenoato, fosfo- roanilotioato, fosforoaniladato, fosforonmidato e similar. Um oligonu- cleotídeo pode incluir um marcador para detecção, se desejado.
[00195] O termo "RNA sintético" se refere a um RNA que é enge- nheirado ou de ocorrência não natural.
[00196] Como aqui usado, o termo "tipo selvagem" é um termo da técnica compreendido pelos versados e significa a forma típica de um organismo, cepa, gene ou característica como ele ocorre na natureza distinguido de formas mutantes ou variantes.
[00197] Os termos "ocorrência não natural" e "engenheirado" são usados intercomutavelmente e indicam o envolvimento da mão do ho- mem. Os termos, quando se referindo a moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos, significa que a molécula de ácido nucleico ou o poli- peptídeo é pelo menos substancialmente livre de pelo menos um outro componente com o qual ele é naturalmente associado na natureza e como encontrado na natureza.
[00198] "Complementaridade" se refere à habilidade de um ácido nucleico em formar ligação(ões) hidrogênio com um outro ácido nu- cleico ou através de Watson-Crick tradicional ou outros tipos não tradi- cionais. Una complementaridade percentual indica a porcentagem de resíduos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogênio (por exemplo, emparelhamento de base Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 sendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% de comple- mentaridade). "Perfeitamente complementar" significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácido nucleico ligarão hidro- gênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácido nucleico. "Substancialmente complementar" como aqui usado se refere a um grau de complementaridade que é pelo me- nos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%. 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% acima de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos ou se refere a dois ácidos nucleicos que hibridizam sob condições ads- tringentes.
[00199] “Como aqui usado, "expressão" se refere ao processo atra- vés do qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de DNA (tal como em mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo através do qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcritos e polipeptídeos codificados podem ser coletivamente referidos como "produto de ge- ne". Se o polinucleotídeo for derivado de DNA genômico, expressão pode incluir união do MRNA em uma célula eucariótica.
[00200] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usa- dos aqui intercomutavelmente para se referir a polímeros de aminoáci- dos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramíifica- do, ele pode compreender aminoácidos modificados, e ele pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também compreendem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, tal como conjugação com um componen- te de marcação. Como aqui usado, o termo "aminoácido" inclui amino- ácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e am- bos os isômeros ópticos D ou L e análogos de aminoácido e peptido- miméticos.
[00201] Um "vetor viral" é definido como um vírus ou partícula viral recombinantemente produzido que compreende um polinucleotídeo a ser administrado a uma célula hospedeira, ou in vivo, ex vivo ou in vi- tro. Exemplos de vetores virais incluem vetores retrovirais, vetores adenovirais, vetores de vírus adenoassociado, vetores adenovirais, vetores lentivirais, vetores do vírus herpes simplex e vetores virais quiméricos e similar. Em algumas modalidades onde a transferência de gene é mediada por um vetor retroviral, um construto de vetor se refere ao polinucleotídeo compreendendo o genoma retroviral ou parte do mesmo.
[00202] Algumas modalidades da descrição se referem a sistemas de vetor compreendendo um ou mais vetores ou vetores em si. Veto- res podem ser projetados para expressão de transcritos de CRISPR (por exemplo, transcritos de ácido nucleico, proteínas ou enzimas) em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, transcritos de CRISPR podem ser expressos em células bacterianas tais como Es- cherichia coli, células de inseto (usando vetores de expressão de ba- culovírus), células de levedura ou células de mamífero.
[00203] As células podem ser células primárias, células-tronco plu- ripotentes induzidas (iPSCs), células-tronco embriônicas (hESCs), cé- lulas-tronco adultas, células progenitoras ou linhagens de célula. "Cé- lulas primárias" são células obtidas diretamente de tecido vivo ou pos- tas in vitro para crescimento. Células primárias têm poucas duplica-
ções de população, e têm um tempo de vida finito para duplicações de população in vitro. "Células-tronco", "células-tronco embriônicas" e "cé- lulas-tronco pluripotentes induzidas" são células não especializadas e não diferenciadas capazes de autorrenovação e tendo o potencial de diferenciar em células de tipos diferentes com função especializada. "Linhagens de célula" incluem culturas de célula que são derivadas de um tipo de célula ou um conjunto de células do mesmo tipo que podem proliferar indefinidamente. Exemplos não limitantes de linhagens de célula de mamífero podem incluir células CD34, células 293, células HEK, células CHO, células BHK, células CV-1, células Jurkat, células HeLa ou quaisquer variantes das mesmas.
[00204] Em algumas modalidades, um vetor é capaz de dirigir ex- pressão de uma ou mais sequências em células de mamífero usando um vetor de expressão de mamífero. Exemplos de vetores de expres- são de mamífero incluem pCDM8 e pMT2PC. Quando usados em cé- lulas de mamífero, as funções de controle do vetor de expressão são tipicamente providas por um ou mais elementos reguladores. Por exemplo, promotores comumente usados são derivados de polioma, adenovírus 2, citomegalovírus, vírus símio 40 e outros revelados aqui e conhecidos na técnica. Outros promotores podem incluir, por exem- plo, promotor EF1 ou promotor EF1 alfa. Para outros sistemas de ex- pressão adequados para ambas células procarióticas e eucarióticas vide, por exemplo, Capítulos 16 e 17 de Sambrook e outros, MOLE- CULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
[00205] Como aqui usado, os termos "marcar" e "marcado" se refe- rem à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, através da incorporação de um aminoácido radiomarcado ou ligação a um po- lipeptídeo de porções biotinila que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluores- cente ou atividade enzimática que pode ser detectada através de mé- todos ópticos ou calorimétricos). Em certas situações, o rótulo ou mar- cador pode também ser terapêutico. Vários métodos de marcação de polipeptídeos ou glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Exemplos de marcadores para polipeptídeos incluem o, mas não estão limitados ao, que segue: radioisótopos ou radionuclií- deos (por exemplo, 3H, 14C, *SN, *S, ºY, Tc, Mn, 1251, 131), marca- dores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantaní- deos), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, p-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimiolumi- nescentes, grupos biotinila, epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, marcadores de epítopo). Em algumas modalidades, marcadores são ligados por braços espaçadores de vá- rios comprimentos para reduzir impedimento estérico potencial. O ter- mo "agente farmacêutico ou fármaco" como aqui usado se refere a um composto ou composição química capaz de induzir um efeito terapêu- tico desejado quando apropriadamente administrado a um paciente.
[00206] Como aqui usado, "substancialmente puro" significa uma espécie-objeto que é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar ela é mais abundante do que qualquer outra espécie indi- vidual na composição). Em algumas modalidades, uma fração subs- tancialmente purificada é uma composição em que a espécie-objeto compreende pelo menos cerca de 50 por cento (em uma base molar) de todas as espécies macromolares presentes.
[00207] Em geral, uma composição substancialmente pura compre- enderá mais do que cerca de 80 por cento de todas as espécies ma- cromoleculares presentes na composição. Em algumas modalidades,
uma composição substancialmente pura compreenderá mais do que cerca de 85%, 90%, 95% e 99% de todas as espécies macromolares presentes na composição. Em algumas modalidades, a espécie-objeto é purificada para homogeneidade essencial (espécies contaminantes não são detectadas na composição através de métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente em uma espécie macromolecular única.
Sistema de Edição de Genoma
[00208] Vários tipos de sistemas de engenharia de genoma podem ser usados. Os termos "sistema de edição de genoma", "sistema de edição de gene", e similar, são usados intercomutavelmente aqui, e se referem a um sistema ou tecnologia que edita um gene-alvo ou sua função ou expressão. Um sistema de edição de genoma compreende: pelo menos um componente de endonuclease permitindo clivagem de uma região(ões) genômica(s)-alvo (ou sequência(s)-alvo)); e pelo me- nos um elemento de direcionamento a genoma que traz ou direciona o componente endonuclease para uma região(ões) genômica-alvo. Exemplos de elemento de direcionamento a genoma incluem um do- mínio de ligação a DNA (por exemplo, proteína de ligação a DNA de- do-de-zinco ou um domínio de ligação a DNA TALE), elementos de RNA-guia (por exemplo, RNA-guia de CRISPR) e elementos de DNA- guia (por exemplo, DNA-guia NgAgo). Direcionamento a genoma pro- gramável e elementos de endonuclease permitem edição de genoma precisa através da introdução de quebras de DNA, tais como quebras de filamento duplo (DSBs) em /oci genômicos específicos. DSBs sub- sequentemente recrutam maquinário de reparo endógeno ou para uni- ão de extremidades não homólogas (NHEJ) ou reparo direcionado por homologia (HDR) para o sítio de DSB para mediar edição de genoma. O "componente de endonuclease" compreende uma endonuclease ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de ácido nuclei-
co codificando tal endonuclease.
[00209] O termo "endonuclease" se refere a qualquer enzima do tipo selvagem, mutante, variante ou engenheirada capaz de catalisar a hidrólise (clivagem) de uma ligação entre ácidos nucleicos dentro de uma molécula de DNA ou RNA. Endonucleases podem reconhecer e clivar uma molécula de DNA ou RNA em suas regiões genômicas-alvo. Exemplos de endonucleases incluem uma endonuclease de homing; enzima de restrição tal como Fokl; uma nuclease Dedo-de-Zinco (ZFN) quimérica resultante da fusão de domínios de dedo-de-zinco engenhei- rados com o domínio catalítico de uma enzima de restrição tal como Fokl; enzimas Cas e enzimas Cpf. Endonucleases químicas em que um agente clivante químico ou peptídico é conjugado ou a um políme- ro de ácidos nucleicos ou a um outro DNA reconhecendo uma se- quência-alvo específica, dessa maneira se direcionado à atividade de clivagem a uma sequência específica, são compreendidas no termo "endonuclease". Exemplos de endonucleases químicas incluem nu- cleases sintéticas tais como conjugados de ortofenantrolina, uma mo- lécula de clivagem de DNA e oligonucleotídeos de formação de tríplex (TFOs).
[00210] Por "variante" se quer dizer uma proteína recombinante ob- tida através de substituição de pelo menos um resíduo na sequência de aminoácido da proteína parental com um aminoácido diferente.
[00211] Em algumas modalidades, endonucleases tais como ZFNs, TALENs e/ou meganucleases compreendem um domínio de clivagem e/ou meio-domínio de clivagem. O domínio de clivagem pode ser ho- mólogo ou heterólogo ao domínio de ligação a DNA. Por exemplo, um domínio de ligação a DNA de dedo-de-zinco e um domínio de clivagem de um domínio de ligação a DNA de nuclease ou meganucleases e domínio de clivagem de uma nuclease diferente podem ser usados. Domínios de clivagem heterólogos podem ser obtidos de qualquer en-
donuclease ou exonuclease. Endonucleases exemplares a partir das quais um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, mas não estão limitadas a, endonucleases de restrição e endonucleases de homing. Vide, por exemplo, WO2013/130824. Enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidas (por exemplo, Nuclease S1; nuclease de feijão mung; DNase | pancreática; nuclease micrococcal; endonu- clease HO de levedura; vide também Linn e outros (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Uma ou mais dessas en- zimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser usadas co- mo uma fonte de domínios de clivagem e meio-domínios de clivagem.
[00212] Um meio-domínio de clivagem pode ser derivado de qual- quer nuclease ou porção da mesma, como mostrado acima, que re- queira dimerização para atividade de clivagem. Em algumas modali- dades, duas proteínas de fusão são requeridas para clivagem se as proteínas de fusão compreenderem meio-domínios de clivagem. Em algumas modalidades, uma proteína única compreendendo dois meio- domínios de clivagem pode ser usada. Em algumas modalidades, os dois meio-domínios de clivagem podem ser derivados da mesma en- donuclease (ou seus fragmentos funcionais). Em algumas modalida- des, cada meio-domínio de clivagem pode ser derivado de uma endo- nuclease diferente (ou seus fragmentos funcionais). Ainda, os sítios- alvo para as duas proteínas de fusão são preferivelmente dispostos, um com relação ao outro, de modo que ligação das duas proteínas de fusão aos seus respectivos sítios-alvo põe os meio-domínios de cliva- gem em uma orientação espacial um com o outro que permite que os meio-domínios de clivagem formem um domínio de clivagem funcional, por exemplo, através de dimerização. Portanto, em certas modalida- des, as bordas próximas dos sítios-alvo são separadas por 5-50 nu- cleotídeos, 5-8 nucleotídeos ou por 15-18 nucleotídeos. É observado que qualquer número integral de nucleotídeos ou pares de nucleotídeo pode acontecer entre dois sítios-alvo (por exemplo, de a partir de 2 a 50 pares de nucleotídeo ou mais). Em algumas modalidades, o sítio de clivagem se encontra entre os sítios-alvo.
[00213] “Endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligação específica de sequência a DNA (em um sítio de reconhecimento), e clivagem de DNA no ou próximo do sítio de ligação. Certas enzimas de restrição (por exemplo, Tipo IIS) clivam DNA em sítios removidos do sítio de reconhecimento e têm domínios de ligação e clivagem separáveis. Por exemplo, a enzima Fok | Tipo IIS catalisa clivagem de DNA de filamen- to duplo. Vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.356.802; 5.436.150 e
5.487.994; bem como Li e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764- 2768; Kim e outros (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim e outros (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982.
[00214] Em algumas modalidades, o componente endonuclease compreende uma proteína(s) de fusão que inclui um domínio de cliva- gem (ou meio-domínio de clivagem) de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação de dedo-de-zinco, que podem ou não ser engenheirados. Uma enzima de restrição do Tipo IIS exemplar, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é Fok |. Essa enzima particular é ativa como um dímero. Bitinaite e outros (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. A porção da enzima Fok | usada em tais proteínas de fusão é conside- rada um meio-domínio de clivagem. Portanto, para clivagem de fila- mento duplo direcionada e/ou substituição direcionada de sequências celulares usando fusões de dedo-de-zinco ou TALE-Fok |, duas prote- Ínas de fusão, cada uma compreendendo um meio-domínio de cliva- gem de Fokl, podem ser usadas para reconstituir um domínio de cliva- gem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma molécula de polipep-
tídeo simples contendo um domínio de ligação de dedo-de-zinco e dois meio-domínios de clivagem de Fokl pode ser também usada.
[00215] Enzimas de restrição do Tipo IIS exemplares são descritas na Publicação Internacional WO 07/014275, incorporado aqui a título de referência. Enzimas de restrição adicionais também contêm domí- nios de ligação e clivagem separáveis, e esses são compreendidos pela invenção. Vide, por exemplo, Roberts e outros (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.
[00216] Em certas modalidades, o domínio de clivagem compreen- de um ou mais meio-domínio de clivagem engenheirado (também refe- rido como mutantes de domínio de dimerização) que minimizam ou evitam homodimerização, como descrito, por exemplo, nas Publica- ções de Patente U.S. Nos. 20050064474, 20060188987 e WO 2013/130824. Meio-domínios de clivagem engenheirados exemplares de Fok | que formam heterodímeros forçados incluem um par em que um primeiro meio-domínio de clivagem inclui mutações em resíduos de aminoácido nas posições 490 e 538 de Fok | e um Segundo meio- domínio de clivagem inclui mutações nos resíduos de aminoácido 486 e 499. Vide, por exemplo, Publicações de Patente U.S. Nos. 2008/0131962 e 2011/0201055. Meio-domínios de clivagem engenhei- rados descritos aqui podem ser preparados usando qualquer método adequado, por exemplo, através de mutagênese direcionada a sítio de meio-domínios de clivagem do tipo selvagem (Fok |) como descrito nas Publicações de Patente U.S. Nos. 20050064474 e 20080131962.
[00217] Os termos "editar", "edita", "edição" e similar se referem a qualquer tipo de engenharia, alteração, modificação ou modulação (em cada caso que inclui, mas não é limitado a, por meio de inativação de gene, marcação de gene, rompimento de gene, mutação de gene, in- serção de gene, deleção de gene, ativação de gene, silenciamento de gene ou ativação de gene).
[00218] “Como aqui usado, "modificação genética", "edição de ge- noma", "modificação de genoma", "modificação de gene" e "edição de gene" se referem a qualquer adição, deleção, inativação, ativação, marcação, mutação, ativação, silenciamento, modificação e/ou rompi- mento para o nucleotídeo de uma célula. A célula nesse contexto pode estar in vitro, in vivo ou ex vivo.
[00219] Por "região genômica-alvo", "gene-alvo", "alvo de DNA", "sequência-alvo de DNA", "sequência-alvo", "sequência de nucleotí- deo-alvo", "sítio-alvo", "alvo", "sítio de interesse", "sítio de reconheci- mento", "sítio de reconhecimento de polinucleotídeo", "sequência de reconhecimento", "sítio de clivagem" quer dizer uma sequência de po- linucleotídeo que é reconhecida e clivada por um sistema de edição de genoma. Esses termos se referem a uma localização de DNA distinta, preferivelmente uma localização genômica, na qual uma quebra de DNA (clivagem) deve ser induzida por sistema de edição de genoma.
[00220] A edição acima, incluindo engenharia, alteração, modifica- ção e modulação, pode ocorrer simultaneamente ou sequencialmente. Qualquer sistema de edição de genoma conhecido na técnica pode ser usado. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nu- clease de dedo-de-zinco (ZFN), um sistema baseado em Nuclease ba- seada em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um siste- ma baseado em CRISPR ou sistema baseado em NgAgo.
[00221] Com base em meganucleases, com base em ZFN e com base em TALEN compreendem, cada um, pelo menos um domínio de ligação a DNA ou um ácido nucleico compreendendo uma sequên- cia(s) de ácido nucleico codificando o domínio de ligação a DNA, e ob- tém direcionamento ou reconhecimento específico de uma região(ões) genômica(s)-alvo por meio de interações proteína-DNA. Um sistema baseado em CRISPR compreende pelo menos um elemento de RNA-
guia ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de ácido nucleico codificando o elemento de RNA-guia, e obtém direcionamento ou reconhecimento específico de uma região(ões) genômica(s)-alvo por meio de pares de base diretamente com o DNA da(s) região(ões) genômica(s)-alvo. Um sistema com base em NgAgo compreende pelo menos um elemento de DNA-guia ou um ácido nucleico compreen- dendo uma sequência(s) de ácido nucleico codificando o elemento de DNA-guia, e obtém direcionamento ou reconhecimento específico de uma região(ões) genômicas-alvo por meio de pares de base direta- mente com o DNA da(s) região(ões) genômica(s)-alvo.
[00222] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em meganucleases. Um sistema baseado em meganucleases emprega meganucleases que são endonucleases com sítios de reconhecimento grandes (>14 pb), e seus domínios de liga- ção de DNA são também responsáveis pela clivagem de sequências- alvo. O domínio de ligação a DNA de meganucleases pode ter uma sequência-alvo de DNA de filamento duplo de 12 a 45 pb. Em algumas modalidades, a meganucleases é ou uma enzima dimérica, em que cada domínio de meganucleases está em um monômero, ou uma en- zima monomérica compreendendo os dois domínios em um polipeptíi- deo único. Não apenas meganucleases do tipo selvagem, mas tam- bém várias variantes de meganucleases, foram geradas por engenha- ria de proteína para cobrir uma miríade de combinações de sequência únicas. Em algumas modalidades, meganucleases quiméricas com um sítio de reconhecimento composto de um meio-sítio de meganuclease A e um meio sítio de proteína B podem ser também usadas. Exemplos específicos de tais meganucleases quiméricas compreendem os do- mínios de proteína de I|-Dmol e |-Crel. Exemplos de meganucleases incluem endonucleases de homing da família LAGLIDADG.
[00223] A meganuclease LAGLIDADG pode ser I-Scel, I-Chul, |-
Crel, I-Csml, PI-Scel, PI-TIil, PI-Mtul, I-Ceul, I-Scell, I-Scelll, HO, PI- Civl, PI-Ctrl, PIl-Aael, PI-Bsul, PI-Dhal, PI-Dral, Pl-Mavl, PIl-Mchl, PI- Míul, PI-MfII, PIl-Mgal, PIl-Mgol, PI-Minl, PI-Mkal, PI-Mlel, Pl-Mmal, Pl- Mshl, PIl-Msml, PI-Mthl, PI-Mtul, PI-Mxel, PI-Npul, PI-Pful, PI-Rmal, PI- Spbl, PI-Sspl, Pl-Facl, PI-Mjal, PI-Phol, Pl-Tagl, PIl-Thyl, Pl-Tkol, Pl- Tspl ou I-Msol; ou pode ser um mutante functional ou variante do mesmo, seja homodimérica, heterodimérico ou monomérico. Em al- gumas modalidades, a meganuclease LAGLIDADG é um derivado de |-Crel. Em algumas modalidades, a meganuclease LAGLIDADG com- partilha pelo menos 80% de similaridade com a meganuclease de |- Creil natural. Em algumas modalidades, a meganuclease LAGLIDADG compartilha pelo menos 80% de similaridade com os resíduos 1-152 da meganuclease LAGLIDADG de Crel natural. Em algumas modali- dades, a meganuclease de LAGLIDADG pode consistir em dois mo- nômeros compartilhando pelo menos 80% de similaridade com resí- duos 1-152 de meganuclease LAGLIDADG de |-Crel ligados juntos, com ou sem um peptídeo ligante.
[00224] A "meganuclease LAGLIDADG" se refere a uma endonu- clease homing da família LAGLIDADG, como definido em Stoddard e outros (Stoddard, 2005) ou uma variante engenheirada compreenden- do um polipeptídeo compartilhando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais de identidade ou similaridade com a dita endonu- clease homing natural. Tais meganucleases LAGLIDADG engenheira- das podem ser derivadas de meganucleases monoméricas ou diméri- cas. Quando derivadas de meganucleases diméricas, tais meganu- cleases LAGLIDADG engenheiradas podem ser endonucleases de ca- deia simples ou diméricas.
[00225] —Por"l-Crel" quer dizer a meganuclease |-Crel do tipo selva- gem natural tendo a sequência de código de acesso pdb 199y.
[00226] As funções de reconhecimento e clivagem de DNA de me-
ganucleases são geralmente entrelaçadas em um domínio único. Dife- rente de meganucleases, os domínios de ligação a DNA de sistemas baseados em ZFN e baseados em TALEN são distintos da endonu- clease para função de clivagem. O sistema com base em ZFN com- preende: pelo menos uma proteína dedo-de-zinco ou uma variante da mesma, ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando a proteína dedo-de-zinco ou variante da mes- ma como seu domínio de ligação a DNA; e um elemento de endonu- clease, tal como domínio de clivagem de nuclease de dedo-de-zinco (ZFN) ou Fok |. A proteína dedo-de-zinco é de ocorrência não natural pelo fato que ela é engenheirada para se ligar a um sítio-alvo de esco- lha. Vide, por exemplo, Beerli e outros (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo e outros (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan e outros (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal e outros (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo e outros (2000) Curr. Opin. Struct Biol. 10:411-416; Patentes U.S. Nos. 6.453.242; 6.534.261;
6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317;
7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; e Publicações de Patente U.S. Nos. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.
[00227] Um domínio de ligação de dedo-de-zinco engenheirada po- de ter uma especificidade de ligação nova, comparado com uma prote- ína dedo-de-zinco de ocorrência natural. Métodos de engenharia in- cluem, mas não estão limitados a, projeto lógico e vários tipos de sele- ção. Projeto lógico inclui, por exemplo, uso de bancos de dados com- preendendo sequências de nucleotídeo tripleto (ou quadrupleto) e se- quências de aminoácido de dedo-de-zinco individuais, em que cada sequência de nucleotídeo de tripleto ou quadrupleto é associada com uma ou mais sequências de aminoácido de dedos-de-zinco que se |li- gam à sequência de tripleto ou quadrupleto particular. Vide, por exem- plo, Patentes U.S. 6.453.242 e 6.534.261 de copropriedade, incorpo-
radas aqui a título de referência em suas modalidades.
[00228] Vários tipos de métodos de seleção podem ser usados com os presentes métodos. Métodos de seleção exemplares, incluindo sis- temas de exibição de fago e de dois híbridos, são revelados nas Pa- tentes U.S. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248;
6.140.466; 6.200.759; e 6.242.568; bem como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 e GB 2.338.237. Ainda, au- mento de especificidade de ligação para domínios de ligação de dedo- de-zinco foi descrito, por exemplo, no WO 02/077227. Ainda, como revelado nessas e outras referências, domínios de dedo-de-zinco e/ou proteínas dedo-de-zinco de múltiplos dedos podem ser ligados juntos usando quaisquer sequências ligantes adequadas, incluindo, por exemplo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Vide, também, Patentes U.S Nos. 6.479.626; 6.903.185; e 7.153.949 quanto a sequências ligantes exemplares de 6 ou mais aminoácidos de com- primento. As proteínas descritas aqui podem incluir qualquer combina- ção de ligantes adequados entre os dedos de zinco individuais da pro- teína. Seleção de sítios-alvo; ZFP e métodos para projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos codificando as mesmas) são conhecidos daqueles de habilidade na técnica e descritos em detalhes nas Patentes U.S. Nos. 6.140.0815; 789.538; 6.453.242; 6.534.261;
5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.
[00229] Ainda, como revelado nessas e outras referências, domí- nios de dedo-de-zinco e/ou proteínas dedo-de-zinco de múltiplos de- dos podem ser ligados juntos usando quaisquer sequências ligantes adequadas, incluindo, por exemplo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Vide também Patentes U.S. Nos. 6.479.626;
6.903.185; e 7.153.949 para sequências ligantes exemplares de 6 ou mais aminoácidos de comprimento. As proteínas descritas aqui podem incluir qualquer combinação de ligantes adequados entre os dedos-de- zinco individuais da proteína.
[00230] Um sistema de Nuclease com base em Efetor do Tipo Ati- vador de Transcrição (TALEN) se refere a um sistema de edição de genoma que emprega um ou mais domínio de ligação a DNA-Efetor Tipo Ativador de Transcrição (TALE) e um elemento endonuclease, tal como domínio de clivagem de Fok 1. O domínio de ligação TALE-DNA compreende uma ou mais unidades de repetição de TALE, cada uma tendo 30-38 (tais como 31, 32, 33, 34, 35 ou 36) aminoácidos de com- primento. O domínio de ligação de TALE-DNA pode empregar uma proteína TALE de comprimento integral ou fragmento da mesma ou uma variante da mesma. O domínio de ligação de TALE-DNA pode ser fundido ou ligado ao domínio de endonuclease por um ligante.
[00231] Os termos "sistema com base em CRISPR", "sistema de edição de gene com base em CRISPR", "edição de genoma CRISPR", "edição de gene CRISPR", "edição de genoma com base em endonu- clease CRISPR" e similar são usados intercomutavelmente aqui, e se referem coletivamente a um sistema de edição de genoma que com- preende um ou mais elementos de RNA-guia; e um ou mais elementos de endonuclease guiados por RNA. O elemento de RNA-guia compre- ende um RNA direcionador compreendendo uma sequência de nucleo- tídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotí- deo na uma ou mais regiões genômicas-alvo ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA direcionador. O elemento de endonuclease guiado por RNA compre- ende uma endonuclease que é guiada ou trazida para uma região(ões) genômica(s)-alvo por um elemento de RNA-guia; ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando tal en-
donuclease. Exemplos de tal sistema de edição de gene com base em CRISPR que inclui sistema com base em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas ou um sistema CRISPR-Cpf.
[00232] Como aqui usado, os termos "elemento de RNA-guia", "RNA-guia", "aRNA", "molécula de gRNA" e "RNA-guia sintético" são usados intercomutavelmente e se referem à sequência de polinucleo- tídeo compreendendo o RNA direcionador que hibridiza com uma se- quência de ácido nucleico-alvo ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA direcionador. Um RNA direcionador de gRNA compreende um domínio de direcionamen- to que inclui uma sequência de nucleotídeo substancialmente com- plementar à sequência de nucleotídeo em uma região genômica-alvo. A expressão "substancialmente complementar" significa um grau de complementaridade que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% em uma região de 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos ou se refere a dois ácidos nucleicos que hi- bridizam sob condições adstringentes.
[00233] Um elemento de RNA-guia pode compreender ainda um RNA ativador que é capaz de hibridizar com o RNA direcionador ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA ativador. O RNA ativador e o RNA direcionador po- dem ser separados ou fundidos como um ácido nucleico único por meio de uma sequência de alça ligante para formar uma molécula de gRNA única. Uma molécula de gRNA pode compreender vários domí- nios. Por exemplo, tal gRNA compreende, por exemplo, de 5' para 3": um domínio de direcionamento (que é complementar a um ácido nu- cleico-alvo); um primeiro domínio de complementaridade; um domínio de ligação; um segundo domínio de complementaridade (que é com- plementar ao primeiro domínio de complementaridade); um domínio proximal; e opcionalmente um domínio de cauda. Vide WO2015048557.
[00234] Um "primeiro domínio de complementaridade" tem com- plementaridade substancial com o segundo domínio de complementa- ridade, e pode formar uma região de dúplex sob pelo menos algumas condições fisiológicas.
[00235] Um "domínio de ligação" serve para ligar o primeiro domínio de complementaridade com o segundo domínio de complementaridade de um gRNA unimolecular. O domínio de ligação pode ligar os primeiro e segundo domínios de complementaridade covalentemente ou não covalentemente.
[00236] Um "domínio proximal" pode ser de 3-25 nucleotídeos de comprimento ou 5-20 nucleotídeos de comprimento. O domínio proxi- mal pode compartilhar homologia com ou ser derivado de um domínio proximal de ocorrência natural.
[00237] Um "domínio de cauda" pode estar ausente ou ser de 1, 2, 3, 4, 5, 5, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos de comprimento. O domínio de cauda pode incluir sequências que são complementares uma à outra e que, sob pelo menos algumas condições fisiológicas, formam uma re- gião de dúplex.
[00238] O elemento de RNA-guia pode formar um complexo com uma endonuclease do elemento de endonuclease guiado por RNA, tal como endonuclease Cas ("complexo de gRNA/nuclease"). Um exem- plo de complexo de gRNA/nuclease é um complexo de CRISPR como descrito abaixo com relação ao sistema baseado em CRISPR. Em al- gumas modalidades, o complexo de CRISPR compreende uma endo- nuclease de sistema de endonuclease guiada por RNA que é comple- xada com o RNA direcionador. Em algumas modalidades, o complexo de CRISPR compreende uma endonuclease de sistema de endonu- clease guiada por RNA que é complexada com o RNA direcionador e o
RNA ativador.
[00239] O domínio de direcionamento de RNA direcionador promo- ve direcionamento ou homing específico de um complexo de gRNA/nuclease para uma sequência de nucleotídeo-alvo. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento pode ser 10-30 pb, tal co- mo 15-25 pb, 18-22 pb ou 20 pb.
[00240] — Métodos para projeto de gRNAs são conhecidos na técnica, incluindo métodos para seleção, projeto e validação de domínio-alvo. Vide, por exemplo, WO2015048577, Mali e outros, 2013 SCIENCE 339(6121): 823-826; Hsu e outros, 2013 NATBIOTECHNOL, 31(9): 827-32; Fu e outros, 2014 NATBTOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer e outros, 2014 NAT METHODS 11 (2): 122-3. doi: | 0.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae e outros, 2014 BIOTNFORMATICS PubMed PMID: 24463181; Xiao, A. e outros, 2014 BIOINFORMATICS Pub Med PMID: 24389662.
[00241] Em algumas modalidades, endonucleases guiadas por RNA, tal como uma enzima ou proteína Cas (por exemplo, proteína Cas9 do Tipo Il) ou enzima ou proteína Cpf (por exemplo, proteína Cpf1), podem ser usadas. Em algumas modalidades, uma versão mo- dificada de tal enzima ou proteína Cas ou Cpf pode ser também usa- da.
[00242] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas. O sistema CRISPR-Cas compreende: (a) pelo menos um elemento de RNA-guia ou um ácido nucleico compre- endendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o elemento de RNA-guia, o elemento de RNA-guia compreendendo um RNA direcio- nador que inclui uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo na uma ou mais regi- ões genômicas-alvo, e um RNA ativador que inclui uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com o RNA direcionador; e (b)
um elemento de proteína Cas compreendendo uma proteína Cas ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo co- dificando a proteína Cas. O RNA direcionador e os RNAs ativadores podem ser separados ou fundidos juntos em um RNA único.
[00243] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR inclui sistemas CRISPR Classe 1 e/ou CRISPR Classe 2. Os sistemas Classe 1 compreendem várias proteínas Cas junto com um RNAs CRISPR (crRNAs) como o RNA direcionador para construir uma endo- nuclease funcional. Sistemas CRISPR Classe 2 empregam uma prote- ína Cas única e um crRNA como o RNA direcionador. Sistemas CRISPR Classe 2, incluindo o sistema baseado em Cas9 tipo Il, com- preendem uma proteína Cas única para mediar clivagem ao invés do complexo de multissubunidades empregado por sistemas Classe 1. O sistema baseado em CRISPR também inclui sistema CRISPR Tipo V, Classe Il, empregando uma proteína Cpf1 e um cr»RNA como o RNA direcionador.
[00244] A proteína Cas é uma nuclease de filamento duplo associa- da a CRISPR (Cas). Em algumas modalidades, sistema CRISPR-Cas compreende uma proteína Cas9. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, Fokl- dCas9 ou D10A nickase. O termo "proteína Cas", tal como proteína Cas9, inclui proteína Cas do tipo selvagem ou derivados funcionais da mesma (tais como versões truncadas ou variantes da proteína Cas do tipo selvagem com uma atividade de nuclease).
[00245] Em algumas modalidades, proteínas Cas9 de espécies que não S. pyogenes e S. thermophiles podem ser usadas. Espécies de proteína Cas9 adicionais que podem ser obtidas e usadas aqui inclu- em: Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobaci- Ilus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp.,cycliphilus de- nitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus; Bacillus smithii,
Bacillus thuringiensisó, Bacteroides sp. Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterosporus, Campilobacter coli, Campilobacter jejuni, Campilobacter lari, Candidatus Puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfingens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium dolichum, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, gamma proteobacte- rium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemoplzilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicohacter cinaedi, Helicobacter mustelae, Ilyobacter polytropus, Kingella kingae, lactoba- cillus crispatus, listeria ivanovii, listeria monocytogenes, listeriaceae bacterium, Methylocystis sp.,Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flaves- cens, Neisseria lactamica, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitro- somonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutells, Ralstonia syzygii, Rhodopseu- domonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomo- nas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus lugdunensis, Strep- tococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp. ouVerminephrobacter eiseniae.
[00246] Em algumas modalidades, um ou mais elementos de um sistema baseado em CRISPR são derivados de um sistema CRISPR tipo |, tipo 1l ou tipo III.
[00247] Em algumas modalidades, um ou mais elementos de um sistema baseado em CRISPR são derivados de um organismo particu- lar compreendendo um sistema de CRISPR endógeno, tal como Strep- tococcus piogenes, Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Prevotella sp., Acidaminococcus sp. e Lachnospiraceae sp. Em geral, um sistema baseado em CRISPR é caracterizado por elementos que promovem a formação de um complexo de CRISPR nas regiões ge- nômicas-alvo ou no sítio de uma sequência-alvo (também referido co-
mo um protoespaçador no contexto de um sistema de CRISPR endó- geno). No contexto de formação de um complexo de CRISPR, "se- quência-alvo" se refere a uma sequência para a qual uma sequência- guia é projetada para ter complementaridade substancial, onde hibridi- zação entre uma sequência-alvo e uma sequência-guia promove a formação de um complexo de CRISPR. Uma sequência-alvo pode compreender qualquer polinucleotídeo, tais como polinucleotídeos de DNA ou RNA. Em algumas modalidades, uma sequência-alvo está lo- calizada no núcleo ou citoplasma de uma célula(s). Em algumas mo- dalidades, a sequência-alvo pode estar dentro de uma organela de uma célula(s) eucariótica(s), por exemplo, mitocôndrias ou cloroplasto.
[00248] Uma sequência ou modelo que pode ser usado para re- combinação no locus direcionado compreendendo as sequências-alvo é referida como um "modelo de edição" ou "polinucleotídeo de edição" ou "sequência de edição". Um polinucleotídeo-modelo exógeno pode ser referido como um modelo de edição ou modelo de doador. Em al- gumas modalidades, DNA de filamento simples e DNA de filamento duplo ou de origem sintética ou biológica pode ser usado. A título de exemplo não limitante, modelos de edição adequados incluem ssODN, dsODN, produtos de PCR, plasmídeos e vírus incluindo AAV, Adenoví- rus, Retrovírus, lentivírus, etc. Modelos de edição adicionais são tam- bém possíveis. Em algumas modalidades, a recombinação é recombi- nação homóloga.
[00249] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas9. O RNA direcionador do sistema CRISPR-Cas9 compreende um RNA de direcionamento a CRISPR (crRNA) e o RNA ativador do sistema CRISPR-Cas9 compreende um CRISPR de transativação RNA (tracRNA). O elemento de proteína Cas do sistema CRISPR-Cas9 emprega uma proteína Cas9. O cr»RNA e o tracrRNA podem ser separados ou combinados em um construto de RNA único por meio de uma sequência de alça ligante. Esse cons- truto de RNA combinado é chamado um RNA-guia simples (sgaRNA; ou RNA-guia).
[00250] Com relação à informação geral sobre sistemas CRISPR- Cas, componentes dos mesmos e administração de tais componentes, incluindo métodos, materiais, veículos de administração, vetores, par- tículas, AAV e sua fabricação e uso, incluindo quantidades e formula- ções, podem ser encontrados nas: Patentes U.S. Nos. 8.999.641,
8.993.233, 8.945.839, 8.932.814, 8.906.616, 8.895.308, 8.889.418,
8.889.356, 8.871.445, 8.865.406, 8.795.965, 8.771.945 e 8.697.359; Publicações de Patente US, US 2014-0310830, US 2014-0287938 A1, US 2014-0273234 A1, US2014-0273232 A1, US 2014-0273231, US 2014-0256046 A1, US 2014-0248702 A1, US 2014-0242700 A1, US 2014-0242699 A1, US 2014-0242664 A1, US 2014-0234972 A1, US 2014-0227787 A1, US 2014-0189896 A1, US 2014-0186958, US 2014- 0186919 A1, US 2014-0186843 A1, US 2014-0179770 A1 e US 2014- 0179006 A1, US 2014-0170753; Patentes Europeias EP 2 784 162 B1 e EP 2 771 468 B1; Pedidos de Patente Europeus EP 2 771 468 (EP13818570.7), EP 2 764 103 (EP13824232.6) e EP 2 784 162 (EP14170383.5); e Publicações de Patente PCT WO 2014/093661, WO 2014/093694, WO 2014/093595, WO 2014/093718, WO 2014/093709, WO 2014/093622, WO 2014/093635, WO 2014/093655, WO 2014/093712, WOZ2014/093701, WOZ2Z014/018423, WO 2014/204723, WO 2014/204724, WO 2014/204725, WO 2014/204726, WO 2014/204727, WO 2014/204728, WO 2014/204729 e WO?2016/028682.
[00251] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cpr. O "Sistema CRISPR-Cpf" compreende: (a) pelo menos um elemento de RNA-guia ou um ácido nucleico compre- endendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o elemento de
RNA-guia, o RNA-guia compreendendo um RNA direcionador tendo uma sequência de nucleotídeo complementar a uma sequência de nu- cleotídeo em um locus do ácido nucleico-alvo; e (b) um elemento de proteína Cpf ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando o elemento de proteína Cpf.
[00252] Um exemplo de um elemento de proteína Cpf inclui uma nuclease Cpf1, tal como Francisella Cpf1 (FnCpf1) e quaisquer varian- tes da mesma. Vide, por exemplo, Zetsche e outros, "Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system," Cell, 163(3): páginas 759-71; e Fonfara e outros, "The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1i also processes precursor CRISPR RNA," Nature 532 (7600): páginas, 517-21. PAM preferido de Cpf1 é 5-TTN, diferindo daquele de Cas 9 (3' NGG) em ambos localização genômica e teor de GC. Ambos Cpf1i e seus RNAs-guia são em geral menores do que suas contrapartes SpCas9. O locus Cpf1i contém um domínio alfa/beta misto, um RuvC-l seguido por uma região helical, um RuvC-ll e um domínio do tipo dedo-de-zinco. A proteína Cpf1 tem um domínio de endonuclease do tipo RuvC que é similar ao domínio RuvC de Cas9. Ainda, Cpfi não tem um domínio de endonuclease HNH, e o terminal N de Cpf1i não tem o lobo de reconhecimento alfa-helical de Cas9. Os /loci de Cpf1i codificam proteínas Cas1, Cas2 e Cas4 mais similar a tipos | e Ill do que de sistemas do tipo Il. Proteínas da família Cpf1 podem ser encontradas em muitas espécies bacterianas.
[00253] Sem ser limitado a uma teoria particular, o sistema CRISPR-Cpf emprega um complexo Cpf1-crRNA que cliva DNA ou RNA-alvo através da identificação de um motivo adjacente protoespa- çador 5'-YTN-3 (onde "Y" é uma pirimidina e "N" é qualquer nucleoba- se) ou 5-TTN-3 em contraste com a PAM rica em G direcionada por Cas9. Após identificação de PAM, Cpf1i introduz uma quebra de fila- mento duplo de DNA do tipo extremidade pegajosa de sobreposição de 4 ou 5 nucleotídeos.
[00254] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em NgAgo. O sistema baseado em NgAgo compreende pelo menos um elemento de DNA-guia ou um ácido nu- cleico compreendendo uma sequência(s) de ácido nucleico codifican- do o elemento de DNA-guia; e uma endonuclease guiada por DNA. O sistema baseado em NgAgo emprega DNA como um elemento-guia. Seu princípio de trabalho é similar àquele de tecnologia CRISPR- Cas9, mas seu elemento-guia é um segmento de guia de DNA(dDNA) ao invés de gRNA em tecnologia CRISPR-Cas9. Um exemplo de en- donuclease guiada por DNA é uma endonuclease Argonaute (NgAgo) de Natronobacterium gregoryi. Vide, por exemplo, Feng Gao e outros, "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Ar- gonaute," Nature Biotechnology, (2016): doi:10.1038/nbt.3547.
[00255] Por "ligante", "ligante de peptídeo", "ligante peptídico" ou "espaçador de peptídeo" quer dizer uma sequência de peptídeo que permite a conexão de monômeros diferentes em uma proteína de fu- são e a adoção da conformação correta para a dita atividade de prote- ína de fusão e que não altera a atividade de nenhum dos monômeros. Ligantes de peptídeo podem ser de vários tamanhos de 1, 2,3,4,5, 10, 15, 20, 30, 40 a 50 aminoácidos como uma faixa indicativa não |li- mitante ou qualquer valor intermediário dentro dessa faixa. Inibidores de DNA-PK para Aumento da Eficiência de Edição Genômi- ca
[00256] Eficiência de edição de genoma direcionada pode ser au- mentada através da administração a uma célula(s) com um ou mais compostos (por exemplo, inibidores de DNA-PK) descritos aqui e um sistema de edição de genoma. Sistemas de edição de genoma ade- quados para uso incluem, por exemplo, um sistema baseado em me- ganuclease, um sistema baseado em nuclease dedo-de-zinco (ZFN),
um sistema de Nuclease baseado em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR ou sistema baseado em NgAgo. Os métodos, composições e estojos da descrição proveem inibidores de DNA-PK e/ou sistema de edição de genoma para aumento de eficiência de edição de genoma. Em algumas moda- lidades, eficiência de edição de genoma de HDR é aumentada seguin- do administração a uma célula(s) com um inibidor de DNA-PK.
[00257] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema de edição de genoma baseado em CRISPR. O sistema de edição de genoma baseado em CRISPR pode ser um sistema CRISPR-Cas ou variantes do mesmo. O sistema CRISPR-Cas pode usar quaisquer endonucleases Cas, tais como endonucleases Cas 9 e suas variantes. Exemplos de endonucleases Cas 9 incluem endonu- cleases Cas9 ou variantes das mesmas, tais como SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, Fokl-dCas9 ou CasD10A nickase. À endonuclease Cas pode ser do tipo selvagem, engenheirada ou mu- tante nickase ou quaisquer variações dos mesmos.
[00258] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma baseado em CRISPR inclui uma sequência de CRISPR, uma sequên- cia cr de transativação (tracr), uma sequência-guia e uma endonu- clease Cas ou quaisquer combinações das mesmas.
[00259] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma baseado em CRISPR inclui um RNA compreendendo uma sequência de CRISPR (crRNA), um RNA compreendendo uma sequência cr de transativação (tracr) (tracrRNA) e uma endonuclease Cas ou quais- quer combinações dos mesmos.
[00260] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma baseado em CRISPR inclui uma sequência de CRISPR, uma sequên- cia-guia e uma endonuclease Cas ou uma endonuclease Cpf ou quaisquer combinações das mesmas.
[00261] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cpf. A nuclease Cpf é uma endonuclease de sistema CRISPR-Cas Classe 2. Cpf é uma en- donuclease guiada por RNA única. A nuclease Cpf pode ser do tipo selvagem, engenheirada ou um mutante nickase ou quaisquer varia- ções dos mesmos. Vide, por exemplo, Zetsche e outros, "CPF1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System," Cell, 163(3): 759-71. Em algumas modalidades, a nuclease Cpf é uma endonuclease Cpf 1.
[00262] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em meganuclease. Edição de genoma baseada em meganuclease usa endonucleases específicas de sequência que reconhecem sítios-alvo de DNA grandes (por exemplo, tipicamente cerca de >12pb). Vide, por exemplo, U.S. 9.365.964. Meganucleases podem clivar sequências cromossomais únicas sem afetar a integrida- de do genoma no geral. Em algumas modalidades, a meganuclease pode ser uma endonuclease de homing. Em algumas modalidades, a meganuclease pode ser uma endonuclease de íntron ou uma endonu- clease de inteína. As endonucleases de homing podem pertencer à família LAGLIDADG. As meganucleases podem ser do tipo selvagem, engenheiradas ou uma mutante nickase.
[00263] Em algumas modalidades, o sistema de edição de gene é um sistema baseado em nuclease de dedo-de-zinco (ZFN). A ZFN é uma enzima de restrição artificial engenheirada baseada na fusão en- tre um domínio de ligação de DNA de dedo-de-zinco e um domínio de clivagem de DNA. Vide, por exemplo, U.S. 9.145.565.
[00264] Em algumas modalidades, o sistema de edição de gene é uma Nuclease baseada em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN). TALENs são enzimas de restrição engenheiradas que são feitas através da fusão de um domínio de ligação a DNA de efetor TAL a um domínio de clivagem de DNA. Vide, por exemplo, U.S. 9.181.535.
[00265] Em algumas modalidades, o sistema de edição de gene é um sistema baseado em Argonaute. Sistemas de edição de gene ba- seados em Argonaute incluem uma endonuclease derivada de Argo- naute e um ssDNA fosforilado 5". Em algumas modalidades, o sSDNA fosforilado pode ser de 10-40 nucleotídeos, 15-30 nucleotídeos ou 18- nucleotídeos (por exemplo, cerca de 24 nucleotídeos) de compri- mento. Em algumas modalidades, a endonuclease Argonaute pode ser qualquer endonuclease. Em algumas modalidades, a endonuclease Argonaute é derivada de Thermus thermophiles (TtAgo), Pirococcus furiosus (PfAgo) ou Natronobacterium gregoryi (NgAgo). Em algumas modalidades, a Natrobacterium gregoryi (NgAgo) é cepa 2 (i.e. N. gre- goryi SP2). Em algumas modalidades, a endonuclease Argonaute é NgAgo. Vide, por exemplo, Gao e outros, "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute," Nature Biotechno- logy, Maio de 2016.
[00266] Os inibidores de DNA-PK pode ser qualquer inibidor de DNA-PK. O inibidor de DNA-PK pode ser qualquer composto ou subs- tância que cause inibição de uma DNA-PK. O inibidor de DNA-PK po- de ser um composto, molécula pequena, anticorpo ou sequência de nucleotídeo. Em algumas modalidades, os inibidores de DNA-PK são compostos representados pelas fórmulas (1), (II), (III-A-1), (III|-A-2), (Ill- B-1), (111-B-2), (IV), (V-A) e (V-B).
[00267] Em algumas modalidades, a invenção provê um método de edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo, o método inclui admi- nistrar a uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômi- cas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto represen-
A x N
SO : S tado pela Fórmula (lI): O (1) ou sais farmaceutica- mente aceitáveis do mesmo, em que cada um de R', R?º, X, Anel A, Anel B e Anel C é independentemente como definido em outro ponto aqui.
[00268] OAnelAé um sistema de anel aromático selecionado de Ro
TX XX É í ou : ; O sistema de anel B é um sistema de anel selecionado de
OSSO O O, O, O, O ou “o , em que o anel B é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em —-F, OH e C1-4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em —F, -CIl, -OH e -OC1-2alquila; O Anel C é um grupo Cas cicloalquila, heteroarila de 5-6 membros ou fenila, em que o Anel C é opcionalmente substituído ain- da com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em halogênio, C1-2 alquila, -OH e -OC71-2 alquila; X é —NH-, -O-, -OC14 alquil-, -S- ou-CH>2-; cada um de R' e R? é, independentemente, hidrogênio, - C(O)NHRº, -C(O0)JOR, -NHC(O)RI, -NHC(O)JORº, -NHC(O)NHRS, - NHS(O)2Rº, -NHR9, -C1-4 alquil-NHRº, -ORº ou R7 em que R' e R2 não podem ser simultaneamente hidrogênio; cada Rº independentemente é hidrogênio, -C14 alquila, ha-
logênio, -OC1.2 alquila, -C(O)OH, -C(0)OC1.2 alquila, -CN, -C(O)NHC 1-2 alquila, -C(O)NH2, C34 cicloalquila ou -NRR', em que cada uma das ditas R$ alquila e cicloalquila independentemente é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em -F, -Cl, -OH e -OC1-2alquila;
cada Rº independentemente é hidrogênio, C1+4 alquila, Ca4 alquenila, C2-4 alquinila, C3-10 cicloalquila, arila de 6-10 membros, hete- roarila de 5-10 membros ou heterociclila de 4-10 membros, em que cada um dos ditos grupos Rº é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -Br, -CI, -F, C1-4 alquila, CN, NO>, C2.4 alquenila, C2-4 alquinila, C3a-6 cicloalquila, Co alquil-C3.5 cicloalquila, Cos alquil-O-C14 alquila, Co-4s alquil-O-Co4 alquil- C3-5 cicloalquila, C(O0)OC14 alquila, C(0)OCo+4 alquil-C3-5 cicloalquila, Cos alqui-C(O)NH2, C(ONHCi4 alquila C(O)N(Cia alquila), C(O)NH(Co1 alquil-C3-5 cicloalquila), CH2OR”, Cos alquil-C(O)Rº, Co-s alquil-C(O)N(R”)2, Co.4 alquil-C(O)ORS, Cos alquil-NHC(OJ)RS, Co alquil- N(R5)2, heterociclila de 5-6 membros, -O(C1+4 alquila)ORS, -OR* e oxo e em que cada um dos ditos substituintes Rº opcionalmente é opcional- mente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -F, -Cl, C14 alquila, -OH, -OC1+4 alquila, -SC14 alquila, -C(O)C14 alquila, -C(0)OC14 alquila e -C(0)OC»- 4 alquil-C3.5 cicloalquila; e cada Rº independentemente é hidrogênio, Cialquila, feni- la, heteroarila de 5-6 membros ou heterociclila de 4-7 membros, em que cada Rº independentemente é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -F, -CI, C1- 2alquila, -CH2O0H, -CN, -OH, -OC1-2 alquila, heteroarila de 5-8 membros e heterociíclila de 4-7 membros ou dois grupos R$ junto com o átomo de nitrogênio interveniente formam opcionalmente um anel morfolina, anel azetidina, anel pirrolidina, anel piperidina ou anel piperazina; e
Rº é hidrogênio ou Ci4alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em - F, -Cl, -CH20H, -CN, -OH e -OC1.2alquila; R' é arila de 6-10 membros, heteroarila de 5-10 membros ou heterociclila de 4-7 membros, cada uma das quais é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em -F, -Cl, C1-2alquila, -CH2O0H, -ON e -OR; e cada um de R e R' independentemente é hidrogênio ou C1+4 alquila, ou R e R' junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados formam opcionalmente um anel morfolina, anel azetidina, anel pirrolidina, anel piperidina ou anel piperazina.
[00269] Em algumas modalidades, a invenção provê um método de edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo, o método inclui admi- nistrar a uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômi- cas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto represen- tado pela Fórmula (II) ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mes- mo: x 4 N O) O R? CE (Il), em que as variáveis de Fórmula (II) são, cada uma, independentemente como descrito abaixo.
[00270] No primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (II), cada uma das variáveis de Fórmula (II) é independentemente como acima des- crito em qualquer um dos primeiro a vigésimo sétimo conjuntos de va- riáveis de Fórmula (1).
[00271] No segundo conjunto de variáveis de Fórmula (Il), R' é - C(O)NHRº, -C(0)JORº, -NHC(O)Rº, -NHC(O0)ORº, -NHC(O)NHR?$, - NHS(O)2Rº, -Co.4 alquil-NHRº, -ORº ou R”; e R? é hidrogênio. As variá- veis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente co-
mo descrito em qualquer um dos primeiro a vigésimo sétimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[00272] Em algumas modalidades, a invenção provê um método de edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo o método inclui admi- nistrar a uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômi- cas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto represen- tado pela Fórmula (III-A-1), (II1-A-2), (III-B-1) ou (I11-B-2) ou sais far- maceuticamente aceitáveis dos mesmos: Rô 1 R$ N R: O. N Rº s Y O. | A LO N PORO “ oO (II-A-1) O (II-B-1), Rô 1 Rº NOR? ON Rô s Y
O ST CS Ro O (I1I-A-2) ou (I11-B-2), em que as variáveis de Fórmula (II) são cada uma independentemente como descrito abaixo.
[00273] No primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (Ill- A-2), (II1I-B-1) ou (II1-B-2), cada uma das variáveis de (III-A-1), (I1I-A-2), (II-B-1) ou (II1I-B-2) é independentemente como acima descrito em qualquer um dos primeiro a vigésimo sétimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[00274] No segundo conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (Ill- A-2), (III-B-1) ou (I11-B-2), Rº é -C(O)NHR$, -C(0)ORº, -NHC(O)RS, - NHC(O0)ORº, -NHC(O)NHRº, -NHS(O)2Rº, -Cos alquil-NHRº, -ORº ou R'; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma independen-
temente como descrito em qualquer um dos primeiro a vigésimo séti- mo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[00275] No terceiro conjunto de variáveis de (III-A-1), (I1I-A-2), (Ill- B-1) ou (I1I-B-2), Rº é —-C1.4 alquil-NHRº, -NHRº ou -OR$; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um do primeiro ou segundo conjunto de variáveis de (III-A-1), (II1-A-2), (I11-B-1) ou (II1I-B-2).
[00276] No quarto conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (III-A- 2), (III-B-1) ou (II1I-B-2), R' é -NHR$; e as variáveis restantes de Fórmu- la (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a terceiro conjuntos de variáveis de Fórmula (I1I-A-1), (I11-A-2), (I1I-B-1) ou (II1I-B-2).
[00277] No quinto conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (III-A- 2), (INI-B-1) ou (I1I-B-2), Rº é -OR$; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a quarto conjuntos de variáveis de Fórmula (III-A-1), (Ill- A-2), (I1I-B-1) ou (111-B-2).
[00278] No sexto conjunto de variáveis de Fórmula (III-A-1), (III-A- 2), (IN-B-1) ou (I1I-B-2), Rº independentemente é hidrogênio, metila, - Cl, -OCH3, CN, ciclopropila, -NHCH3 ou N(CH3)2; Rº é hidrogênio ou metila; e as variáveis restantes de Fórmula (1) são cada uma e inde- pendentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a quinto conjuntos de variáveis de Fórmula (III-A-1), (II1-A-2), (I11-B-1) ou (III-B- 2).
[00279] Em ainda uma outra modalidade, os compostos da inven- ção são representados pela Fórmula (IV) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos:
"Ou SS < O (IV), em que as variáveis de Fórmula (IV) são ca- da uma e independentemente como descrito abaixo.
[00280] No primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (IV), cada uma das variáveis é independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a trigésimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[00281] No segundo conjunto de variáveis de Fórmula (IV), R' é hi- drogênio, -C(O)NHR%, -C(O)JOR%, -NHC(OJ)R, -NHC(O)JOR!, - NHC(O)NHR?, -NHS(O)2Rº, -Co.4 alquil-NHRº, -OR? ou R'; e as variá- veis restantes de Fórmula (IV) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a trigésimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[00282] No terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (IV), o Anel B é opcionalmente substituído ÇQ e as variáveis restantes de Fórmula (IV) são cada uma e independentemente como descrito no primeiro ou segundo conjunto de variáveis de Fórmula (IV).
[00283] Em algumas modalidades, a invenção provê um método de edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo, o método inclui admi- nistrar a uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômicas um sistema de edição de genoma e um composto representado pela Fórmula (V-A) ou (V-B) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos:
RO, 3 3
N Ç (V-A) ou Ro O. & Rº
DS
N Ç (V-B), em que cada uma das variáveis de Fórmula (V-A) ou (V-B) é independentemente como descrito abaixo.
[00284] No primeiro conjunto de variáveis de Fórmula (V-A) ou (V- B), cada uma das variáveis é independentemente como descrito em qualquer um dos primeiro a trigésimo conjuntos de variáveis de Fórmu- la (1).
[00285] No segundo conjunto de variáveis de Fórmula (V-A) ou (V- B), Rº é hidrogênio, metila, ciclopropila, -F, -CI, -OC1-2alquila, -NRR' ou -CN, em que cada uma da dita R3 alquila é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em — F, -OH e -O(C1-2 alquila); cada Rº independentemente é C1-1 alquila op- cionalmente substituída opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em —F, -OH e -O(C1-2 alquila); e R e R' são cada um independentemente hidrogênio ou C1-2 alquila. As variáveis restantes de Fórmula (V-A) ou (V-B) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer um dos primei- ro a trigésimo conjuntos de variáveis de Fórmula (1).
[00286] No terceiro conjunto de variáveis de Fórmula (V-A) ou (V- B), cada R? é independentemente hidrogênio, metila, -CI, -OCHs3, -CN, ciclopropila, -NHCH3 ou -N(CH3)2; e Rô é hidrogênio ou metila. As va-
riáveis restantes de Fórmula (V-A) ou (V-B) são cada uma e indepen- dentemente como descrito no primeiro ou segundo conjunto de variá- veis de Fórmula (V-A) ou (V-B).
[00287] Em ainda uma outra modalidade, os compostos da inven- ção são representados por qualquer uma das Fórmulas (1), (II), (III-A- 1), (III-A-2), (I11-B-1), (I11I-B-2), (IV), (V-A) e (V-B), ou sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos, em que cada uma das variáveis des- sas Fórmulas é independentemente como mostrado nas fórmulas es- truturais das Tabelas 1 e 2.
[00288] Em algumas modalidades, a descrição também provê um método de reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas-alvo através de uma via de reparo direcionado por homolo- gia (HDR), o método inclui administrar a uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de geno- ma e um composto representado pelas Fórmulas (1), (II), (III-A-1), (Ill- A-2), (U1-B-1), (I11-B-2), (IV), (V-A) e (V-B) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00289] O sistema de edição de genoma interage com um ácido(s) nucleico(s) das regiões genômicas-alvo, resultando em uma quebra de DNA, e em que a quebra de DNA é reparada pelo menos em parte por meio da via de HDR.
[00290] Em algumas modalidades, a invenção também provê um método de inibição ou supressão de reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas-alvo por meio de uma via de NHEJ, o método inclui administrar a uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto representado pela Fórmula (1), (II), (III-A-1), (I1I-A-2), (IIl- B-1), (I1I-B-2), (IV), (V-A) e (V-B) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00291] O sistema de edição de genoma interage com um ácido(s)
nucleico(s) da uma ou mais regiões genômicas-alvo, resultando em uma quebra de DNA, e em que reparo da quebra de DNA por meio da via de NHEJ é inibido ou suprimido.
[00292] Em algumas modalidades, a invenção também provê um método de modificação da expressão de um ou mais genes ou proteí- nas, o método incluindo administrar a uma ou mais células que com- preendem uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto representado pelas Fórmulas (1), (II), (III-A- 1), (II|-A-2), (I1I-B-1), (I11-B-2), (IV), (V-A) e (V-B) ou sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos.
[00293] O sistema de edição de genoma interage com um ácido(s) nucleico(s) da uma ou mais regiões genômicas-alvo de um gene(s)- alvo, resultando em edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo e em que a edição modifica a expressão de um gene(s) e/ou proteína(s) a jusante associado(s) com o(s) gene(s)-alvo(s).
[00294] Em algumas modalidades, a quebra de DNA inclui uma quebra de DNA de filamento duplo (DSB).
[00295] Em algumas modalidades, o composto é um cocristal que inclui um composto tendo uma estrutura de Fórmula (1) e um formador de cocristal selecionado de ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico ou ácido benzoico.
[00296] Em algumas modalidades, a eficiência de edição das regi- ões genômicas-alvo na uma ou mais células é aumentada comparado com aquela em célula ou células de outro modo idênticas sem o com- posto.
[00297] Em algumas modalidades, a eficiência do reparo da quebra de DNA nas regiões genômicas-alvo na uma ou mais células por meio de uma via de HDR é aumentada comparado com aquela em célula ou células de outro modo idênticas, mas sem o composto.
[00298] Em algumas modalidades, a eficiência de inibição ou su-
pressão do reparo da quebra de DNA nas regiões genômicas-alvo na uma ou mais células por meio de uma via de NHEJ é aumentada com- parado com aquela em célula ou células de outro modo idênticas, mas sem o composto.
[00299] Em algumas modalidades, a eficiência é aumentada em pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes com- parado com aquela em célula ou células de outro modo idênticas, mas sem composto.
[00300] Em algumas modalidades, a eficiência é medida através de frequência de integração de polinucleotídeo direcionada. Em algumas modalidades, a eficiência é medida através da frequência de mutagê- nese mutada. Em algumas modalidades, a mutagênese direcionada compreende mutações por ponto, deleções e/ou inserções.
[00301] Em algumas modalidades, a expressão de um gene(s) e/ou proteína(s) a jusante associado(s) com o(s) gene(s) alvo é aumentada comparado com o nível de expressão de linha basal na uma ou mais células antes da administração. Por exemplo, a dita expressão é au- mentada em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou 10 vezes comparado com o nível de expressão de linha basal na uma ou mais células antes da administração.
[00302] Em algumas modalidades, a expressão de um gene(s) e/ou proteína(s) a jusante associado(s) com o(s) gene(s)-alvo é diminuída comparado com o nível de expressão de linha basal na uma ou mais células antes da administração. Por exemplo, a expressão do gene é diminuída em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% comparado com o nível de expressão de linha basal na uma ou mais células antes da administra- ção.
[00303] Em algumas modalidades, a expressão de um gene(s) e/ou proteína(s) a jusante associado(s) com o(s) gene(s)-alvo é substanci- almente eliminada na uma ou mais células.
[00304] Em algumas modalidades, a célula é sincronizada na fase de ciclo celular S ou G2.
[00305] Em algumas modalidades, a uma ou mais células que são administradas ou contatadas com o dito composto têm sobrevivência aumentada comparado com a uma ou mais células que não foram administradas ou contatadas com o dito composto.
[00306] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma e o composto são administrados a uma ou mais células simultanea- mente. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma e o composto são administrados a uma ou mais células sequencialmente. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é adminis- trado a uma ou mais células antes do composto. Em algumas modali- dades, o composto é administrado a uma ou mais células antes do sis- tema de edição de genoma.
[00307] Em algumas modalidades, a uma ou mais células são célu- las culturadas. Em algumas modalidades, a uma ou mais células são células in vivo dentro de um organismo. Em algumas modalidades, a uma ou mais células são células ex vivo de um organismo.
[00308] Em algumas modalidades, o organismo é um mamífero. Em algumas modalidades, o organismo é um humano.
[00309] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma e o composto são administrados através da mesma via. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma e o composto são admi- nistrados através de uma via diferente. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é administrado intravenosamente e o composto é administrado oralmente.
[00310] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é selecionado de um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease dedo-de-zinco (ZFN), um sistema de Nuclease com base em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sis- tema com base em CRISPR ou um sistema com base em NgAgo.
[00311] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema com base em CRISPR. Em algumas modalidades, o sis- tema com base em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas ou um siste- ma CRISPR-Cpf.
[00312] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas e em que o sistema CRISPR-Cas inclui: (a) pelo menos um elemento de RNA-guia que inclui: (1) um RNA direcio- nador que inclui uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo na uma ou mais regi- ões genômicas-alvo ou um ácido nucleico que inclui uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA direcionador; (ii) e um RNA ativador que inclui uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com o RNA direcionador ou um ácido nucleico que inclui uma sequên- cia(s) de nucleotídeo codificando o RNA ativador; e (b) um elemento de proteína Cas que inclui uma proteína Cas ou um ácido nucleico que inclui uma sequência(s) de nucleotídeo codificando a proteína Cas.
[00313] Em algumas modalidades, o RNA direcionador e RNA ati- vador são fundidos como uma molécula única.
[00314] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 do Tipo Il. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, Fokl-dCas9 ou D1O0A nickase ou qualquer combinação das mesmas.
[00315] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cpf e o sistema CRISPR-Cpf inclui: (a) pelo menos um elemento de RNA-guia ou um ácido nucleico que inclui uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o elemento de RNA-guia, o
RNA-guia que inclui um RNA direcionador que inclui uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo na uma ou mais regiões genômicas-alvo; e (b) um elemen- to de proteína Cpf que inclui uma proteína Cpf ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando a proteína Cpf.
[00316] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é administrado através de um ou mais vetores.
[00317] Em algumas modalidades, o um ou mais vetores são sele- cionados de vetores virais, plasmídeos ou ssDNAs.
[00318] Em algumas modalidades, os vetores virais são seleciona- dos de vetores virais retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoassocia- dos e herpes simplex.
[00319] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é administrado através de RNA sintético.
[00320] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é administrado através de uma nanoformulação.
[00321] Em algumas modalidades, um estojo ou composição é pro- vido para edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo. Em algu- mas modalidades, o estojo ou composições incluem um sistema de edição de genoma; e um composto representado pela Fórmula (1), (Il), (III-A-1), (III-A-2), (I11-B-1), (111-B-2), (IV), (V-A) e (V-B) ou sais farma- ceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00322] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma do estojo ou composição é um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease dedo-de-zinco (ZFN), um sistema de Nuclease com base em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR ou sistema baseado em NgAgo. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma do estojo ou composição é um sistema baseado em CRISPR. Em algu-
mas modalidades, o sistema baseado em CRISPR do estojo ou com- posição é um sistema CRISPR-Cas ou um sistema CRISPR-Cpf.
[00323] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR do estojo ou composição é um sistema CRISPR-Cas e em que o sis- tema CRISPR-Cas inclui: (a) pelo menos um elemento de RNA-guia que inclui: (1) um RNA direcionador que inclui uma sequência de nu- cleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleo- tídeo na uma ou mais regiões genômicas ou um ácido nucleico que inclui uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA direciona- dor; (ii) e um RNA ativador que inclui uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com o RNA direcionador ou um ácido nuclei- co que inclui uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA ati- vador; e (b) um elemento de proteína Cas que inclui uma proteína Cas ou um ácido nucleico que inclui uma sequência(s) de nucleotídeo codi- ficando a proteína Cas.
[00324] Em algumas modalidades, a proteína Cas do estojo ou composição é uma proteína Cas9 do Tipo Il. Em algumas modalida- des, a proteína Cas9 do estojo ou composição é uma SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, Fokl-dCas9 ou D1O0A nickase ou qualquer combinação das mesmas.
[00325] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR do estojo ou composição é um sistema CRISPR-Cpf, e em que o sis- tema CRISPR-Cpf inclui: (a) um RNA direcionador que inclui uma se- quência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma se- quência de nucleotídeo na uma ou mais regiões genômicas-alvo ou um ácido nucleico que inclui uma sequência(s) de nucleotídeo codifi- cando o RNA direcionador; e (b) um elemento de proteína Cpf que in- clui uma proteína Cpf ou um ácido nucleico que inclui uma sequên- cia(s) de nucleotídeo codificando a proteína Cpf.
[00326] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma do estojo ou composição está incluído ou empacotado em um ou mais vetores. Em algumas modalidades, o um ou mais vetores são selecio- nados de vetores virais, plasmídeos ou ssSDNAs. Em algumas modali- dades, os vetores virais são selecionados do grupo consistindo em ve- tores virais retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoassociados e de herpes simplex.
[00327] Em algumas modalidades, a eficiência de edição de geno- ma aumentada é cerca de 1| vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, em comparação com uma condição em que um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não é administrado a uma célula(s), ou comparado com uma condição em que apenas um sistema de edição de genoma e não um inibidor de DNA-PK é admi- nistrado a uma célula(s). Uso de Inibidores de DNA-PK e Sistema de Edição de Genoma, Esto- jos e Composições dos mesmos
[00328] Edição de genoma, em que regiões genômicas particulares são alteradas com precisão, detém um grande potencial terapêutico.
[00329] Em algumas modalidades, são providos aqui métodos para edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo, para reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas-alvo por meio de uma via de HDR, para inibição ou supressão de reparo mediado por NHEJ de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas- alvo e para modificação da expressão de um ou mais genes ou proteí- nas por meio da administração a uma célula de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK.
[00330] Em algumas modalidades, são providos aqui métodos de modificação de expressão de um ou mais genes ou proteínas compre- endendo administrar a uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK descrito aqui, em que o sistema de edição de ge- noma interage com um ácido(s) nucleico(s) da uma ou mais regiões genômicas-alvo de um gene(s)-alvo, resultando em edição da uma ou mais regiões genômicas-alvo e em que a edição modificada expressão de um gene(s) e/ou proteína(s) a jusante associado com o(s) gene(s)- alvo.
[00331] O sistema de edição de genoma pode ser qualquer sistema de edição de genoma que possa editar uma região genômica-alvo em uma célula(s). Sistemas de edição de genoma exemplares são descri- tos em detalhes acima e podem incluir, por exemplo, um sistema ba- seado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease dedo-de- zinco (ZFN), um sistema de Nuclease com base em Efetor do Tipo Ati- vador de Transcrição (TALEN), um sistema com base em CRISPR ou um sistema com base em NgAgo.
[00332] Edição da uma ou mais regiões genômicas-alvo inclui qual- quer tipo de manipulações genéticas ou engenharia do genoma de uma célula. A edição da uma ou mais regiões genômicas-alvo pode incluir inserções, deleções ou substituições de regiões genômicas em uma célula(s) realizadas por uma ou mais endonucleases. Regiões genômicas compreendem o material genético em uma célula(s), tal como DNA, RNA, polinucleotídeos e oligonucleotídeos. Regiões ge- nômicas em uma célula(s) também compreendem os genomas de mi- tocôndrias ou cloroplastos contidos em uma célula(s).
[00333] Em algumas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento de um indivíduo tendo uma doença ou condição com ne- cessidade de edição de uma ou mais regiões genômicas-alvo em uma célula(s) do indivíduo, os quais compreendem administrar a uma ou mais células um sistema de edição genômica e um inibidor de DNA- PK.
[00334] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui são usados para modificar expressão de um gene, uma molécula de RNA, uma proteína, um grupo de proteínas ou proteínas a jusante em uma via. Tal modificação pode ser usada para tratar uma doença, uma dis- função, homeostase organismal anormal, ou adquirida ou herdada ou aquelas devido ao processo de envelhecimento. Como aqui usado, o termo "modificar" ou "modificação" inclui modulação, elevação, dimi- nuição, aumento, inserção, deleção, inativação, ativação e similar.
[00335] Um versado na técnica compreende que doenças, ou ad- quiridas ou herdadas, ou de outro modo obtidas, envolvem uma des- regulagem de mecanismos homeostáticos incluindo envolvimento de função de gene ou proteína. Para essa finalidade, um versado pode usar os métodos providos aqui para modular, modificar, elevar, diminu- ir ou prover uma função genética em um indivíduo.
[00336] Modificação de expressão de gene e consequente expres- são de proteína em uma célula(s) pode ser obtida através dos méto- dos providos aqui, por exemplo, através de edição específica (por exemplo, substituição, inserção ou deleção, qualquer combinações das mesmas) de uma sequência de ácido nucleico em qualquer um de um éxon, um íntron, um sítio de início de transcrição, uma região pro- motora, uma região aumentadora, uma região silenciadora, uma região isolante, um antirrepressor, um elemento regulador pós-traducional, um sinal de poliadenilação (por exemplo, poli A mínimo), uma região conservada, um sítio de ligação de fator de transcrição ou qualquer combinações dos mesmos.
[00337] Em algumas modalidades, os métodos, estojos e composi- ções providos aqui são usados para tratar um indivíduo que tem cân- cer. O método de tratamento de um indivíduo tendo um câncer ou condição relacionada a câncer compreende administrar a uma célu- la(s) do indivíduo um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma. A administração do inibidor de DNA-PK e do sistema de edi-
ção de genoma pode ser in vivo ou ex vivo.
[00338] O câncer pode ser de qualquer tipo de câncer. Câncer inclui tumores sólidos tais como de mama, ovário, próstata, pulmão, rim, gástrico, de cólon, testicular, cabeça e pescoço, pâncreas, cérebro, melanoma e outros tumores de tecido e órgãos e cânceres das células sanguíneas, tais como linfomas e leucemias, incluindo leucemia mie- lógena aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfocítica de célu- la T e linfomas de célula B. Os cânceres podem incluir melanoma, leu- cemia, astrocitoma, glioblastoma, linfoma, glioma, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crônica e câncer do pâncreas, mama, tireoide, ová- rio, útero, testículos, pituitária, rim, estômago, esôfago e reto.
[00339] Em algumas modalidades, os métodos, estojos e composi- ções providos aqui são usados para tratar um indivíduo tendo qualquer um ou mais dos cânceres que seguem: Leucemia linfoblástica aguda (ALL), Leucemia mieloide aguda, Câncer anal, Câncer de apêndice, Astrocitoma, cerebelar ou cerebral infantil, Carcinoma de célula basal, Câncer do duto biliar, extraepático (vide colangiocarcinoma), Câncer de bexiga, Tumor ósseo, osteossarcomal/histiocitoma fibroso maligno, Glioma do tronco cerebral, Câncer de cérebro, Tumor cerebral, astroci- toma cerebelar, Tumor de cérebro, astrocitoma cerebral/glioma malig- no, Tumor cerebral, ependimoma, Tumor cerebral, meduloblastoma, Tumor cerebral, tumores neuroectodermais primitivos supratentoriais, Tumor cerebral, glioma da via visual e hipotalâmico, Câncer de mama, Adenomas/carcinoides brônquicos, linfoma de Burkitt, Tumor carcinoi- de, Tumor carcinoide, infantil, Carcinoma de primário desconhecido, gastrintestinal, Linfoma do sistema nervoso central, Astrocitoma cere- belar, primário, Astrocitoma cerebral/glioma maligno, infantil, Câncer cervical, infantil, Cânceres infantis, Condrossarcoma, Leucemia linfocí- tica crônica, Leucemia mielógena crônica, Distúrbios mieloproliferati- vos crônicos, Câncer de cólon, Linfoma de célula T cutâneo, Tumor de célula redonda pequena desmoplástico, Câncer endometrial, Ependi- moma, Hemangioendotelioma epiteloide (EHE), Câncer esofageal, Sarcoma de Ewing na família Ewing de tumores, Tumor de célula ger- minativa extracraniano, Tumor de célula germinativa extragonadal, Câncer do duto da bile extraepático, Câncer do olho, melanoma intra- ocular, Câncer do olho, retinoblastoma, Câncer da vesícula biliar, cân- cer gástrico (estômago), Tumor carcinoide gastrintestinal, Tumor es- tromal gastrintestinal (GIST), Tumor de célula germinativa: extracrani- ano, extragonodal ou ovariano, Tumor trofoblástico gestacional, Glio- ma do tronco cerebral, Glioma, astrocitoma cerebral infantil, Glioma, da via visual infantil ou hipotalâmico, Carcinoide gástrico, Leucemia de célula pilosa, Câncer de cabeça e pescoço, Câncer do coração, Cân- cer hepatocelular (fígado), Linfoma de Hodgkin, Câncer hipofaringeal, Glioma hipotalâmico e da via visual, Melanoma intraocular, infantil, Carcinoma de célula da ilhota (pâncreas endócrino), Sarcoma de Ka- posi, Câncer de rim (câncer de célula renal), Câncer laringeal, Leuce- mias, Leucemia, linfoblástica aguda (também chamada leucemia linfo- cítica aguda), Leucemia, mieloide aguda (também chamada leucemia mieloide aguda), Leucemia, linfocítica crônica (também chamada leu- cemia linfocítica crônica), Leucemia, mielógena crônica (também cha- mada leucemia mieloide crônica), Leucemia, de célula pilosa, Câncer de lábio e cavidade oral, Lipossarcoma, Câncer de fígado (primário), Câncer de pulmão, de não pequenas células, Câncer de pulmão, de pequenas células, Linfomas, Linfoma relacionado à AIDS, Linfoma de Burkitt, Linfoma de Célula T cutâneo, Linfomas de Hodgkin, Linfoma Não Hodgkin (classificação antiga de todos os linfomas exceto de Ho- dakin), Macroglobulinemia do sistema nervoso central primário, Wal- denstróm, Câncer de Mama masculino, Histiocitoma fibroso maligno de osso/osteossarcoma, Meduloblastoma, Melanoma infantil, Melano- ma, introcular (olho), Câncer de célula Merkel, Mesotelioma, Mesoteli-
oma maligno adulto, Câncer de pescoço escamoso metastático infantil com primário oculto, Câncer de boca, Mieloma múltiplo de síndrome de neoplasia endócrina múltipla/neoplasma de células plasmáticas, Micose fungoide, Síndromes mielodisplásticas, Doenças mielodisplás- tica/mieloproliferativas, Leucemia mielógena, Leucemia mieloide crôni- ca, Leucemia mieloide aguda do adulto, Mieloma agudo infantil, múlti- plo (câncer da medula óssea), Distúrbios mieloproliferativo, Mixoma crônico, Câncer da cavidade nasal e seio paranasal, Carcinoma naso- faringeal, Neuroblastoma, Linfoma Não Hodgkin, Câncer de pulmão de Não pequenas células, Oligodendroglioma, Câncer Oral, Câncer orofa- ringeal, Osteossarcomal/histiocitoma fibroso maligno de osso, Câncer ovariano, Câncer epitelial ovariano (tumor epitelial-estromal da super- fície), Tumor de célula germinativa ovariano, Tumor de potencial ma- ligno baixo ovariano, Câncer pancreático, Câncer pancreático de célu- la da ilhota, Câncer do seio paranasal e cavidade nasal, Câncer parati- reoide, Câncer de pênis, Câncer de faringe, Feocromocitoma, Astroci- toma Pineal, Germinoma pineal, Pineoblastoma e tumores neuroecto- termais primitivos supratentoriais, Adenoma da pituitária, Neoplasia de célula plasmática/Mieloma múltiplo, Blastoma pleuropulmonar, Linfoma do sistema nervoso central primário, Câncer de próstata, Câncer retal, Carcinoma de célula renal (câncer de rim), Câncer de pelve renal e do ureter, câncer de célula transicional, Retinoblastoma, Rabdomiossar- coma, Câncer da glândula salivar, Sarcoma, Família Ewing de tumo- res, Sarcoma de Kaposi, Sarcoma de tecido mole, sarcoma uterino, Síndrome de Sézary, Câncer de pele (não melanoma), Câncer de Pele (melanoma), Carcinoma de pele, Célula Merkel, Câncer de pulmão de pequenas células, Câncer do intestino delgado, Sarcoma de tecido mole, Carcinoma de célula escamosa — vide câncer de pele (não me- lanoma), Câncer de pescoço escamoso com primário oculto, metastá- tico, Câncer de estômago, Tumor neuroectodermal primitivo supraten-
torial, Linfoma de célula T, cutâneo (Micose Fungoide e síndrome de Sézary), Câncer testicular, Câncer de garganta, Timoma, Timoma e carcinoma tímico, Câncer de tireoide, Câncer de tireoide, Câncer de célula transicional da pelve renal e do ureter, Tumor trofoblástico ges- tacional, Carcinoma de sítio primário desconhecido de adulto, Câncer de sítio primário desconhecido, infantil, Ureter e pelve renal, câncer de célula transicional, Câncer uretral, Câncer uterino, câncer endometrial, Sarcoma uterino, Câncer vaginal, Glioma da via visual e hipotalâmico, Câncer vulvar, Macroglobulinemia de Waldenstrôm ou Tumor de Wilms (câncer de rim).
[00340] Em algumas modalidades, genes-alvo exemplares associa- dos com câncer incluem ABL1, ABL2, ACSL3, AF1I5Q14, AF1Q, AF3p21, AF5931, AKAP9, A T1, AKT2, ALDH2, AL, ALO017, APC, ARHGEF12, ARHH, ARID1IA, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASXL1, ATF1, ATIC, ATM, ATRX, AXIN1, BAP1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCL7A, BCL9, BCOR, BCR, BHD, BIRC3, BLM, BMPRIA, BRAF, BRCAI, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIPI, BTG1, BUB1B, C120rf9, C150rf21, C150rf55, C16orf75, C2orf44, CAMTAS, CANT1, CARD11, CARS, CBFA2T1, CBFA2T3, C.BFB, CBL, CBLB, CBLC, CCDC6, CCNB1IP1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD273, CD274, CD74, CD79A, CD79B, CDH1, CDH11, CDK12, CDKA4, CDK6, CD N2A, CD N2a(pl4), CD N2C, CDX2, CEBPA, CEPI, CHCHD7, CHEK2, CHIC2, CHNI, CIC, Cin A, CLTC, CLTCLI1, CMKOR1, CNOT3, COL1 Al, COPEB, COX6C, CREB1, CREB3L1, CREB3L2, CREBBP, CRLF2, CRTC3, CTNNB1, CYLD, D10S170, DAXX, DDB2, DDIT3, DDX10, DDX5, DDX6, DEK, DICER1, DNM?2, DNMT3A, DUXA4, EBFI, ECT2L, EGFR, E1F4A2, ELF4, ELKA4, ELKS, ELL, ELN, EMLA4, EP300, EPS 15, ERBB2, ERCC2, ERCC3, ERCCA, ERCC5, ERG, ETVI, ETVA4, ETV5, ETV6, EVII, EWSR1, EXTI, EXT2, EZH2, EZR, FACL6, FAM22A, FAM22B, FAM46C, 1ANCA, EANCC,
FANCD?2, FANCE, FANCF, FANCG, FBXOI| 1, FBXW7, FCGR2B, FEV, FGFR1, FGFRIOP, FGFR2, FGFR3, FTI, FIT, FIPILI, FLU, FLJ27352, FLT3, FNBP1, FOXL2, FOXOIA, FOXO03A, FOXP1, FSTL3, FUBP1, FUS, FVT1, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GMPS, GNA11, GNAQ, GNAS, GOLGAS5, GOPC, GPC3, GPHN, GRAF, H3F3A, ICMOGT-1, IEAB, HERPUD1, IIEY1, IPI, HIST11T3B, WST114], IILE, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNRNPAZBI, HOOK3, HOXA11, HOXA13, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HRAS, IIRPT2, HSPCA, HSPCB, IDHI, IDH2, IGH, IGK, IGL, IKZFI, IL2, TL21R, IL6ST, IL7R, IRF4, IRTA1, ITK, JAK1I, JAK2, JAK3, JAZF1, JUN, KCNJ5, KDMS5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KIAA1549, KIF5SB, KIT, KLF4, KLK2, KRAS, KTN1, LAF4, LASPI, LOCK, LCP1, LOX, LHFP, LIFR, LMOI, LMO2, LPP, LRIG3, LYL1, MADH4, MAF, MAFB, MALT1, MAML?2, MAP2KL MAP2K2, MAP2K4, MAX, MDM2, MDM4, MDS1, MDS?2, MECTI, MED12, MEN1, MET, MITF, MKL1, MLF1, MLIII, MLL, MLL2, MLL3, MLLT1, MLLTIO, MLLT2, MLLT3, MLLTA4, MLLT6, MLLT7, MN1, MPL, MSF, MSH2, MSH6, MSI2, MSN, MTCP1, MUC1, MUTYH, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYSTA4, NACA, NBS1, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NDRG1, NF1, NF2, NFE2L2, NFIB, NFKB2, NIN, NKX2-1, NONO, NOTCH |, NOTCH2, NPMI, NR4A3, NRAS, NSDI, NT5C2, NTRKI, NTRK3, NUMAI, NUP214, NUPS98, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PALB 2, PAX3, PAX5, PAX, PAX8, PBRM1, PBX1, PCM1, PCSK7, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PERI, PIIF6, PHOX2B, PICALM, PIK3CA, PIK3R1, PIM1, PLAG 1, PML, PMS1, PMS2, PMX1, PNUTL1, POT1, POUZAF1, POUSF1, PPARG, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRF1, PRKAR1 A, PRO1073, PSIP2, PTCH, PTEN, PTPN11, RABSEP, RACI, RAD51L1, RAFI, RALGDS, RANBP17, RAPIGDS|, RARA, RB, RBM15, RECQLA4, REL, RET, RNF43, ROS1, RPL10, RPL22, RPL5, RPN1, RUNDC2A, RUNX1, RUNXBP2, SBDS, SDC4, SDH5, SDHB,
SDHC, SDHD, SEPT6, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC34A2, SLC45A3, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, SMO, SOCS1, SOX2, SRGAP3, SRSF2, SSI8, SS18L1, SSH3BP1, SSX1, SSX2, SSX4, STAT3, STK11, STL, SUFU, SIJZ12, SYK, TAF15, TALI, TAL2, TCEA1I, TCF1, TCF12, TCF3, TCF7L2, TCL1IA, TCL6, TERT, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, THRAP3, TIF1, TLX1, TLX 3, TMPRSS2, TNFAIP3, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF6, TOPI, TP53, TPM3, TPMA4, TPR, TRA, TRAF7, TRB, TRD, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, U2AF1, USP6, VHL, VTUA, WAS, WHSC1, WHSC1L1, WIF1, WRN, WT1, WTX, WWTR1, XPA, XPC, XPOI, YWHAE, ZNF145, ZNF198, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF9, ZRSR2 ou quaisquer combinações dos mesmos.
[00341] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui são usados para tratar um indivíduo que tem um distúrbio herdado. O mé- todo de tratamento de um indivíduo tendo uma doença ou condição genética ou distúrbio herdado compreende administrar a uma célula(s) do indivíduo um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de geno- ma. A administração do inibidor de DNA-PK e do sistema de edição de genoma pode ser in vivo ou ex vivo.
[00342] O distúrbio herdado pode resultar de mutações ou duplica- ções em regiões cromossomais (por exemplo, de mutações por ponto, deleções, inserções, mudança da matriz de leitura, duplicações ou de- leções cromossomais). O distúrbio herdado pode ser qualquer distúr- bio herdado.
[00343] Em algumas modalidades, o distúrbio herdado é síndrome de deleção de 22911.2, síndrome de Angelman, doença de Canavan, doença de Charcot-Marie-Tooth, Daltonismo, Síndrome do Miado de Gato, Síndrome de Down, Distrovia muscular de Duchenne, Hemo- cromatose, Hemofilia, Síndrome de Klinefelter, Neurofibromatose, Fe-
nilcetonuria, Doença renal policística, Síndrome de Prader-Willi, Ane- mia falciforme, Atrofia muscular espinhal, Atrofia Muscular Espinhal, doença Tay-Sachs, Síndrome de Turner, uma hemoglobinopatia ou quaisquer combinações das mesmas.
[00344] Em algumas modalidades, o distúrbio herdado é síndrome de deleção de 1p36, síndrome de deleção de 18p, deficiência de 21- hidroxilase, 47 XXX (síndrome do triplo X), 47 XXY (Síndrome de Kli- nefelter), porforia deficiente em 5-ALA desidratase, deficiência de ALA desidratase, porfiria de deficiência de desidratase 5-aminolevulínica, síndrome de deleção de 5p, Miado-de-gato (também conhecida como síndrome 5p), ataxia telangiectasia (também conhecida como A-T), deficiência de alfa 1-antitripsina (AAT), aceruloplasminemia, acondro- gênese tipo Il (ACG2), acondroplasia (ACH), deficiência de beta- glucosidase ácida, doença de Gaucher (qualquer tipo, por exemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3), Acrocefalossindactilia (Apert), síndrome de Apert, acrocefalossindactilila (qualquer tipo, por exemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 5), síndrome de Pfeiffer, Acrocefalia, doença de Gaucher cerebral aguda, porfiria intermitente aguda, deficiência de ACY2 (AIP), doença de Alzheimer (AD), craniossinostose do tipo Adelaide, síndrome de Muenke, Colo Poliposo Adenomatoso, polipose adenomatosa familiar, Polipose Adenomatosa do Colo, polipose adenomatosa familiar (ADP), deficiência de adenilossuccinato liase, Distúrbios da glândula adrenal, Síndrome Adrenogenital, Adrenoleucodistrofia, síndrome de insensibi- lidade a andrógenos (AIS), alcaptonuria (AKU), porfiria ALA desidra- tase, porfiria ALA-D, deficiência de ALA desidratase, síndrome de Ala- gille, Albinismo, Alcaptonúria, alcaptonúria, doença de Alexander, al- captonúria, Ocronose alcaptonúrica, alcaptonúria, doença do inibidor de alfa-1 proteinase, enfisema relacionado a alfa-1, Deficiência de Al- fa-galactosidase A, Doença de Fabry, Síndrome de Alstrôm, Doença de Alexander (ALX), Amelogênese imperfecta, Deficiência de ácido amino levulínico desidratase, Deficiência de Aminoacilase 2, Doença de Canavan, Doença de Anderson-Fabry, síndrome de insensibilidade a andrógeno, Anemia, sideroblástica hereditária, anemia esplênica si- deroblástica ligada ao X e/ou anemia familiar, Angioqueratoma Corpó- reo Difuso, Angioqueratoma difuso, Retina angiomatose, doença von Hippel-Lindau, resistência a APC, tipo Leiden, trombofilia de fator V de Leiden, Síndrome de Apert, deficiência de AR, síndrome de insensibili- dade a andrógeno, doença de Charcot-Marie-Tooth (qualquer tipo, por exemplo, CMT1, CMTX, CMT2, CMT4, CMT de início precoce severa), Aracnodactilia, Síndrome de Marfan, ARNSHL, Surdez não sindrômica (recessiva autossômica, dominante autossômica, ligada ao X ou mito- condrial), Artro-oftalmopatia, progressiva hereditária, Síndrome de Sti- ckler (por exemplo, COL2A1, COL11A1, COL11A2, COL9A1), Artroca- lase multiplexa congênita, Síndrome de Ehlers-Danlos (por exemplo, tipo hipermobilidade, tipo artrocalasia, tipo clássica, tipo vascular, tipo cifoscoliose, tipo dermatosparaxis), deficiência de Asp, deficiência de Aspa, deficiência de Aspartoacilase, ataxia telangiectasia, síndrome de Autismo-Demência-Ataxia-Perda de Uso Intencional da Mão, Síndro- me de Rett, ALS juvenil dominante autossômica, síndrome de G/BBB opitz dominante autossômica, forma recessiva autossômica de ALS juvenil tipo 3, Esclerose lateral amiotrófica (qualquer tipo: ALS1, ALS2, ALS3, ALSA4, ALS5, ALS5, ALS6, ALS7, ALS8, ALS9, ALS1O, ALS11, ALS12, ALS13, ALS14, ALS15, ALS16, ALS17, ALS18, ALSO, ALS20, ALS21, ALS22, FTDALS1, FTDALS2, FTDALS3, FTDALSA, FTDALSA, IBMPFD?2), perda de audição não sindrômica autossômica recessiva, Prejuízo da Audição Sensorioneural Autossômico Recessi- vo e Goiter, Síndrome de Pendred, doença de Alexander (AxD), Sín- drome de Ayerza, hipertensão arterial pulmonar familiar, variante B da gangliosidose de Hexosaminidase GM2, doença de Sandhoff, distúrbio relacionado a BANF, neurofibromatose (qualquer tipo, por exemplo,
NF1, NF2, schwannomatose), síndrome de Beare-Stevenson cutis gyrata, Peritonite paroxismal benigna, Síndrome de Benjamin, beta- talassemia, Deficiência de BH4, deficiência de tetra-hidrobiopterina, Neurofibromatose Acústica Bilateral, deficiência de biotinidase, câncer de bexiga, Distúrbios hemorrágicos, trombofilia de fator V de Leiden, síndrome de Bloch-Sulzberger, incontinentia pigmenti, síndrome de Bloom, Doença óssea, doença de Bourneville, esclerose tuberosa, Doença cerebral, doença do príon, câncer de mama, síndrome de Birt- Hogg-Dubé, Doença óssea frágil, osteogênese imperfecta, Síndrome de Polegar-Hálux Largo, Síndrome de Rubinstein-Taybi, Diabetes Bronze, hemocromatose, Cirrose cor de bronze, Atrofia muscular bul- boespinhal, Atrofia muscular espinhal e bulbar ligada ao X, Síndrome de Burger-Grutz, deficiência de lipoproteína lipase, síndrome CADASIL familiar, distúrbio granulomatoso crônico CGD, Displasia campomélica, Síndrome de Câncer Familiar, câncer colorretal não poliposo hereditá- rio, câncer de mama, câncer de bexiga, Deficiência de Carboxilase, Deficiência de biotinidase de Início Tardio Múltipla, Síndrome do choro do gato, Síndrome cardiofacial de Caylor, Deficiência de Ceramida tri- exosidase, Angiomatose Cerebelorretinal, doença de von Hippel- Lindau familiar, Arteriopatia cerebral, síndrome de CADASIL, Arterio- patia autossômica dominante cerebral, síndrome de CADASIL, Hipe- ramonemia Cerebroatrófica, síndrome de Rett, síndrome de Lipidose por Cerebrosídeo, doença de Charcot, síndrome de CHARGE, Con- drodistrofia, síndrome de Condrodistrofia, Condrodistrofia com surdez sensorioneural, displasia otoespondilomegaepifiseal, Condrogênese imperfeita, síndrome de hiperuricemia, coreoatetose e automutilação, síndrome de Lesch-Nyhan, Glactosemia Clássica, galactosemia, fenda labial e palatina, síndrome de Stickler, Crânio em folha de trevo com nanismo tanatofórico, Displasia tanatofórica (por exemplo, tipo 1 ou tipo 2), síndrome de Coffin-Lowry (CLS), síndrome de Cockayne, sín-
drome de Coffin-Lowry, colagenopatia tipos Il e XI, Não polipose fami- liar, câncer colorretal não poliposo hereditário, câncer de cólon famili- ar, polipose adenomatosa familiar, Câncer colorretal, Deficiência de HPRT completa, Síndrome Lesch-Nyhan, Deficiência de hipoxantina- guanina fosforribosiltransferase completa, Neuropatia de compressão, neuropatia hereditária com susceptibilidade à paralisia por compres- são, Doença de tecido conectivo, Síndrome de anomalias faciais e co- notruncais, Anemia de Cooley, beta-talassemia, Doença do armaze- namento de Copper, doença de Wilson, doença do transporte de Cop- per, doença de Menkes, Coproporfiria, coproporfiria hereditária, Defici- ência de coproporfirinogênio oxidase, Síndrome de Cowden, Deficiên- cia de CPX, Disartrose craniofacial, Síndrome de Crouzon, Disostose Craniofacial, síndrome de Crouzon, doença de Crohn, fibroesteno- sante, síndrome de Crouzon, síndrome de Crouzon com acantose ni- gricans, síndrome Crouzondermoesquelético, síndrome de Crouzon- dermoesquelético, Síndrome de Cockayne (CS), síndrome de Cowden, síndrome de Curschmann-Batten-Steinert, síndrome da cutis gyrata de Bear-Stevenson, deficiência de D-glicerato desidrogenase, hiperoxalu- ria, primária, Síndrome da metáfise manchada, displasia espondilo- epimetafiseal, tipo Strudwick, Demência do tipo de Alzheimer (DAT), Hipercalciúria genética, doença de Dent, distrofia muscular (por exem- plo dos tipos Duchenne e Becker), Surdez com bócio, Síndrome de Pendred, Síndrome de surdez-retinite pigmentosa, Síndrome de Us- her, Doença de deficiência, Fenilalanina Hidroxilase, Doenças degene- rativas do nervo, síndrome de Grouchy 1, Síndrome De Grouchy, Sín- drome de Dejerine-Sottas, Porfiria com deficiência de delta- aminolevulinato desidratase, Demência, síndrome de CADASIL, leu- codistrofia desmielinogênica, doença de Alexander, Tipo Dermatospa- rático de síndrome de Ehlers-Danlos, Dermatosparaxis, incapacidades desenvolvimentais herdadas, neuropatia motora distal hereditária
(AHMN), neuropatia motora distal hereditária (por exemplo, DHMN-V), deficiência de DHTR, síndrome de insensibilidade a andrógenos, Es- clerose do Corpo Globoide Difusa, doença de Krabbe, síndrome de Di George, Deficiência de receptor de di-hidrotestosterona, síndrome da insensibilidade a andrógenos, neuropatia motora distal hereditária, Dis- trofia miotônica (tipo 1 ou tipo 2), atrofia muscular espinhal distal (qualquer tipo, incluindo, por exemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 4, tipo 5, tipo 6), distrofia muscular de Duchenne/Becker, Nanismo (qualquer tipo, por exemplo, acondroplástica, acondroplasia, displasia tanatofóri- ca), Síndrome do nanismo-atrofia retinal-surdez, Síndrome de Cockayne, leucodistrofia dismielinogênica, doença de Alexander, Dis- trofia miotônica, síndrome de distrofia da retina pigmentosa-disostose, síndrome de Usher, doença de Alzheimer familiar de Início Precoce (EOFAD), doença de Alzheimer (incluindo, por exemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3 ou tipo 4), doença de Ekman-Lobstein, osteogênese imperfecta, Neuropatia por aprisionamento, neuropatia hereditária com tendência a paralisias por compressão, protoporfiria eritropoiética (EPP), Anemia eritoblástica, beta-talassemia, Protoporfiria eritroepática, Deficiência de eritroide 5-aminolevulinato sintetase, anemia sideroblástica ligada ao X, Câncer do olho, retinoblastoma FA — Ataxia de Friedreich, ataxia de Freidreich, FA, anemia de fanconi, Lesões e distúrbios faciais, Trom- bofilia de fator V de Leiden, FALS, esclerose lateral amiotrófica, neu- roma acústico familiar, polipose adenomatosa familiar, doença de Al- zheimer familiar (FAD), esclerose lateral amiotrófica familiar, esclerose lateral amiotrófica, disautonomia familiar, hipertrigliceridemia induzida por gordura familiar, deficiência de lipoproteína lipase, familiar, hemo- cromatose familiar, hemocromatose, deficiência de LPL familiar, defici- ência de lipoproteína lipase, familiar, câncer de cólon não poliposo fa- miliar, câncer colorretal não poliposo hereditário, poliserosite peroxis- mal familiar, PCT familiar, porfiria cutânea tardia, neuropatia sensível à compressão familiar, neuropatia hereditária com tendência à paralisias por compressão, hipertensão pulmonar primária familiar (FPPH), leu- ceoencefalopatia vascular familiar, síndrome CADASIL, FAP, polipose adenomatosa familiar, FD, disautonomia familiar, Deficiência de ferro- quelatase, doença de ferroportina, Hemocromatose (qualquer tipo, por exemplo, tipo 1, tipo 2A, tipo 2B, tipo 3, tipo 4, hemocromatose neona- tal, acaeruloplasminemia, atransferrinemia congênita, síndrome Graci- le, Síndrome da febre periódica, Febre mediterrânea familiar (FMF), síndrome FG, sinostose coronal associada a FGFR3, Degeneração fibrinoide de astrócitos, doença de Alexander, Doença fibrocística do pâncreas, Doença de Folling, síndrome do fra(X), síndrome do X frágil, Fragilitas ossium, osteogênese imperfeita, síndrome FRAXA, ataxia de Freidreich (FRDA), deficiência de G6PD, doença de deficiência de ga- lactocinase, galactosemia, doença de deficiência de galactose-1- fosfato uridil-transferase, galactosemia, doença de deficiência de ga- lactosilceramidase, doença de Krabbe, Lipidose de galactosilceramida, doença de Krabbe, deficiência de galactosilcerebrosidase, lipidose de galactosilesfingosina, deficiência de GACL, deficiência de GALT, ga- lactosemia, doença do tipo Gaucher, doença pseudo-Gaucher, defici- ência de GBA, Distúrbios cerebrais genéticos, enfisema genético, he- mocromatose genética, hemocromatose, Hepatite de célula gigante, neonatal, Hemocromatose neonatal, deficiência de GLA, Glioblastoma, retina, retinoblastoma, Glioma, retinal, retinoblastoma, leucodistrofia de célula globoide (GCL, GLD), doença de Krabbe, leucoencefalopatia de célula globoide, Deficiência de glucocerebrosidase, Glucocerebrosido- se, Lipidose por glicosila cerebrosídeo, Deficiência de glucosilcerami- dase, Deficiência de glucosilceramida beta-glicosidase, Lipidose por glucosilceramida, Acidúria glicérica, hiperoxaluria, primária, Encefalo- patia por glicina, Hiperglicinemia não cetótica, Acidúria glicólica, hipe- roxaluria, primária, gangliosidose GM2, doença de Tay-Sachs, síndro-
me de bócio-surdez, síndrome de Pendred, síndrome de Graefe- Usher, síndrome de Usher, síndrome de Gronblad-Strandberg, pseu- doxantoma elástico, Hemocromatose, hemocromatosse, síndrome de Hallgren, síndrome de Usher, iquitiose do tipo Harlequin, doença de Hb S, hipocondroplasia(HCH), coproporfiria hereditária (HCP), Malfor- mações de cabeça e cérebro, Distúrbios auditivos e surdez, Problemas auditivos em crianças, HEF2A, HEFB2, Hematoporfiria, porfiria, Defici- ência de heme sintetase, Hemocromatoses, doença de hemoglobina M, metemoglobinemia do tipo beta-globina, doença de hemoglobina S, hemofilia, porfiria hepatoeritropoiética (HEP), deficiência de AGT he- mática, hiperoxaluria, primária, Síndrome de degeneração hepatolenti- cular, Doença de Wilson, Artro-oftalmopatia hereditária, Síndrome de Stickler, Lipidose distópica hereditária, Hemocromatose hereditária (HHC), hemocromatose, Telangiectasia hemorrágica hereditária (HHT), Miopatia de Corpo de Inclusão Hereditária, regeneração de músculo esqueletal, Anemia de carga de ferro hereditária, anemia si- deroblástica ligada ao X, Neuropatia motora e sensorial hereditária, Neuropatia motora hereditária, tipo V, neuropatia motora hereditária distal, Exostoses múltiplas hereditárias, Câncer colorretal não poliposo hereditário, Síndrome de febre periódica hereditária, Colo Poliposo He- reditário, polipose adenomatosa familiar, Enfisema pulmonar hereditá- rio, Resistência hereditária à proteína C ativada, trombofilia de fator V de Leiden, Neuropatia sensorial e autonômica hereditária tipo Ill, di- sautonomia familiar, Paraplegia espástica hereditária, paralisia espás- tica hereditária ascendente de início na infância, Ataxia espinhal here- ditária, ataxia de Friedreich, Esclerose espinhal hereditária, ataxia de Friedreich, anemia de Herrick, OSMDE heterozigoto, síndrome de Weissenbacher-Zweymúller, Displasia otospondilomegaepifiseal hete- rozigota, síndrome de Weissenbacher-Zweymúller, deficiência de He- xA, doença de Tay-Sachs, Deficiência de hexosaminidase A, doença de Tay-Sachs, Deficiência de alfa-subunidade de Hexosaminidase (qualquer variante, por exemplo, variante A, variante B), doença de Tay-Sachs, hemocromatose associada a HFE, hemocromatose, HGPS, Progeria, doença de Hippel-Lindau, doença de von Hippel- Lindau, hemocromatose (HLAH), neuropatia motora hereditária distal (HMN V), câncer colorretal não poliposo hereditário (HNPCC), neuro- patia hereditária com tendência a paralisias por compressão (HNPP), homocistinúria, Deficiência de ácido homogentísico oxidase, alcapto- nuria, Acidura homogentísica, alcaptonuria, Porfiria cutânea tardia ho- mozigota, porfiria hepatoeritropoiética, hiperoxaluria, primária (HP1), hiperoxaluria (HP2), hiperfenilalaninemia (HPA), HPRT — Deficiência de Hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase, síndrome de Lesch- Nyhan, HSAN tipo Ill, disautonomia familiar, disautonomia familiar (HSAN3), Neuropatia Sensorial Hereditária (qualquer tipo, por exem- plo, HSN-1, HSN-Il, HSN-III), disautonomia familiar, Dermatosparaxis humana, doença de Huntington, síndrome de progeria de Hutchinson- Gilford, progeria, Hiperandrogenismo, tipo não clássico devido à defi- ciência de 21-hidroxilase, Hiperquilomicronemia, deficiência de lipopro- teína lipase familiar, familiar, Hiperglicinemia com cetoacidose e leu- copenia, acidemia propiônica, Hiperlipoproteinemia tipo |, deficiência de lipoproteína lipase, hiperoxaluria familiar, hiperfenilalaninemia pri- mária, hiperfenilalaninemia, hiperfenilalaninemia, Hipocondrodisplasia, hipocondroplasia, Hipochondrogênese, Hipocondroplasia, Anemia hi- pocrômica, anemia sideroblástica ligada ao X, Deficiência de hipoxan- tina fosforribosilitransferase (HPRT), síndrome de Lesch-Nyhan, para- lisia espástica hereditária ascendente de início na infância (IAHSP), síndrome de ICF, Imunodeficiência, síndrome de instabilidade do cen- trômero e anomalias faciais, Hemocromatose idiopática, hemocroma- tose, tipo 3, Hemocromatose idiopática neonatal, hemocromatose, ne- onatal, Hipertensão pulmonar idiopática, Distúrbios do sistema imune,
imunodeficiência combinada severa ligada ao X, Incontinência pigmen- tar, Doença de Gaucher cerebral infantil, Doença de Gaucher infantil, paralisia espástica hereditária ascendente de início na infância, Inferti- lidade, enfisema herdado, tendência herdada a paralisias por com- pressão, neuropatia hereditária com tendência a paralisias por com- pressão, síndrome de Insley-Astley, displasia otospondilomegaenpifi- seal, Síndrome de porfiria aguda intermitente, porfiria aguda intermi- tente, Síndrome de polipose intestinal-pigmentação cutânea, síndrome de Peutz-Jeghers, incontinência pigmentar (IP), Distúrbio de armaze- namento de ferro, hemocromatose, 15 Isodicêntrico, 15 isodicêntrico, Surdez isolada, surdez não sindrômica, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Joubert, Esclerose Lateral Primária Juvenil (JPLS), escle- rose lateral amiotrófica juvenil, Gota juvenil, coreoatetose, síndrome de retardo mental, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de hiperuricemia juvenil, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Jackson-Weiss (JWS), atrofia muscular espinhal e bulbar, doença de Kennedy, atrofia muscu- lar espinhal e bulbar, atrofia muscular espinhal e bulbar de Kennedy, atrofia muscular espinhal e bulbar, Histiciose de Kerasin, Lipoidose de Kerasin, tesaurismose de Keratin, glicinemia cetótica, acidemia pro- piônica, hiperglicinemia cetótica, acidemia propiônica, Doenças renais, hiperoxaluria, primária, displasia de Kniest, doença de Krabbe, doença de Kugelberg-Welander, atrofia muscular espinhal, Demência lacunar, síndrome de CADASIL, Acondrogênese de Langer-Saldino, Displasia de Langer-Saldino, Doença de Alzheimer de início tardio, doença de Krabbe de início tardio (LOKD), doença de Krabbe, Distúrbios de Aprendizagem, Incapacidade de aprendizagem, Lentiginose, perioral, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Lesch-Nyhan, Leucodistrofi- as, leucodistrofia com fibras de Rosenthal, doença de Alexander, Leu- codistrofia, espongiforme, síndrome de Li-Fraumeni (LFS), síndrome de Li-Fraumeni, Deficiência de lipase D, deficiência de lipoproteína li-
pase, deficiência de LIPD familiar, deficiência de lipoproteína lipase, Lipidose familiar, cerebrosídeo, Lipidose, gangliosídeo, infantil, doença de Tay-Sachs, Histiocitose lipoide (tipo kerasin), deficiência de lipopro- teína lipase, doenças Hepáticas familiares, galactosemia, doença de Lou Gehrig, síndrome de Louis-Bar, ataxia telangiectasia, síndrome de Lynch, câncer colorretal não poliposo hereditário, deficiência de Lysyl- hidroxilase, doença de Machado-Joseph, Ataxia espinocerebelar (qualquer tipo, por exemplo, SCA1, SCA2, SCA3, SCA 18, SCA20, SCA21, SCA23, SCAZ6, SCA28, SCA29), Câncer de mama masculi- no, câncer de mama, Distúrbios genitais masculinos, Neoplasma ma- ligno de mama, câncer de mama, tumor maligno de mama, câncer de mama, Tumor maligno da bexiga urinária, câncer de mama, Câncer mamário, câncer de mama, síndrome de Marfan, síndrome do X mar- cador, síndrome do X frágil, síndrome de Martin-Bell, síndrome do X frágil, síndrome de McCune-Albright, síndrome de McLeod, síndrome de MEDNIK, Anemia Mediterrânea, beta-talassemia, Nanismo mega- epifiseal, displasia otoespondilomegaepifiseal, síndrome de Menkea, doença de Menkes, doença de Menkes, Retardo mental com anorma- lidades osteocartilaginosas, síndrome de Coffin-Lowry, Distúrbios me- tabólicos, Nanismo metatrópico, tipo Il, Displasia de Kniest, Displasia metatrópica tipo Il, Displasia de Kniest, Metemoglobinemia (qualquer tipo, por exemplo, congênita, tipo beta-globina, metemoglobinemia congênita tipo II), acidemia metilmalônica, síndrome de Marfan (MFS), MHAM, síndrome de Cowden, Microssíndrome, Microcefalia, MMA, acidemia meilmalônica, doença de Menkes (também conhecida como MK ou MNK), Síndrome de monossomia 1p36, doença do neurônio motor, esclerose lateral amiotrófica, esclerose lateral amiotrófica, Dis- túrbios do movimento, síndrome de Mowat-Wilson, Mucopolissacarido- se (MPS 1), Mucoviscidose, Demência multi-infarto, síndrome de CA- DASIL, Deficiência múltipla de carboxilase, de início tardio, deficiência de biotinidase, Síndrome múltipla de hamartoma, síndrome de Cowden, Neurofibromatose múltipla, Distrofia muscular (qualquer tipo, incluindo, por exemplo, tipo Duchenne e Becker), Miotonia atrófica, distrofia miotônica, Miotonia distrófica, síndrome de Nance-lnsley, dis- plasia otoespondilomegaenpifiseal, condrodisplasia de Nance-Sweeney, displasia otospondilomegaepifiseal, NBIA1I, neurodegeneração associ- ada a pantotenato cinase, síndrome de Neill-Dingwall, síndrome de Cockayne, Neuroblastoma, retinal, retinoblastoma, Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1, neurodegeneração associada à pantotenato cinase, Doenças neurológicas, Distúrbios neuromuscula- res, neuronopatia motora hereditária distal, Niemann-Pick, doença de Niemann-Pick, síndrome de Noack, Hiperglicemia não cetótica, Ence- falopatia por glicina, Doença de Gaucher não neuronopática, Hiperfeni- lalaninemia não fenilcetonúrica, deficiência de tetra-hidrobiopterina, surdez não sindrômica, síndrome de Noonan, doença de Gaucher Nor- rbottnian, Ocronose, alcaptonuria, Artrite ocronótica, alcaptonuria, Sín- drome de Ogden, osteogênese imperfecta (Ol), doença de Osler- Weber-Rendu, Telangiectasia hemorrágica hereditária, OSMED, dis- plasia otospondilomegaenpifiseal, osteogênese imperfecta, Osteopsati- rose, osteogênese imperfecta, Osteoesclerose congênita, displasia Otoespondilo-megaepifiseal, displasia otoespondilomegaenpifiseal, dis- plasia otoespondilomegaepifiseal, Oxalose, hiperoxaluria, primária, Oxaluria, primária, hiperoxaluria, primária, neurodegeneração associa- da à pantotenato cinase, Síndrome de Patau (Trissomia 13), deficiên- cia de PBGD, porfiria intermitente aguda, deficiência de PCC, acidemia propiônica, porfiria cutânea tardia (PCT), doença de PDM, síndrome de Pendred, Doença periódica, Febre mediterrânea, Peritonite periódi- ca familiar, Síndrome lentiginose perioficial, síndrome de Peutz- Jeghers, Distúrbios do nervo periférico, disautonomia familiar, Neurofi- bromatose periférica, Atrofia muscular peroneal, deficiência de alanina peroxissomal:glioxato aminotransferase, hiperoxaluria, síndrome de Peutz-Jeghers primária, Doença de deficiência de fenilalanina hidroxi- lase, Feocromocitoma, doença de von Hippel-Lindau, síndrome de Pi- erre Robin com condrodisplasia fetal, síndrome de Weissenbacher- Zweymúller, Cirrose pigmentar, hemocromatose, síndrome de Peutz- Jeghers (PJS), neurodegeneração associada à pantotenato cinase (PKAN), PKU, fenilcetonúria, Plumboporfiria, porfiria por deficiência de ALA, PMA, Doença do rim policístico, displasia fibrosa poliostótica, síndrome de McCune-Albright, polipose adenomatosa familiar, polipo- se intestinal hamartomatosa, síndrome de pólipos-e-manchas, síndro- me de Peutz-Jeghers, Deficiência de porfobilinogênio sintase, porfiria por deficiência de ALA, distúrbio de porfiria, deficiência de PPOX, por- firia variegada, síndrome de Prader-Labhart-Willi, síndrome de Prader- Willi, demência pré-senil e senil, Discinesia ciliar primária (PCD), he- mocromatose primária, hemocromatose, síndrome de hiperuricemia primária, síndrome de Lesch-Nyhan, demência degenerativa senil pri- mária, EDS VII tipo procolágeno, mutante, progéria, síndrome de Hut- chinson Gilford Progeria, Síndrome do tipo progéria, síndrome de Cockayne, nanismo progeroide, síndrome de Cockayne, coreia pro- gressiva, hereditária crônica (Huntington), doença de Huntington, os- teogênese imperfeita progressivamente deformante com esclera anormal, Osteogênese imperfeita (qualquer tipo, por exemplo, Tipo |, Tipo Il, Tipo Ill, Tipo IV, Tipo V, Tipo VI, Tipo VII, Tipo VIII), distrofia miotônica proximal (PROMM), acidemia propiônica, deficiência de pro- pionila-CoA carboxilase, deficiência de proteína C, deficiência de pro- teina S, protoporfiria, deficiência de protoporfirinogênio oxidase, porfi- ria variegada, distrofia miotônica proximal, Distrofia miotônica tipo 2, miopatia miotônica proximal, doença pseudo-Gaucher, pseudoxanto- ma elástico, lipidose da psicose, doença de Krabbe, hipertensão arte- rial pulmonar, hipertensão pulmonar, pseudoxantoma elástico (PXE),
pseudoxantoma elástico, retinoblastoma (Rb), doença de Recklin- ghausen, Polisserotose recorrente, Distúrbios retinais, Síndrome de Retinite pigmentosa-surdez, síndrome de Usher, Retinoblastoma, sín- drome de Rett, RFALS tipo 3, síndrome de Ricker, síndrome de Riley- Day, disautonomia familiar, síndrome de Roussy-Levy, síndrome de Rubinstein-Taybi (RSTS), síndrome de Rett (RTS), síndrome de Ru- binstein-Taybi, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Sack- Barabas, doença de SADDAN, síndrome de sarcoma familiar de Li e Fraumeni, síndrome de Li-Fraumeni, síndrome de SBLA (síndrome de sarcoma, mama, leucemia e glândula adrenal), síndrome de Li- Fraumeni, atrofia muscular espinhal e bulbar (SBMA), Schwannoma, acústica, bilateral, neurofibromatose tipo Il, síndrome Schwartz- Jampel, imunodeficiência combinada severa ligada ao X (SCIDX1), SED congênita, displasia espondiloepifiseal congênita, SED Strudwick, displasia espondiloepimetafiseal, tipo Strudwick, displasia espondiloe- pifiseal congênita (SEDc), displasia epondiloepimetafiseal (SEMD), SEMD tipo Strudwick, demência senil, acrondroplasia severa com re- tardo desenvolvimental e acantose nigricante, doença de SADDAN, síndrome de Shprintzen, síndrome do retardo mental ligado ao X Side- rius causada por mutações no gene PHF8, síndrome do esqueleto- pele-cérebro, Distúrbios de pigmentação da pele, atrofia espinhal mus- cular (SMA), Displasia espôndilo-meta-epifiseal (SMED) (qualquer tipo, por exemplo, tipo Studwick, tipo 1), síndrome Smith-Lemli-Optiz, Sín- drome de Smith Magenis, porfiria genética da sul-africana, paralisia espástica ascendente de início na infância, paralisia espástica heredi- tária ascendente de início da infância, Distúrbios de fala e comunica- ção, esfingolipidose, Tay-Sachs, doença de Tay-Sachs, atrofia muscu- lar espinhal e bulbar, atrofia muscular espinhal, atrofia muscular espi- nhal, tipo V distal, neuropatia motora hereditária distal, atrofia muscular espinhal distal com predominância do membro superior, neuropatia motora hereditária distal, ataxia espinocerebelar, displasia espondiloe- pifiseal congênita, displasia espondiloepifiseal, colagenopatia (qual- quer tipo, por exemplo, tipos Il e XI), displasia espondiloepimetafiseal, displasia espondilometafiseal (SMD), displasia espondilometafiseal, degeneração esponjosa do sistema nervoso central, degeneração es- ponjosa do cérebro, degeneração esponjosa de matéria branca na in- fância, hipertensão pulmonar primária esporádica, síndrome de SSB, síndrome do cabeço de aço, doença de Mankes, doença de Steinert, distrofia miotônica, síndrome da distrofia miotônica de Steinert, distro- fia miotônica, síndrome de Stickler, acidente vascular cerebral, sín- drome de CADASIL, síndrome de Strudwick, doença de Gaucher neu- ropática subaguda, porfiria genética Sueca, porfiria intermitente aguda, porfiria intermitente aguda, displasia da cartilagem do queijo Suíço, displasia de Kniest, doença de Tay-Sachs, TD — nanismo tanatofórico, displasia tanatofórica, TD com fêmures retos e crânio em formato de folha de trevo, displasia tanatofórica Tipo 2, Telangiectasia, cerebelo- oculocutâneo, ataxia telangiectasia, Síndrome da feminização testicu- lar, síndrome da insensibilidade a andrógenos, deficiência de tetra- hidrobiopterina, síndrome da feminização testicular (TFM), síndrome da insensibilidade a andrógenos, talassemia intermediária, beta- talassemia, Talassemia Maior, beta-talassemia, displasia tanatofórica, Trombofilia devido à deficiência de cofator para proteína C ativada, tipo Leiden, trombofilia de fator V de Leiden, Doença da tireoide, Neu- ropatia tomaculous, neuropatia hereditária com tendência à paralisias por compressão, deficiência de HPRT total, síndrome de Lesch-Nyhan, Deficiência de hipoxantina-guanina fosforribostil transferase total, sín- drome de Lesch-Nyhan, Síndrome de Trcadaer Collins, Trias fragilitis ossium, síndrome do triplo X, Síndrome do triplo X, Trissomia 21Trissomia X, síndrome de Troisier-Hanot-Chauffard, hemocromato- se, doença de Tay-Sachs (TSD), Complexo de Esclerose Tuberosa
(TSC), Esclerose tuberosa, Síndrome do tipo Turner, Síndrome de No- onan, doença de deficiência de UDP-galactose-4-epimerase, galactos- semia, doença de deficiência de UDP glicose 4-epimerase, galactos- semia, deficiência de UDP glicose hexose-1-fosfato uridililtransferase, galactossemia, galactossemia, Surdez não diferenciada, surdez não sindrômica, deficiência de UPS, porfiria intermitente aguda, Câncer da bexiga urinária, câncer da bexiga, deficiência de UROD, Deficiência de uroporfirinogênio descarboxilase, Deficiência de uroporfirinogênio sin- tase, porfiria intermitente aguda, Síndrome de Usher, deficiência de UTP hexose-1-fosfato uridililtransferase, galactossemia, síndrome de Van Bogaert-Bertrand, síndrome de Van der Hoeve, síndrome Velo- cardiofacial, síndrome de VHL, doença de von Hippel-Lindau, Prejuízo da visão e cegueira, síndrome de Alstróm, doença de Von Bogaert- Bertrand, doença de von Hippel-Lindau, doença de Von Recklenhau- sen-Applebaum, hemocromatoase, doença de von Recklinghausen, neurofibromatose tipo |, doença de Vrolik, osteogênese imperfecta, síndrome de Waardenburg, Síndrome de Warburg Sjo Fledelius, Mi- crossíndrome, doença de Wilson (WD), síndrome de Weissenbacher- Zweymúller, doença de Werdnig-Hoffmann, atrofia muscular espinhal, Síndrome de Williams, doença de Wilson, doença de Wilson, doença de Wilson, síndrome de Wolf-Hirschhorn, doença Periódica de Wolff, síndrome de Weissenbacher-Zweymúller (WZS), Xeroderma pigmen- toso, retardo mental ligado ao X e macroorquidismo, síndrome do X frágil, hiperuricemia primária ligada ao X, síndrome de Lesch-Nyhan, imunodeficiência combinada severa ligada ao X, anemia sideroblástica ligada ao X, atrofia muscular espinhal-bulbar ligada ao X, atrofia mus- cular espinhal e bulbar, defeito da enzima acidúria úrica ligada ao X, síndrome de Lesch-Nyhan, X-SCID, imunodeficiência combinada seve- ra ligada ao X, anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA), X-SCID, imunodeficiência combinada severa ligada ao X, anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA), XSCID, imunodeficiência combinada severa ligada ao X, síndrome XXX, síndrome do triplo X, síndrome XXXX, síndrome XXXXKXK, XXXXXK, síndrome XXY, trissomia XXY, síndrome de Klinefel- ter, síndrome de XYY, distúrbios da repetição do trigêmeo ou quais- quer combinações dos mesmos.
[00345] Em modalidades, um modulador de controle pós- transcripcional específico é direcionado para modulação, modificação, aumento ou diminuição em atividade através da administração de um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica. Por exemplo, moduladores de controle pós-transcripcional podem incluir PARN, PAN, CPSF, CstF, PAP, PABP, PAB2, CFI, CFII, RNA trifosfatase, RNA gluaniltransferase, RNA metiltransferase, SAM sintase, enzima de conjugação de ubiquitina E2R, proteínas SR SFRS1 a SFR11, pro- teínas hnRNP (por exemplo, HNRNPAO, HNRNPA1, HNRNPA1L1, HNRNPA1L2, HNRNPA2, HNRNPA2B1, HNRNPAB, HNRNPB1, HNRNPC, HNRNPCL1, HNRNPD, HNRPDL, HNRNPF, HNRNHP1, HNRNPH2, HNRNPH3, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPLL, HNRNPM, HNRNPR, HNRNPU, HNRNPUL1, HNRNPUL2, HNRNPUL3, ADAR, Mex 67, Mtr2, Nab2, helicase de Dead-box, elF4A, elF4B, elF4E, elF4G, GEF, GCN2, PKR, HRI, PERK, eEF1, eEF2, GCN, eRF3, pro- teínas de ligação específica ARE, EXRN1, DCP1, DCP2, RCK/p54, CPEB, elF4E, microRNAS e siRNAs, DICER, proteínas Ago, proteínas de degradação de mMRNA mediada por mutação sem sentido, UPF3A, UPF3BelF4A3, MLN51, YI4/MAGOH, MG-1, SMG-5, SMG-6, SMG-7 ou quaisquer combinações dos mesmos.
[00346] Em algumas modalidades, vias genéticas associadas com o ciclo celular são moduladas, aumentadas ou diminuídas em atividade através da administração de um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica. Vias e genes exemplares associados com o ciclo celular incluem ATM, PMS2, FAS-L, MRE11, MLH1, FasR, NBS1,
MSH6, Trail-L, RAD50, MSH2, Trail-R, 538BP1, RFC, TNF-Ct, P53, PCNA, TNF-R1, CHKE, MSH3, FADD, E2F1, MutS, homólogo, TRADD, PML, MutLl, homólogo, R1P1, FANCD2, Exonuclease, MyD88, SMC1, DNA, Polimerase, delta, IRAK, BLM1, (POLDI, POLD?2, POLD3, NIL, BRCA1 e POLDA, -genes, IKK, H2AX, codificação, subu- nidades), NFKB, ATR, Topoisomerase, 1, IkBa, RPA, Topoisomerase, 2, IAP, ATRIP, RNAseHl, Caspase, 3, RAD9, Ligase, 1, Caspase, 6, RAD1, DNA, polimerase, 1, Caspase, 7, HUS, DNA, polimerase, 3, Caspase, 8, RAD17, Primase, Caspase, 10, RFC, Helicase, HDAC1, CHK1, Filamento único, ligação HDAC2, TLK1, proteínas, Citocromo, C, CDC25, Bxl-xL, STAT3, STAT5, DFF45, Vcl-2, ENDO-G, PI3K, AKkt, Calpaína, Bad, Bax, Proteólise mediada por ubiquitina, Hipoxia, Proli- feração Celular, HIF-loc, MAPK, El, HERC1, TRAF6, HIF-IB, MAPKK, E2, UBE2Q, MEKK1, Refl, MAPKKK, E3, UBE2R, COP!, HSP90, c- Met, UBLE1A, UBE2S, PIFH2, VEGF, HGF, UBLE1B, UBE2U, clAP, PAS, ER, S1/2, UBLEIC, UBE2W, PIAS, ARNT, ATK, UBE2ZA, UBE27, SYVN, VHL, PKCs, UBE2B, AFC, LLC, N, NHLRC1, HLF, Paxilina, UBEZ2C, UBE1, AIRE, EPF, FAK, UBE2Z2A, E6AP, MGRN1, VDU2, Adu- cina, UBE2E, UBE3SB, BRCA1, SUMORESUME, PIK1, UBE2F, Smurf, FANCL, SENP1, RB, UBE2G1, ltch, MIDI, Calcineurina, A, RB, UBE2G2, HERC2, Cdc20, RACK1, Raf-1, UBE2|, HERC3, Cdhl, PTB, A-Raf, UBE2J1, HERCA4, Apcl, Hur, B-raf, UBE2J2, UBE4A, Apc2, PHD2, MEK1/2, UBE2L3, UBE4B, Apc3, SSAT2, ERK1/2, UBE2L6, CHIP, Apc4, SSAT1, Ets, UBE2M, CYCA4, Apc5, GSK3, EIlkl, UBE2N, PPR19, Apc6, CBP, SAP1, UBE20, UIP5, Apc7, FOXO4, cPLA?, WWPI, Mdm2, Apc8, FIH-1, WWP?2, Parkin, Apc9, TRIP, 12, Trim32, Ape, 10, NEEDA, Trim37, Ape, 11, ARF-BP1, SIAH-1, Ape, 12, EDD1, PML, Célula, sobrevivência, Célula, ciclo, parada, SMADI, P21, SMADS5, BAX, SAMD8, MDR, LEF1, DRAIL, IGFBP3, TCF3, GADD45, TCF4, P300, HAT1, PI3, Akt, GF1 ou quaisquer combinações dos mesmos.
[00347] Em algumas modalidades, genes associados com angiogê- nese são modulados, aumentados ou diminuídos em atividade através da administração de um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica a uma célula(s). Genes e vias genéticas exemplares associ- ados com angiogênese e condições relacionadas à angiogênese in- cluem VEGF, VEGFR2, SHC, E2F7, VEGFB, VEGFR3, PI3, VEGFC, Nrp |, PIP3, EGFDIP3, DAG, GRB2, SOS, Akt, PB, PKC, Ras, RAF1, DAG, eNOS, NO, ERK1, ER2, cPLA2, ME1, MEK2 ou qualquer com- binação dos mesmos.
[00348] Em algumas modalidades, vias genéticas e/ou genes asso- ciados com função mitocondrial são modulados, aumentados ou dimi- nuídos em atividade através da administração de um inibidor de DNA- PK e um sistema de edição genômica a uma célula(s). Genes e vias genéticas exemplares associados com função mitocondrial incluem Malato desidrogenase Aminotrasnferase, Hidratase, Desacilase, Desi- drogenase, Carboxilase, Mutase, distúrbios de Isoleucina com Oxida- ção de Leucina e oxidação de Ácido graxo (deficiências da Via de oxi- dação da enzima) Aminotransferase Aminotransferase, Cadeia ramifi- cada OCTN2 Cadeia ramificada, FATP1 -6 aminotransferase 2, amino- transferase 2, CPT-1 mitocondrial mitocondrial, CACT Isobutil-CoA 2- metilbutil-CoA, CPT-Il desidrogenase Desidrogenase, SCAD (Cadeia Ramificada (Cadeia Ramificada, MCAD Ceto Ácido Ceto Ácido, VLCAD Desidrogenase Desidrogenase, Complexo de ETF-DH) Com- plexo), AIfa-ETF Hidratase Hidratase, Beta-ETF HMG-CoA liase 2- metil-3-O0H- SCHAD butiri-CoA, LCHAD desidrogenase, MTP 3- Oxotiolase, LKAT, DECR 1, HMGCS2, HMGCL ou quaisquer combina- ções dos mesmos.
[00349] Em algumas modalidades, vias genéticas e/ou genes asso- ciados com dano a DNA ou instabilidade genômica são modulados,
aumentados ou diminuídos em atividade. Genes e vias genéticas exemplares associados com vias e/ou genes relacionados a Dano a DNA e instabilidade genômica incluem 53BP1, BLM, MBD?2, DNA, li- gase, 4, MDC1, H2AX, XLF, SMC1, 53BP1, Rad50, P53, P53, Artemis, Rad27, TdT, APE1, PMS2, APE2, UvrA, RecA, MLH1, NEIL1, UvrB, SSB, MSH6, NEIL2, UvrC, Mrell, MSH2, NEIL3, XPC, Rad50, RFC, XRCC1, Rad23B, Nbsl, PONA, PNKP, CEN2, CtlP, MSH3, Tdpl, DDB1, RPA, MutS, APTX, XPE, Rad51, MutL, DNA, polimerase B CSA, Rad52, DNA polimerase ô, CSB, Rad54, Topoisomerase, 1, DNA, TFT1IH, BRCA1, Topoisomerase, 2, PCNA, XPB, BRCA?2, RNAseHl, FEN1, XPD, Exol, Ligase 1, RFC, XPA, BLM, DNA, polime- rase, 1, PAR, 1, RPA, Toplilla, DNA, Ligl, XPG, GEN1, Primase, Lig3, ERCC1 Yenl Helicase, UNG, XPF, SIxl, SSBs, MUTY DNA polimerase õ, SIx4, SMUG DNA polimerase e, Mus8, MBD4, Emel, Dssl, ASH1L, SETD4, DQT1IL, SETD5, EHMT1, SETD6, EHMT2, SETD7, EZH1, SETD8, EZzH2, SETD9, MLL, SETDB1, MLL2, SETDB2, MLL3, SET- MAR, MLL4, SMYD, 1, MLL5, SMYD2, NSD, 1, SMYD3, PRDM?2, SMYDA4, SET, SMYD5, SETBP1, SUV39H1, SETD 1A, SUV39H2, SETD 1B, SUV420H1, SETD2, SUV420 H2, SETD3 ou qualquer com- binações dos mesmos.
[00350] Em algumas modalidades, genes codificando fatores de transcrição de mamífero são modulados, aumentados, diminuídos ou providas a uma célula. Fatores de transcrição humanos exemplares incluem AFF4, AFF3, AFF2, AFF1, AR, TFAP2B, TFAP2D, TFAP2C, TFAP2E, TFAP2A, JARID2, KDM5D, ARID4A, ARID4B, KDMS5A, ARID3A, KDM5B, KDM5C, ARID5B, ARID3B, ARID2, ARIDS5A, ARID3C, ARID1A, ARID1B, HIF1A, NPAS1, NPAS3, NPASA4, MLXIPL, ARNTL2, MXD1, AHRR, TFE3, HES2, MNT, TCF3, SREBF1, TFAPA, TCFL5, LYL1, USF2, TFEC, AHR, MLX, MYF6, MYF5, SIM1, TFEB, HAND1, HES1, ID2, MYCL1, ID3, TCF21, MXI1, SOHLH2, MYOG,
TWIST1, NEUROG3, BHLHE41, NEUROD4, MXD4, BHLHE?23, TCF15, MAX, ID1, MYOD1, ARNTL, BHLHE40, MYCN, CLOCK, HEY2, MYC, ASCL1, TCF12, ARNT, HES6, FERD3L, MSGN1, USF1, TAL1, NEUROD1, TCF23, HEILA, HAND2, NEUROD6, HEY1, SOHLH1, MESP1, PTF1A, ATOH8, NPAS2, NEUROD?2, NHLH1, IDA, ATOH1, ARNT2, HES3, MLXIP, ASCL3, KIAA2Z2018, OLIG3, NHLH2, NEUROG?2, MSC, HES7, ATOH7, BHLHA15, BHLHE22, NEUROG1, FIGLA, ASCL2, OLIG1, TAL2, MITF, SCXB, HELT, ASCLA4, MESP?2, HES4, SCXA, TCF4, HES5, SREBF2, BHLHA9S, OLIG2, MXD3, TWIST2, LOC388553, C130rf38-SOHLH2, CEBPE, XBP1, BATF3, CREB5, CEBPG, ATF3, ATF7, CEBPB, CEBPD, CEBPA, CBFB, CAMTA2, CAMTA1, EBF4, EBF3, EBF1, EBF2, NR2F6, NR2F1, NR2F2, GRHL2, TFCP2L1, GRHL1, TFCP2, UBP1, GRHL3, YBX2, CSDE1, CSDA, YBX1, LIN28A, CARHSP1, CSDC2, LIN28B, NFIX, NFIC, NFIB, NFIA, CUX2, ONECUT2, CUX1, ONECUT1, SATBJ1, ONECUT3, SATB2, DMRT3, DMRT1, DMRTC2, DMRTA2, DMRTB1, DMRT2, DMRTA1, E2F2, E2F1, E2F3, TFDP2, E2F8, E2F5, E2F7, E2F6, TFDP3, TFDP1, E2F4, NR1H3, NR1H2, ETV1, ETV7, SPI1, ELF4, ETV2, ERF, ELF2, ELK3, ETV3, ELF1, SPDEF, ELK1, ETS1, EHF, ELF5, ETV6, SPIB, FLI, GABPA, ERG, ETS2, ELKA4, ELF3, FEV, SPIC, ETV4, ETV5, FOXN3, FOXC1, FOXJ2, FOXF1, FOXN1, FOXM1, FOXP1, FOXO3, FOXA2, FOXP2, FOXJ1, FOXPA4, FOXF2, FOXNA4, FOXK2, FOXO1, FOXH1, FOXQ1, FOXK1, FOXITI, FOXDA, FOXA3, FOXN2, FOXB1, FOXG1, FOXR1, FOXL1, FOXC2, FOXE1, FOXS1, FOXL2, FOXO4, FOXD4L1, FOXD4LA4, FOXD2, FOXI2, FO- XE3, FOXD3, FOXD4L3, FOXR2, FOXJ3, FOXO6, FOXB2, FOXDALS5, FOXDA4L6, FOXDA4L2, KIAA0415, FOXA1I, FOXP3, GCM2, GCM1, NR3C1, GTF2I/IRD1, GTF2I1, GTF2IRD2B, GTF2/RD2, SOX8, SOX30, PMS1, CIC, TCF7, TOX4, SOX10, HMGXB4, HBP1, TFAM, UBTF, WHSC1, SOX6, HMGXB3, BBX, TOX2, SOX4, SOX21, SOX9, SOX15,
SOX5, SOX3, LEF1, HMG20A, SOX13, TCF7L2, SSRP1, TCF7L1, SOX17, SOX14, PINX1, SOX7, SOX11, SOX12, SOX2, SOX1, SRY, SOX18, UBTFL1, UBTFL2, TOX, HMGB1, HMGB2, PBRM1, TOX3, SMARCE1, HMG20B, HMGB3, HMGA2, HMGA1, ARX, HOXA11, MEOX1, DLX6, ISL1, HOXC8, BARX2, ALX4, GSC2, DLX3, PITX1, HOXA9, HOXA1O, LHX5, LASS4, ZFHX4, SIX4, VSX1, ADNP, RHOXF1, MEIS3, PBX4, DLX5, HOXA1, HOXA2, HOXA3, HOXAS, HOXA6, HOXA13, EVX1, NOBOX, MEOX2, LHX2, LHX6, LHX3, TLX1, PITX3, HOXB6, HNF1B, DLX4, SEBOX, VTN, PHOX2B, NKX3- 2, DBX1, NANOG, IRX4, CDX1, TLX2, DLX2, VAX2, PRRX1, TGIF2, VSX2, NKX2-3, HOXB8, HOXB5, HOXB7, HOXB3, HOXB1, MSX2, LHX4, HOXA7, HOXC13, HOXC11, HOXC12, ESX1, BARHL1, NKX2- 4, NKX2-2, SIX1, HOXD1, HOXD3, HOXD9, HOXD10, HOXD11, HOXD13, MNX1, CDX4, BARX1, RHOXF2, LHX1, GSC, MEIS2, RAX, EMX1, NKX2-8, NKX2-1, HLX, LMX1B, SIX3, LBX1, PDX1, LASSS5, ZFHX3, BARHL2, LHX9, LASS2, MEIS1, DLX1, HMBOX1, ZEB1, VAX1, NKX6-2, VENTX, HHEX, TGIF2LX, LASS3, ALX3, HOXB13, IRX6, ISL2, PKNOX1, LHX8, LMX1A, EN1, MSX1, NKX6-1, HESX1, PITX2, TLX3, EN2, UNCX, GBX1, NKX6-3, ZHX1, HDX, PHOX2A, PKNOX2, CDX2, DRGX, NKX3-1, PBX3, PRRX2, GBX2, SHOX?, GSX1, HOXD4, HOXD12, EMX2, IRX1, IRX2, SIX2, HOXB9, HOPX, OTP, LASS6, HOXC5, HOXB2, RAX2, EVX2, ZHX3, PROP1, ISX, HOXDB8, TGIF2LY, IRX5, SIX5, TGIF1, IRX3, ZHX2, LBX2, NKX2-6, ALX1, GSX2, HOXC9, HOXC10, HOXB4, NKX2-5, SIX6, MIXL1, DBX2, PBX1, SHOX, ARGFX, HMX3, HMX2, BSX, HOXA4, DMBX1, HOXC6, HOXC4, RHOXF2B, PBX2, DUXA, DPRX, LEUTX,, NOTO, HOMEZ, HMX1, DUX4L5, DUX4L2, DUX4L3, DUX4L6, NKX1-1, HNF1A, HSF4, HSFY2, HSFX1, HSFX2, HSFY1, HSF1, LCORL, LCOR, IRF6, IRF1, IRF3, IRF5, IRF4, IRF8, IRF2, IRF7, IRF9, MBD3, BAZ2B, MBD4, SETDB2, MBD1, MECP2, SETDB1, MBD2, BAZ2A,
SMAD7, SMAD5, SMAD9, SMAD6, SMAD4, SMAD3, SMADI, SMAD?, ZZZ3, RCOR1, CDC5L, MYBL2, DNAJC2, TADAZA, RCOR3, MYB, TERF2, DMTF1, DNAJC1, NCOR1, TERF1, MIER3, MYSM!1, SNAPC4, RCOR2, TADA2B, MYBL1, TERF1P2, NCOR2, CCDC79, SMARCC1, SMARCC?2, TTF1, C110rf9, NFYA, NFYC, NFYB, NRF1, NR4A3, NR4A1, NR4A2, ESR1, NROB2, NROB1, PREB, EAF2, SPZ1, TP63, TP73, TP53, PAX6, PAX7, PAX2, PAX4, PAX8, PAX1, PAX3, PAX5, PAX9, SUB1, POU2F2, POU1F1, POU4F3, POU6GF2, POUZF3, POUZ2F1, POU4F2, POU4F1, POUGF1, POU3F2, POU3BF1, POU3FA, POU3F3, POUSF1, POUSFIB, PPARD, PPARG, PPARA, PGR, PROX1, PROX2, NR2E1, NR5A2, NR2C1, NR5A1, NR6A1, ESRRA, NR2C2, RFX3, RFX2, RFX4, RFX1, RFX5, REX7, RFX6, RFX8, NFATC3, NFKB2, NFATC4, NFATC2, NFAT5, RELB, NFKB1, NFATC1, REL, RELA, RORA, RORC, NR1D2, RORB, RUNX3, RUNX1, SP100, SP140, GMEB2, SP110, AIRE, GMEB1, DEAF1, SP140L, LOC729991-MEF2B, MEF2A, SRF, MEF2D, MEF2B, STAT1, STATS5A, STAT4, STAT6, STAT3, STAT2, STATSB, TBX21, TBX5, TBX15, TBX18, TBX2, TBX4, TBX22, TBX3, TBR1, TBX19, TBXG6, EOMES, T, TBX20, TBX10, MGA, TBX1, TEAD3, TEAD2, TEADI, TEAD4, CREBL2, NFE2L3, CREB3L3, FOSL2, NFE2L1, CREM, DBP, CREB3, HLF, BACH2, ATF2, NFE2L2, ATF6, CREB1, ATF1, NFE?, FOSB, ATF4, NRL, JUND, JDP2, CREB3L4, BATF, BACH, CREB3L1, NFIL3, TEF, BATF2, ATF5, FOS, JUNB, DDIT3, FOSL1, JUN, MAF, CREB3L2, MAFA, MAFF, MAFG, MAFK, MAFB, ATFGB, CRX, OTX1, OTX2, THAP3, THAP10, THAP1, PRKRIR, THAPS, THAP9, THAP11, THAP2, THAP6, THAP4, THAPS5, THAP7, NR1HA, NR2E3, RARB, HNF4A, VDR, ESRRB, THRA, NR1D1, RARA, ESR2, NR113, NR112, THRB, NR3C2, HNF4G, RARG, RXRA, ESRRG, RXRB, TSC22D1, TSC22D3, TSC22D4, TSC22D2, TULP3, TULP?2, TULP1, TULPA4, TUB, ZBTB33, ZBTB32, ZBTB11, MYNN, ZBTB25,
PATZ1, ZBTB16, ZBTB24, BCL6, ZBTB47, ZBTB17, ZBTB45, GZF1, ZBTB1, ZBTB46, ZBTB8A, ZBTB7B, BCL6B, ZBTB49, ZBTB43, HIC2, ZBTB26, ZNF131, ZNF295, ZBTBA4, ZBTB34, ZBTB38, HIC1, ZBTBA41, ZBTB7A, ZNF238, ZBTB42, ZBTB2, ZBTB20, ZBTB40, ZBTB7C, ZBTB37, ZBTB3, ZBTB6, ZBTB44, ZFP1IG61I, ZBTB1I2, ZBTB48, ZBTB10, ZBEDA4, ZBED3, ZBED2, C110rf95, ZBED1, IKZF5, ZNF821, ZNF451, ZNF195, ZFX, ZNF263, ZNF200, HIVEP2, WIZ, ZNF582, SNAI2, ZFP64, IKZF2, ZIC2, ZNF800, PRDM1, PRDM6, ZFP112, ZNF275, ZNF76, ZFAT, KLF6, ZFY, ZXDC, GLI2, ZNF532, ZNF37A, ZNF510, ZNF506, ZNF324, ZNF671, ZNF416, ZNF586, ZNF446, ZNF8, ZNF264, REST, MECOM, ZNF213, ZNF343, ZNF302, ZNF268, ZNF10, HIVEP1, ZNF1I84, MZF1, SALLA4, ZNF516, KLF8, KLF5, ZNF629, ZNF423, CTCF, ZNF500, ZNF174, SALL1, MAZ, ZNF419, OVOL3, ZNF175, ZNF14, ZNF574, ZNF85, SP4, ZKSCAN1, GLI3, GLIS3, KLF3, PRDM4, GLI1, PRDM13, ZNF142, PRDM2, ZNF684, ZNF541, KLF7, PLAGL1, ZNF430, KLF12, KLF9, ZNF410, BCL11A, EGR1, ZFP30, TSHZ3, ZNF549, ZSCAN18, ZNF211, ZNF639, ZSCAN20, GTF3A, ZNF205, ZNF644, EGR2, IKZF4, CTCFL, ZNF831, SNAI1, ZNF576, ZNF45, TRERF1, ZNF391, RREB1, ZNF133, OVOL?2, ZNF436, PLAGL2, GLIS2, ZNF384, ZNF484, HIVEP3, BCL11B, KLF2, ZNF780B, FEZF1, KLF16, ZSCAN10, ZNF557, ZNF337, PRDM12, ZNF317, ZNF426, ZNF331, ZNF236, ZNF341, ZNF227, ZNF141, ZNF304, ZSCANSA, ZNF132, ZNF20, EGRA4, ZNF670, VEZF1, KLFA, ZFP37, ZNF1I189, ZNF193, ZNF280D, PRDM5, ZNF740, ZIC5, ZSCAN29, ZNF710, ZNF434, ZNF287, ZIM3, PRDM15, ZFP1A4, ZNF787, ZNF473, ZNF614, PRDM16, ZNF697, ZNF687, OSRI1, ZNF514, ZNF660, ZNF300, RBAK, ZNF92, ZNF157, ZNF182, ZNF41, ZNF711, PRDM14, ZNF7, ZNF214, ZNF215, SALL3, ZNF827, ZNF547, ZNF773, ZNF776, ZNF256, ZSCAN1, ZNF837, PRDMB, ZNF117, ZIC1, FEZF2, ZNF599, ZNF18, KLF10, ZKSCAN2, ZNF689,
ZIC3, ZNF1I9, ZSCAN1I2, ZNF276, ZNF283, ZNF221, ZNF225, ZNF230, ZNF222, ZNF234, ZNF233, ZNF235, ZNF362, ZNF208, ZNF714, ZNF394, ZNF333, ZNF382, IKZF3, ZNF577, ZNF653, ZNF75A, GFI1, ZNF281, ZNF496, ZNF2, ZNF513, ZNF148, KLF1S5, ZNF691, ZNF589, PRDM9, ZNF12, SP8, OSR2, ZNF367, ZNF2?, GFI1B, ZNF219, SALL2, ZNF319, ZNF202, ZNF143, ZNF3, ZSCAN21, ZNF606, SP2, ZNF91, ZNF23, ZNF226, ZNF229, ZNF180, ZNF668, ZNF646, ZNF641, ZNF610, ZNF528, ZNF701, ZNF526, ZNF146, ZNF444, ZNF83, ZNF558, ZNF232, E4F1, ZNF597, INSM2, ZNF30, ZNF507, ZNF354A, ZEB2, ZNF32, KLF13, ZFPM2, ZNF764, ZNF768, ZNF35, ZNF778, ZNF212, ZNF282, PRDM10, SP7, SCRT1, ZNF16, ZNF296, ZNF160, ZNF415, ZNF672, ZNF692, ZNF439, ZNF440, ZNF581, ZNF524, ZNF562, ZNF561, ZNF584, ZNF274, ZIK1, ZNFS540, ZNF570, KLF17, ZNF217, ZNF57, ZNF556, ZNF554, KLF11, HINFP, ZNF24, ZNF596, OVOL1, SP3, ZNF621, ZNF680, BNC2, ZNF483, ZNF449, INSM1, ZNF417, ZNF791, ZNF8O0, GLIS1, ZNF497, KLF1A4, ZNF266, ZIC4, ZNF408, ZNF519, ZNF25, ZNF77, ZNF169, ZNF613, ZNF683, ZNF135, ZSCAN2, ZNF575, ZNF491, ZNF620, ZNF619, ZNF354C, ZNF114, ZNF366, ZNF454, ZNF543, ZNF354B, ZNF223, ZNF713, ZNF852, ZNF552, ZFP42, ZNF664, EGR3, ZFPM1, ZNF784, ZNF648, FIZ1, ZNF771, TSHZ1, ZNF48, ZNF816, ZNF571, ZSCANA, ZNF594, ZFP3, ZNF443, ZNF792, ZNF572, ZNF7OT, ZNF746, ZNF322A, ZNF467, ZNF678, ZFP41, HKR1, PLAG1, ZNF329, ZNF101, ZNF716, ZNF708, ZSCAN22, ZNF662, ZNF320, ZNF623, ZNF530, ZNF285, ZFP1, WT1, ZFP90, ZNF479, ZNF445, ZNF7A4, SP1, SNAI3, ZNF696, IKZF1, ZNF267, ZNF566, ZNF224, ZNF529, ZNF284, ZNF749, ZNF17, ZNF555, ZNF75D, ZNF501, ZNF197, ZNF396, ZFP91, ZNF732, ZNF397, ZSCAN30, ZNF546, ZNF286A, ZKSCANA4, ZNF70, ZNF643, ZNF642, ZSCAN23, ZNF490, ZNF626, ZNF793, ZNF383, ZNF669, ZNF559, ZNF177, ZNF548, MTFI1,
ZNF322B, ZNF563, ZNF292, ZNF567, SP6, ZNF573, ZNF527, ZNF33A, ZNF600, ZKSCAN3, ZNF676, ZNF699, ZNF250, ZNF79, ZNF681, ZNF766, ZNF107, ZNF471, ZNF836, ZNF493, ZNF167, ZNF565, ZNF34, ZNF781, ZNF1I40, ZNF774, ZNF658, ZNF765, ZNF124, ZNF569, ZNF777, ZNF775, ZNF799, ZNF782, ZNF846, ZNF136, ZKSCAN5, ZNF502, ZFP62, ZNF33B, ZNF512B, ZNF431, ZNF418, ZNF700, ZNF239, ZSCAN16, ZFP28, ZNF705A, ZNF585A, ZNF138, ZNF429, ZNF470, ZNF1I00, ZNF398, ZNF498, ZNF441, ZNF420, ZNF763, ZNF679, ZNF682, ZNF772, ZNF257, ZNF785, ZSCAN5B, ZNF165, ZNF655, ZNF98, ZNF786, ZNF517, ZNF675, ZNF860, ZNF628, ZNF665, ZNF624, ZNF841, ZNF615, ZNF350, ZNF432, ZNF433, ZNF460, ZNF81, ZNF780A, ZNF461, ZNF181, LOC100287841, ZNF44, ZNF790, ZNF677, ZNF823, ZNF311, ZNF347, ZNF71, ZNF121, ZNF335, ZNF560, ZNF273, ZNF8A4, ZNF667, ZNF649, ZNF248, ZNF544, ZNF770, ZNF737, ZNF251, ZNF607, ZNF334, ZXDA, ZNF485, ZIM2, PEG3, ZNF192, ZNF442, ZNF813, ZNF26, ZNF69, ZNF583, ZNF568, ZXDB, ZNF480, ZNF587, ZNF808, ZNF43, ZNF28, ZNF627, ZNF789, ZNF536, ZNF534, ZNF652, ZNF521, ZNF358, ZFP2, SP5, ZNF814, ZNF551, ZNF80O5, ZSCAN5C, ZNF468, ZNF616, ZFP57, ZNF1I55, ZNF783, ZNF425, ZNF580, ZNF611, ZNF254, ZNF625, ZNF134, ZNF845, ZNF99, ZNF253, ZNF90, ZNF93, ZNF486, REPINI, LOC100131539, ZNF705D, LOC100132396, ZNF705G, SCRT2, ZNF407, SP9, ZNF579, ZNF880, ZNF630, ZNF844, ZNF469, ZNF717, ZNF865, ZNF492, ZNF688, YY2, ZNF878, ZNF879, ZNF736, ZNF323, ZNF709, ZNF512, ZNF585B, ZNF1I54, ZNF324B, ZNF564, ZFP82, GLIA, ZNF674, ZNF345, ZNF550, KLF1, YY1, MYST2, ST18, L3MBTLA, MYT1L, MYT1, L3MBTL1, MTA3, GATA1I, TRPS1, GATA3, GATAS, GATAA4, GATA6, GATAD2B, GATAD1, GATA2, MTA1, ZGLP1, MTA2Z, RERE, C160orf5, LITAF, PIAS1, PIAS2, PIASA4, ZMIZ1, ZMIZ2, PIAS3,
RNF138, NFX1, NFXL1 ou quaisquer combinações dos mesmos.
[00351] Em algumas modalidades, as células são manipuladas (por exemplo, convertidas ou diferenciadas) a partir de um tipo de célula para um outro. Em algumas modalidades, uma célula pancreática é manipulada para uma célula de ilhota beta. Em algumas modalidades, um fibroblasto é manipulado para uma célula iPS. Em algumas moda- lidades, um preadipócito é manipulado para uma célula de gordura marrom. Outras células exemplares incluem, por exemplo, células musculares, células neurais, leucócitos e linfócitos.
[00352] Em algumas modalidades, a célula é uma célula doença ou carregando mutante. Tais células podem ser manipuladas para tratar a doença, por exemplo, corrigir uma mutação ou alterar o fenótipo da célula, por exemplo, inibidor o crescimento de uma célula cancerosa. Por exemplo, uma célula está associada com uma ou mais doenças ou condições descritas aqui.
[00353] Em algumas modalidades, a célula manipulada é uma célu- la normal.
[00354] Em algumas modalidades, a célula manipulada é uma célu- la-tronco ou célula progenitora (por exemplo, células iPS, embriônicas, hematopoiéticas, adipose, linha germinativa, pulmão ou tronco-neural ou progenitoras). Em algumas modalidades, a célula manipulada pode ser uma célula de qualquer uma das três camadas germinativas (isto é, mesodermal, endodermal ou ectodermal). Em algumas modalida- des, a célula manipulada pode ser de um tecido extraembriônico, por exemplo, da placenta.
[00355] Em algumas modalidades, a célula sendo manipulada é se- lecionada de fibroblastos, precursores monociíticos, células B, células exócrinas, progenitores pancreáticos, progenitores endócrinos, hepa- toblastos, mioblastos ou preadipócitos. Em algumas modalidades, a célula é manipulada (por exemplo, convertida ou diferenciada) em cé-
lulas musculares, células eritroide-megacarióticas, eosinófilos, células iPS, macrófagos, células T, células beta da ilhota, neurônios, cardio- miócitos, células sanguíneas, progenitores endócrinos, progenitores exócrinos, células ductais, células acinares, células alfa, células beta, células delta, células PP, hepatócitos, colangiócitos, angioblasto, me- soangioblasto ou adipócitos marrons.
[00356] Em algumas modalidades, a célula é uma célula muscular, célula eritroide-megacariocítica, eosinófilo, célula iPS, macrófago, cé- lula T, célula beta da ilhota, neurônio, cardiomiócito, célula sanguínea, progenitora endócrina, progenitora exócrina, célula ductal, célula aci- nar, célula alfa, célula beta, célula delta, célula PP, hepatócito, colan- giócito ou adipócito branco ou marrom.
[00357] Em algumas modalidades, a célula é uma célula precurso- ra, uma célula pluripotente, uma célula totipotente, uma célula-tronco adulta, uma célula de massa celular interna, uma célula-tronco embri- ônica ou uma célula iPS.
[00358] Em algumas modalidades, a célula manipulada é uma célu- la cancerosa. Em algumas modalidades, a célula cancerosa pode ser uma célula cancerosa de pulmão, uma célula de câncer de mama, uma célula de câncer de pele, uma célula de câncer de cérebro, uma célula de câncer pancreático, uma célula de câncer hematopoiético, uma célula de câncer de fígado, uma célula de câncer de rim, uma cé- lula de câncer ovariano, uma célula de câncer de próstata, uma célula de câncer de pele.
[00359] Em algumas modalidades, a célula é uma célula muscular, uma célula eritroide-megacariocítica, célula iPS, macrófago, célula T, célula beta da ilhota, neurônio, cardiomiócito, célula sanguínea, proge- nitora endócrina, progenitora exócrina, célula ductal, célula acinar, cé- lula alfa, célula beta, célula delta, célula PP, hepatócito, colangiócito ou adipócito branco ou marrom.
Administração de Inibidores de DNA-PK e Sistema de Edição de Gene a uma Célula(s)
[00360] Administração a uma célula(s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK pode ser realizada através de qual- quer método conhecido na técnica. A administração pode ser in vitro, ex vivo ou in vivo. A administração a uma célula(s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK pode ocorrer simultanea- mente ou sequencialmente. Em algumas modalidades, a administra- ção resulta nos componentes do inibidor de DNA-PK e do sistema de edição de genoma entrando na membrana celular. Em algumas moda- lidades, a administração resulta nos componentes do inibidor de DNA- PK e do sistema de edição de genoma entrando no núcleo da célula. Em algumas modalidades, a administração inclui incubação da célula na presença do inibidor de DNA-PK e sistema de edição de genoma.
[00361] O sistema de edição de genoma pode ser administrado a uma célula(s) através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, quaisquer métodos de administração de ácido nucleico ou proteína conhecidos na técnica pode ser usado. O sistema de edição de gene é administrado (por exemplo, distribuído) a uma célula por meio de um ácido nucleico codificando os componentes do sistema de edição de gene. O sistema de edição de gene pode ser administrado a uma célula através de vetores ou virais ou vetores não virais. Em al- gumas modalidades, vetores virais são usados. Os vetores virais po- dem ser retrovirais (por exemplo, leucemia de murino, HIV ou lentiviral) ou vírus de DNA (por exemplo, adenovírus, herpes simplex e adeno- associado). Em algumas modalidades, métodos de transfecção (por exemplo, métodos de administração não virais) são usados para intro- duzir o sistema de edição de genoma em uma célula. Métodos de transfecção incluem contato da célula com DEAE-Dextrano, fosfato de cálcio, lipossomas ou eletroporação de um plasmídeo em uma célula.
Métodos adicionais de administração não viral incluem eletroporação, lipofecção, microinjeção, biolística, virossoma, lipossomas, imunoli- possoma, policátion ou lipídeo: conjugados de ácido nucleico, DNA nu, RNA nu, vírions artificiais e DNA de absorção aumentada de agente. Sonoporação usando, por exemplo, o sistema Sonitron 2000 (Rich- Mar) pode ser também usada para administração de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos são adminis- trados como mMRNA. Em algumas modalidades, MRNAs capeados são usados para aumentar a eficiência de tradução e/ou estabilidade do MRNA. Em algumas modalidades, capeamentos ARCA (análogo de capeamento antirreverso) ou suas variantes são usados. Vide patentes US7074596 e US8153773.
[00362] Em modalidades, a endonuclease (por exemplo, Cas, Cpf1 e similar) e o gRNA, são transcritos a partir do DNA.
[00363] Em modalidades, a endonuclease (por exemplo, Cas, Cpf1 e similar) é transcrita a partir de DNA e o gRNA é provido como RNA.
[00364] Em modalidades, a endonuclease (por exemplo, Cas, Cpf1 e similar) e o gRNA são providos como RNA.
[00365] Em modalidades, a endonuclease (por exemplo, Cas, Cpf1 e similar) é provida como uma proteína e o gRNA é provido como DNA.
[00366] Em modalidades, a endonuclease (por exemplo, Cas, Cpf1 e similar) é provida como proteína e o gRNA é provido como RNA.
[00367] Sistemas de administração de ácido nucleico adicionais in- cluem aqueles providos pela Amaxa Biosystems (Cologne, Alemanha), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) e Copernicus Therapeutics Inc, (vide, por exemplo, US6008336). Lipofectiona é descrita nas, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.049.386; 4.946.787; e 4.897.355) e reagentes de lipofecção são vendidos comercialmente (por exemplo, Transfectam'Y e LipofectinTv e Lipofectamine"y RNAIMAX). Lipídeos catiônicos e neutros que são adequados para lipofecção de reconhecimento de receptor eficiente de polinucleotídeos incluem aqueles de Feigner/, WO 91/17424, WO 91/16024. Administração pode ser a células (administração ex vivo) ou tecidos-alvo (administração in vivo).
[00368] A preparação de complexos de lipídeo:ácido nucleico, inclu- indo lipossomas direcionados tais como complexos de imunolipídeo, é bem conhecida de um versado na técnica (vide, por exemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese e outros, Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr e outros, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy e outros, Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao e outros, Gene Therapy 2:710-722 (1995);
[00369] Métodos de administração adicionais incluem o uso de em- pacotamento dos ácidos nucleicos a serem administrados a veículos de administração EnGenelC (EDVs). Esses EDVs são especificamente administrados a tecidos-alvo usando anticorpos específicos onde um braço do anticorpo tem especificidade para o tecido-alvo e o outro tem especificidade para o EDV. O anticorpo traz os EDVs para a superfície da célula-alvo e então o EDV é trazido para a célula através de endoci- tose. Uma vez na célula, os conteúdos são liberados (vide MacDiarmid e outros (2009) Nature Biotechnology 27(7):643) Ahmad e outros, Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); Pat. U.S. Nos. 4.186.183.
4.217.344. 4.235.871. 4.261.975. 4.485.054. 4.501.728. 4.774.085.
4.837.028 e 4.946.787).
[00370] Em algumas modalidades, a transfecção pode ser transien- te, em que o sistema de edição de genoma transfectado contendo plasmídeo entra no núcleo, mas não se torna incorporado ao genoma da célula durante replicação. A transfecção pode ser estável, em que o plasmídeo transfectado se tornará integrado a uma região genômica da célula.
[00371] Em algumas modalidades em que expressão transiente é usada, sistemas de base adenoviral podem ser usados. Vetores de base adenoviral são capazes de eficiência de transdução muito alta em muitos tipos de célula e não requerem divisão celular. Com tais vetores, título alto e níveis de expressão altos foram obtidos. Esse ve- tor pode ser produzido em quantidades grandes em um sistema relati- vamente simples. Vetores de vírus adenoassociado ("AAV") são tam- bém usados para transduzir células com ácidos nucleicos-alvo, por exemplo, na produção in vitro de ácidos nucleicos e peptídeos, e para procedimentos de terapia gênica in vivo e ex vivo (vide, por exemplo, West e outros, Virology 160:38-47 (1987); Patente U.S. No. 4.797.368; WO 93/24641; Kotinn Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, Jy. Clin. Invest. 94: 1351 (1994). Construção de vetores de AAV recombinantes são descritos em várias publicações, incluindo Pat. U.S. No. 5.173.414; Tratschin e outros, Mol. Cell. Biol. 5:3251- 3260 (1985); Tratschin e outros, Mol Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); eSamulski e ou- tros, J. Virol 63:03822-3828 (1989).
[00372] Em algumas modalidades, a administração a uma célula(s) de um inibidor de DNA-PK é realizada através da cultura de uma célu- la(s) isolada na presença do inibidor de DNA-PK e qualquer meio ade- quado que permita que o inibidor de DNA-PK entre na membrana celu- lar e/ou no núcleo da célula.
[00373] Em algumas modalidades, os inibidores de DNA-PK são administrados a uma célula(s) in vitro, in vivo ou ex vivo. Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK é contatado com uma célula(s) por cerca de 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas, 21, horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, 45 horas, 50 horas, 55 horas, 60 horas, 65 horas, 70 horas, 85 horas, 90 horas, 100 horas, 125 horas, 150 horas, 200 horas ou por qualquer período de tempo entre esses. Em algumas modalidades, o inibidor de DNA- PK é contatado com uma célula(s) por cerca de 1,5 semana, 2,0 se- manas, 2,5 semanas, 3,0 semanas, 3,5 semanas, 4 semanas ou qual- quer período de tempo entre esses. O inibidor de DNA-PK pode ser contatado com a célula ou antes, durante ou após introdução de com- ponentes do sistema de edição de genoma.
[00374] Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK é adminis- trado a uma célula(s) em uma concentração de cerca de 0,1 uM, 0,25 UM, 0,5 UM, 0,75 UM, 1,0 uM, 1,25 UM, 1,50 uM, 1,75 UM, 2,0 UM, 2,5 UM, 3,0 UM, 3,5 uM, 4,0 UM, 4,5 UM, 5,0 UM, 5,5 UM, 6,0 UM, 6,5 UM, 7,0 UM, 7,5 uM, 8,0 uM, 8,5 uM, 9,0 uM, 9,5 uM, 10 uM, 10,5 uM, 11,0 UM, 11,5 uM, 12UM ou quaisquer concentrações entre elas. A concen- tração de inibidor de DNA-PK pode ser modificada durante o curso de administração.
[00375] Em algumas modalidades, os componentes de edição de genoma são administrados a uma célula(s) por um ou mais vetores ou na forma de RNA, mRNA ou no caso do componente endonuclease como proteína ou mRNA purificado (por exemplo, proteína Cas9). O um ou mais vetores podem incluir vetores virais, plasmídeos ou ssD- NAs. Vetores virais podem incluir vetores virais retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoassociados e de herpes simplex ou quaisquer com- binações dos mesmos. Em algumas modalidades, os componentes de edição de gene são administrados por meio de RNA ou RNA sintético.
[00376] Em algumas modalidades, administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula junto com um sistema de edição de gene resulta em quantidades aumentadas de resultado de edição de gene de repa- ro direcionado por homologia em comparação com uma condição de linha basal em que a célula não é administrada com um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula(s) junto com um sistema de edição de gene re-
sulta em supressão de indels (de NHEJ) ou no alvo ou fora do alvo. Em algumas modalidades, administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula(s) junto com um sistema de edição de gene resulta em ex- pressão aumentada ou diminuída de um gene de interesse. Adminis- tração dos inibidores de DNA-PK a uma célula(s) junto com um siste- ma de edição de gene pode resultar na expressão de um gene não endógeno a uma célula. Em algumas modalidades, administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula(s) junto com um sistema de edição de gene resulta na remoção completa ou parcial ou uma modificação de um gene de uma célula(s). Em algumas modalidades, administra- ção dos inibidores de DNA-PK a uma célula(s) junto com sistema de edição de gene resulta na remoção completa ou parcial ou uma modi- ficação de um íntron e/ou um éxon em uma célula(s). Em algumas modalidades, administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula(s) junto com sistema de edição de gene resulta na remoção completa ou parcial ou uma modificação de uma região de não codificação em uma célula(s). Em algumas modalidades, administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula junto com sistema de edição de gene resulta em remoção simultânea ou sequencial, completa ou parcial ou uma modi- ficação de uma região genética de codificação e/ou não codificação em uma célula(s). Em algumas modalidades, administração dos inibi- dores de DNA-PK a uma célula(s) junto com sistema de edição de ge- ne resulta em remoção simultânea ou sequencial, completa ou parcial ou uma modificação de uma região genética de codificação e/ou não codificação em uma célula, incluindo DNA ou RNA extracromossomal. O DNA extracromossomal pode ser DNA mitocondrial, DNA de cloro- plasto, DNA circular extracromossomal ou DNA extracromossomal vi- ral.
[00377] Em algumas modalidades, administração de inibidores de DNA-PK a uma célula junto com sistema de edição de genoma resulta em expressão aumentada ou expressão diminuída de um gene de in- teresse. Em algumas modalidades, o aumento ou diminuição em ex- pressão de um gene de interesse pode ser cerca de ou entre 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% em compara- ção com uma condição de linha basal em que a célula não é adminis- trada com um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, o au- mento ou diminuição de um gene de interesse pode ser cerca de ou entre 0,5 vez, 1,0 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3,0 vezes, 3,5 ve- zes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação com o nível de expressão de linha basal em que a célula não é administrada com um inibidor de DNA-PK.
[00378] Em algumas modalidades, administração de inibidores de DNA-PK a uma célula junto com um sistema de edição de genoma re- sulta em um aumento em edição de genoma. Em algumas modalida- des, o aumento em edição de genoma pode ser cerca de ou entre 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% em comparação com uma condição de linha basal em que a célula não é administrada a um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, o aumento em edição de genoma pode ser cerca de ou entre 0,5 vez, 1,0 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3,0 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação com o nível de expressão de linha basal em que a célula não é administrada com um inibidor de DNA-PK.
[00379] Em algumas modalidades, administração de um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de gene a uma população de célula resulta em uma sobrevivência celular maior em comparação com uma condição de linha basal em que uma população celular administrada com apenas um sistema de edição de gene e não é administrada a um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, o incidir de DNA-PK que resulta em sobrevivência celular maior é um composto de Fórmu-
las (1), (11), (INI-A-1), (I1I-A-2), (I11-B-1), (111-B-2), (IV), (V-A) e (V-B).
[00380] Em algumas modalidades, a célula é sincronizada na fase de ciclo celular S ou G2, ou antes, após ou durante administração do inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, a célula é sincronizada na fase de ciclo celular S ou G2, ou antes, após ou durante introdução dos componentes de edição de gene. Sincronização da célula na fase de ciclo celular S ou G2 pode ser obtida através de qualquer método conhecido na técnica. Como um exemplo não limitante, agentes que podem ser usados para sincronizar uma célula na fase de ciclo celular S ou G2 incluem afidicolina, diroxiureia, lovastatina, mimosina, noco- dazol, timidina ou quaisquer combinações dos mesmos. (Vide Lin e outros, Elife 2014 Dez 15;32014). Em algumas modalidades, os agen- tes para sincronização celular podem ser administrados a qualquer momento durante o processo de edição de gene.
[00381] Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK e/ou o sis- tema de edição de genoma podem ser incluídos em um recipiente, pa- cote ou dispensador junto com instruções para uso. Em algumas mo- dalidades, o agente inibidor de DNA-PK e/ou o sistema de edição de genoma incluídos em um recipiente, pacote ou dispensador junto com instruções para uso é um estojo.
[00382] Em algumas modalidades, os inibidores de DNA-PK e/ou o sistema de edição de genoma estão incluídos em um estojo com ins- truções para uso. O estojo pode conter qualquer sistema de edição de genoma e/ou inibidor de DNA-PK e instruções para uso. Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK é qualquer um dos compostos re- presentados pela Fórmula Estrutural (1). Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um selecionado de um sistema base- ado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease dedo-de- zinco (ZFN), um sistema de Nuclease baseado em Efetor do Tipo Ati- vador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR ou um sistema baseado em NgAgo. O sistema de edição de genoma po- de ser provido no estojo em qualquer forma, por exemplo, como um construto de plasmídeo, vetor, DNA ou RNA.
[00383] Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK e/ou um sistema de edição de genoma é administrado in vivo. O inibidor de DNA-PK e o sistema de edição de gene são formulados para serem compatíveis com sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração são descritos acima.
[00384] Em algumas modalidades, a formulação pode também con- ter mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, por exemplo, aqueles com atividades com- plementares que não afetam de modo adverso um ao outro. Alternati- vamente, ou em adição, a composição pode compreender um agente que aumenta sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, citocina, agente quimioterapêutico ou agente inibidor de crescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[00385] Em algumas modalidades, o agente inibidor de DNA-PK e/ou o sistema de edição de genoma são administrados em terapia de combinação, isto é, combinados com outros agentes, por exemplo, agentes terapêuticos, que são úteis para tratamento de condições ou distúrbios patológicos, tais como várias formas de câncer e doenças inflamatórias. O termo "em combinação" nesse contexto significa que os agentes são dados substancialmente contemporaneamente, ou si- multaneamente ou sequencialmente. Se dados sequencialmente, no início de administração do segundo composto, o primeiro dos dois compostos é preferivelmente ainda detectável em concentrações efi- cazes no sítio de tratamento. Métodos de Avaliação de Edição de Genoma
[00386] “Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado pa- ra avaliar células quanto à eficiência de edição de genoma, incluindo a eficiência de NHEJ e/ou HDR. Por exemplo, métodos de avaliação po- dem incluir amplificação baseada em PCR de regiões direcionadas seguido por sequenciamento ou sequenciamento profundo das regiões amplificadas para confirmar edição de genoma. Genotipificação de PCR permite a quantificação e classificação de compostos em HDR estimulante. Outros métodos de avaliação podem incluir sequencia- mento de próxima geração. Vide, por exemplo, Bell e outros, "A high- throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mu- tations using next-generation sequencing," BMC Genomics, 15:1002 (2014).
[00387] Iniciadores de PCR podem ser engenheirados para seleti- vamente amplificar ambas as regiões genéticas não modificadas e modificadas, resultando em amplicons de comprimentos diferentes de- pendendo do estado da modificação genética. Os Amplicons podem ser então separados em um gel, e a eficiência de HDR estimada atra- vés de densitometria usando um Bio-lmager. Alternativamente, uma nova tecnologia de PCR, a PCR de gotícula digital rápida (DDPCR) pode ser usada para simultaneamente medir eventos de HDR e NHEJ em amostras editadas de genoma. Vide, por exemplo, Miyaoka e ou- tros, "Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effects of locus, nuclease e cell type on genome-editing," Scientific Reports, 6,
2016. Outros métodos que podem ser usados para avaliar células quanto a modificações genômicas incluem sequenciamento Sanger, sequenciamento profundo e RT-PCR.
[00388] Em algumas modalidades, um construto de repórter de luz de tráfego (TLR) é usado para avaliar células. Avaliação por TLR inclui uma célula repórter que é engenheirada para expressar um marcador fluorescente quando da edição de genoma direcionada. Seguindo di-
recionamento apropriado, o marcador fluorescente é expresso pela célula. Quantificação das células apropriadamente direcionadas pode ser realizada através de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, análise citométrica de fluxo. Vide, por exemplo, Certo e ou- tros 2011, "Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints," Nature Methods, 8, páginas 671-676 (2011). Preparação de Compostos da Invenção
[00389] “Como usado aqui, todas as abreviações, símbolos e con- venções estão de acordo com aqueles usados na literatura científica contemporânea. Vide, por exemplo, Janet, S. Dodd, ed., The ACS Style Guide: A Manual for Authors and Editors, 2nd Ed., Washington, D.C.: American Chemical Society, 1997. As definições que seguem descrevem termos e abreviações usados aqui: BPin pinacol! éster boronato Brine solução de NaCl saturada em água DCM diclorometano DIAD diisopropilazodicarboxilato DIEA diisopropiletilamina DMA dimetilacetamida DMF dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido DTT ditiotreitol ESMS espectrometria de massa por eletropulverização EtO éter de etila EtOAc acetato de etila EtoH álcool de etila HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico HPLC cromatografia líquida de alto desempenho IPA isopropanol LAH hidreto de lítio e alumínio
LC-MS cromatografia líquida-espectrometria de massa com LDA diisopropiletilamida de lítio Me metila MeOH metanol MsCI cloreto de metanossulfonila MTBE metil t-butil éter NMP N-metilpirrolidina Pd2(dba); tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(O0) Pd(dppf)Cl2 — 1,1' bis(difenilfosfino)-ferroceno dicloro-paládio PG grupo de proteção Ph fenila (rac)-BINAP 2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftila racêmica RockPhos di-terc-butil(2',4' 6'-triisopropil-3,6-dimetóxi-[1,1'-bifenil]- 2-ilfosfina RT ou rt temperatura ambiente SFC cromatografia fluida supercrítica SPhos 2-diciclo-hexilfosfino-2',6'-dimetoxibifenila TBAI iodeto de tetrabutilamônio tBu butila terciária THF tetra-hidrofurano TEA trietilamina TMEDA tetrametiletilenodiamina VPhos [3-(2-diciclo-hexilfosfanilfenil)-2,4-dimetóxi- fenil]lsulfoniloxisódio Procedimentos Sintéticos Gerais
[00390] Em geral, os compostos da invenção podem ser prepara- dos através de métodos descritos aqui ou através de outros métodos conhecidos — daqueles versados na técnica por exemplo, US2013/0281431 e PCT/US2014/024767 depositado em 12 de março de 2014. Preparações exemplares específicas dos compostos da in-
venção são descritas na seção de Exemplificação abaixo.
[00391] Em uma modalidade, os métodos de preparação de com- postos representados pela Fórmula (Il) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos empregam a etapa de reagir Composto (X-1) com Composto (Y-1) sob condições adequadas para formar um com- posto representado pela Fórmula (|) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
A x N x (CG) so) O
IS R? LV E) (X-1) (1)
[00392] As variáveis de Fórmula (1) são cada uma e independente- mente como acima descrito para os Composto da Invenção. L' do Composto (X-1) é um grupo de saída tal como um halogênio (por exemplo, -F, -Cl, -Br ou -|), toluenossulfonato, metanossulfonato ou trifluormetanossulfonato, e as outras variáveis do Composto (X-1) são cada uma e independentemente como descrito acima para a Fórmula (1). Em uma modalidade específica, L' é -Br, toluenossulfonato, meta-
N nossulfonato ou trifluormetanossulfonato. O Composto (Y-1) é Ç H H B(ORº) B(ORº)
IGOO O 0, O, o ou o , em que Rº é —-H ou dois Rº, junto com o átomo de oxigênio ao qual eles estão ligados, formam um anel dio- xolano opcionalmente substituído com uma ou mais C1.2 alguila. Em uma modalidade específica, dois Rº, junto com o átomo de oxigênio ao qual eles estão ligados e com o átomo de boro, formam 4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolano. Quaisquer condições adequadas para realização de acoplamentos cruzados, tais como acoplamentos Csp>2- Csp2, conhecidas na técnica podem ser usadas. Condições exempla- res específicas são descritas abaixo na Exemplificação.
[00393] Em uma outra modalidade, os compostos de Fórmula (1) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que R' é- NHC(O)Rº, -NHC(0)OR, -NHC(O)NHRº, -NHS(O)2Rº, -NHRº ou -OR?, e as outras variáveis de fórmula (1) são cada uma e independentemen- te como descrito acima, são preparados empregando a etapa de rea- ção do Composto (X-2) com Composto (Y-2) sob condições adequa- das: e (a) x A N JS O N pucca ec—— R' LI) OQ (Y-2) S R? R
O 0x2) () : Q' de Composto (X-2) é -NH2 ou -OH e as outras variáveis de Com- posto (X-2) são cada uma e independentemente como descrito acima para a Fórmula (1). O composto (Y-2) é RI-C(O)-L?, R4-O-C(O)-L?, NHRº*-C(O)-L?, R*S(O)2-L?, R*-L2, R(C(0)OR!? ou R-N=C=O, em que cada Rº independentemente é como descrito para a Fórmula (1); Lº é um halogênio (por exemplo, -F, -Cl, -Br ou -|), toluenossulfonato, me- tanossulfonato ou trifluormetanossulfonato; e Rº é C14 alquila, tal como metila ou etila. Em uma modalidade específica, Lº é —Br, toluenossul- fonato, metanossulfonato ou trifluormetanossulfonato. Quaisquer con- dições adequadas de realização da reação conhecidas na técnica po- dem ser usadas. Condições exemplares específicas são descritas abaixo na Exemplificação.
[00394] Em uma outra modalidade, os compostos de Fórmula (1) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que X é -NH ou —
O, e as outras variáveis de fórmula (1) são cada uma e independente- mente como descrito acima, são preparados através dos métodos em- pregando: (i) reagir Composto (X-3) com Composto (Y-3) para formar um composto representado pela fórmula (1) ou um sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo: e LB S N xH PT
LISAS R? (6) O (Y-3) X-3) No (ii) reagir Composto (X-4) com Composto (Y-4) para formar um composto representado pela fórmula (1) ou um sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo: e
SS : > (X-41) o O) Lô de Composto (X-3) é um halogênio (por exemplo, -Br, -CI ou —I). Lº de Composto (Y-4) é um halogênio (por exemplo, -Br, -Cl ou —l), toluenossulfonato, metanossulfonato ou trifluormetanossulfonato. Cada X para Compostos (Y-3) e (X-4) é independentemente -NH- ou — O-. As variáveis restantes de cada um dos Compostos (X-3), (X-4), (Y- 3) e (Y-4) são cada uma e independentemente como descrito acima para Fórmula (1). Em uma modalidade específica, L? do Composto (X- 3) é —Br. Em uma outra modalidade específica, L* do Composto (Y-4) é —Br, toluenossulfonato, metanossulfonato ou trifluormetanossulfona-
to. Quaisquer condições adequadas para substituições nucleofílicas conhecidas na técnica podem ser usadas. Condições exemplares es- pecíficas são descritas abaixo na Exemplificação.
[00395] Em uma outra modalidade, os métodos da invenção em- pregam a etapa de reagir o Composto (X-5) com RºOH ou ROH para formar um composto representado pela Fórmula (1) ou um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo, em que R' é -C(O)NHRS, - C(O0)ORº, -NHC(OJ)Rº, -NHC(O0)ORº, -NHC(O)JNHRº, -NHS(O)2.Rº, - NHRº,-C1-4 alquil-NHRº ou -ORº ou R”; Rº é heteroarila de 5-10 mem- bros substituída com pelo menos um -OR5; R? é heteroarila de 5-10 membros substituída com pelo menos um -OR; e R, Rº e as outras va- riáveis de fórmula (1) são cada um e independentemente como acima descrito para a Fórmula (1), contanto que ambos R e Rº não sejam hi- drogênio: Ca) Ca) x N x N 1 É o R2 RºOH ou ROH nº 2 O O (X-5) (1) : Qº? de Composto (A-5) é uma ligação, -C(O)NH-, -C(0)O-, -NHC(O)-, -NHC(0)O-, -NHC(O)NH-, -NHS(O)2-, -NH-, -C1+4 alquil-NH- ou -O-. O Anel D do Composto (A-5) é heteroarila de 5-10 membros. Lº é um halogênio (por exemplo, -Br, -CI, -F ou —I). R de ROH, Rº de RºOH e as variáveis restantes do Composto 5 (X-5) são cada um e independentemente como descrito acima para a Fórmula (1). Em uma modalidade específica, Lº é —Br. Quaisquer condições adequadas para substituição aromática nucleofílica conhecidas na técnica podem ser usadas. Condições exemplares específicas são descritas abaixo na Exemplificação.
[00396] Em uma outra modalidade, os compostos de Fórmula (1) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que XK é -O-, e as outras variáveis de fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito acima, são preparados através dos métodos empregan- do: reagir o Composto (X-6) com Composto (Y-6) para formar um composto representado pela fórmula (1) ou um sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo: e Lô v Lo) O N 6 | o '
O O (Y-6) (X-6) (1) :
[00397] Lô do Composto (X-6) é -OH. L” do Composto (Y-6) é -OH. As variáveis restantes de cada um dos Compostos (X-6) e (Y-6) são cada uma e independentemente como descrito acima para Fórmula (1). Quaisquer condições adequadas para substituições nucleofílicas, tais como reações Mitsunobu, conhecidas na técnica podem ser usadas. Condições exemplares específicas são descritas abaixo na Exemplifi- cação.
[00398] Em um exemplo específico, Compostos de Fórmula (1), em que X é -—-NH-, podem ser preparados como mostrado abaixo no Es- quema 1. Portanto, como mostrado na etapa 1-i do Esquema 1, com- postos heteroarila de Fórmula A podem ser reagidos com morfolina ou um análogo de morfolina através de aquecimento da mistura em um solvente não prótico, polar, para produzir compostos de Fórmula B. Utilizando um acoplamento tipo Buchwald/Hartwig auxiliado por ligante fosfina, como mostrado na etapa 1-ii do Esquema 1, um composto de Fórmula B pode ser reagido com aminociclo-hexanos de fórmula C pa-
ra produzir compostos de Fórmula D, em que R' e R? são como des- crito em outro lugar aqui. Em um exemplo, quando meso ciclo-hexano- 1,4-diaminas monoprotegidas de Fórmula E são preparadas, remoção do grupo de proteção forma compostos que podem ser reagidos com várias porções tendo grupos reativos para aminas (por exemplo, R'*-L ,onde L é um grupo de saída tal como cloro, bromo, iodo, toluenossul- fonato, metanossulfonato ou trifluormetanossulfonato; ou onde L é uma porção contendo carbonila reativa tal como um grupo éster ou isocianato ativo) para produzir um composto de fórmula G, como mos- trado na etapa 1-iv do Esquema 1. Compostos de Fórmula (Il), em que X é —S-, podem ser preparados de uma maneira similar como mostra- do no Esquema 1, empregando um equivalente tiol de Composto (C) sob condições adequadas. Exemplo 1. Preparação geral dos compostos de fórmula G H NH. O on O ENO p— R F (etapa 1-) N Catalisador de Pd, rac- N (Aa) Ç BINAP, (etapa 1-ii) o) ÇQ [8) el Y (etapa 14) | Do: em 1) nl) o E) Ç Fl Ç 16) Ç Esquema 1
[00399] Em um outro exemplo, Compostos de Fórmula (1), em que X é —-O-, podem ser preparados como mostrado abaixo nos Esquemas 2a e 2b. Portanto, como mostrado na etapa 2-i do Esquema 2a, o gru- po hidroxila de compostos heteroarila de Fórmula H pode ser protegido para produzir compostos de Fórmula J, que podem ser então reagidos com morfolina ou um análogo de morfolina através de aquecimento da mistura em um solvente não prótico, polar, para produzir compostos de
Fórmula K após remoção do grupo de proteção, como mostrado nas etapas 2-ii e 2-lii do Esquema 2a. Subsequentemente, como mostrado na etapa 2-iv do Esquema 2a, um composto de Fórmula K pode ser reagido com um composto de Fórmula L sob condições suficientes pa- ra realizar o deslocamento de SN2 de seu grupo de saída (por exem- plo, onde L é um grupo de saída tal como cloro, bromo, iodo, toluenos- sulfonato, metanossulfonato ou trifluormetanossulfonato) para produzir um composto de Fórmula M ou Fórmula M, dependendo de se R' ou R? é hidrogênio. Nesses casos quando R'? ou R? são porções nitrogê- nio ou oxigênio protegidas, compostos da invenção podem ser produ- zidos através da remoção do grupo de proteção e subsequente mani- pulação genética da amina/álcool livre resultante. Exemplo 2. Preparação geral dos compostos de fórmulas M NReS
GQ Q OQ Ho proteger — nO N Ç desproteger O Z& (etapa 2-1) ne. (etapa 2-ii) (etapa 2-iii) ” CG o al 2) o. CG) o CG) me OS, OO base " IM) N ã ” IN) N Ex Ô O Esquema 2a
[00400] —Alternativamente, como mostrado no esquema 2b, o grupo hidroxila de um composto de Fórmula O pode ser reagido com um composto de Fórmula L para produzir um brometo de biciclo- heteroarila de Fórmula P, que pode ser subsequentemente reagido com morfolina ou um análogo de morfolina para produzir um composto de Fórmula M ou Fórmula N.
QDO A OQ Ho NRO LS NO mo [o] (etapa 2-v)
[00401] —Alternativamente, como mostrado no Esquema 2c, os com- postos da invenção em que o Anel B é um anel di-hidropirano podem ser preparados reagindo compostos de Fórmula Q com dialquil (3,6-di- hidro-2H-piran-4-il)boronatos para produzir compostos de Fórmula R. A reação pode ser feita sob um catalisador de Pd, tal como Pd(dppf) em uma condição básica (por exemplo, um carbonato de metal, tal como Na2CO;). Rº no Esquema 2c é —H ou dois Rº, junto com o átomo de oxigênio ao qual eles estão ligados, formam um anel dioxolano op- cionalmente substituído com uma ou mais C1.2 alguila. Em uma moda- lidade específica, dois Rº, junto com o átomo de oxigênio ao qual eles estão ligados e com o átomo de boro, formam 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolano. B(OR%, o (a) Õ SS CG)
EEE Romão SRS” meo É fo) Esquema 2c
[00402] Em um outro exemplo, Compostos de Fórmula (1), em que X é -CH7>-, podem ser preparados como mostrado abaixo nos Esque- mas 3A e 3B. Por exemplo, o Composto (3A-10) onde o Anel C é uma Ca cicloalquila e X é -CH2- pode ser preparado como mostrado no Esquema 3A. Na etapa (i), uma substituição aromática nucleofílica do grupo F do Composto (3A-1) com o grupo cianida do Composto (3A-2) gera Composto (3A-2). Tratamento do Composto (3A-2) com HCI me- tanólico forma Composto éster (3A-3), que reage na Etapa (iii) com uma morfolina sob condições Buchwald para formar Composto (3A-4). Redução de Composto éster (3A-4) com um agente de redução ade- quado, tal como hidreto de lítio e alumínio, provê Composto álcool! pri- mário (3A-5). Cloração de Composto álcool (3A-5) com um agente de cloração adequado, tal como POCI3, seguido por reação com uma tri- fenilfosfina forma um sal Wittig, Composto (3A-7). Desprotonação de Composto (3A-7) com uma base, tal como KO'Bu, gera Composto (3A- 8). Uma reação de Composto (3A-8) com uma ciclo-hexanona apropri- adamente substituída provê Composto alceno (3A-9). Composto alce- no (3A-9) é então reduzido sob condições de hidrogenação adequa- das, tal como Pd/C com gás Hz. : o do EEN se GBA-1) GBA2) GA) sa [) | x clPns'P. e Pe. o) em vi) o) o) VW OQ “O meo E A Em = SO (4-9) (34-10) Esquema 3A
[00403] Em um outro exemplo, Composto (3B-4) onde o Anel C é um sistema de anel aromático (ou fenila ou heteroarila) e X é -CH>-, pode ser preparado como mostrado no Esquema 3B. Condições espe- cíficas para o Esquema 3B podem ser encontradas na técnica anterior, por exemplo, J. Org. Chem. 2014, 79, 4285-4292.
: O LO y (zo NI(PCy3)2Cla S Br N THF/NMP 100C O > Br N (3B-1) (3B-2) (S6:3) | Es Es:
SN
SO (3B-4) Esquema 3B
[00404] &—Alternativamente, os compostos da Tabela 2 podem ser também usados para preparação de outros compostos de Fórmula (1), como ilustrado abaixo na Exemplificação.
EXEMPLIFICAÇÃO Caracterizações Analíticas
[00405] “Como usado aqui, o termo "Rt(min)" se refere ao tempo de retenção de HPLC, em minutos, associado com o composto. A menos que de outro modo indicado, os métodos de HPLC utilizados para ob- ter os tempos de retenção reportados são como descrito abaixo: Método A de HPLC Instrumento: Waters Acquity UPLC, Espec Mass Waters 3100 Coluna: Waters CSH C18 1,7um 2,1x50mm Temp: 25º C Solvente A: Água + 0,1% TFA Solvente B: Acetonitrila + 0,1% TFA Detecção: DAD 220-400nm Gradiente: O min A 95%, B 5%
0,6min A 5%, B 95% 0,7min A 5%, B 95% 1,4 min A 95%, B 5% Taxa de fluxo: 0,600 mL/min Método B de HPLC Instrumento: Waters Autopure Coluna: Waters Sunfire C18 5 um, 4,6x100mm Temp: Temperatura ambiente Solvente A: Água + 0,1% TFA Solvente B: Acetonitrila + 0,1% TFA Detecção: Espe massa — Waters 3100, DAD (220-400 nm) Gradiente: O min - A 98%, B 2%
3.8 min — A 2%, B 98%
4.9 min — A 2%, B 98%
5.0 min — A 98%, B 2% Taxa de fluxo: 1,50 mL/min Método C de HPLC Instrumento: Waters Acquity UPLC, Espec Massa Waters 3100 Coluna: Waters CSH C18 1,7um 2,1x50mm Temp: 25º C Solvente A: Água + 0,1% TFA Solvente B: Acetonitrila + 0,1% TFA Detecção: DAD 220-400nm Gradiente: O min A 90%, B 10% 0,6min A 40%, B 60% 0,7min A 90%, B 10% 1,4 min A 90%, B 10% Taxa de fluxo: 0,600 mL/min
Método D de HPLC Instrumento: Waters Acquity UPLC, Espec Massa Waters 3100 Coluna: Waters UPLC BEH C8 1,7um 2,1x50mm Temp: 25 C Solvente A: 95/5 Água (SOMM Formato de Amônio, pH9)/Acetonitrila Solvente B: Acetonitrila Detecção: DAD 220-400nm Gradiente: O min A 95%, B 5% 0,6min A 5%, B 95% O0,7min A 5%, B 95% 1,4 min A 95%, B 5% Taxa de fluxo: 0,600 mL/min. Exemplo 1: Preparação de Compostos Preparação do Composto 1: 2-metil-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5- il)oxiciclo-hexil]-6,7-di-hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-amina 4-[(2-clorofuro[3, 2-d]pirimidin-4-il)amino]Jciclo-hexanol! (1-A) H 6 H & . O TOU o — HNH v no (1-A)
[00406] Em um frasco de fundo redondo equipado com um conden- sador, uma mistura de 4-aminociclo-hexan-1-ol (1,219 g, 10,58 mmol), 2, 4-diclorofuro[3,2-d]pirimidina (2,000 g, 10,58 mmol), Base de Hunig (2,735 g, 3,686 mL, 21,16 mmol) e iPrOH (26,38 mL) foi aquecida para 100 ºC por 16 h. O solvente foi removido, e o resíduo bruto foi dividido entre EtOAc e NH.CI aquoso saturado. As camadas foram separadas e a aquosa extraída mais com EtOAc (2x). Os orgânicos combinados foram secos (Na2SO;), filtrados e concentrados para dar um sólido la-
ranja. 'H RMN (CDCls) mostrou 4-[(2-clorofuro[3,2-d]pirimidin-4- iN)>amino]ciclo-hexano desejado (2,659 g, 9,932 mmol, 93,89%) junto com EtOAc residual. Seco sob vácuo de um dia para o outro e levado adiante como é. *H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 7,73 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,09 (s, 1H), 4,20 - 4,08 (m, 1H), 3,78 - 3,61 (m, 1H), 2,19 (d, J = 11,5 Hz, 2H), 2,05 (d, J = 10,8 Hz, 2H), 1,66 - 1,45 (m, 4H), 1,45 - 1,30 (m, 2H). ESI-MS m/z calc. 267,07745, encon- trado 268,15 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,56 minuto. 4-[(2-metilfuro[3, 2-d]pirimidin-4-il)amino]Jciclo-hexanol (1-B)
H
O EN aí Y os eo NL. Ox vol) NC o H (1-A) (1-B)
[00407] Em um tubo de micro-ondas seco ao forno sob N,, dissol- veu Composto 4 (1-A) em THF anidro (8,0 mL). Desgaseificada a rea- ção através de borbulhamento de N, através da solução por 5 minutos. Pd(PPh3)a adicionado (215,9 mg, 0,1868 mmol) e desgaseificado por mais dois minutos. Trimetilalumínio (2,107 g, 2,802 mL de 2 M, 5,603 mmol) foi adicionado cuidadosamente, e a mistura de reação foi aque- cida em um banho de 125º C de esferas de alumínio por 16 h. A mistu- ra de reação foi despejada cuidadosamente em NH,.CI aquoso satura- do. As camadas foram separadas, e a aquosa extraída mais com EtO- Ac (2x) e CH2Cl2 (2 x). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos (Na2SO;), filtrados e concentrados para um semissó- lido laranja. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel (12 g de coluna Isco gold, gradiente linear MeOH/CH2CI2 0 — 30%) para prover o produto desejado (180,75 mg, 0,/309 mmol, 78,27%). *H RMN 5 7,67 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,75 (d, Jy = 2,2 Hz, 1H), 4,91 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,15 (tdt, J = 12,2, 8,1, 4,0 Hz, 1H), 3,70 (ddd,
J = 14,7, 10,3, 4,1 Hz, 1H), 2,57 (s, 3H), 2,19 (d, y = 12,7 Hz, 2H), 2,11 - 1,98 (m, 2H), 1,67 (s, 1H), 1,52 (ddd, J = 23,4, 13,0, 3,4 Hz, 2H), 1,35 (ddd, J = 24,1, 12,9, 3,3 Hz, 2H). ESI-MS m/z calc. 247,13208, encon- trado 248,25 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,46 minuto. 4-[(2-metil-6, 7-di-hidrofuro[3, 2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclo-hexanol (1-C)
CEI SI on N on RN
O O Ho" Hoy (1-B) (1-C)
[00408] A um frasco contendo Pd(OH)2 (3,424 g, 4,877 mmol) foi adicionado Composto (1-B) (2,68 g, 9,754 mmol) em EtOH (270,9 mL) e HCI (11 mL de 2 M, 22,0 mmol). A mistura de reação resultante foi agitada sob H2 344,74 kPa (50 psi) no agitador Parr por 2h 10 min. À mistura de reação foi filtrada em celite e concentrada. O material foi carregado seco em Celite e purificado através de cromatografia de síli- ca-gel (coluna Isco gold 80 g, gradiente linear 0% hexanos — 30% MeOH/CH2CI?). Frações relevantes foram combinadas e concentradas para prover 4-[(2-metil-6,7-di-hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclo- hexanol (2,15 g, 8,624 mmol, 88,40%). *H RMN (400 MHz, MeOH-D4) 4,85 - 4,79 (t, J = 9,2 Hz, 2H), 4,24 - 4,12 (m, 1H), 3,63 - 3,51 (m, 1H), 3,42 (t, J = 9,2 Hz, 2H), 2,56 (s, 3H), 2,11 - 1,85 (m, 4H), 1,44 (da, J = 22,9, 10,4 Hz, 4H). ESI-MS m/z calc. 249,14772, encontrado 250,19 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,46 minuto. [4-[(2-metil-6, 7 -di-hidrofuro[3, 2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclo-hexil]l meta- nossulfonato (1-D)
N
N OX Yr o or RN o HNyH o O Hi o” Ho o=$—
O (1-C) (1-D)
[00409] A uma suspensão em temperatura ambiente de 4-[(2-metil- 6,7-di-hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclo-hexanol (2,15 g, 8,624 mmol) e Et3N (2,793 g, 3,847 mL, 27,60 mmol) em CH2Cl2 (223,6 mL) foi adicionado MsCI (1,087 g, 734,5 uL, 9,486 mmol). Agitação conti- nuada em temperatura ambiente por 30 min. A reação foi despejada em NaHCO; sat. As camadas foram separadas, e a fase aquosa foi extraída mais com CH2Cl2 (2 x 150 mL). Os orgânicos combinados fo- ram lavados com salmoura, secos (Na2SO3), filtrados e concentrados. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel (coluna Isco gold 120 g, gradiente linear 0% — 10% MeOH/CH2CI2). [4-[(2-metil-6,7-di-hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclo-hexil] meta- nossulfonato (2,3269 g, 7,107 mmol, 82,43%) foi obtido. *H RMN (300 MHz, CDCI3) 5 4,74 - 4,62 (m, 1H), 4,57 (t, J = 9,1 Hz, 2H), 4,34 (d J = 8,1 Hz, 1H), 4,11 - 3,95 (m, 1H), 3,18 (t, J = 9,0 Hz, 2H), 3,03 (s, 3H), 2,46 (s, 3H), 2,20 (d, J = 10,4 Hz, 4H), 1,78 (dd, J = 22,4, 10,3 Hz, 2H), 1,34 (dd, J = 22,4, 10,8 Hz, 2H). ESI-MS m/z calc. 327,12527, encon- trado 328,16 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,52 minuto. 2-metil-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]-6, 7-di- hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-amina 2a a | o fa) LON 25 | Ny NON 2 ————— TO
JS TO DE À “o om nº PV a o H (1-D) (1-F) 1)
[00410] Uma suspensão de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (17,4 mg, 0,07524 mmol, Composto (1-F): vide a preparação para Composto 7 abaixo), 4-[(2-metil-6,7-di-hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclo- hexil] metanossulfonato (49,3 mg, 0,1506 mmol) e Cs2CO;3 (73,6 mg, 0,2259 mmol) em dioxana anidra (1,0 mL) foi aquecida para 110º C por 72 h.
A mistura de reação foi despejada em H2O e extraída com CH2Ck.
Os orgânicos combinados foram secos (Na2SO;), filtrados e concentrados.
O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel (coluna I|sco gold 12 g, gradiente linear O — 10% MeOH/CH2CI2) para prover o produto desejado, embora ele contivesse impurezas residuais.
O material foi seco e purificado mais através de fase reversa Isco [coluna Aq C18 50 g; O — 50% CH3CN/H2O (modifi- cador de TFA)]. Frações relevantes foram combinadas e concentra- das.
O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 e passado através de um car- tucho Stratospheres SPE para prover 2-metil-N-[4-(7- morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]-6,7-di-hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4- amina (12,2 mg, 0,02374 mmol, 31,55%). *H RMN (400 MHz, CDCI3) 9,43 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,78 (s, 1H), 6,58 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 4,75 (s, 1H), 4,59 (t, J = 9,0 Hz, 2H), 4,52 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,24 - 4,11 (m, 1H), 3,94 - 3,83 (m, 4H), 3,42 - 3,31 (m, 4H), 3,19 (t, J = 9,0 Hz, 2H), 2,48 (s, 3H), 2,21 (d, J = 13,1 Hz, 2H), 1,99 (dd, J = 12,6, 3,6 Hz, 2H), 1,90 - 1,72 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 462.23795, encontrado 463,26 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,5 minuto.
Preparação do Composto 2: 5-[4-[(2-metil-6,7-di-hidrofuro[3,2- djpirimidin-4-il)amino]ciclo-hexóxi]-7-morfolino-quinazolino-4- carbonitrila
N NON EX re JO o (Un N o HO C HNy MA x ns TS es j 9 (1-D) (2-A) (2)
[00411] Uma suspensão de 5-hidróxi-7-morfolino-quinazolino-4- carbonitrila (31 mg, 0,1210 mmol, Composto (2-A): vide a Preparação do Composto 11 abaixo), [4-[(2-metil-6,7-di-hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4- iN)>amino]ciclo-hexil] metanossulfonato (80 mg, 0,2444 mmol) e Cs2CO3 (160 mg, 0,4911 mmol) em dioxana anidra (1,5 mL) foi aquecida para 115 ºC por 72 h. A mistura de reação foi filtrada em Celite, e o filtrado concentrado. O resíduo bruto foi dissolvido em mínimo em DMSO e purificado através de Isco de fase reversa [coluna C18 Aq 150 g; 0 — 50% CH3CN/H2O (modificador de TFA)]. Frações relevantes foram combinadas e concentradas. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 e passado por um cartucho Stratospheres SPE para prover o produto, a pureza total é apenas 75%. Repurificado através de Isco de fase nor- mal (coluna Isco gold 40 g, gradiente linear 0% — 10% MeOH/CH2CL) para obter 5-[4-[(2-metil-6,7-di-hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclo- hexóxil-7-morfolino-quinazolino-4-carbonitrila (3,1 mg, 0,005881 mmol, 4,861%) com 92,5% de pureza em peso. *H RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,08 (s, 1H), 6,83 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,84 (s, 1H), 4,64 (dd, J = 8,6, 4,2 Hz, 1H), 4,62 - 4,52 (m, 2H), 4,27 - 4,17 (m, 1H), 3,94 - 3,85 (m, 4H), 3,51 - 3,40 (m, 4H), 3,18 (t, J = 9,1 Hz, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,33 - 2,22 (m, 2H), 2,07 - 1,86 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 487,2332, encontrado 488,34 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,63 minu- to.
Preparação do Composto 3: 2-metil-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5- il)oxiciclo-hexil]pirimidin-4-amina
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[00412] Uma suspensão de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (Ácido Triflu- oracético (1)) (68,78 mg, 0,1992 mmol), [4-[(2-metilpirimidin-4- iNamino]ciclo-hexil] metanossulfonato (142,1 mg, 0,4980 mmol) e Cs20O;3 (324,5 mg, 0,9960 mmol) em dioxana anidra (3,3 mL) foi aquecida para 110º C por 23 h. A mistura de reação foi despejada em H2O e extraída com CH2Cl2. Os orgânicos combinados foram secos (Na2SO:), filtrados e concentrados. O resíduo bruto foi purificado atra- vés de cromatografia de sílica-gel (coluna Isco gold 40 g, gradiente linear O — 100% CH2Cl2 a 20% MeOH/CH2Cl2) para prover o produto (11,5 mg, 0,02653 mmol, 13,32%). *H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 9,45 (s, 1H), 9,12 (s, 1H), 8,12 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,86 - 6,77 (m, 1H), 6,60 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,79 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 4,02 - 3,80 (m, 5H), 3,48 - 3,30 (m, 4H), 2,52 (s, 3H), 2,32 - 2,20 (m, 2H), 2,07 - 1,95 (m, 2H), 1,94 - 1,76 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 420,2274, encontrado 421,42 (M+1)+; Tempo de re- tenção: 0,55 minuto. Preparação do Composto 4: 5-[4-[(2-metilpirimidin-4- il)amino]ciclo-hexóxi]-7-morfolino-quinazolino-4-carbonitrila JL no TA, RA TO, NA e LON N - Ho C H MA Av
SN J Oo Cc N N Fe As E Ss, do (2-A) (4)
[00413] Uma suspensão de B5-hidróxi-7-morfolino-quinazolino-4- carbonitrila (sal de ácido trifluoracético) (95,42 mg, 0,2577 mmol), [4- [(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclo-hexil] metanossulfonato (220,6 mg, 0,7731 mmol) e Cs2C0O;3 (420 mg, 1,289 mmol) em DMF anidro (2,6 mL) foi aquecida para 80º C por 112 h. A mistura de reação foi filtrada em uma frita de vidro, enxaguando com CH2Cl2. O filtrado foi evapora- do, e o resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica- gel (coluna Isco gold 40 g, gradiente linear O — 100% CH2Cl2 a 20% MeOH/CH2Cl2) para prover o produto (41,8 mg, 0,09101 mmol, 35,32%). *H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,08 (s, 1H), 8,06 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,71 - 6,63 (m, 1H), 6,14 (d J = 6,0 Hz, 1H), 4,93 (s, 1H), 4,85 (s, 1H), 4,06 - 3,79 (m, 5H), 3,49 (s, 3H), 3,48 - 3,40 (m, 4H), 2,49 (s, 3H), 2,34 - 2,21 (m, 2H), 2,13 - 1,85 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 445,22263, encontrado 446,35 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,61 minuto.
Preparação do Composto 5: N-[4-(4-meto-7-morfolino-quinazolin- S-il)oxiciclo-hexil]-2-metil-6,7-di-hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-amina
N NON LI EN + SS A) DR N o o NsÃo do "O " O, NEN É ) ç O ON N o=8 o) o 6)
[00414] Uma suspensão de 4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-5-ol (Ácido Trifluoracético (1)) (73,78 mg, 0,1966 mmol), [4-[(2-metil-6,7-di- hidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclo-hexil] metanossulfonato (161 mg, 0,4918 mmol) e Cs2CO;3 (321 mg, 0,9852 mmol) em DMF anidro (1,3 mL) foi aquecida para 90 ºC por 24 h. A mistura de reação foi fil- trada em um chumaço de algodão, enxaguando com CH2Cl2. O filtrado foi evaporado, o resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel (coluna Isco gold 40 g, gradiente linear O — 100% CH2CI2 a 20% MeOH/CH2CI2) para prover o produto (39,9 mg, 0,07938 mmol, 40,38%). *H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,58 (s, 1H), 6,80 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,68 (s, 1H), 4,58 (t, J = 9,1 Hz, 2H), 4,46 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,13 (s, 3H), 3,93 - 3,82 (m, 4H), 3,38 - 3,27 (m, 4H), 3,19 (t, J = 9,1 Hz, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,25 - 2,13 (m, 2H), 1,99 - 1,74 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 492,2485, encontrado 493,34 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,58 minuto. Preparação do Composto 6: N-[4-(4-metóxi-7-morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]-2-metil-pirimidin-4-amina
H Ú. ve To LA qo o Oo Na o o Õ OA — O 4 “OO As os De do (43-F) 6
[00415] Uma suspensão de 4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-5-ol (Ácido —Trifluoracético (1)) (73,78 mg, 0,1966 mmol), [4-[(2- metilpirimidin-4-il)amino]ciclo-hexil] metanossulfonato (140 mg, 0,4906 mmol) e Cs2CO;3 (330 mg, 1,013 mmol) em DMF anidro (1,3 mL) foi aquecida para 90 ºC por 24 h. A mistura de reação foi filtrada em um chumaço de algodão, enxaguando com CH2Cl2. O filtrado foi evapora- do, e o resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica- gel (coluna Isco gold 40 g, gradiente linear O — 100% CH2Cl2 a 20% MeOH/CH2Cl2) para prover o produto (20,3 mg, 0,04416 mmol, 22,46%). *H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,58 (s, 1H), 8,12 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,17 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,86 (s, 1H), 4,69 (s, 1H), 4,12 (s, 3H), 3,94 - 3,84 (m, 4H), 3,70 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 3,41 - 3,25 (m, 4H), 2,49 (s, 3H), 2,21 (d, J = 11,0 Hz, 2H), 1,98 - 1,73 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 450,23795,
encontrado 451,35 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,57 minuto. Preparação do Composto 7 4-[5-[(4- metoxifenil)]metóxilquinazolin-7-ilJmorfolina Preparação do Composto (1-F): 7-morfolinoquinazolin-5-ol
O
N N TA Cs) ço
PA E. o (6) (1-F)
[00416] A uma solução de 4-[5-[(4-metoxifenil)metóxilquinazolin-7- illmorfolina (1,38 9, 3,927 mmol) em CH2Cl> (40 mL) foi adicionado TFA (12,36 g, 8,351 mL, 108,4 mmol). A mistura vermelho-laranja es- cura resultante foi agitada a 50º C por 4 h, então temperatura ambiente de um dia para o outro. O solvente foi evaporado sob aquecimento su- ave/corrente de N>. O resíduo bruto foi levado diretamente para a eta- pa seguinte. M+ 1: 232,32. Tempo de retenção 0,5. Preparação de [4-(1, 3-dioxoisoindolin-2-il)ciclo-hexil] metanossulfonato o Oo
H CO OO. O o O (7-A) (7-B)
[00417] Uma suspensão a 0 C de 2-(4-hidroxiciclo- hexil)isoindolino-1,3-diona (1,0 g, 4,077 mmol) em Et3N (1,238 g, 1,705 mL, 12,23 mmol) e CH2Cl2 (6,683 mL) foi tratada com MsCI (607,1 mg, 410,2 ul, 5,800 mmol) (exotérmico, aquecimento rxn — posto em banho de água em temperatura ambiente). Agitação continuada enquanto aquecimento para RT de um dia para o outro. A reação foi diluída com EtOAc e despejada em H2O. As camadas foram separadas, e a fase aquosa foi extraída mais com EtOAc (2 x 50 mL). Os orgânicos combi-
nados foram lavados com salmoura, secos (Na2SO), filtrados e con- centrados para um sólido branco fofo. *H RMN mostra produto deseja- do limpo, nenhuma purificação requerida, pesos do produto 1,277 9. Preparação do Composto 7: 2-[4-(7-morfolinoquinazolin-5S-il)oxiciclo- hexillisoindolino-1,3-diona o TA n NE N OGRO MOD q o À p CX (7-A) (1-F) Oo (7)
[00418] “Uma suspensão de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (Ácido Triflu- oracético (1)) (324,7 mg, 0,9405 mmol), [4-(1,3-dioxoisoindolin-2- il)ciclo-hexill metanossulfonato (760,2 mg, 2,351 mmol) e Cs2CO;z (1,535 g, 4,712 mmol) em DMF anidro (5,705 mL) foi aquecida para 90º C por 24 h. A mistura de reação foi filtrada em um tampão de Celi- te, enxaguando com CH2ClI2. O filtrado foi evaporado, e o resíduo bruto foi carregado seco em Celite e purificado através de cromatografia de sílica-gel (coluna Isco gold 40 g, 0,4414 mmol, 46,93%) como um sóli- do castanho. *H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,80 (d, J = 0,6 Hz, 1H), 9,15 (s, 1H), 7,89 - 7,78 (m, 2H), 7,78 - 7,65 (m, 2H), 6,80 (dd, J = 2,3, 0,6 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,86 (s, 1H), 4,30 (tt, J = 12,5, 4,1 Hz, 1H), 3,96 - 3,82 (m, 4H), 3,47 - 3,30 (m, 4H), 2,83 (qd, J= 12,8, 3,4 Hz, 2H), 2,35 (d, J = 15,0 Hz, 2H), 1,84 - 1,62 (m, 4H). ESI- MS m/z calc. 458,1954, encontrado 459,31 (M+1)+; Tempo de reten- ção: 0,66 minuto. Preparação do Composto 8: N-metil-2-[[4-(7-morfolinoquinazolin- S-il)oxiciclo-hexilJamino]pirimidina-4-carboxamida Preparação de 4-(7-morfolinoquinazolin-S5-il)oxiciclo-hexanamina: Composto (8-A)
o O A lo so —— Ss Do. ? é o o H (7) (8-A)
[00419] A uma solução agitada de 2-[4-(7-morfolinoquinazolin-5- il)oxiciclo-hexillisoindolino-1,3-diona (1,477 g, 3,221 mmol) em MeOH (110 mL) foi adicionada hidrazina (2,0 mL, 63,72 mmol). A reação re- sultante foi selada e agitada em temperatura ambiente por 20 h. A mis- tura de reação foi concentrada. Ao resíduo bruto foi adicionado CH2CI2 e a suspensão foi filtrada em uma frita de vidro de porosidade média (sólido foi enxaguado várias vezes com CH2Cl> e coletado no mesmo frasco). O filtrado foi concentrado para prover 4-(7-morfolinoquinazolin- B-il)oxiciclo-hexanamina (1,0133 g, 3,085 mmol, 95,78%). A batelada inteira foi seca sob vácuo a 50º C por 4 dias. 4-(7-morfolinoquinazolin- 5-il)oxiciclo-hexanamina (1,0133 g, 3,085 mmol, 95,78%) foi obtida. *H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,47 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 6,86 - 6,72 (m, 1H), 6,58 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 4,72 (s, 1H), 4,02 - 3,83 (m, 4H), 3,47 - 3,29 (m, 4H), 2,95 - 2,79 (m, 1H), 2,21 (d, J = 14,0 Hz, 2H), 1,90 - 1,69 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 328,1899, encontrado 0,52 (M+1)+; Tempo de retenção: 329,39 minutos. Preparação de N-metil-2-[[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo- hexillamino]pirimidina-4-carboxamida (Composto 8)
a O) Ps aos EEENDD OS " Ho o
H H O (8-A) (8)
[00420] Uma mistura de A4-(7-morfolinoquinazolin-S-il)oxíciclo- hexanamina (33,2 mg, 0,09503 mmol), 2-cloro-N-metil-pirimidina-4- carboxamida (18,8 mg, 0,1096 mmol) e Na2CO;z (190 ul de 2 M, 0,3800 mmol) em água (156 uL) foi aquecida para refluxo (100 ºC) em um tubo de micro-ondas selado. A mistura resultante foi deixada agitar de um dia para o outro. A suspensão bruta foi esfriada, congelada e seca no liofilizador. O resíduo foi carregado seco em celite e purificado através de I|sco de fase reversa [coluna C18 Aq 150 g; O — 50% CH3CN/H2O (modificador de TFA)]. Frações relevantes foram combi- nadas e concentradas. A amostra foi dissolvida em CH2Cl2 mínimo e passada por um cartucho Stratospheres PL-HCO3 MP Resin. O filtra- do foi concentrado e seco a vácuo para prover N-metil-2-[[4-(7- morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexilJamino]pirimidina-4-carboxamida (32,4 mg, 0,06920 mmol, 72,82%). *H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 9,45 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,49 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,79 (d, Jy = 2,2 Hz, 1H), 6,59 (d J = 2,2 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,86 - 4,70 (m, 1H), 4,15 - 3,96 (m, 1H), 3,96 - 3,78 (m, 4H), 3,49 - 3,33 (m, 4H), 3,00 (d, J = 5,2 Hz, 3H), 2,32 - 2,14 (m, 2H), 2,10 - 1,96 (m, 2H), 1,96 - 1,74 (m, 4H). ESI- MS m/z calc. 463,2332, encontrado 464,35 (M+1)+; Tempo de reten- ção: 0,58 minuto. Preparação do Composto (9): 2-[[4-(4-metóxi-7-morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexilJamino]-N-metil-pirimidina-4- carboxamida Preparação de 4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-5-01: Composto (9-A)
O N N A OM
É HA o (53) (9-A)
[00421] A uma solução de 4-[4-metóxi-5-[(4- metoxifenil)metóxilquinazolin-7-il]morfolina (100 mg, 0,2622 mmol) em CH2Cl2 (2,667 mL) foi adicionado TFA (1,794 g, 1,212 mL, 15,73 mmol). A reação foi selada e aquecida termicamente para 50º C por 16 h. O solvente foi removido sob corrente de N2/aquecimento suave. O resíduo bruto foi diretamente levado para a reação seguinte. Massa + 1: 262,34. Tempo de Retenção: 0,55. Preparação de [4-(terc-butoxicarbonilamino)ciclo-hexil] metanossulfo- nato: Composto (9-B) X as mio o TH — º Q % 6 nº es
[00422] Auma solução de N-(4-hidroxiciclo-hexil)carbamato de terc- butila (8,2 g, 38,09 mmol) em DCM (100 mL) foram adicionados DIEA (14 mL, 80,38 mmol) e MsCI (3,2 mL, 41,34 mmol). A mistura foi agita- da por 0,5 h e diluída com DCM, lavada com H2O, seca em Na2SO:, filtrada em uma camada de almofada de sílica-gel, concentrada. Re- cuperado sólido esbranquiçado. *H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 4,64 (tt, J = 10,8, 4,1 Hz, 1H), 4,40 (s, 1H), 3,48 (s, 1H), 3,02 (s, 3H), 2,25 1,99 (m, 4H), 1,80-1,59 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,36-1,13 (m, 2H).
Preparação de N-[4-(4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-S-il)oxiciclo- hexillcarbamato de terc-butila: Composto (9-C) x De o "não O N TO ZH Am NO O
O WT O % o” nO oo To (se) (9-A) + (e)
[00423] Uma suspensão de 4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-5-ol (Ácido —Trifluoracético(1)) (984 mg, 0,2622 mmol), [4-(terc- butoxicarbonilamino)ciclo-hexil]l metanossulfonato (154 mg, 0,5249 mmol) e Cs2CO;3 (427 mg, 1,311 mmol) em DMF anidro (1,75 mL) foi aquecida para 90º C por 24 h. A mistura de reação foi filtrada em um chumaço de algodão, enxaguando com CH2Cl2. O filtrado foi evapora- do, o resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel (coluna Isco gold 40 g, gradiente linear O — 20% MeOH/CH2Cl2) para prover N-[4-(4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclo- hexil|carbamato de terc-butila. O material bruto foi levado adiante para desproteção Boc como é. ESI-MS m/z calc. 458,25293, encontrado 459,45 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,67 minuto. Preparação de 4-(4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-S5-il)oxiciclo- hexanamina: Composto (9-F) q Ls Fm o OO Ls AN o NNW TO 7 O “% + ' (9-0) ' R ' (9-F)
[00424] A uma solução de N-[4-(4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-5-
il)oxiciclo-hexil|carbamato de terc-butila (120,2 mg, 0,2622 mmol) em CH2Cl2 (2,622 mL) foi adicionado TFA (896,9 mg, 606,0 uL, 7,866 mmol). A solução resultante foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. A mistura de reação foi concentrada, e o resí- duo bruto foi purificado através de Isco de fase reversa [coluna C18 Aq 50 g; O — 40% CH3CN/H2O (modificador de TFA)]. Frações relevantes foram combinadas, concentradas e secas por azeótropo de tolueno (2X) e vácuo para prover 4-(4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-5- i)oxiciclo-hexanamina (Ácido Trifluoracético(1)) (50 mg, 0,1058 mmol, 40,36%) (Rendimento em 3 etapas). ESI-MS m/z calc. 358,2005, en- contrado 359,36 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,53 minuto. Preparação de 2-[[4-(4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-9-il)oxiciclo- hexillamino]-N-metil-pirimidina-4-carboxamida: Composto (9)
O N N
CA q TO ts AN ÂN 7 HO O RR Si O ” NÓ CI Ho J O O Pe nO R NÓ ON HQ |
H A (9-F) HAN (9) Preparação do Composto (10): N-[4-(2-metil-7-morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexil|carbamato de terc-butila Dx Dx OH
LOZADA MeO N MeO N N Br A O a ON A 0) 0 BocHN ce O. mma o co
ON A o)
Reagentes e condições: (a) morfolina, DIEA, iPrOH; (b) TFA, DCM; (c) [4-(terc-butoxicarbonilamino)ciclo-hexill — metanossulfonato, — CsCO;,
DMF Etapa a
[00425] Uma mistura de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)netóxil-2-metil- quinazolina (80 mg, 0,22 mmol), morfolina (23 mg, 0,27 mmol), carbo- nato de césio (145 mg, 0,45 mmol), Pd(OAc)2 (5,0 mg, 0,023 mmol) e rac-BINAP (28 mg, 0,045 mmol) em 1,4-dioxana (2 mL) foi borbulhada com N,, e agitada a 90 ºC por 1 h. A mistura de reação foi diluída com DCM, filtrada em uma camada de Celite, evaporada. O bruto foi purifi- cado através de cromatografia de sílica-gel eluindo com um gradiente de 0-5 % MeOH/DCM. Isso proveu 4-[5-[(4-metoxifenil)netóxi]l-2-metil- quinazolin-7-il]morfolina (50 mg, 61%). ESI-MS m/z calc. 365,1, encon- trado 366,14 (M+1) *; Tempo de retenção: 0,58 minuto. Etapa b
[00426] A uma solução de 4-[5-[(4-metoxifenil)netóxil-2-metil- quinazolin-7-illmorfolina (180 mg, 0,49 mmol) em DCM (10 mL) foi adi- cionado TFA (ImL, 12,9 mmol) e a reação resultante foi agitada em temperatura ambiente por 1h. A mistura foi concentrada in vacuo. O bruto foi purificado através de cartucho de sílica-gel de 12 g eluindo com um gradiente de 0-4% de MeOH/DCM e proveu 2-metil-7- morfolino-quinazolin-5-ol (85 mg, 70%). *H RMN (400 MHz, CDCI3) à 9,37 (s, 1H), 6,67 (d, J= 2,1 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 3,82 (dd, J = 5,8, 4,0 Hz, 4H), 3,35 - 3,23 (m, 4H), 2,80 (s, 3H). Etapa c
[00427] A uma mistura de 2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-ol (30 mg, 0,12 mmol), carbonato de césio (200 mg, 0,62 mmol) em DMF (1 mL) a 70 ºC foi adicionado [4-(terc-butoxicarbonilamino)ciclo-hexil] me- tanossulfonato (100 mg, 0,34 mmol). A mistura de reação resultante foi agitada por 1 h a 70 ºC. À mistura foi adicionada uma outra porção de
[4-(terc-butoxicarbonilamino)-ciclo-hexil] metanossulfonato (100 mg, 0,34 mmol) e agitação foi continuada a 70 ºC por 18 h. A mistura foi diluída com DCM, filtrada em uma camada de Celite, concentrada in vacuo. O bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel elu- indo com um gradiente de 0-10% de MeOH/DCM e recuperado N-[4- (2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclo-hexil|carbamato de terc- butila (2,0 mg, 3,6%) (Composto 10). *H RMN (400 MHz, Clorofórmio- d) 5 9,32 (s, 1H), 6,80 (s, 1H), 6,50 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,71 (s, 1H), 4,56 (s, 1H), 3,89 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,63 (s, 1H), 3,42 (t J = 4,9 Hz, 4H), 2,84 (s, 3H), 2,17 (d, J = 13,4 Hz, 2H), 1,97 - 1,60 (m, 6H), 1,47 (s, 9H). ESI-MS m/z calc. 442,26, encontrado 443,2 (M+1) *; Tempo de retenção: 0,6 minuto.
Preparação do Composto 11: N-metil-2-[[4-[(7-morfolino-4-0x0-3H- quinazolin-5-il)óxilciclo-hexilJamino]pirimidina-4-carboxamida Preparação de S5-hidróxi-7-morfolino-quinazolino-4-carbonitrila (Com- posto (2-A)) ço ETs
N 2º (55) (2-A)
[00428] A uma solução de 5-[(4-metoxifenil)]metóxil-7-morfolino- quinazolino-4-carbonitrila (160 mg, 0,4251 mmol) em CH2Cl2 (4,25 mL) foi adicionado TFA (1,800 g, 1,216 mL, 15,79 mmol) (a solução passou de amarelo para vermelho). A mistura de reação foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente, depois do que LCMS mostra apenas um pico maior correspondendo a [M+1] do produto desejado. O solvente foi removido sob aquecimento suave/corrente de Na e o resíduo bruto foi carregado diretamente para a etapa seguinte sem manipulação adicional. ESI-MS m/z calc. 256,09604, encontrado 257,3 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,62 minuto. Preparação de N-[4-(4-ciano-7-morfolino-quinazolin-S-il)oxiciclo- hexillcarbamato de terc-butila (Composto (11-A))
O x Ls AN ão SS HN So Lo AN y ço O
RN N Q oO Cc NT oo" "> Ã oo À + (2-A) (11-A)
[00429] Uma suspensão de 5-hidróxi-7-morfolino-quinazolino-4- carbonitrila (Ácido Trifluoracético (1)) (157,4 mg, 0,4251 mmol), [4- (terc-butoxicarbonilamino)ciclo-hexil] metanossulfonato (312 mg, 1,063 mmol) e Cs2CO;3 (694 mg, 2,130 mmol) em DMF anidro (2,75 mL) foi aquecida para 90º C por 24 h. A mistura de reação foi filtrada a vácuo em um tampão de celite, enxaguando com CH2Cl2. O filtrado foi evapo- rado, e o resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de síli- ca-gel (coluna Isco gold de 40 g, gradiente linear de O — 100% de CH2Cl2 a 20% de MeOH/CH2CI2) para prover CaaH31N5O4 (192,8 mg, 0,4251 mmol, 100,0%). Esse material bruto foi carregado para a frente para a etapa seguinte. ESI-MS m/z calc. 453,2376, encontrado 454,41 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,83 minuto. Preparação de 5-(4-aminociclo-hexóóxi)-7-morfolino-quinazolino-4- carbonitrila (Composto (11-B))
o HO C É 7 So x o ço "nº
T (11-A) mm.
[00430] A uma solução de N-[4-(4-ciano-7-morfolino-quinazolin-5- il)oxiciclo-hexil|carbamato de terc-butila (192,8 mg, 0,4251 mmol) em CH2Cl2 (10 mL) foi adicionado TFA (1,454 g, 982,4 ul, 12,75 mmol). À solução resultante foi agitada em temperatura ambiente por 4 h. A mis- tura de reação foi concentrada e o resíduo bruto foi purificado através de Isco de fase reversa [coluna C18 Aq de 50 g: O — 40% CH3CN/H20 (modificador de TFA)]. As frações relevantes foram combinadas, con- centradas e secas através de azeótropo de tolueno (2x) e vácuo para prover — 5-(4-aminociclo-hexóxi)-7-morfolino-quinazolino-4-carbonitrila (Ácido Trifluoracético (1)) (47,8 mg, 0,1023 mmol, 24,06%) (Rendimen- to em 3 etapas). ESI-MS m/z calc. 353,18518, encontrado 354,41 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,57 minuto. Preparação de —N-metil-2-[[4-[(7-morfolino-4-0x0-3H-quinazolin-5- iDóxilciclo-hexilJamino]pirimidina-4-carboxamida (Composto (11))
O
N N Qo 2 o o —N Y SN CI so c o * (11-A) BN A)
[00431] Uma mistura de B5-(4-aminociclo-hexóóxi)-7-morfolino- quinazolino-4-carbonitrila (Ácido Trifluoracético (1)) (47,8 mg, 0,1023 mmol), 2-cloro-N-metil-pirimidina-4-carboxamida (23 mg, 0,1340 mmol) e Na2CO; (256,2 ul de 2 M, 0,5124 mmol) em água (506,7 uL) foi aquecida para 110 ºC em um tubo de micro-ondas selado e agitada por 16 h.
LC mostrou conversão para um pico maior, embora ela cor- responda a [M+1] 480,42. Pareceu que N-metil-2-[[4-[(7-morfolino-4- oxo-3H-quinazolin-5-il)óxilciclo-hexilJamino]pirimidina-4-carboxamida (ou seu tautômero) foi formada durante a reação.
A suspensão bruta foi esfriada para temperatura ambiente.
Para auxiliar na dissolução, MeOH/H20 1:1 (-1 mL) e —-6-8 gotas de TFA foram adicionados.
A so- lução resultante foi diretamente carregada na Isco de fase reversa [co- luna C18 Aq de 50 g; O — 50% CH;CN/H2O (Modificador de TFA)]. Frações correspondendo a produto [M+1] 480,42 foram coletadas e concentradas sob pressão reduzida.
A amostra foi dissolvida em CH2CIl/MeOH 1:1 mínimo e passada através de um cartucho Stratos- pheres PL-HCO3 MP Resin.
O filtrado foi concentrado, deixando para trás uma película sólida branca. *H RMN (CDCl2) do material estava de acordo com N-metil-2-[[4-[(7-morfolino-4-0x0-3H-quinazolin-5- iN)óxilciclo-hexilJamino]pirimidina-4-carboxamida (ou seu tautômero). 1H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,46 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,87 (dd, J = 5,4, 4,5 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,70 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,76 - 5,31 (m, 1H), 4,72 (s, 1H), 3,99 (dt, J = 8,1, 4,0 Hz, 1H), 3,92 - 3,74 (m, 4H), 3,42 - 3,22 (m, 4H), 2,98 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,32 - 2,12 (m, 2H), 2,12 - 1,84 (m, 4H), 1,77 (td, J = 13,2, 11,9, 3,2 Hz, 2H). ESI-MS m/z calc. 479,2281, encontra- do 480,33 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,57 minutos.
Preparação do Composto 12: 2-metil-N-[4-(2-metil-7-morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]-pirimidin-4-amina
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AO OO o o Reagentes e condições: (a) acetamidina (HCl), KCO3 e MS 4A, buti- ronitrila, 130ºC, 22h, (b) NaH, PMB-OH, DMF; (c) TFA, DCM; (d) 2-(4- hidroxiciclo-hexil)isoindolino-1,3-diona, PPh3, DIAD, THF; (e) morfolina, Pd(OAc)2, rac-BINAP, CsCO;s, dioxana; (f) NHANH2, MeOH; (g) 4-cloro- 2-metil-pirimidina, t-butilxPhospalladceycle, NaOtBu, tBuOH. Etapa a
[00432] Uma mistura de 4-bromo-2,6-difluor-benzaldeído (4 9, 18,Immol), acetamidina (Ácido Clorídrico (1)) (24 g, 25,4 mmol), K2CO; (3,5 g, 25 mmol) e MS 4A (2,8 g, pó) em butironitrila (20,00 mL) foi agitada a 130 ºC por 20 h. Depois de esfriar para a temperatura ambiente, a mistura foi diluída com EtOAc (20 mL), filtrada em uma camada de celite, concentrada sob vácuo. O bruto foi purificado a par- tir de cartucho de sílica-gel 120 g eluindo com um gradiente de 0-30% EtOAc/heptano. Isso provê 7-bromo-5-flúor-2-metil-quinazolina (1,359, 31%). *H RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,47 (s, 1H), 7,89 (dt, J = 1,9, 1,0 Hz, 1H), 7,31 (dd, J = 8,7, 1,6 Hz, 1H), 2,84 (s, 3H). Etapa b
[00433] A uma solução de (4-metoxifenil)metanol (886 mg, 0,8 mL, 6,4 mmol) em DMF (20,00 mL) foi adicionado NaH (260 mg, 6,4 mmol), e a mistura resultante foi agitada por 30 min. À mistura foi adicionada 7-bromo-5-flúor-2-metil-quinazolina (800 mg, 3,3 mmol), e agitação foi continuada por 1 h. A mistura de reação foi diluída com EtOAc, lavada com H2O, seca em Na2SO;,, concentrada. O bruto foi purificado a partir de cartucho de sílica-gel de 40 g eluindo com um gradiente 0-60% de EtOAc/heptano. Isso provê 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metóxi]-2-metil- quinazolina (900 mg, 75,5%). *H RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,58 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 7,74 --7,65 (m, 1H), 7,43 - 7,37 (m, 2H), 7,06 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,99 - 6,92 (m, 2H), 5,17 (s, 2H), 3,85 (s, 3H), 2,86 (s, 3H). Etapa c
[00434] A uma solução de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)netóxil-2- metil-quinazolina (1,2 g, 3,3 mmol) em DCM (10 mL) foi adicionado TFA (2,0 mL, 26 mmol), e a mistura de reação resultante foi agitada por 30 min. A mistura de reação foi concentrada e purificada a partir de cartucho de sílica-gel de 40 g eluindo com um gradiente 0-100% de EtOAc/heptano para prover 7-bromo-2-metil-quinazolin-5-o0l (450 mg, 56%). *H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,60 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 7,56 (dt, J = 1,8, 0,9 Hz, 1H), 7,01 (t, J = 1,3 Hz, 1H), 2,83 (d, J= 0.9 Hz, 3H). Etapa d
[00435] A uma solução de 7-bromo-2-metil-quinazolin-5-ol (200 mg, 0,83 mmol), 2-(4-hidroxiciclo-hexil)isoindolino-1,3-diona (210 mg, 0,85 mmol) e PPh3 (330 mg,1,25 mmol) em THF (10 mL) foi lentamente adicionado DIAD (253 mg, 250 uL, 1,25 mmol). A mistura de reação resultante foi agitada por 1 h. A mistura foi concentrada sob vácuo, pu- rificada a partir de cartucho de sílica-gel de 12 g eluindo com um gra- diente de 0-70% de EtOAc/heptano para prover 2-[4-(7-bromo-2-metil- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexillisoindolino-1,3-diona (280 mg, 71%). *H
RMN (400 MHz, CDCI3) 5 10,01 (t, J= 1,1 Hz, 1H), 7,91 - 7,80 (m, 2H), 7,75-7,68 (m, 2H), 7,03 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,36 (s, 2H), 5,06 -4,93 (m, 2H), 4,33 (tt, J = 12,5, 4,2 Hz, 1H), 2,94-2,84 (m, 2H), 2,83-2,78 (m, 2H), 2,37 (s, 3H), 1,87-1,7 (m, 4H). Etapa e
[00436] Uma mistura de 2-[4-(7-bromo-2-metil-quinazolin-5- il)oxiciclo-hexillisoindolino-1,3-diona (280 mg, 0,60 mmol), morfolina (100 ul, 1,1 mmol), carbonato de césio (400 mg, 1,2 mmol), rac- BINAP (40 mg, 0,06 mmol) e PdOAc>z (7 mg, 0,03 mmol) em dioxana (5 mL) foi borbulhada com N>2 por 5 min. A mistura de reação foi selada e agitada de um dia para o outro a 100º C. Após esfriar para temperatura ambiente, a mistura foi diluída com DCM, filtrada em uma camada de Celite e concentrada. O bruto foi purificado a partir de cromatografia de sílica-gel com um gradiente de 0-3% de MeOH/DCM para prover 2-[4- (2-metil-7 -morfolino-quinazolin-S5-il)oxiciclo-hexillisoindolino-1,3-diona (125 mg, 44%). *H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,7 (s, 1H), 7,88 - 7,75 (m, 2H), 7,72-7,65 (m, 2H), 6,8 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,55 (s, 2H), 5,03 - 4,83 (m, 1H), 4,35-4,25 (m, 1H), 3,92-3,83 (m, 4H), 3,42-3,31 (m, 4H), 2,7-2,9 (m, 2H), 2,45-2,3 (m, 2H), 2,37 (s, 3H), 1,80 (m, 4H). Etapa f
[00437] A uma solução de 2-[4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5- il)oxiciclo-hexillisoindolino-1,3-diona (120 mg, 0,25 mmol) em MeOH (5 mL) foi adicionada hidrazina (Água (1)) (250 mg, 280 ul, 5 mmol), e a mistura de reação resultante foi agitada a 70º C por 1 h. A mistura de reação foi esfriada para temperatura ambiente, concentrada in vacuo e purificada a partir de cromatografia de sílica-gel (cartucho de 12 g) elu- indo com um gradiente de 0-10% (NH3 7M em MeOH/DCM). Isso pro- veu 4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-S5-il)oxiciclo-hexanamina (66 mg, 76%). *H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,39 (d, J = 0,6 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,51 (d, J = 2,1, 1H), 4,72 — 4,60 (m, 1H), 3,94 — 3,81
(m, 4H), 3,43 — 3,30 (m, 4H), 2,80 (s, 3H), 2,26 — 2,12 (m, 2H), 1,86- 1,54 (m, 6H). Etapa q
[00438] A uma mistura de 4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5- iN)oxiciclo-hexanamina (66 mg, 0,19 mmol), 4-cloro-2-metil-pirimidina (42 mg, 0,32 mmol), t-butilxPhos palladycycle (13 mg, 0,02 mmol) em t-BuOH (2 mL) foi adicionado terc-butóxido de sódio (200 ul de uma solução 2 M em THF, 0,4 mmol) e agitado de um dia para o outro em temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com DCM, filtra- da em camada de Celite, concentrada. O bruto foi purificado a partir de cromatografia de sílica-gel (cartucho de 49) eluindo com um gradiente de 0-6% de MeOH/DCM e proveu 2-metil-N-[4-(2-metil-7-morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]-pirimidin-4-amina ( 20,9 mg, 23,7%). *H- RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,27 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,44 (d, JU = 2,1 Hz, 1H), 6,19 - 6,05 (m, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,66 (s, 1H), 3,80 (t, J = 4,9 Hz, 5H), 3,29 (dd, J = 6,8, 3,1 Hz, 4H), 2,71 (d, J = 1,9 Hz, 3H), 2,43 (d, J = 1,8 Hz, 4H), 2,14 (d, J = 13,8 Hz, 2H), 2,01 - 1,68 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 434,24, en- contrado 435,28 (M+1) *; Tempo de retenção: 0,50 minutos. Preparação do Composto 13: N-metil-2-[[4-(4-metil-7-morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexilJamino]pirimidina-4-carboxamida o o O s O "s o EC o O
Q O (54) (13-A)
Preparação de 4-[5-[(4-metoxifenil) metóxil-4-metil-quinazolin-7- illmorfolina ( Composto (13-A))
[00439] — 4-[4-Cloro-5-[(4-metoxifenil)metóxilquinazolin-7-il]|morfolina (100 mg, 0,2592 mmol) foi dissolvida em THF (1,3 mL) sob N.> e esfria- da para O ºC. PdCl2(dppf)-CH2Cl2 (10,6 mg, 0,01298 mmol) foi adicio- nado, seguido por MeMgBr (110 uL de solução 3 M em éter de dietila, 0,3300 mmol) em gotas. O banho gelado foi removido, e a mistura de reação resultante foi agitada em temperatura ambiente sob N2 de um dia para o outro. Essa etapa foi repetida em escala maior, nesse mo- mento usando 2-2,5 equivalentes de MeMgBr. Os produtos das duas bateladas foram combinados e despejados em H2O. As camadas fo- ram separadas, e a aquosa extraída mais com CH2Cl2 (2 x 20 mL). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos (Na2SO:), filtrados e concentrados para um sólido laranja-amarelo brilhante. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel (co- luna Isco gold de 40 g, gradiente linear de O — 10% de MeOH/CH2CI2) para prover 4-[5-[(4-metoxifenil)mnetóxi]-4-metil-quinazolin-7-il]morfolina (245,0 mg, 0,6705 mmol, 43,12%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 8,85 (s, 1H), 7,46 - 7,35 (m, 2H), 7,01 - 6,92 (m, 2H), 6,84 (d, J= 2,4 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,12 (s, 2H), 3,93 - 3,86 (m, 4H), 3,84 (s, 3H), 3,44 - 3,32 (m, 4H), 2,90 (s, 3H). ESI-MS m/z calc. 365,17395, encontrado 366,39 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,64 minuto. Preparação de 4-metil-7-morfolino-quinazolin-5-0l (Composto (13-B))
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[00440] A uma solução de 4-[5-[(4-metoxifenil)mnetóxil-4-metil-
quinazolin-7-illmorfolina (245,0 mg, 0,6705 mmol) em CH2Cl2 (6,534 mL) foi adicionado TFA (2,0 mL, 25,96 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. O solvente foi removido sob corrente de N7/aquecimento suave. O resíduo bruto foi diretamente carregado adiante para a reação seguinte. Massa + 1: 246,41. Tempo de Reten- ção: 0,54. Preparação de 2-[4-(4-metil-7 -morfolino-quinazolin-S5-il)oxiciclo- hexillisoindolino-1,3-diona (Composto (13-C)) Am e So
TM OGRO A o ON * nº NH (13-B) º (13-C)
[00441] Uma suspensão de 4-metil-7-morfolino-quinazolin-5-ol (sal de ácido trifluoracético) (240,9 mg, 0,6/05 mmol), [4-(1,3- dioxoisoindolin-2-il)ciclo-hexil] metanossulfonato (542 mg, 1,676 mmol) e Cs2CO; (1,10 g, 3,376 mmol) em DMF anidro (4,2 mL) foi aquecida para 90º C por 5 h. LCMS mostra progresso parcial. Adicionado mais 1,5 eq. de mesilato e aquecido para 110º C por 16 h. A mistura de rea- ção foi filtrada em um tampão de Celite, enxaguando com CH2Chl2. O filtrado foi evaporado, e o resíduo bruto foi carregado seco em Celite e purificado através de cromatografia de sílica-gel (coluna Isco gold de 40 g, gradiente linear de O — 20% de MeOH/CH2CI2) para prover 2-[4- (4-metil-7 -morfolino-quinazolin-S5-il)oxiciclo-hexillisoindolino-1,3-diona (127,9 mg, 0,2707 mmol, 40,37%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 8,89 (s, 1H), 7,91 - 7,77 (m, 2H), 7,77 - 7,65 (m, 2H), 6,82 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,61 - 6,49 (m, 1H), 4,89 - 4,74 (m, 1H), 4,29 (tt, J = 12,4, 3,9 Hz, 1H), 4,00 - 3,79 (m, 4H), 3,44 - 3,31 (m, 4H), 3,27 (s, 3H), 2,77 (qd, J = 13,2, 12,7, 3,0 Hz, 2H), 2,51 - 2,30 (m, 2H), 1,84 - 1,68 (m, 4H).
ESI-MS m/z calc. 472,21106, encontrado 473,4 (M+1)+; Tempo de re- tenção: 0,66 minuto. Preparação de 4-(4-metil-7-morfolino-quinazolin-S5-il)oxiciclo- hexanamina (Composto (13-D)) o Me Dus Oo ——m SS o (OS x Nº O" o 80) 9 (13-D)
[00442] A uma solução agitada de 2-[4-(4-metil-7-morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexillisoindolino-1,3-diona (127,9 mg, 0,2707 mmol) em MeOH (10 mL) foi adicionada hidrazina (172 ul, 5,480 mmol). A reação resultante foi selada e agitada em temperatura ambi- ente por 20 h (LCMS mostrou completa). A mistura de reação foi con- centrada. Ao resíduo bruto foi adicionado CH2Cl2. A suspensão foi fil- trada através de uma frita de vidro de porosidade média (o sólido foi enxaguado várias vezes com CH2Cl2 e coletado no mesmo frasco). O filtrado foi concentrado, e o resíduo bruto foi purificado através de Isco de fase reversa [coluna C18 Aq de 50 g; O — 50% de CH3CN/H20 (Modificador de TFA)]. Frações relevantes foram combinadas e con- centradas sob pressão reduzida para prover o produto (Ácido Trifluo- racético(1)) (21,9 mg, 0,04798 mmol, 17,72%). O sal de TFA foi levado diretamente para a reação seguinte. Massa + 1: 343,39. Tempo de Re- tenção: 0,52 g. Preparação de N-metil-2-[[4-(4-metil-7 -morfolino-quinazolin-5- i)oxiciclo-hexillamino]pirimidina-4-carboxamida (Composto (13))
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H AO C
H (13-D) nHN (13)
[00443] Uma mistura de 4-(4-metil-r-morfolino-quinazolin-5- i)oxiciclo-hexanamina (Ácido Trifluoracético (1)) (21,9 mg, 0,04798 mmol), 2-cloro-N-metil-pirimidina-4-carboxamida (12,35 mg, 0,07197 mmol) e Na2CO; (120 ul de 2 M, 0,2400 mmol) em água (250 yuL) foi aquecida para refluxo (100º C) em um tubo de micro-ondas selado. A mistura resultante foi deixada agitar 72 h. A suspensão bruta foi trata- da com MeOH e algumas gotas de TFA, e a solução resultante foi puri- ficada através de Isco de fase reversa [coluna C18 Aq de 50 g; 0 — 50% CH3CN/H2O (Modificador de TFA)]. Frações relevantes foram combinadas e concentradas. A amostra foi dissolvida em MeOH/CH2Cl2 1:1 mínimo e passada através de um cartucho Stratos- pheres PL-HCO3 MP Resin. O filtrado foi concentrado para prover o produto (5,8 mg, 0,01154 mmol, 24,05%) como um sólido amarelo pá- lido. *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,87 (s, 1H), 8,49 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,82 (d J = 2,4 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 4,79 - 4,69 (m, 1H), 4,03 (ddt, J = 13,1, 7,8, 4,4 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 5,7, 4,1 Hz, 4H), 3,42 - 3,27 (m, 4H), 3,05 (s, 3H), 3,01 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,31 - 2,16 (m, 2H), 2,13 - 2,00 (m, 2H), 2,00 - 1,75 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 477,24884, encontrado 478,44 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,59 minutos.
Preparação do Composto 14: 6-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[4-(7-
morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]pirimidin-4-amina Preparação de d4-cloro-6-(4-metilpiperazin-1-il)pirimidina (Composto (4-0) | | fe] N
O A %
NÓ O (14-A)
[00444] A uma solução a 0º C de 4,6-dicloropirimidina (2,0 g, 13,42 mmol) e Et3N (1,494 g, 2,058 mL, 14,76 mmol) em EtOH (40 mL) foi adicionada 1-metilpiperazina (1,344 g, 1,490 mL, 13,42 mmol). A solu- ção resultante foi aquecida para temperatura ambiente, então agitada por 5 h. A reação foi concentrada in vacuo e dividida entre EtOAc e NaOH 1N. As camadas foram separadas, e a fase aquosa foi extraída mais com EtOAc (2 x 30 mL). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos (Na2SO;), filtrados e concentrados. O resíduo bruto foi dissolvido em hexanos/EtOAc e deixado permanecer por 5 dias, durante o qual um material esbranquiçado precipitou (não produ- to). Filtrado o sólido e concentrado o filtrado para obter o produto. *H- RMN (CDCl3) mostra 4-cloro-6-(4-metilpiperazin-1-il)pirimidina deseja- da limpa (2,126 g, 9,896 mmol, 73,75%). *H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 8,37 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 3,67 (s, 4H), 2,56 - 2,41 (m, 4H), 2,34 (s, 3H). ESI-MS m/z calc. 212,08287, encontrado 213,14 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,39 minuto.
Preparação de 6-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5- iD)oxiciclo-hexil]pirimidin-4-amina ( Composto (14) )
tt O aa A TA "ço SN HO O, SN
H H (14-A) (8-5) (14)
[00445] Uma suspensão de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxíciclo- hexanamina (40 mg, 0,1218 mmol), 4-cloro-6-(4-metilpiperazin-1- iNpirimidina (28,5 mg, 0,1340 mmol), 4-cloro-6-(4-metilpiperazin-1- il)pirimidina (28,5 mg, 0,1340 mmol) e NaOtBu (35 mg, 0,3642 mmol) em tBuOH (800 uL) foi tratada com t-BuXPhos Palladacycle (8 mg, 0,01165 mmol). A reação foi selada e aquecida para 100º C em um banho de esferas de alumínio por 2h. O solvente foi removido sob cor- rente de N>, e o resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel (coluna Isco gold de 40 g, gradiente linear de 0% — 10% MeOH/CH2CI2 [+0,1% EtaN]J). As frações relevantes foram combinadas e concentradas para obter o produto (42,1 mg, 0,07509 mmol, 61,65%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,42 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 8,18 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 6,77 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,44 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 4,85 - 4,62 (m, 2H), 3,97 - 3,74 (m, 5H), 3,60 - 3,55 (m, 4H), 3,45 - 3,27 (m, 4H), 2,52 - 2,46 (m, 4H), 2,33 (d, J = 2,5 Hz, 3H), 2,26 - 2,15 (m, 2H), 2,05 - 1,91 (m, 2H), 1,91 - 1,64 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 504,2961, encontrado 505,44 (M+1)+; Tem- po de retenção: 0,53 minuto.
Preparação do Composto 15: N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5- il)oxiciclo-hexil]pirimidina-4-carboxamida o mm O OH O N NA 2
O TD * O jose (8-A) (15)
[00446] A uma suspensão de 4-(7-morfolinoquinazolin-S5-il)oxiciclo- hexanamina (40 mg, 0,1218 mmol), ácido pirimidino-4-carboxílico (23 mg, 0,1853 mmol) e EtaN (102 uL, 0,7318 mmol) em 1,4-dioxana (1,2 mL) foi adicionado T3P (235 uL de solução 50% p/p em acetato de eti- la, 0,3693 mmol) em gotas. A solução resultante foi aquecida para 50º C por 20 h. O solvente foi removido sob uma corrente de N,? e o resí- duo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel [coluna Isco gold de 12 g; O — 10% de MeOH/CH2CI2 (EtaN +0,5%)], mas o material ainda continha impurezas. O material foi dissolvido/suspenso em 2 mL de DMSO e purificado através de HPCL preparativa C18 (água/acetonitrila com modificador de TFA). As frações relevantes fo- ram secas, e o resíduo foi dissolvido em MeOH/CH2CI2 1:1 e passadas por um cartucho Stratospheres PL-HCO3 MP Resin cartridge. O filtra- do foi concentrado para prover N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo- hexil]pirimidina-4-carboxamida (20,9 mg, 0,04714 mmol, 38,70%). *H- RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,47 (s, 1H), 9,26 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,97 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 8,12 (dd, J = 5,1, 1,5 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,82 - 6,75 (m, 1H), 6,58 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,83 - 4,73 (m, 1H), 4,20 - 4,07 (m, 1H), 3,95 - 3,82 (m, 4H), 3,43 - 3,31 (m, 4H), 2,33 - 2,17 (m, 2H), 2,06 - 1,82 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 434,20663, encontrado 435,35 (M+1)+; Tempo de retenção: 2,48 minutos. Preparação do Composto 16: N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5- il)oxiciclo-hexil|ciclopropanocarboxamida o
O o N N Dx “oO Tá —— O H. Oo OS "s So (16) (8-A)
[00447] A uma solução de 4-(7-morfolinoquinazolin-S5-il)oxiciclo- hexanamina (40 mg, 0,1218 mmol) em CH3CN (1,0 mL) foi adicionado K2CO;3 (20,21 mg, 0,1462 mmol) seguido por cloreto de ciclopropano- carbonila (12,73 mg, 11,05 uL, 0,1218 mmol) em gotas. A mistura de reação vermelho-laranja resultante foi agitada em temperatura ambien- te por 1 h. A mistura de reação foi concentrada. O resíduo bruto foi dissolvido/suspenso em MeOH/H20O 1:1, filtrado em Celite e submetido à HPLC preparatória C18 (água/acetonitrila com modificador de TFA). As frações relevantes foram secas, e o resíduo foi dissolvido em MeOH/CH2Cl2 1:1 e passado através de um cartucho Stratospheres PL-HCO3 MP Resin. O filtrado foi concentrado para prover N-[4-(7- morfolinoquinazolin-S-il)oxiciclo-hexil]ciclopropanocarboxamida (7,2 mg, 0,01780 mmol, 14,61%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,43 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,78 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,73 - 5,54 (m, 1H), 4,74 (t, J = 3,9 Hz, 1H), 3,97 (ddd, J = 14,9, 6,4, 4,1 Hz, 1H), 3,92 - 3,81 (m, 4H), 3,45 - 3,30 (m, 4H), 2,19 (dd, J = 12,1, 2,7 Hz, 2H), 1,95 - 1,59 (m, 6H), 1,34 (tt, J = 7,7, 4,6 Hz, 1H), 1,03 - 0,91 (m, 2H), 0,79 - 0,68 (m, 2H). ESI-MS m/z calc. 396,21616, encon- trado 397,44 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,58 minuto.
Preparação do Composto 717: N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5- il)oxiciclo-hexil]furo[3,2-d]pirimidin-4-amina
N GG N N Á | Os H TU O te o — N
HO N OR ro: O So
H (8-A) (17)
[00448] Uma suspensão de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxíciclo- hexanamina (40 mg, 0,1218 mmol), 4-clorofuro[3,2-d]pirimidina (21 mg, 0,1359 mmol) e terc-butóxido de sódio (35 mg, 0,3642 mmol) foi desgaseificada borbulhando N> através da mistura por 10 min. t- BuXPhos Palladacycle (8 mg, 0,01165 mmol) foi adicionado, e a rea- ção foi aquecida para 100º C por 16 h. A mistura de reação foi concen- trada, dissolvida/suspensa em 2 mL de DMSO, filtrada em Celite e pu- rificada através de HPLC preparativa C18 (água/acetonitrila com modi- ficador de TFA). As frações relevantes foram secas, e o resíduo foi dissolvido em MeOH/CH2CI2 1:1 e passado através de um cartucho Stratospheres PL-HCO3 MP Resin. O filtrado foi concentrado para prover N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexillfuro[3,2- d]Jpirimidin-4-amina (10,5 mg, 0,02116 mmol, 17,38%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,49 (s, 1H), 9,12 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 7,76 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,82 (dd, J = 2,2, 0,5 Hz, 1H), 6,62 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,17 (d, Jy = 7,9 Hz, 1H), 4,83 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 4,45 - 4,29 (m, 1H), 3,94 - 3,90 (m, 4H), 3,45 - 3,39 (m, 4H), 2,30 (d, J = 9,4 Hz, 2H), 2,15 - 2,06 (m, 2H), 1,99 - 1,86 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 446,20663, encontrado 447,12 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,55 minuto. Preparação do Compostos 18: 2-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[4-(7- morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]pirimidin-4-amina Preparação de 2-cloro-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-S-il)oxiciclo- hexil|pirimidin-4-amina
CI O 2N e 2N OA o TOO e HO % NAN
[00449] Uma mistura de A4-(7-morfolinoquinazolin-S-il)oxíciclo- hexanamina (110 mg, 0,3349 mmol), 2,4-dicloropirimidina (55 mg, 0,3692 mmol) e Na2CO; (670 ul de 2 M, 1,340 mmol) em água (450 UL) foi aquecida para refluxo em um tubo de micro-ondas selado por 16 h momento que material tinha agrupado em uma bola grande (soli- difica quando do esfriamento). O sobrenadante foi removido através de pipeta, e o sólido foi quebrado com uma espátula e lavado com várias porções de água. O sólido foi dissolvido em CH2Cl? e a solução foi se- ca (Na2SO;), filtrada e concentrada para uma espuma amarronzada- laranja. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de síli- ca-gel (coluna Isco gold de 40 g, gradiente linear de 0% — 20% de MeOH/CH2Cl2) para prover 2-cloro-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5- il)oxiciclo-hexil]|pirimidin-4-amina (41,2 mg, 0,09344 mmol, 27,89%). 1H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,41 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 7,99 (d, J=5,7 Hz, 1H), 6,79 (d, (J = 2,1 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,25 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 33,6 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 4,15 - 3,77 (m, 5H), 3,45 - 3,29 (m, 4H), 2,34 - 2,15 (m, 2H), 2,07 - 1,93 (m, 2H), 1,93 - 1,70 (m, 6H).
Preparação de 2-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5- i)oxiciclo-hexil]pirimidin-4-amina o | *- Po So O TO AA o. < Ph ANN (18)
[00450] Uma mistura de 2-cloro-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5- il)oxiciclo-hexil]pirimidin-4-amina (41,2 mg, 0,09344 mmol), 1- metilpiperazina (25 uL, 0,2254 mmol) e Base de Hunig (40 uL, 0,2296 mmol) em iPrOH (700 uL) foi aquecida para 170 ºC no micro-ondas por 1 h. O i-PrOH foi removido in vacuo. O resíduo bruto foi dissolvido em CH2Cl> e despejado em NH4CI aquoso saturado. As camadas fo- ram separadas, e a aquosa extraída mais com CH2Cl2. Os orgânicos combinados foram lavados com NaOH 1N e salmoura, secos (Na2SO;), filtrados e concentrados. O resíduo bruto foi purificado atra- vés de Isco (coluna Gold de 40 g; O — 60% de MeOH/CH2Cl2) para prover 2-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-S5-il)oxiciclo- hexil]pirimidin-4-amina (21,6 mg, 0,04152 mmol, 44,44%). O produto resultante foi dissolvido em CH3CN, refluxado e reconcentrado várias vezes para remover solventes residuais. *H-RMN (300 MHz, Clorofór- mio-d) 5 9,43 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 7,89 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 6,85 - 6,72 (m, 1H), 6,57 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,68 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,74 (s, 1H), 4,60 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 3,95 - 3,70 (m, 9H), 3,44 - 3,32 (m, 4H), 2,49 - 2,39 (m, 4H), 2,32 (s, 3H), 2,27 - 2,14 (m, 2H), 2,05 - 1,92 (m, 2H), 1,92 - 1,76 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 504,2961, encontrado 505,49 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,53 minuto. Preparação do Composto 19: N-metil-2-[4-(2-metil-7 -morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]-pirimidin-4-carboxilamidas
[00451] O Composto 19 foi preparado como mostrado no esquema sintético acima para o Composto 12, mas empregando o procedimento que segue para a etapa g:
HAN Dx N o “TO o 2N o *N 9 *N
AO AO o o 9) 2-cloro-N-metil-pirimidino-4-carboxamida, t-butóxido de sódio, t-BuXPhos palladacycle, t-BuOH
[00452] A uma mistura de 4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5- i)oxiciclo-hexanamina (80 mg, 0,23 mmol), cloro-N-metil-pirimidina-4- carboxamida (68 mg, 0,4 mmol) e t-butyl xPhos palladacycle 20 mg, 0,03 mmol) em t-BuOH (2 mL) foi adicionado t-butóxido de sódio (250 ul de 2 M, 0,50 mmol) e a mistura resultante foi agitada de um dia pa- ra o outro a 50º C. A mistura de reação foi diluída com DCM, filtrada através de uma camada de Celite e evaporada. O bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel com um gradiente de 0-10% de MeOH/DCM para prover o produto desejado. O produto foi purificado através de HPCL preparativa C18 (água/acetonitrila com modificador de TFA). As frações relevantes foram secas, e o resíduo foi passado através de uma PL-HCO3 MP SPE para dar N-metil-2-[4-(2-metil-7- morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]-pirimidin-4-carboxilamideas (13,3 mg 11,3%). *H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,17 (s, 1H), 8,28 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,56 (s, 1H), 7,12 (dd, J = 4,8, 0,7 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,32 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,54 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 3,82 (dp, J = 13,9, 4,2 Hz, 1H), 3,67 (dd, J = 5,9, 3,8 Hz, 4H), 3,21 - 3,12 (m, 4H), 2,80 (d, J = 5,0 Hz, 3H), 2,59 (s, 3H), 2,12 - 1,95 (m, 2H), 1,88 - 1,75 (m, 2H), 1,73 - 1,51 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 477,25, encontrado 478,3 (M+1) *; Tempo de retenção: 0,53 mi- nuto. Preparação do Composto 20: 2-metóxi-N-((1s,4s)-4-((7- morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo-hexil)acetamida
"O. ; o ácido 2-metoxiacético PATO, FAN > o Nos OO o) ON nº o
[00453] “Monoidrato de 1-hidroxibenzotriazol (16 mg, 0,118 mmol), 3-(etiliminometilenoamino)-N,N-dimetil-propan-1-amina (Ácido Clorídri- co (1)) (35 mg, 0,183 mmol) e ácido 2-metoxiacético (8,8 ul, 0,115 mmol) foram combinados em DMF (0,2 mL) sob nitrogênio em tempe- ratura ambiente. A mistura resultante foi agitada por 40 minutos. 4-(7- morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexanamina (25 mg, 0,0761 mmol) foi adicionada e agitação foi continuada por 30 minutos. Bicarbonato de sódio saturado foi adicionado, e a mistura foi extraída com EtOAc (2x). Os orgânicos combinados foram lavados com água (2x), salmoura, secos em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado através de cromatografia em sílica-gel 4 g usando um gradiente de 0-10% de metanol/DCM. 2-Metóxi-N- ((18,48)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo-hexil)acetamida (10 mg) foi obtida (33% de rendimento). *H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,45 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,79 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,75 (p, J = 3,2 Hz, 1H), 4,06 - 3,93 (m, 1H), 3,94 - 3,84 (m, 6H), 3,45 (s, 3H), 3,42 - 3,33 (m, 4H), 2,26 - 2,14 (m, 2H), 1,93 - 1,61 (m, 6H). ESI-MS m/z = 401,32 (M+1)+.
Preparação de 3-metil-5-[4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclo- hexóxi]-7-morfolino-quinazolin-4-ona: Composto 21
Do Do
Ê O Q
F O NaH Mel, Nal, KgCO; NH + — vu doe vç, A O, = dO tor F ” F é (21-A) (218) (21-0) | morfolina
NMP Do " OH O Q o NON, no TFA > MV Os + nO DCM Nos 9 o) o) LE) (21-D) | Cs,CO;z
DMF NS DO, ,
O ON nN e) Preparação de 7-flúor-5-[(4-metoxifenil)metóxil-3H-quinazolin-4-0na: Composto (21-B)
[00454] A uma solução de (4-metoxifenil)metanol (10,69 g, 77,39 mmol) em DMF (200 mL) a 0º C foi adicionado NaH (6,89 g, 172,3 mmol) em porções durante 5 minutos, então aquecido para temperatu- ra ambiente durante 30 minutos. A reação foi esfriada para 0º C, e 5,7- difluor-3H-quinazolin-4-0na (23,78 g, 114,9 mmol) foi adicionado em porções durante 5 minutos. A reação foi agitada nessa temperatura por 30 minutos, então aquecida para temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi considerada incompleta, então 0,96 mL de álcool e 680 mg de NaH foram adicionados e a reação agitada em temperatura ambiente por 30 minutos. A reação foi ainda considerada incompleta, então mais 0,96 mL de álcool e 680 mg de NaH foram adi- cionados e a reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi diluída com água e o pH foi ajustado para 5 com ácido acético. O sólido resultante foi filtrado e lavado com água e EtO, então seco sob vácuo para prover 7-flúior-5-[(4- metoxifenil)metóxil-3H-quinazolin-4-o0na (23,45 g, 100% de rendimen- to). !H-RMN (400 MHz, DMSO) à 8,00 (s, 1H), 7,54 - 7,46 (m, 2H), 7,00 - 6,83 (m, 4H), 5,16 (s, 2H), 3,76 (s, 3H). Preparação de 7-flúor-5-[(A-metoxifenil)netóxil-3-metil-quinazolin-4- ona: Composto (21-C)
[00455] Um frasco de micro-ondas de 10 mL Biotage equipado com uma barra de agitação magnética foi carregado com 7-flúor-5-[(4- metoxifenil)metóxi]l-3H-quinazolin-4-ona (406 mg, 1,352 mmol), Mel (193,9 mg, 85,04 uL, 1,366 mmol), Nal (20,00 mg, 0,1334 mmol) e K2CO; (935,9 mg, 6,772 mmol) em acetona (10 mL). O frasco foi sela- do com uma tampa de septo de Teflon e aquecido para 100º C no mi- cro-ondas por 15 minutos. A reação foi filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de uma coluna de sílica-gel derivatiza- da C18 de fase reversa usando CH3CN 10-50% (TFA 0,1%) em H2O (TFA 0,1%). As frações de produto foram combinadas, neutralizadas através da adição de NaHCO; (sat.) e extraídas com EtOAc. Os extra- tos orgânicos foram combinados e lavados com salmoura, secos em MgSO., filtados e concentrados para prover 7-flúor-5-[(4- metoxifenil)metóxi]-3-metil-quinazolin-4-o0na (227 mg, 53,4% de rendi- mento). ESI-MS m/z calc. 314,10666, encontrado 315,09 (M+1)*. Preparação de 5-[(A4-metoxifenil) netóxil-3-metil-7-morfolino-quinazolin- 4-ona: Composto (21-D)
[00456] Uma solução de 7-flúor-5-[(4-metoxifenil)mnetóxil-3-metil- quinazolin-4-o0na (80 mg, 0,25 mmol) e morfolina (430 uL, 4,9 mmol) em NMP anidro (1 mL) foi aquecida a 120º C por 18 horas. A reação foi esfriada para temperatura ambiente e diluída com água. O precipi- tado foi filtrado e lavado com água, então seco sob vácuo para forne- cer 5-[(4-metoxifenil)metóxil-3-metil-7 -morfolino-quinazolin-4-0na (60 mg, 64% de rendimento). ESI-MS m/z calc. 381,16885, encontrado 382,21 (M+1)*. Preparação de 3-metil-5-[4-[(2-metilpirimidin-4-il) amino]ciclo-hexóxil-7- morfolino-quinazolin-4-ona: Composto (21-E)
[00457] Uma solução de 5-[(4-metoxifenil)netóxil-3-metil-7- morfolino-quinazolin-4-0na (60 mg, 0,16 mmol) e TFA (0,5 mL, 6,5 mmol) em DCM (1 mL) foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. O solvente foi removido in vacuo para prover 5-hidróxi-3- metil-7-morfolino-quinazolin-4-o0na. ESI-MS m/z calc. 261,11133, en- contrado 262,07 (M+1)*. Preparação de 3-metil-5-[4-[(2-metilpirimidin-4-il) amino]ciclo-hexóxil-7- morfolino-quinazolin-4-ona: Composto (21)
[00458] “Um frasco de micro-ondas equipado com uma barra de agi- tação magnética foi carregado com 5-hidróxi-3-metil-7-morfolino- quinazolin-4-0na (60,9 mg, 0,2331 mmol), [4-[(2-metilpirimidin-4- iN)>amino]ciclo-hexil] metanossulfonato (200 mg, 0,/009 mmol) e Cs2C0O;3 (380 mg, 1,17 mmol) em DMF (3 mL). O frasco foi selado com uma tampa de septo de Teflon descartável e aquecido no micro-ondas a 120º C por 10 minutos. Adicionados 50 mg de [4-[(2-metilpirimidin-4- i)>amino]ciclo-hexil] metanossulfonato e aquecidos no micro-ondas a 120º C por 10 minutos. A reação foi aquecida no micro-ondas a 120º C por mais 5 minutos. A reação foi filtrada e purificada em uma coluna de SiO> derivatizada C18 de fase reversa usando CH3CN 10-50% (TFA 0,1%) em H2O (TFA 0,1%). As frações de produto foram combinadas e neutralizadas com NaHCO; (sat.) e então extraídas com EtOAc. Os extratos orgânicos foram combinados e lavados com salmoura, secos em MgSO:,, filtrados e concentrados para prover 3-metil-5-[4-[(2-
metilpirimidin-4-il)amino]ciclo-hexóxi]l-7-morfolino-quinazolin-4-ona (32,6 mg, 30,8% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 8,08 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 6,65 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,48 (d, J= 2,2 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 5,22 (s, 1H), 4,72 (s, 1H), 3,97 - 3,81 (m, 4H), 3,53 (d, J = 10,6 Hz, 3H), 3,40 - 3,25 (m, 4H), 2,52 (s, 3H), 2,23 (d, J = 12,9 Hz, 2H), 2,05 - 1,70 (m, 7H). ESI-MS m/z calc. 450,23795, encontrado 451,33 (M+1)*.
Preparação do Composto 22: ((1s8,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5- il)9óxi)ciclo-hexil)carbamato de etila “O. O, º Ccloroformato de etila q Og —— OS
EO N EO N
[00459] A uma solução gelada de 4-(7-morfolinoquinazolin-5- iN)oxiciclo-hexanamina (25 mg, 0,076 mmol) e TEA (32 ul, 0,230 mmol) em DCM (800 uL) foi adicionado cloroformato de etila (10,9 uL, 0,114 mmol). Deixado agitar por 30 min. A reação foi diluída com DCM e bicarbonato de sódio saturado (aq.) foi adicionado. A mistura foi pas- sada através de separador de fase e os orgânicos foram concentrados sob pressão reduzida. Cromatografados em coluna de sílica-gel de 4 g usando 0-10% de MeOH/DCM como eluente e purificado mais através de HPLC preparativa C18 (água/acetonitrila com modificador de TFA). As frações relevantes foram secas, e o resíduo foi passado através de um PL-HCO3 MP SPE para prover ((1s,48)-4-((7-morfolinoquinazolin- B-il)óxi)ciclo-hexil)carbamato (2,3 mg, 7% de rendimento). *H-RMN (400 MHz, CDCI3) à 9,41 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,85 - 6,72 (m, 1H), 6,56 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,78 - 4,56 (m, 2H), 4,12 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,96 - 3,82 (m, 4H), 3,66 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 3,46 - 3,31 (m, 4H), 2,25 - 2,08 (m, 2H), 1,90 (dt, J = 12,5, 4,1 Hz, 2H), 1,84 - 1,61 (m, 4H), 1,25 (t, J = 7,1 Hz, 3H). ESI-MS m/z = 401,32 (M+1)+.
Preparação do Composto 23: 1-metil-N-((1s,4s)-4-((7- morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo-hexil)ciclopropano-1- carboxamida
HAN KA O, ácido 1-metilciclopropano-1-carboxílico o O.
O O
[00460] Monoidrato de 1-hidroxibenzotriazol (16 mg, 0,118 mmol), 3-(etiliminometilenoamino)-N, N-dimetil-propan-1-amina (Ácido Clorídri- co (1)) (35 mg, 0,183 mmol) e ácido 1-metilciclopropano-1-carboxílico (12 mg, 0,1199 mmol) foram combinados em DMF (0,2 mL) sob nitro- gênio em temperatura ambiente e deixados agitar por 40 min. 4-(7- Morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexanamina (25 mg, 0,0761 mmol) foi adicionada e agitação foi continuada por mais 30 minutos. Bicarbonato de sódio saturado foi adicionado, e a mistura foi extraída com EtOAc (2x). Os orgânicos combinados foram lavados com água (2x), salmou- ra, secos em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado através de cromatografia através de sílica-gel 4 g usando gradiente de 0-10% de metanol/DCM. 1-Metil-N- ((18,48)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)Óóxi)ciclo-hexil)ciclopropano-1- carboxamida (13 mg, 40% de rendimento) foi provido. 1H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,46 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,85 - 6,74 (m, 1H), 6,56 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,67 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,74 (t, J = 3,2 Hz, 1H), 4,04 - 3,80 (m, 5H), 3,47 - 3,32 (m, 4H), 2,28 - 2,14 (m, 2H), 1,96 - 1,83 (m, 2H), 1,83 - 1,51 (m, 4H), 1,35 (s, 3H), 1,19 (q, J = 3,8 Hz, 2H), 0,65 - 0,53 (m, 2H). ESI-MS m/z = 411,31 (M+1)+. Preparação do Composto 24: 1-metil-N-((1s,4s)-4-((7- morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo-hexil)ciclopropano-1- carboxamida
HaN nd O, ESSO
XÁ N FA R Nos OO o o
[00461] Em um tubo de micro-ondas de 2 mL, uma mistura de 4-(7- morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexanamina (27 mg, 0,082 mmol), 3- bromo-1-metil-pirazol (9,5 uL, 0,0999 mmol), alil(cloro)paládio (0,8 mg, 0,004 mmol), di-terc-butil(2',4',6'-trilsopropil-3,6-dimetóxi-[1,1'-bifenil]-2- iNfosfano (4 mg, 0,008 mmol) e 2-metilpropan-2-olato de sódio (83 ul de 2 M em tetra-hidrofurano, 0,166 mmol) em tBuOH (400 yL) foi aquecida para 90º C e deixada agitar de um dia para o outro. A reação foi diluída com DCM e filtrada em Celite e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi cromatografado em sílica-gel 12 9g usando 0-10% de MeOH/DCM como eluente para prover 1-metil-N- ((18,48)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo-hexil)-1H-pirazol-3- amina (12,5 mg, 36%). *H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,43 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 9,09 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,78 (d J= 2,1 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 5,53 (t, J = 2,0 Hz, 1H), 4,76 - 4,66 (m, 1H), 3,88 (dt, J = 5,0, 3,0 Hz, 4H), 3,72 (d, J = 1,5 Hz, 3H), 3,49 - 3,33 (m, 5H), 2,18 (dd, J = 13,8, 4,1 Hz, 3H), 1,99 (dt, J = 11,7, 3,7 Hz, 2H), 1,89 - 1,63 (m, 4H). ESI-MS m/z = 409,33 (M+1)+. Preparação do Composto 25: N-metil-2-[[4-(3-metil-7-morfolino-4- oxo-quinazolin-5-il)oxiciclo-hexilJamino]pirimidino-4-carboxamida
F Oo PMB o oH O OH O DO LO NL LO E LO oo B w 8 N B N 8 n
QN Q x N HaN TO, e TA, oh. r o N Oo N o v W o n W TOO, TE, 9 h NA ss SO Tm OS Etapa a
[00462] Auma solução de (4-metoxifenil)metanol (5 mL, 40,1 mmol) em DMF (50 mL) foi adicionado NaH (3 g, 75,0 mmol) e a mistura re- sultante foi agitada por 30 min em temperatura ambiente. À mistura foi adicionada 7-bromo-S5-flúor-3H-quinazolin-4-o0na (5 g, 20,6 mmol) e agitação foi continuada por 2 h em temperatura ambiente. A mistura foi diluída com H2O (100 mL) e neutralizada com ácido acético para pH 5. O precipitado resultante foi coletado através de filtragem a vácuo, la- vado com H2O, Et2O, seco sob vácuo de um dia para o outro. Isso pro- veu [7-bromo-5-[(4-metoxifenil)netóxi]l-3-H-quinazolin-4-0na (79, 95%). 1H-RMN (400 MHz, DMSO) 5 8,01 (s, 1H), 7,49 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,36 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,02 - 6,89 (m, 2H), 5,20 (s, 2H), 3,76 (s, 3H). Etapa b
[00463] A uma solução de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metóxil-3H- quinazolin-4-0na (7 g, 19,4 mmol) em DCM(30 mL) foi adicionado TFA (15 mL, 194,7 mmol) e a solução resultante foi agitada por 30 min. À mistura foi concentrada, diluída com H2O, neutralizada com solução de NaHCO;, filtrada para coletar o sólido. O sólido foi seco in vacuo de um dia para o outro para prover 7-flúor-5-[(4-metoxifenil)metóxil-3H-
quinazolin-4-0na (4,5 g, 98%). 1H-RMN (400 MHz, DMSO) à 8,16 (s, 1H); 7,26 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,03 (d, J=1,8 Hz, 1H), 3,6 (b, 1H). Etapa c
[00464] A uma suspensão de NaH (1,9 g, 47,7 mmol) em DMF (30 mL) a 0º C foi adicionada lentamente 7-bromo-5-hidróxi-3H-quinazolin- 4-ona (5 9, 20,7 mmol) e a mistura resultante foi agitada em tempera- tura ambiente por 20 min. A mistura foi esfriada para 0º C e então adi- cionado POMCI (9,4 g, 9 mL, 62,2 mmol). A mistura foi agitada por 30 min. A mistura de reação foi despejada em uma solução de ácido acé- tico (10 mL) em H2O (100 ml). O precipitado foi filtrado e dissolvido em DMC, seco em Na2SO, e evaporado. O bruto foi purificado através de cartucho de sílica-gel de 120 g eluindo com EtOAc 0-25%/heptano e proveu 2,2-dimetilpropanoato de (7-bromo-5-hidróxi-4-0x0-quinazolin- 3-il)]metila (4,5 g, 61%). 'H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 11,35 (d, J= 1,1 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 7,39 (t J = 1,4 Hz, 1H), 7,15 (t J = 1,5 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 1,1 Hz, 2H), 1,23 (d, J = 1,2 Hz, 9H). Etapa d
[00465] A uma mistura de 2,2-dimetilpropanoato de (7-bromo-5- hidróxi-4-0x0-quinazolin-3-il)|metila (3,5 g, 9,85 mmol), PPh3 (4,1 9, 15,8 mmol) e 2-(4-hidroxiciclo-hexil)isoindolino-1,3-diona (2,8 g, 11,4 mmol) em THF (35 mL) foi adicionado DIAD em gotas (3,2 g, 3,1 mL, 15,8 mmol). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 h. À mistura foi concentrada, purificada através de coluna de cromatografia de sílica-gel eluindo com EtOAc/heptano. Isso proveu 2,2- dimetilpropanoato — de — [7-bromo-5-[4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)ciclo- hexóxi]l-4-oxo-quinazolin-3-il]metila (4,2 g, 73%). *H-RMN (400 MHz, CDCI3) à 8,22 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,73 (tt, J = 5,2, 3,7 Hz, 2H), 7,65 - 7,57 (m, 2H), 7,40 (t, J = 1,7 Hz, 1H), 7,00 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 1,4 Hz, 2H), 4,65 (s, 1H), 4,16 (tt, J = 12,9, 3,9 Hz, 1H), 2,80 (dt, J = 15,5, 12,0 Hz, 2H), 2,29 (d, J = 14,5 Hz, 2H), 1,74 -1,52 (m, 5H),
1,16 (d, J= 1,5 Hz, 9H). Etapa e
[00466] Uma mistura de 2,2-dimetilpropanoato de [7-bromo-5-[4- (1,3-dioxoisoindolin-2-il)ciclo-hexóxi]l-4-0x0-quinazolin-3-illmetila — (500 mg, 0,86 mmol), morfolina (83 mg, 85 ul, 1,0 mmol), carbonato de cé- sio (566 mg, 1,7 mmol), rac-BINAP (107 mg, 0,17 mmol) e em 1,4- dioxana (5,0 mL) foi borbulhada com N2 for 5 min. A mistura foi aqueci- da no micro-ondas por 15 min a 150º C. A mistura foi esfriada para temperatura ambiente, diluída com DCM, filtrada em uma camada de Celite e concentrada. O resíduo bruto foi purificado através de croma- tografia de sílica-gel eluindo com DCM 0-20%/EtOAc para prover 2,2- dimetilpropanoato — de — [5-[4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)ciclo-hexóxi]-7- morfolino-4-0xo0-quinazolin-3-il]metila (56 mg, 11%). ESI-MS m/z calc. 588,26, encontrado 589,3 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,78 minuto. Etapa f
[00467] A uma solução de 2,2-dimetilpropanoato de [5-[4-(1,3- dioxoisoindolin-2-il)ciclo-hexóxi]l-7-morfolino-4-0x0-quinazolin-3- illmetila (56 mg, 0,1 mmol) em MeOH (5 mL) foi adicionado NH2NH2 (100 yuL, 3,2 mmol) e a solução de reação resultante foi agitada a 70º C por 90 min. Após esfriar para temperatura ambiente, a mistura foi concentrada e purificada através de cartucho de sílica-gel de 4 g elu- indo com 0-10% (7N NH3/MeOH)/DCM para prover 5-(4-amino-ciclo- hexóxi)-7-morfolino-3H-quinazolin-4-0na desejada (30 mg, 91%). 'H- RMN (400 MHz, CDCI3) 5 7,93 (s, 1H), 6,64 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,41 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 3,86 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,31 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,11 (td, J = 8,9, 7,1, 3,4 Hz, 1H), 2,12 (d, J = 13,6 Hz, 2H), 2,03 -1,91 (m, 2H), 1,82 (d, J = 10,8 Hz, 2H), 1,58 (t, J = 13,2 Hz, 2H). Etapa q
[00468] Uma mistura de 5-(4-aminociclo-hexóxi)-7-morfolino-3H- quinazolin-4-0na (30 mg, 0,14 mmol), 2-cloro-N-metil-pirimidina-4-
carboxamida (30 mg, 0,17 mmol) e KCO3 (100 mg, 0,72 mmol) em H2O (2 mL) foi agitada a 100 ºC por 18 h. A mistura foi extraída com DCM, seca em Na2SO., concentrada e purificada através de cromato- grafia de sílica-gel eluindo com MeOH 0-10%/DCM. Isso proveu N- metil-2-[[4-[(7-morfolino-4-0x0-3H-quinazolin-5-il)óxilciclo- hexillamino]pirimidina-4-carboxamida (15 mg, 35,9%). 'H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 8,48 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,97 - 7,78 (m, 2H), 7,31 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,73 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,04 (s, 1H), 3,93 - 3,81 (m, 4H), 3,50 (s, 1H), 3,43 - 3,29 (m, 4H), 3,00 (d, J= 5,1 Hz, 3H), 2,29 - 2,17 (m, 2H), 2,11 - 1,97 (m, 2H), 1,92 (da, J = 12,7, 4,2 Hz, 2H), 1,85 - 1,70 (m, 2H). Etapa h
[00469] A uma mistura de N-metil-2-[[4-[(7-morfolino-4-0x0-3H- quinazolin-5-il)óxilciclo-hexillamino]-pirimidino-4-carboxamida (15 mg, 0,031 mmol), K2CO;3 (80 mg, 0,58 mmol) em DMF (1 mL) foi adiciona- do Mel (50 uL, 0,80 mmol) e agitado a 70 ºC for 30 min. O solvente foi evaporado e o bruto foi purificado através de cartucho de sílica-gel de 4 g eluindo com 0-10% de MeOH/DCM. O produto recuperado era im- puro. O produto foi submetido à separação SFC para prover N-metil-2- [[4-(3-metil-7-morfolino-4-0x0-quinazolin-5-il)oxíciclo- hexillamino]pirimidina-4-carboxamida (2 mg, 16,3%). '"H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 8,47 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,28 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,47 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,32 (s, 1H), 4,67 (s, 1H), 3,99 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,92 - 3,80 (m, 4H), 3,50 (s, 3H), 3,37 - 3,23 (m, 4H), 3,01 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,27 - 2,15 (m, 2H), 2,07 - 1,95 (m, 2H), 1,90 (dd, J = 13,0, 4,2 Hz, 2H), 1,79 (tl J= 12,8 Hz, 2H). ESI-MS m/z calc. 493,24374, encontrado 494,37 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,6 minuto. Preparação do Composto 26: 1-metil-N-((1s,4s)-4-((7- morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo-hexil)-1H-imidazol-4-
carboxamida H2aN NEN IO 7 O. Z>N — o ON es OO o ON nº o
[00470] “Monoidrato de 1-hidroxibenzotriazol (16 mg, 0,118 mmol), 3-(etiliminometilenoamino)-N,N-dimetil-propan-1-amina (Ácido Clorídri- co (1)) (35 mg, 0,183 mmol) e ácido 1-metil-1H-imidazol-4-carboxílico (15 mg, 0,119 mmol) foram combinados em DMF (0,2 mL) sob nitrogê- nio em temperatura ambiente e deixados agitar por 40 min. 4-(7- morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexanamina (25 mg, 0,0761 mmol) foi adicionada, e agitação foi continuada por mais 30 min. Bicarbonato de sódio saturado foi adicionado, e a mistura foi extraída com EtOAc (2x). Os orgânicos combinados foram lavados com água (2x), salmoura, secos em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado através de cromatografia em sílica-gel 4 gq usando gradiente de 0-10% de metanol/DCM para prover 1-metil- N-((18,48)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo-hexil)-1 H-imidazol-4- carboxamida (6 mg, 17%). *H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,44 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 7,51 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 7,40 - 7,34 (m, 1H), 7,09 (d J = 8,4 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,74 (d, J=3,9 Hz, 1H), 4,11 (tq, J = 9,9, 6,2, 5,3 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 5,9, 3,9 Hz, 4H), 3,73 (s, 3H), 3,43 - 3,33 (m, 4H), 2,29 - 2,17 (m, 2H), 2,04 - 1,73 (m, 6H). ESI-MS m/z = 433,05 (M+1)+. Preparação do Composto 27: Preparação de 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]Jdecan-8-ilóxi)pirimidina: Compos- to (27-A)
O 00 = Ro: cn fo) ox X) (27-A)
[00471] A uma suspensão de NaH (370,1 mg, 9,254 mmol) (60% em óleo mineral) em DMA (2 ml), esfriada com banho gelado foi adici- onada uma solução de 1,4-dioxaspiro[4,5]decan-8-ol (1 g, 6,321 mmol) em DMA (10 mL) e imidazol (43 mg). Depois de agitar em temperatura ambiente por 30 min, 2-cloropirimidina (868,7 mg, 7,585 mmol) foi adi- cionada e a mistura foi agitada por 30 min em temperatura ambiente por 2 h, então 60º c por 1 h. A reação foi então diluída com EtOAçc, la- vada com H2O, seca em Na2SO, e concentrada. Purificada através de cromatografia de sílica-gel (síilica-gel 40 g, EI!OAc/heptano 0-50%) pa- ra prover 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]decan-8-ilóxi)pirimidina (3,20 g, 6,230 mmol, 98,59%) que foi levada para a próxima reação como é. *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,43 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,83 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,06 (tt, J = 6,5, 4,2 Hz, 1H), 4,06 - 3,75 (m, 4H), 1,98 - 1,77 (m, 6H), 1,64 - 1,55 (m, 2H). ESI-MS m/z calc. 236,11609, encontrado 237,22 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,72 minutos. Preparação de 4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexanona: Composto (27-B) 12 Pra Sl p o 98
A XT O o (27-A) O 76)
[00472] A uma solição de 2-(1,4-dioxaspiro[4,5)decan-8- ilóxi)pirimidina (1,10 g, 4,656 mmol) em dioxana (6 mL) foi adicionado HCI (7,883 mL de 6 M, 47,30 mmol). Depois de agitar por 2 dias, a mistura de reação foi evaporada, neutralizada com NaHCO;3 aquoso saturado, extraída com DCM (3x), seca com MgSO:, filtrada e purifica-
da através de cromatografia de sílica-gel (sílica-gel 12 g, EtO- Acl/heptano 0-100%) para prover 4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexanona (800 mg, 4,162 mmol, 89,39%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,56 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,98 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,47 (tt, J = 6,4, 3,3 Hz, 1H), 2,88 - 2,62 (m, 2H), 2,51 - 2,28 (m, 5H), 2,30 - 2,11 (m, 2H). ESI- MS m/z calc. 192,08987, encontrado 193,07 (M+1)+; Tempo de reten- ção: 0,6 minuto.
Preparação do Compostos (27-C), (27-D) e (27-E) 12 4 do do Hoy on >nº e o N nº N QN HB Na O
US O O o nº no no (27-B) (27-C) (27-D) (27-E)
[00473] A uma solução de Composto (27-B) (383 mg, 1,993 mmol) em MeOH (2 mL) foi adicionado Boroidreto de sódio (151 mg, 3,991 mmol). Evolução de gás moderada observada com pequeno aumento em temperatura. A reação foi deixada agitar por 1h, então ela foi extin- ta com HCl (0,70 mL 6N) e deixada agitar até que evolução de gás pa- rasse. A mistura foi basificada para pH -8 com NaOH 1N e extraída com EtOAc (20 mL). Os orgânicos foram secos em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida. 248 mg de 4-pirimidin-2-iloxiciclo- hexanol obtidos. 12 mg da amostra foram purificados através de cro- matografia prep de HPLC (gradiente de CH3CN 10-90%/Água) para separar isômeros cis-trans. Trans-4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexanol: *H- RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,54 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,95 (t, J= 4,8 Hz, 1H), 5,05 (tt, J = 9,4, 4,0 Hz, 1H), 3,91 — 3,75 (m, 1H), 2,26 — 1,99 (m, 4H), 1,76 — 1,41 (m, 4H). Cis-4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexano!l: 1H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,62 (d, J = 4,9 Hz, 2H), 7,04 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,21 (tt, J = 5,3, 2,6 Hz, 1H), 4,56 (s, 1H), 3,85 (p, J =
5,9 Hz, 1H), 2,17 — 2,02 (m, 2H), 1,88 — 1,67 (m, 6H). Preparação de 7-morfolinoquinazolin-5-ol: Composto (1-F) Br. N o O) º NON Ns QD — “ & Pç no 7º (1-F)
[00474] Uma suspensão de 7-bromo-5-[(4- metoxifenil)metóxilquinazolina (300 mg, 0,8691 mmol), PA(OAc)2 (18 mg, 0,08017 mmol) e RuPhos (81,10 mg, 0,1738 mmol) em 1,4- dioxana (5 mL) em um frasco de micro-ondas de 20 ml foi borbulhada com N>. Morfolina (113,6 mg, 113,7 ul, 1,304 mmol) foi adicionada, seguido por terc-butóxido de sódio (250,5 mg, 2,607 mmol). O frasco foi vedado e aquecido a 100º C por 19 h. NHKCI aquoso foi adicionado, e a mistura foi extraída com EtOAc (6x). A fase orgânica combinada foi seca em MgSO:,, filtrada e concentrada. O produto bruto foi purificado mais duas vezes através de cromatografia de sílica-gel (49 + 12 g de sílica-gel, MeEOH/DCM 0-10%) para dar 7-morfolinoquinazolin-5-ol (147 mg, 0,6357 mmol, 73,14%). 'H- RMN (300 MHz, DMSO-d6) 5 10,86 (s, 1H), 9,23 (s, 1H), 8,93 (s, 1H), 6,72 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 3,76 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,33 (dd, J = 6,2, 3,4 Hz, 4H). ESI-MS m/z calc. 231,10078, encontrado 232,22 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,49 minuto. Preparação de trans-(4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexil)netanossulfonato: Composto (27-F)
% à o o >NÔ X% PA — º cr H o ANÇO ú CX nº WN (27-F)
[00475] Uma solução de trans-4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexanol (80 mg, 0,4119 mmol) (de FC1), TEA (125,1 mg, 172,3 uL, 1,236 mmol) em DCM (5 mL) foi tratada com cloreto de metanossulfonila (70,77 mg, 47,82 uL, 0,6178 mmol) por 1 h. A mistura de reação foi evaporada, e o resíduo foi purificado através de cromatografia rápida (sílica-gel 4 9, EtOAc-DCM 0-30%) para prover trans-(4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexil) metanossulfonato (74 mg, 0,2717 mmol, 65,95%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,43 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,86 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,05 (tt, J = 6,6, 3,4 Hz, 1H), 4,78 (tt, J = 7,0, 3,2 Hz, 1H), 2,17 - 1,93 (m, 5H), 1,82 (tdd, J = 13,0, 5,7, 3,5 Hz, 4H). ESI-MS m/z calc. 272,08307, encontrado 273,12 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,76 minuto. Preparação de 4-[5-cis-(4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexóxi)quinazolin-7- illmorfolina: Composto (27) fe) Xe O) 2 o nº O OO
NO AN
Q O é o O N Oo OH 2 nº - ESA 1 | (27-F) Ma NZ
[00476] Uma mistura de trans-(4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexil) meta- nossulfonato (58,7 mg, 0,2156 mmol), 7-morfolinoquinazolin-5-ol (40 mg, 0,1730 mmol) e Cs2CO;3 (67,64 mg, 0,2076 mmol) em Dioxana (1 mL) e DMF (1 mL) foi selada em um tubo de micro-ondas de 5 mL e aquecida para 110º C por 15 h. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em DCM/MeOH 9:1 e filtrado em celite. O filtrado foi evaporado e purificado através de cro- matografia de sílica-gel (silica-gel 2x4 gq, MeOH/DCM 0-5%) para pro- ver 4-[5-cis-(4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexóxi)quinazolin-7-il]morfolina (45 mg, 0,0994 mmol, 57,45%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,45 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,53 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,93 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,85 - 6,72 (m, 1H), 6,60 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,20 (da, J = 7,6, 3,7 Hz, 1H), 4,67 (dt, J = 6,3, 3,1 Hz, 1H), 3,99 - 3,79 (m, 4H), 3,51 - 3,15 (m, 4H), 2,38 - 2,06 (m, 4H), 2,11 - 1,78 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 407,19574, encontrado 408,35 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,63 mi- nutos. Preparação do Composto 28: 4-[5-trans-(4-pirimidin-2-iloxiciclo- hexóxi)quinazolin-7-illJmorfolina Preparação de cis-(4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexil)netanossulfonato: Composto (27-F) O, NOS o
O % E ZH — O err O EH o NÃO “o e. nº Ss (28-F)
[00477] A uma solução de cis-4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexanol (160 mg, 0,8238 mmol) (FC2) e TEA (250,0 mg, 344,4 uL, 2,471 mmol) em DCM (1078 mL) foi adicionado cloreto de metanossulfonila (140,7 mg, 95,07 uL, 1,228 mmol). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 h, concentrada e cromatografada em sílica-gel 12 g usando EtOAc 0—70%/heptano como eluente para prover metanossulfonato cis-(4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexila) (142 mg, 0,5214 mmol, 63,31%). *H- RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,51 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,93 (t, J =
4,8 Hz, 1H), 5,15 (tt, J = 7,9, 3,1 Hz, 1H), 4,97 - 4,70 (m, 1H), 3,04 (s, 3H), 2,38 - 2,04 (m, 4H), 1,95 - 1,68 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 272,08307, encontrado 273,16 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,74 mi- nuto. Preparação de 4-[5-(4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexóxi)quinazolin-7- illmorfolina: Composto (27) o Ano
A TU Gs “H SN CS (28-F) (1-F) > (28)
[00478] Uma mistura de metanossulfonato de cis-(4-pirimidin-2- iloxiciclo-hexila (43 mg, 0,1579 mmol), 7-morfolinoquinazolin-5-ol (40 mg, 0,1730 mmol) e Cs2CO;z (67,64 mg, 0,2076 mmol) em dioxana (1 mL) e DMF (1 ml) foi selada em um tubo de micro-ondas de 5 mL e aquecida para 110º C por 15 h. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em DMC/MeOH 9:1, filtrado em celite. O filtrado foi evaporado e purificado através de cro- matografia de sílica-gel (silica-gel 2x4 gq, MeOH/DCM 0-5%) para pro- ver —4-[5-trans-(4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexóxi)quinazolin-7-il]morfolina (14,5 mg, 0,03203 mmol, 18,51%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 9,43 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,54 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,95 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,80 (dd, J = 2,1, 0,8 Hz, 1H), 6,62 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5,29 - 5,24 (m, 1H), 4,80 - 4,59 (m, 1H), 4,11 - 3,77 (m, 4H), 3,58 - 3,30 (m, 4H), 2,33 - 2,20 (m, 4H), 2,04 - 1,70 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 407,19574, encontrado 408,39 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,62 minuto. Preparação do Compostos 29 e 35 vb FA a o o soh Soh £& o qe ão Mater, J (29-A) (298) (29-0) (29-D) | dd O e (29-E) (29-F) Preparação de 2-(1,4-dioxaspiro[4,5])dec-7-en-8-il)tiazol: Composto (29-B)
[00479] “Uma mistura de 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]dec-7-en-8-il)-4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (2,0 9, 7,5 mmol), 2-bromotiazol (1,27 9, 7,74 mmol), PAd(PPh3) a (436 mg, 0,377 mmol) e Na2CO; (7,60 mL de solução 2M, 15,2 mmol) em dioxana (40 mL) foi evacuada e retrocheia com nitrogênio (repetido 2 vezes), então aquecida para 90º C por 6 horas. A reação foi esfriada para temperatura ambiente e diluída com água, então extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos foram combi- nados e lavados com salmoura, secos em MgSO:;, filtrados e concen- trados. O resíduo foi purificado através de cromatografia rápida usan- do EtOAc e heptano para prover 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]dec-7-en-8- iDtiazol (889 mg, 53,0% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 7,75 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,19 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 6,63 - 6,52 (m, 1H), 4,04 (s, 4H), 3,00 - 2,74 (m, 2H), 2,69 - 2,38 (m, 2H), 1,94 (t, J = 6,6 Hz, 2H). Preparação de 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]decan-8-il)tiazol: Composto (29-C)
[00480] Uma mistura de 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]dec-7-en-8-il)tiazol (889 mg, 3,98 mmol) e paládio sobre carbono ativado 10% (425 mg, 0,399 mmol) em EtOAc (15 mL) foi agitada em temperatura ambiente sob 1 atm de hidrogênio de um dia para o outro. A reação foi filtrada em Celte e concentrada in vacuo para prover 2-(1,4- dioxaspiro[4,5]decan-8&-il)tiazol (860 mg, 93,9% de rendimento). *H- RMN (300 MHz, CDCI3) 5 7,70 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,22 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 3,99 (s, 4H), 3,11 (tt, J = 11,1, 3,8 Hz, 1H), 2,28 - 2,12 (m, 2H), 1,99 - 1,83 (m, 4H), 1,72 (td, J = 13,3, 4,3 Hz, 2H). ESI-MS m/z calc. 225,08235, encontrado 226,05 (M+1)+. Preparação de 4-tiazol-2-ilciclo-hexanona: Composto (29-D)
[00481] Uma solução de 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]decan-&-il)tiazol (860 mg, 3,82 mmol) e p-toluenossulfonato de piridínio (1,93 g, 7,68 mmol) em acetona (19 mL) e água (19 mL) foi aquecida para refluxo de um dia para o outro. A acetona foi removida in vacuo. A camada aquosa foi extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos foram combinados e lavados com salmoura, secos em MgSO:;, filtrados e concentrados pa- ra prover 4-tiazol-2-ilciclo-hexanona (641,5 mg, 90% de rendimento). 1H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 7,74 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,28 (d, J= 0,8 Hz, 1H), 3,53 (tt, J = 10,4, 3,4 Hz, 1H), 2,66 - 2,40 (m, 6H), 2,27 - 2,05 (m, 2H). ESI-MS m/z calc. 181,05614, encontrado 182,02 (M+1)*. Preparação do Compostos (29-E) e (29-F)
[00482] A uma solução de 4-tiazol-2-ilciclo-hexanona (564 mg, 3,11 mmol) em MeOH (15 mL) a 0ºC foi adicionado NaBHa, (244 mg, 6,32 mmol). A reação foi aquecida para temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido in vacuo. A reação foi diluída com água e então extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos foram combinados e lavados com salmoura, secos em MgSO:;, filtrados e concentrados para prover 4-tiazol-2-ilciclo-hexanol (492 mg, 82,4% de rendimento). 1H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 7,68 (t, J = 3,2 Hz, 1H), 7,20 (dd, J = 5,3, 3,3 Hz , 1H), 4,11 - 4,01 (m, 1H), 3,70 (tt, J = 10,6, 4,3 Hz, 1H), 3,16 - 2,90 (m, 1H), 2,29 - 2,16 (m, 2H), 2,16 - 2,05 (m, 2H), 1,73 - 1,56 (m, 2H), 1,54 - 1,35 (m, 2H). ESI-MS m/z calc. 183,07178, encontrado
184,0 (M+1)+.
[00483] Uma mistura de trans- e cis-4-tiazol-2-ilciclo-hexanol (492 mg, 2,68 mmol) foi purificada através de SFC usando CO, e EtoH (EtaNH 0,2%) para dar trans-4-tiazol-2-ilciclo-hexanol (381 mg, 2,08 mmol). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 7,70 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 3,72 (tt, J = 10,6, 4,3 Hz, 1H), 3,02 (tt, J = 11,9, 3,7 Hz, 1H), 2,33 - 2,19 (m, 2H), 2,19 - 2,05 (m, 2H), 1,77 - 1,37 (m, 4H) e cis- 4-tiazol-2-ilciclo-hexanol (65,7 mg, 0,359 mmol) *H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 7,70 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,22 (dt, J = 7,2, 3,6 Hz, 1H), 4,08 (s, 1H), 3,11 (tt, J = 10,2, 3,9 Hz, 1H), 2,19 - 2,01 (m, 2H), 2,01 - 1,92 (m, 2H), 1,92 - 1,81 (m, 2H), 1,81 - 1,70 (m, 2H). Preparação do Composto (29)
N OH SN Po VN 7 DBAD, PPh3 “o CA = Or N Q DCM LO o OH ON nó o (1-A) (29-E) (29)
[00484] A uma solução de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (25 mg, 0,11 mmol), cis-4-tiazol-2-ilciclo-hexanol (30 mg, 0,16 mmol) e PPh3 (52 mg, 0,20 mmol) em DCM (1 mL) foi adicionado azodicarboxilato de di-terc- butila (45 mg, 0,20 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambi- ente de um dia para o outro. A reação foi concentrada in vacuo e o re- síduo foi purificado em uma coluna de SiO> derivatizada C18 de fase reversa usando CH3CN 5-50% (TFA 0,1%) em H2O (TFA 0,1%). As frações de produto foram combinadas e neutralizadas com NaHCO;z (sat.) e então extraídas com EtOAc. Os extratos orgânicos foram com- binados e lavados com salmoura, secos em MgSO:, filtrados e con- centrados para prover 4-[5-(trans-4-tiazol-2-ilciclo-hexóxi)quinazolin-7- illmorfolina (17,2 mg, 38,5%). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,42 (s,
1H), 9,09 (s, 1H), 7,74 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,63 - 4,42 (m, 1H), 4,01 - 3,84 (m, 4H), 3,49 - 3,31 (m, 4H), 3,380 - 3,10 (m, 1H), 2,39 (d, J = 9,6 Hz, 4H), 2,04 - 1,58 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 396,162, encon- trado 397,32 (M+1)+.
Preparação do Composto (35) oH Fa o nE OO . : DBAD, PPh; o
ON N O DCM OO 9 ôn (ON né 0 (1-A) (29-F) (35)
[00485] A uma solução de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (25 mg, 0,11 mmol), trans-4-tiazol-2-ilciclo-hexanol (25 mg, 0,14 mmol) e PPh3 (46 mg, 0,148 mmol) em DCM (1 mL) foi adicionado azodicarboxilato de di- terc-butila (40 mg, 0,18 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi considerada incompleta de modo que trans-4-tiazol-2-ilciclo-hexanol (5 mg), PPh3 (11 mg) e azodicarboxilato de di-terc-butila (10 mg) foram adicionados e a reação agitada em temperatura ambiente por 2 horas. A reação foi concentra- da in vacuo e o resíduo foi purificado em uma coluna de SiO»> derivati- zada C18 de fase reversa usando CH3CN 5-40% (TFA 0,1%) em H2O (TFA 0,1%). As frações de produto foram combinadas e neutralizadas com NaHCO; (sat). e então extraídas com EtOAc. Os extratos orgâni- cos foram combinados e lavados com salmoura, secos em MgSO:,, filtrados e concentrados para prover 4-(5-((cis-4-(tiazol-2-il)ciclo- hexil)óxi)quinazolin-7-il)]morfolina (14,8 mg, 33,2% de rendimento). *H- RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,47 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 7,74 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,27 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,61 (d J = 1,9 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 3,96 - 3,84 (m, 4H), 3,51 - 3,38 (m, 4H), 3,31
- 3,16 (m, 1H), 2,42 - 2,27 (m, 2H), 2,22 - 2,05 (m, 4H), 1,96 - 1,82 (m, 2H). ESI-MS m/z calc. 396,162, encontrado 397,26 (M+1)*. Preparação dos Compostos 30 e 38 Preparação dos Compostos (30-A) e (30-B)
[00486] Os compostos (30-A) e (30-B) foram preparados de uma maneira similar àquela para os Compostos (29-E) e (29-F). Uma mistu- ra de trans- e cis-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclo-hexano (465 mg, 2,42 mmol) foi purificada através de SFC usando CO, e EtoH (EtaNH 0,2%) para prover trans-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclo-hexanol (331 mg, 1,69 mmol). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 8,53 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 3,82 - 3,62 (m, 1H), 2,72 (s, 3H), 2,62 (tt, J = 12,0, 3,5 Hz, 1H), 2,23 - 2,09 (m, 2H), 2,09 - 1,96 (m, 2H), 1,70 - 1,35 (m, 4H) e cis-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclo-hexanol (71 mg, 0,35 mmol) *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 8,55 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,22 - 4,08 (m, 1H), 2,80 - 2,59 (m, 4H), 2,08 - 1,61 (m, 8H). Preparação do Composto 30: 4-[5-[cis-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclo- hexóxilquinazolin-7-illmorfolina
À
NÓ N OH OC “O CO + O DBAD, PPh;3 “Oo
N N DCM RN o (1-A) (30-A) (30)
[00487] A uma solução de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (27,5 mg, 0,12 mmol), trans-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclo-hexanol (35 mg, 0,18 mmol) e PPh;3 (56 mg, 0,21 mmol) em DCM (1 mL) foi adicionado azodicarboxi- lato de di-terc-butila (49 mg, 0,21 mmol). A reação foi agitada em tem- peratura ambiente de um dia para o outro. A reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado em uma coluna de SiO> derivatizada C18 de fase reversa usando CH3CN 5-40% (TFA 0,1%) em H2O (TFA
0,1%). As frações de produto foram combinadas e neutralizadas com NaHCO; (sat.) e então extraídas com EtOAc. Os extratos orgânicos foram combinados e lavados com salmoura, secos em MgSO:, filtra- dos e concentrados para prover 4-[5-[cis-4-(2-metilpirimidin-4- il)ciclohexóxilquinazolin-7-il]morfolina (18,5 mg, 36,5% de rendimento). 1H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,51 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,59 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,61 (d J = 1,9 Hz, 1H), 4,96 - 4,82 (m, 1H), 4,03 - 3,82 (m, 4H), 3,51 - 3,30 (m, 4H), 2,90 - 2,77 (m, 1H), 2,75 (s, 3H), 2,44 - 2,28 (m, 2H), 2,19 - 1,75 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 405,21646, encontrado 406,36 (M+1)+. Preparação do Composto 38: 4-[5-[trans-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclo- hexóxilquinazolin-7-illmorfolina N —s OH CX “O. PN z DBAD, PPh;z O nO ' O DCM CO o E Ox 2 0 (1-A) (30-B) (38)
[00488] A uma solução de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (25 mg, 0,11 mmol), cis-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclo-hexanol (33 mg, 0,416 mmol) e PPh;3 (52 mg, 0,20 mmol) em DCM (1 mL) foi adicionado azodicarboxi- lato de di-terc-butila (45 mg, 0,20 mmol). A reação foi agitada em tem- peratura ambiente por 2 dias. A reação foi agitada em temperatura ambiente por 2 dias. A reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de cromatografia de sílica-gel usando EtOAc para prover 4-[5-[trans-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclo-hexóxilquinazolin-7- illmorfolina (17 mg, 0,041 mmol, 37% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,41 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 8,57 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,64 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,63 - 4,41 (m, 1H), 4,05 - 3,83 (m, 4H), 3,53 - 3,29 (m, 4H), 2,86 -
2,76 (m, 1H), 2,75 (s, 3H), 2,51 - 2,33 (m, 2H), 2,25 - 2,10 (m, 2H), 1,96 - 1,62 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 405,21646, encontrado 406,29 (M+1)*. Preparação do Composto 31: 4-(7-morfolinoquinazolin-5- il)oxiciclo-hexanocarboxilato de etila R nd a. E num O, CEEE TO, (1-A) (1-8) (1-0) eu Preparação do Composto (31-C)
[00489] A uma solução de 7-bromoquinazolin-5-ol (500 mg, 2,22 mmol), 4-hidroxiciclo-hexanocarboxilato de etila (516 mg, 3,00 mmol) e PPh3 (937 mg, 3,57 mmol) em DCM (20 mL) foi adicionado azodicar- boxilato de di-terc-butila (819 mg, 3,56 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente por 2 dias. A reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de cromatografia de sílica-gel usando EtOAc e heptano para prover 4-(7-bromoquinazolin-S5-il)oxiciclo- hexanocarboxilato de cis-etila (585 mg, 69,4% de rendimento). *H- RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,74 (s, 1H), 9,32 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,05 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 4,82 - 4,72 (m, 1H), 4,19 (q, J=7,1 Hz, 2H), 2,58 - 2,43 (m, 1H), 2,28 - 2,12 (m, 2H), 2,12 - 1,74 (m, 6H), 1,380 (t, J =7,1 Hz, 3H). ESI-MS m/z calc. 378,0579, encontrado 379, 1 (M+1)*. Preparação do Composto (31)
[00490] Um frasco de micro-ondas de 0,5-2 mL Biotage equipado com uma barra de agitação magnética foi carregado com 4-(7- bromoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexanocarboxilato de etila (100 mg, 0,264 mmol), PAd(OAc)2 (6 mg, 0,03 mmol) e RuPhos (25 mg, 0,054 mmol) em dioxana (1,6 mL) e nitrogênio foi borbulhado através da reação por minutos. Morfolina (36 ul, 0,41 mmol) e Cs2CO;3 (258 mg, 0,792 mmol) foram adicionados, e o frasco foi vedado com uma tampa de septo de Teflon descartável. O frasco foi aquecido para 100º C por 4,5 horas. A reação foi esfriada para a temperatura ambiente e diluída com água, então extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos foram combinados e lavados com salmoura, secos em MgSO:, filtrados e concentrados. O resíduo foi purificado através de cromatografia rápida usando EtOAc para prover 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxíciclo- hexanocarboxilato de etila (90 mg, 85% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,46 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 6,81 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,83 - 4,66 (m, 1H), 4,19 (q, J=7,1 Hz, 2H), 4,01 - 3,83 (m, 4H), 3,51 - 3,29 (m, 4H), 2,48 (tt, J = 10,3, 3,9 Hz, 1H), 2,30 - 2,12 (m, 2H), 2,12 - 1,65 (m, 6H), 1,30 (t, J =7,1 Hz, 3H). ESI-MS m/z calc. 385,20016, encontrado 386,28 (M+1)*. Preparação do Composto 32: cis-N-ciclopropil-4-((7- morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo-hexanocarboxamida À. Da jD - O, E - DA + Dm APRE, si O, (31) (32-A) (32) Preparação do Composto (32-A)
[00491] Uma solução de 4-(7-morfolinoquinazolin-S-il)oxiciclo- hexanocarboxilato de etila (210 mg, 0,545 mmol: Composto (31)) e Li- OH (20 mg, 0,835 mmol) em MeOH (3 mL) e água (500 yuL) foi agitada a 65º C por 1,5 hora. A reação foi esfriada para a temperatura ambien- te e o pH foi ajustado para 1 com HCI 6M. O solvente foi removido pa- ra prover cloridrato do ácido 4-(7-morfolinoquinazolin-S-il)oxiciclo- hexanocarboxílico. Preparação do Composto (32)
[00492] A uma solução de cloriddato do ácido 4(7- morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexanocarboxílico (46,4 mg, 0,118 mmol), ciclopropanamina (10 ul, 0,14 mmol) e HATU (49 mg, 0,13 mmol) in THF (2 mL) foi adicionado DIPEA (82 uL, 0,47 mmol). A rea- ção foi agitada em temperatura ambiente por 40 minutos. A reação foi concentrada in vacuo, e o resíduo foi purificado em uma coluna de SiO, derivatizada C18 de fase reversa usando 5-30% de CH3CN (0,1% TFA) em H2O (0,1% TFA). As frações de produto foram combinadas e neutralizadas com NaHCOS3 (sat.) e então extraídas com EtOAc. Os extratos orgânicos foram combinados e lavados com salmoura, secos em MgSO:;, filtrados e concentrados para prover cis-N-ciclopropil-4-((7- morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo-hexanocarboxamida (27 mg, 56% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,47 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 6,81 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 5,65 (s, 1H), 4,87 - 4,72 (m, 1H), 4,02 - 3,83 (m, 4H), 3,48 - 3,35 (m, 4H), 2,82 - 2,68 (m, 1H), 2,37 - 2,17 (m, 3H), 2,02 - 1,68 (m, 8H), 0,90 - 0,75 (m, 2H), 0,59 - 0,41 (m, 2H). ESI-MS m/z calc. 396,21616, encontrado 397,31 (M+1)*. Preparação do Composto 33: 2,2-dimetil-N-((1s,4s)-4-((7- morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo-hexil)ciclopropano-1- carboxamida HaN q AA o CO o o OQ, ON Wo OO 0 ON nº o
[00493] “Monoidrato de 1-hidroxibenzotriazol (23 mg, 0,170 mmol), 3-(etiliminometilenoamino)-N, N-dimetil-propan-1-amina (Ácido Clorídri- co (1) (49 mg, 0,256 mmol) e ácido 2,2-dimetilciclopropanocarboxílico (18 mg, 0,158 mmol) foram combinados em DMF (280 uL) sob nitro- gênio em temperatura ambiente e deixados agitar por 40 min. 4-(7- Morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexanamina (35 mg, 0,107 mmol) foi adicionada e deixada agitar de um dia para o outro. Bicarbonato de sódio saturado foi adicionado e extraído com EtOAc (2x). Os orgânicos combinados foram lavados com água (2x), salmoura, secos em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi cromato- grafado em coluna de sílica-gel 4 g usando 0-10% de MeOH/DCM co- mo eluente e purificado mais através de HPLC preparativa C18 (água/acetonitrila com modificador de TFA). As frações relevantes fo- ram secas, e o resíduo foi passado por uma PL-HCO3 MP SPE para dar 2,2-dimetil-N-((1s,48)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)óxi)ciclo- hexil)ciclopropano-1-carboxamida (11,5 mg, 25% de rendimento). *H- RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,45 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,78 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5,57 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,74 (q, J = 3,2 Hz, 1H), 4,05 - 3,84 (m, 5H), 3,46 - 3,31 (m, 4H), 2,19 (dq, J= 9,9, 3,3 Hz, 2H), 1,97 - 1,55 (m, 6H), 1,26 (dd, J = 8,0, 5,3 Hz, 1H), 1,17 (s, 3H), 1,15 (s, 3H), 1,09 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 0,73 (dd, J = 8,0, 4,3 Hz, 1H). ESI-MS m/z = 425,33 (M+1)+.
Preparação do Composto 34: N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin- 5-il)óxi)ciclo-hexil)oxetano-3-carboxamida H2N o H O. No. [) ow 3 AA ce o E N
[00494] “Monoidrato de 1-hidroxibenzotriazol (18 mg, 0,133 mmol), 3-(etiliminometilenoamino)-N,N-dimetil-propan-1-amina (Ácido Clorídri- co (1) (38 mg, 0,198 mmol) e ácido oxetano-3-carboxílico (13 mg, 0,127 mmol) e trietilamina (15 uL, 0,1076 mmol) foram combinados em DMF (1 mL) sob nitrogênio em temperatura ambiente e deixados agitar por 40 min. 4-(7-Morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexanamina (27 mg, 0,0822 mmol) foi adicionada, e a reação foi deixada agitar de um dia para o outro. Bicarbonato de sódio saturado foi adicionado e extraído com EtOAc (2x). Os orgânicos combinados foram lavados com água
(2x), salmoura, secos em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado através de cromatografia em sílica-gel 4 g usando gradiente 0-10% de metanol/DCM para forne- cer N-((1s,48)-4-((7-morfolinoquinazolin-S-il)óxi)ciclo-hexil)oxetano-3- carboxamida (4mg, 11% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,42 (s, 1H), 9,08 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,79 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,51 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,95 - 4,72 (m, 5H), 4,10 - 3,84 (m, 5H), 3,70 (tt, J = 8,3, 6,7 Hz, 1H), 3,39 (dd, J = 5,8, 4,0 Hz, 5H), 2,30 - 2,15 (m, 3H), 1,98 - 1,58 (m, 4H). ESI-MS m/z = 413,46 (M+1)+. Preparação do Composto 36: N-[4-(2,4-dimetil-7-morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]-2-metil-pirimidin-4-amina Fo F Oo F O F OC o LO o LO OR F F F NH? F x F A o o e to eo Ab —A
F A O N N E&
E OO Reagentes e condições: (a) NH3, 90ºC, 22h; (b) ACCI, DIEA, DCM; (c) NH3, EtoOH; (d) NaH, PMB-OH, DMF; (e) morfolina, DIEA, iPrOH; (f) TFA, DCM; (g) [4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclo-hexil] metanossul- fonato, CSCO3, DMF Etapa a
[00495] Uma mistura de 1-(2,4,6-trifluorfenil)etanona (7 g, 40,2 mmol) e amônio (40 g, 665 mmol, 30% p/p) foi agitada a 90º C por 22 h em uma garrafa de pressão vedada. Depois de esfriar em temperatu-
ra ambiente, a mistura foi extraída com DCM, seca em Na2SO;, con- centrada e purificada através de cartucho de sílica-gel 120 g eluindo com EtOAc/heptano 0-30%. Isso proveu 1-(2-amino-4,6-difluor- fenil)etanona (5,1 g, 74%). *H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 6,66 - 6,27 (m, 2H), 6,19 - 6,11 (m, 2H), 2,59 (dd, J = 8,4, 1,4 Hz, 3H). Etapa b
[00496] A uma solução de 1-(2-amino-4,6-difluor-fenil)etanona (3,1 g, 18,1 mmol) em DCM (30 mL) foram adicionados DIEA (3,8 mL, 21,8 mmol) e AcCI (2 mL, 28,1 mmol) a O ºC. A mistura foi agitada por 1 he concentrada. O resíduo foi diluído com DCM, lavado solução de NaHCO,» saturado e concentrado in vacuo. O resíduo branco foi carre- gado para a etapa seguinte. Isso proveu N-(2-acetil-3,5-difluor- fenil)acetamida (3,8 g, 17,8 mmol, 98,4%). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 11,66 (s, 1H), 8,39 (ddd, J = 11,7, 2,6, 1,6 Hz, 1H), 6,60 (ddd, J = 12,2, 8,2, 2,6 Hz, 1H), 2,67 (d, J = 8,5 Hz, 3H), 2,24 (s, 3H). Etapa c
[00497] Uma mistura de N-(2-acetil-3,5-difluor-fenil)acetamida (1,7 9, 8 mmol) e 2M de NH3 em EtOH (80 mL de 2 M, 160 mmol) foi agita- da a 90º C por 18 h. A mistura foi concentrada in vacuo e purificada através de cartucho de sílica-gel 40 g com 0-30% EtoAc/hex. Isso pro- veu 5,7-difluor-2,4-dimetil-quinazolina (1,2 9, 77%). *H RMN (300 MHz, CDCI3) 5 7,40 (ddt, J = 9,3, 2,3, 1,2 Hz, 1H), 7,03 (ddd, J = 11,2, 8,9, 2,4 Hz, 1H), 3,01 (dd, J = 6,0, 0,9 Hz, 3H), 2,83 (s, 3H). Etapa d
[00498] A uma solução de (4-metoxifenil)metanol (270 ul, 2,0 mmol) em DMF (5 mL) foi adicionado NaH (110 mg, 2,75 mmol) e a mistura resultante foi agitada por 10 min. À mistura foi adicionada uma solução de 5,7-difluor-2,4-dimetil-quinazolina (350 mg, 1,8 mmol) em DMF (5 mL), e agitação foi continuada por mais 30 min. A mistura foi arrefecida por H2O, extraída com DCM, seca em Na2SOs., concentrada.
O bruto foi purificado através de cartucho de sílica-gel de 40 g eluindo com um gradiente de 0-40% de EtOAc/heptano e proveu 7-flúor-5-[(4- metoxifenil)metóxi]-2,4-dimetil-quinazolina (300 mg, 37%). '"H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 7,51 - 7,36 (m, 2H), 7,17 (dd, J = 9,4, 2,3 Hz, 1H), 7,07 - 6,91 (m, 2H), 6,76 (dd, J = 10,9, 2,4 Hz, 1H), 5,15 (s, 2H), 3,87 (s, 3H), 2,97 (s, 3H), 2,81 (s, 3H). Etapa e
[00499] “Uma mistura de 7-flúor-5-[(4-metoxifenil)metóxi]l-2,4-dimetil- quinazolina (300 mg, 0,96 mmol), morfolina (300 uL, 3,4 mmol) e DIEA (300 uL, 1,7 mmol) em iPrOH (3 mL) foi posta em micro-ondas a 160º C por 20 min. A mistura foi posta em micro-ondas por 30 min a 180º C e então 60 min a 190º C. A mistura foi concentrada, purificada através de cromatografia de sílica-gel eluindo com um gradiente de 0-70% de EtOAc/heptano e proveu 4-[5-[(4-metoxifenil)netóxi]l-2,4-dimetil- quinazolin-7-il]lmorfolina (60 mg, 0,158 mmol, 16,5%). "H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 7,49 - 7,37 (m, 2H), 7,03 - 6,90 (m, 2H), 6,77 (d, J= 2,3 Hz, 1H), 6,58 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,11 (s, 2H), 3,99 - 3,81 (m, 7H), 3,46 - 3,32 (m, 4H), 2,88 (s, 3H), 2,73 (s, 3H). ESI-MS m/z calc. 379,1896, encontrado 380,1 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,6 minutos. Etapa f
[00500] A uma solução de 4-[5-[(4-metoxifenil)metóxi]l-2,4-dimetil- quinazolin-7-illmorfolina (60 mg, 0,16 mmol) em DCM(10 mL) foi adici- onado TFA (1 mL, 13 mmol) e a solução resultante foi agitada por 1 h. A mistura foi concentrada e purificada através de cartucho de sílica-gel de 4 g eluindo com 0-5% de MeOH/DCM para prover 2,4-dimetil-7- morfolino-quinazolin-5-ol (37 mg, 90%). *H RMN (300 MHz, DMSO) à 6,69 (s, 2H), 5,76 (s, 1H), 3,74 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,36 (s, 4H), 2,93 (s, 3H), 2,58 (s, 3H). Etapa q
[00501] Uma mistura de 2,4-dimetil-7-morfolino-quinazolin-5-ol (34 mg, 0,13 mmol), [4-[(2-metilpirimidin-4-il) amino]ciclo-hexil] metanossul- fonato (55 mg, 0,19 mmol) e carbonato de césio (70 mg, 0,21 mmol) em DMF (1 mL) foi agitada a 90º C por 20 h. A mistura foi diluída com DCM, filtrada em uma camada de Celite e concentrada. O bruto foi pu- rificado através de cromatografia de sílica-gel eluindo com 0-10% de MeOH/DCM e proveu N-[4-(2,4-dimetil-r-morfolino-quinazolin-5- il)oxiciclo-hexil]-2-metil-pirimidin-4-amina (6,1 mg, 0,013 mmol, 9,9%). 1H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 8,13 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,93 (d J = 7,9 Hz, 1H), 4,73 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 3,96 - 3,85 (m, 4H), 3,42 - 3,28 (m, 4H), 3,01 (s, 3H), 2,73 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,32 - 2,19 (m, 2H), 2,08 - 1,73 (m, 9H). ESI-MS m/z calc. 448,25867, encontrado 449,32 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,5 minuto.
Preparação de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)óxi-N-(2-piridil)ciclo- hexanocarboxamida: Composto 37 do “Po “o US A) AlMezC! “o LO ue co
CS N ES N 61) (37)
[00502] A uma solução de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxíciclo- hexanocarboxilato de etila (30 mg, 0,078 mmol: Composto (30)) e piri- din-2-amina (15 mg, 0,16 mmol) em tolueno (0,5 mL) sob nitrogênio foi adicionado AlMez2CI (155 ul de 1,0 M, 0,155 mmol) em gotas. Após adição completa, a reação foi aquecida para 80º C por 30 minutos. A reação foi esfriada para temperatura ambiente e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de MPLC em uma coluna de SiO>, de fase reversa C18 usando 5-40% CH3CN (0,1% TFA) em H2O (0,1% TFA). As frações de produto foram combinadas e neutralizadas com
NaHCO; (sat.) e então extraídas com EtOAc. Os extratos orgânicos foram combinados e lavados com salmoura, secos em MgSO:, filtra- dos e concentrados para prover 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)óxi-N-(2- piridil)ciclo-hexanocarboxamida (21,8 mg, 63,3% de rendimento). *H- RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,49 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 8,28 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 8,16 (s, 1H), 7,84 - 7,68 (m, 1H), 7,15 - 7,02 (m, 1H), 6,83 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,59 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,88 - 4,76 (m, 1H), 4,05 - 3,81 (m, 4H), 3,40 (dd, J = 14,8, 10,0 Hz, 4H), 2,59 - 2,42 (m, 1H), 2,42 - 2,25 (m, 2H), 2,25 - 2,04 (m, 2H), 2,04 - 1,71 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 433,2114, encontrado 434,33 (M+1)*.
Preparação do Composto 39: N-[4-(7-bromoquinazolin-5- il)oxiciclo-hexil]-2-metil-pirimidin-4-amina
H OH . DO Wo, ss PS Br Ná NZ o DMF LO Br N (39)
[00503] “Um frasco de micro-ondas equipado com uma barra de agi- tação magnética foi carregado com 7-bromoquinazolin-5-ol (31,3 mg, 0,139 mmol), [4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclo-hexil] metanossulfo- nato (120 mg, 0,421 mmol) e Cs2CO;3 (136 mg, 0,417 mmol) em DMF (0,5 mL). O frasco foi vedado e aquecido no micro-ondas a 120º C por minutos. A reação foi considerada incompleta de modo que a rea- ção foi aquecida no micro-ondas a 120º C por 10 minutos e então a 140º C por 10 minutos. A reação foi filtrada e purificada em uma colu- na de SiO> derivatizada C18 de fase reversa. O produto foi neutraliza- do através de dissolução em acetato de etila e lavagem com NaHCO;z aquoso saturado. As camadas foram separadas, e a aquosa extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados e lavados com salmou- ra, secos em MgSO:, filtrados e concentrados para prover N-[4-(7-
bromoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexil]-2-metil-pirimidin-4-amina (19,3 mg, 32,4% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,72 (s, 1H), 9,33 (s, 1H), 8,12 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 6,22 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,04 (s, 1H), 4,90 - 4,75 (m, 1H), 3,90 (s, 1H), 2,54 (s, 3H), 2,36 - 2,18 (m, 2H), 2,14 - 1,59 (m, 6H). ESI- MS m/z calc. 413,0851, encontrado 414,17 (M+1)*.
Preparação do Composto 40: N-metil-4-(7-morfolinoquinazolin-5- il)óxi-ciclo-hexanocarboxamida “Po é to 181) (40-A) (40)
[00504] A uma solução de cloriddato do ácido 4(7- morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexanocarboxílico (46,4 mg, 0,118 mmol), metilamina (100 ul de 2M, 0,200 mmol) e HATU (55 mg, 0,14 mmol) em THF (1 mL) e DMF (1 mL) foi adicionado DIPEA (95 uL, 0,55 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. A reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparatória C18 (água/acetonitrila com modificador de TFA). As frações relevantes foram secas e neutralizadas com NaHCO; (sat.) e então extraídas com EtOAc. Os extratos orgânicos foram combina- dos e lavados com salmoura, secos em MgSO:,, filtrados e concentra- dos para prover N-metil-4-(7-morfolinoquinazolin-S-il)óxi-ciclo- hexanocarboxamida (30 mg, 63% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,47 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,83 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 5,67 - 5,49 (m, 1H), 4,83 - 4,75 (m, 1H), 3,95 - 3,85 (m, 4H), 3,48 - 3,36 (m, 4H), 2,87 (d, J = 4,8 Hz, 3H), 2,38 - 2,24 (m, 3H), 2,11 - 1,84 (m, 4H), 1,83 - 1,67 (m, 2H). ESI-MS m/z calc. 370,2005, encontrado 371,38 (M+1)*.
Preparação do Composto 41: N-(3-metoxipropil)-4-(7-
morfolinoquinazolin-5-il)óxi-ciclo-hexanocarboxamida o o q o Ad, ND f, ” O, mo - VU, SS DD O, > O o 61) (41-0) (41)
[00505] A uma solução de cloriddato do ácido 4(7- morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclo-hexanocarboxílico (46 mg, 0,13 mmol), 3-metoxipropan-1-amina (13 mg, 0,45 mmol) e HATU (55 mg, 0,14 mmol) em THF (1 mL) foi adicionado DIPEA (95 yuL, 0,55 mmol). A re- ação foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. A reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de MPLC em uma coluna de SiO, de fase reversa C18 usando CH3CN 5-50% (0,1% TFA) em H2O (0,1% TFA). As frações de produto foram combinadas e neutralizadas com NaHCO; (sat.) e então extraídas com EtOAc. Os extratos orgânicos foram combinados e lavados com salmoura, secos em MgSO:,, filtrados e concentrados para prover N-(3-metoxipropil)-4- (7-morfolinoquinazolin-S5-il)óxi-ciclo-hexanocarboxamida “(394 mg, 69,3% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 9,47 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 6,81 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,38 - 6,21 (m, 1H), 4,83 - 4,72 (m, 1H), 3,98 - 3,84 (m, 4H), 3,53 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,49 - 3,29 (m, 9H), 2,40 - 2,19 (m, 3H), 2,12 - 1,63 (m, 8H). ESI- MS m/z calc. 428,24237. Preparação do Composto 42: 2-[[4-(2,4-dimetil-7-morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexilJamino]-N-metil-pirimidina-4- carboxamida:
Ant O ATA o.
ALA O LO nt TCA, cê o A Reagentes e condições: (a) TFA, DCM; (b) [4-[[4-(metilcarbamoil)- pirimidin-2-illamino]ciclo-hexil]l metanossulfonato, CsCO3, DMF; (c) morfolina, DIEA, iPrOH Etapa a
[00506] A uma solução de 7-flúor-5-[(4-metoxifenil)netóxil-2,4- dimetil-quinazolina (130 mg, 0,41 mmol) em DCM (1mL) foi adicionado TFA (0,5 mL, 6,5 mmol) e agitação foi continuada em temperatura am- biente por 1 h. A mistura foi concentrada e purificada em um cartucho de sílica-gel de 12 g eluindo com 0-4% MeOH/DCM para prover 7- flúor-2,4-dimetil-quinazolin-5-0l (70 mg, 87%). '"H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 7,00 (ddd, J = 28,8, 9,8, 2,4 Hz, 2H), 3,17 (s, 3H), 2,87 (s, 3H). Etapa b
[00507] Uma mistura de 7-flúor-2,4-dimetil-quinazolin-5-ol (45 mg, 0,23 mmol), [4-[[4-(metilcarbamoil)-pirimidin-2-ilJamino]ciclo-hexil] me- tanossulfonato (120 mg, 0,36 mmol) e carbonato de césio (200 mg, 0,61 mmol) em DMF (1 mL) foi agitada a 90 ºC por 20 h. A mistura foi diluída com DCM, filtrada em uma camada de celite, concentrada a purificada através de cartucho de sílica-gel de 4 g usando 0-5% de MeOH/DCM para prover 2-[[4-(7-flior-2,4-dimetil-quinazolin-5- iN)oxiciclo-hexillamino]-N-metil-pirimidina-4-carboxamida (10 mg, 10%). ESI-MS m/z calc. 424,2, encontrado 425,3 (M+1)+; Tempo de reten- ção: 0,55 minutos.
Etapa c
[00508] Uma mistura de 2-[[4-(7-flúor-2,4-dimetil-quinazolin-5- iN)oxiciclo-hexilJamino]-N-metil-pirimidina-4-carboxamida (10 mg, 0,023 mmol), morfolina ( 200 uL, 2,3 mmol) e DIEA (400 yuL, 2,3 mmol) em IPrOH (0,5 mL) foi agitada a 90 ºC por 3 dias. A mistura foi concentra- da e purificada através de HPLC preparativa C18 (água/acetonitrila com modificador de TFA). As frações relevantes foram secas, e o resí- duo foi passado através de um PL-HCO3 MP SPE para prover 2-[[4- (2,4-dimetil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclo-hexilJamino]-N-metil- pirimidina-4-carboxamida (3,2 mg, 25%). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 8,52 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,36 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,55 - 6,47 (m, 1H), 5,19 (s, 1H), 4,75 (s, 1H), 4,15 - 4,00 (m, OH), 3,90 (dd, J = 6,0, 3,8 Hz, 4H), 3,43 - 3,32 (m, 4H), 3,11 - 2,98 (m, 6H), 2,80 (s, OH), 2,33 - 2,18 (m, 2H), 2,143 - 1,77 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 491,2645, encontrado 492,3 (M+1)+; Tempo de re- tenção: 0,54 minutos. Preparação do Composto 43: 2-metóxi-N-[4-(4-metóxi-7-morfolino- quinazolin-5-il)oxiciclo-hexiljacetamida Preparação do Composto (43-A)
HH Ô Impror O > “ek, o x! H= nº Q
H no (43)
[00509] A uma solução a 0º C de 4-aminociclo-hexan-1-ol (5,01 g, 42,19 mmol) em DCM (50 mL) foi adicionado DIEA (14,7 mL, 84,39 mmol) seguido por cloreto de 2-metoxiacetila (4,4 mL, 47,31 mmol) em gotas. A reação foi agitada por 5 min, então o banho gelado foi remo- vido e a reação foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. A mistura de reação foi então transferida para um funil de separação, a camada orgânica foi lavada com HCI IN, a camada aquosa extraída com EtOAc, as camadas orgânicas foram combina- das, secas em Na>SO;, filtradas e concentradas para um sólido amar- ronzado para prover 2,4 g de produto bruto. Esse produto bruto foi dis- solvido em DCM e injetado em uma coluna ISCO de 80 mg, detector de ELSD, 0-7% de MeOH/DCM. As frações desejadas foram combina- das e concentradas sob vácuo para prover N-(4-hidroxiciclo-hexil)-2- metóxi-acetamida (800 mg). *H-RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) 5 6,32 (s, 1H), 3,86 (s, 2H), 3,79 (ddd, J = 11,7, 8,1, 3,9 Hz, 1H), 3,62 (tt, J = 10,5, 3,9 Hz, 1H), 3,41 (d, J = 0,6 Hz, 3H), 2,00 (dtd, J = 11,8, 7,7, 7,1, 3,5 Hz, 4H), 1,47 - 1,35 (m, 2H), 1,31 - 1,17 (m, 2H). Preparação do Composto (43-B) y y K nes “no o º o R % As" H É > (43-A) (43-B)
[00510] A uma solução de N-(4-hidroxiciclo-hexil)-2-metóxi- acetamida (800 mg, 4,144 mmol) em DCM (9,467 mL) foram adiciona- dos DIEA (1,130 g, 1,523 mL, 8,744 mmol) e MsCI (515,0 mg, 348,0 uL, 4,496 mmol). A mistura foi agitada por 0,5 h e diluída com DCM, lavada com H2O, seca em Na>2S0O;, filtrada através de uma almofada fina de sílica-gel, a almofada de sílica foi lavada com DCM e concen- trada. [4-[(2-Metoxiacetil)amino]ciclo-hexil] metanossulfonato foi obtido como um sólido esbranquiçado (1,09 g, 99,1% de rendimento). *H- RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 6,36 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,65 (m, 1H), 3,87 (m, 3H), 3,41 (s, 3H), 3,02 (s, 3H), 2,22 - 2,01 (m, 4H), 1,81 - 1,64 (m, 2H), 1,40 - 1,24 (m, 2H).
Preparação do Composto (43) o b Qu, to O N TO =H FAT —> AO O
SOTO O. H x & (9-A) O " (43-B) (43)
[00511] Uma mistura de [4-[(2-metoxiacetil)amino]ciclo-hexil] meta- nossulfonato (75 mg, 0,2827 mmol), 4-metóxi-7-morfolino-quinazolin-5- ol (sal de ácido trifluoracético: Composto (9-A)) (54 mg, 50% de pure- za, 0,07194 mmol) e Cs2CO;3 (251 mg, 0,7704 mmol) em DMF foi sela- da em um tubo de micro-ondas de 5 mL e aquecida para 100º C. Re- movida do aquecimento e agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro, a mistura de reação foi filtrada, concentrada e dissolvida em DCM e injetada em uma coluna ISCO de 4 g e eluída com 0-10% MeOH/DCM. As frações desejadas foram coletadas, combinadas e concentradas para prover 22 mg de produto impuro. Esse material foi dissolvido em MeOH e purificado em uma coluna C18 para prover 24 mg de óleo amarelo. Esse material foi dissolvido em DCM e passado através de um cartucho de carbonato Stratospheres para prover uma solução transparente que foi concentrada sob vácuo e seca de um dia para o outro sob vácuo alto para prover 2-metóxi-N-[4-(4-metóxi-7- morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclo-hexilJacetamida (14 mg, 43,8% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) 5 8,48 (s, 1H), 7,54 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,84 (m, 1H), 4,04 (s, 3H), 3,79 (s, 2H), 3,75 (m, 5H), 3,35 (m, 4H), 3,30 (s, 3H), 2,01 (m, 2H), 1,84 - 1,53 (m, 6H). Preparação do Composto 44: 2-[[4-[4-(dimetilamino)-7-morfolino- quinazolin-5-ilJoxiciclo-hexilJamino]-N-metil-pirimidina-4-
carboxamida Preparação de 2-[(4-hidroxiciclo-hexil)amino]-N-metil-pirimidina-4- carboxamida: Composto (44-A)
HH nu fo P no NÓS AO O — Ta o H= H nº º (44-A)
[00512] A uma mistura de 2-cloro-N-metil-pirimidina-4-carboxamida (4,5 g, 26,23 mmol), 4-aminociclo-hexan-1-o0l (3 g, 26,05 mmol) em iPrOH (25,00 mL) foi adicionado DIEA (6 mL, 34,45 mmol) e refluxo de um dia para o outro, então concentrada para prover 4,2 g (96%) de 2- [(4-hidroxiciclo-hexil)amino]-N-metil-pirimidino-4-carboxamida. *H-RMN (300 MHz, CDCI3) ? 8,48 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,34 (d J= 4,9 Hz, 1H), 3,80 (dtt, J = 39,2, 9,9, 3,8 Hz, 2H), 3,51 (s, 1H), 3,03 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,29-0 2,00 (m, 4H), 1,65-1,22 (m, 4H). Preparação de 4-(dimetilamino)-7-morfolino-quinazolin-5-0l: Composto (44-B)
VE O
E GR 2N
Ó HO AN p. (58-A) (44-8)
[00513] Uma solução de 5-[(4-metoxifenil)mnetóxi]l-N, N-dimetil-7- morfolino-quinazolin-4-amina (370 mg, 0,8911 mmol) em DCM (4,456 mL) e TFA (5 mL, 64,90 mmol) foi agitada a 50 ºC por 3 h. A reação foi então concentrada até secagem, tratada com bicarbonato de sódio aquoso saturado e extraída 3 x com EtOAc. Os orgânicos combinados foram concentrados até secagem, dissolvidos em EtOAc mínimo e go-
tejados em heptano. O precipitado castanho resultante foi filtrado e seco para prover 4-(dimetilamino)-7-morfolino-quinazolin-5-0l como um sólido castanho (240 mg, 0,8749 mmol, 98,20%) que foi usado sem purificação adicional. ESI-MS m/z calc. 274,14297, encontrado 275,0 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,55 minuto. Preparação de [4-[[4-(metilcarbamoil)pirimidin-2-illamino]ciclo-hexil] metanossulfonato: Composto (44-C) “O NS XO NS LÁ A ma o AA Y o H o (44-A) (44-C)
[00514] A uma solução de 2-[(4-hidroxiciclo-hexil)amino]-N-metil- pirimidina-4-carboxamida (4,3 g, 17,18 mmol) em DCM(50 mL) foram adicionados DIEA (15 mL, 86,12 mmol) e MsCI (2,8 mL, 36,18 mmol). A solução foi agitada por 3 h, então concentrada e purificada a partir de cartucho de sílica-gel de 80 g com 0-100% de EtoAc/hex para pro- ver [4-[[4-(metilcarbamoil)pirimidin-2-ilJamino]ciclo-hexil] metanossulfo- nato (5,2 g, 15,83 mmol, 92,17%). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 8,49 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,36 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 5,15 (s, 1H), 4,73 (tt, J = 10,3, 3,8 Hz, 1H), 3,92 (dtd, J = 10,7, 7,5, 3,7 Hz, 1H), 3,11 - 2,98 (m, 6H), 2,23 (dq, J = 12,7, 3,1, 2,5 Hz, 4H), 1,92 - 1,63 (m, 4H). Preparação de 2-[[4-[4-(dimetilamino)-7-morfolino-quinazolin-5- ilJoxiciclo-hexillamino]-N-metil-pirimidina-4-carboxamida: Composto (44)
Nos
NJ N VOL oa NON > RN HS (44-C) Po É) o (44-B) DA (44)
[00515] 4-(Dimetilamino)-7-morfolino-quinazolin-5-ol (75 mg, 0,2734 mmol), [4-[[4-(metilcarbamoil)pirimidin-2-ilJamino]ciclo-hexil] metanos- sulfonato (125,7 mg, 0,3828 mmol) e carbonato de césio (267,2 mg, 0,8202 mmol) em DMF (1,367 mL) foram agitados de um dia para a noite em um tubo selado a 100º C. Adicionado mais 0,7 eq. de mesila- to e agitado a 100º C por mais 3 h. A reação foi então diluída com água e extraída 3x EtOAc. Os orgânicos combinados foram concen- trados até secagem e purificados através de cromatografia rápida elu- indo com 0-20% de MeOH em DCM. As frações puras foram combina- das, concentradas e liofilizadas para prover 2-[[4-[4-(dimetilamino)-7- morfolino-quinazolin-5-ilJoxiciclo-hexillamino]-N-metil-pirimidina-4- carboxamida (19,7 mg, 0,03694 mmol, 13,51%). '*H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 8,49 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,76 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,54 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,13 (s, 1H), 4,55 (s, 1H), 4,06 - 3,78 (m, 5H), 3,31 (dd, J = 14,5, 9,7 Hz, 4H), 3,15 (s, 6H), 3,02 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,12 - 2,00 (m, 2H), 1,81 (dd, J = 30,2, 11,2 Hz, 6H). ESI-MS m/z calc. 506,2754, en- contrado 507,0 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,64 minuto. Preparação do Composto 51: 5-[(4-metoxifenil)]metóxi]l-7- morfolino-3H-quinazolin-4-ona
F. Não a VP “OO o O o H é GG
N a.
o o (51)
[00516] A uma mistura de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metóxil-3H- quinazolin-4-ona (1,38 g, 3,821 mmol), tButóxido (Íon de sódio (1)) (1,11 g, 11,55 mmol), PAd(OAc)2 (43 mg, 0,1915 mmol) e RuPhos (176 mg, 0,3772 mmol) foi adicionada uma solução de morfolina (467 uL, 5,355 mmol) em 1,4-dioxana (16,8 mL) (adicionados 14 mL primeiro, então mais 2,8 mL porque a mistura não agitou bem). A mistura resul- tante foi aquecida a 100º C de um dia para o outro. A mistura foi esfri- ada para temperatura ambiente e dividida entre DCM e NHaCI aquoso saturado. As camadas foram separadas, e a água e sólidos flutuantes foram lavados com DCM. As camadas orgânicas foram combinadas, e a camada aquosa foi filtrada. Todas as camadas orgânicas foram combinadas e secas em Na>2SO;, filtradas e concentradas para prover 1,3 g de produto. Esse material foi dissolvido em DCM e MeOH e puri- ficado através de cromatografia de coluna rápida (coluna de 40 gra- mas equilibrada com DCM, eluída com MeOH/DCM 0-10% durante 20 min) para prover 240 mg de sólido branco. O material sólido dos filtra- dos e as camadas aquosas foram dissolvidos em MeOH/DCM, combi- nados e concentrados, redissolvidos em mistura de DOCM/MeOH e 14 q de celite foram adicionados. Essa mistura foi concentrada quase até secagem, carregada em coluna ISCO de 40 g e eluída como acima para prover produto como um sólido branco (370 mg). As primeiras frações dessa coluna foram concentradas para prover produto adicio- nal (480 mg) como um sólido esbranquiçado. Os materiais brutos fo-
ram combinados para prover 1,1 grama de 5-[(4-metoxifenil)metóxi]-7- morfolino-3H-quinazolin-4-o0na. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 11,45 (s, 1H), 7,83 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 7,57 - 7,45 (m, 2H), 6,99 - 6,87 (m, 2H), 6,60 (dd, J = 39,0, 2,3 Hz, 2H), 5,13 (s, 2H), 3,75 (m, 7H), 3,31 (m, 4H).
Preparação do Composto 52: 4-[5-[(4- metoxifenil)]metóxilquinazolin-7-iljJmorfolina São ço 2N 2N O Cd — Oo SA: (54) (52)
[00517] A uma solução de 4-[4-cloro-5-[(4- metoxifenil)metóxilquinazolin-7-illmorfolina (8,0 g, 20,73 mmol) em CH2CIl2 (470 mL) foi adicionado NaCl (360 mL). A mistura bifásica re- sultante foi aquecida para refluxo (banho de esferas de alumínio de 55º C), e NHXOH (100 mL de 30% p/v, 856,0 mmol) e zinco (45,0 9, 688,0 mmol) foram adicionados. Aquecimento foi continuado por 2,5 h. A mistura foi filtrada em celite, e a almofada do filtro foi lavada com CH2Cl2 e H2O. O filtrado foi separado em camadas aquosas e orgâni- cas. A aquosa foi extraída mais com CH2Cl2 (2x), lavada com salmou- ra, seca (Na2SO;), filtrada e concentrada. O resíduo bruto foi carrega- do seco em Celite e purificado através de cromatografia de sílica-gel (coluna Isco 220 g, gradiente linear 0%-10% de MeOH/CH2CI2) para prover 4-[5-[(4-metoxifenil)metóxilquinazolin-7-illmorfolina (3,96 go, 10,14 mmol, 48,92%), -90-95% puro. *H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,42 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 7,41 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,01 - 6,92 (m, 2H), 6,79 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,64 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5,16 (s, 2H), 3,95 - 3,86 (m, 4H), 3,84 (s, 3H), 3,44 - 3,31 (m, 4H). ESI-MS m/z calc.
351,1583, encontrado 352,39 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,63 minu- to. Preparação de 4-[4-metóxi-5-[(4-metoxifenil)netóxi]lquinazolin-7- illJmorfolina: Composto 53 "om Pos 2N 2N O Cd —> O A O. Ç (53)
[00518] — 4-[4-Cloro-5-[(4-metoxifenil)metóxilquinazolin-7-il]morfolina (450 mg, 1,166 mmol), metanol (0,236 mL, 5,826 mmol), KCO;3 (322 mg, 2,330 mmol) e DMF (5,0 mL) foram combinados em um recipiente de micro-ondas e aquecidos no micro-ondas para 150º C por 30 minu- tos, resultando em conversão parcial conforme considerado por LCMS. Aquecido novamente no micro-ondas para 175º C por 1 h. A mistura de reação foi filtrada em uma frita de vidro, e o solvente foi evaporado. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel (coluna Isco gold 12 g, gradiente linear 0%-10% de MeOH/CH2Cb) pa- ra prover 4-[4-metóxi-5-[(4-metoxifenil)metóxilquinazolin-7-il]morfolina (206 mg, 0,5347 mmol, 45,86%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) à 8,61 (s, 1H), 7,55 - 7,43 (m, 2H), 7,04 - 6,93 (m, 2H), 6,84 (d, J= 2,4 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,16 (s, 2H), 4,13 (s, 3H), 3,95 - 3,88 (m, 4H), 3,86 (s, 3H), 3,42 - 3,380 (m, 4H)... ESI-MS m/z calc. 381,16885, encontrado 382,32 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,65 mi- nuto. Preparação do Composto 54: 4-[4-cloro-5-[(4- metoxifenil)netóxilquinazolin-7-il]morfolina
SR Ny 2N O O ——, o Cc cc (51) (54)
[00519] A uma suspensão de 5-[(4-metoxifenil)metóxil-7-morfolino- 3H-quinazolin-4-ona (Composto (51): 18,60 g, 47,08 mmol) em tolueno (250 mL) foi adicionada N, .N-diisopropiletilamina (41,00 mL, 235,4 mmol) seguido por POCI3 (17,55 mL, 188,3 mmol). A reação foi aque- cida a 80º C por 3 h. A reação foi diluída com CH2CI? e despejada em NaHCO; aquoso saturado. As camadas foram separadas e a aquosa extraída mais com CH2Cl2. A camada orgânica combinada foi seca (Na2SO:), filtrada e concentrada para um sólido amorfo laranja. O re- síduo bruto foi carregado seco em Celite e purificado através de cro- matografia de sílica-gel (coluna Isco gold 40 g, gradiente linear 0%- 15% de MeOH/CH2CI2) para prover 4-[4-cloro-5-[(4- metoxifenil)metóxilquinazolin-7-il]morfolina (11,977 g, 31,04 mmol, 65,92%). *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,71 (s, 1H), 7,51 - 7,40 (m, 2H), 7,01 - 6,89 (m, 2H), 6,84 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,16 (s, 2H), 3,93 - 3,85 (m, 4H), 3,83 (s, 3H), 3,43 - 3,34 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 385,11932, encontrado 386,32 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,77 minuto. Preparação do Composto 55: W 5-[(4-metoxifenil)metóxi]l-7- morfolino-quinazolino-4-carbonitrila ca ca
GR SR ço o o (54) (55)
[00520] Uma mistura de 4-[4-cloro-5-[(4- metoxifenil)metóxilquinazolin-7-illmorfolina (400 mg, 1,037 mmol), KCN (204 mg, 3,133 mmol), p-toluenossulfonato de sódio (132 mg, 0,6798 mmol) e DMF (7,2 mL) foi selada e aquecida para 80º C por 16h. À mistura de reação foi dividida entre H2O e CH2Cl2. As camadas foram separadas, e a aquosa extraída mais com CH2Cl2 (2 x 20 mL). Os or- gânicos combinados foram lavados duas vezes com água e uma vez com salmoura, secos (Na2SO;:), filtrados e concentrados. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de sílica-gel (coluna Iscol gold 12 g, gradiente linear 0%-10% de MeOH/CH2CI2) para prover 5- [(4-metoxifenil)metóxi]l-7-morfolino-quinazolino-4-carbonitrila (263,5 mg, 0,7000 mmol, 67,51%). Seco sob vácuo para remover DMF resi- dual. *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 9,08 (s, 1H), 7,53 - 7,43 (m, 2H), 6,98 - 6,91 (m, 2H), 6,81 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,69 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,29 (s, 2H), 3,95 - 3,85 (m, 4H), 3,82 (s, 3H), 3,48 - 3,36 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 376,15353, encontrado 377,32 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,81 minuto.
Preparação do Composto 56: 4-[4-ciclopropil-5-[(4- metoxifenil)]metóxilquinazolin-7-il]Jmorfolina o o o o o morfolina o o POC, DIPEA S Cc + D>—nmaBr LO NvP DO tolueno LDO o
XE A A (56-B) (56-C) qua o
ÉÓ “S
O N (o) Preparação do Composto (56-B)
[00521] Uma solução de 7-flior-b-[(4-metoxifenil)netóxil-3H- quinazolin-4-ona (5,63 g, 18,8 mmol) e morfolina (33 mL, 380 mmol) em NMP anidro (60 mL) foi aquecida para 120º C de um dia para o outro. A reação foi esfriada para temperatura ambiente e diluída com água. O precipitado foi filtrado e seco sob vácuo a 55º C para prover 5- [(4-metoxifenil)netóxi]-7 -morfolino-3H-quinazolin-4-ona (3,26 g, 47,3% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, DMSO) 5 11,46 (s, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,51 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,95 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,60 (dd, J = 29,8, 2,1 Hz, 2H), 5,14 (s, 2H), 3,90 - 3,58 (m, 7H), 3,31 (s, 4H). Preparação do Composto (56-C)
[00522] A uma suspensão de 5-[(4-metoxifenil)metóxi]l-7-morfolino- 3H-quinazolin-4-0na (2,0 g, 5,4 mmol) em tolueno (25 mL) foi adicio- nado DIPEA (5,69 mL, 32,7 mmol) seguido por POCI3 (2,54 mL, 27,3 mmol). A reação foi aquecida para 80º C por 3,5 horas. A reação foi esfriada para temperatura ambiente, diluída com água e extraída com EtOAc/DCM. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos em MgSO:;, filtrados e concentrados. O resíduo foi purificado através de cromatografia rápida usando EtOAc e heptano para prover 4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenil)metóxilquinazolin-7-il]morfolina (1,46 g, 69,5% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 8,73 (s, 1H), 7,52 - 7,41 (m, 2H), 7,04 - 6,91 (m, 2H), 6,87 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,19 (s, 2H), 3,98 - 3,87 (m, 4H), 3,86 (s, 3H), 3,48 - 3,35 (m, 4H). Preparação do Composto (56)
[00523] A uma mistura de 4-[4-cloro-5-[(4- metoxifenil)metóxilquinazolin-7-illmorfolina (200 mg, 0,520 mmol) e Fe(acac)3 (55 mg, 0,16 mmol) em THF (5 mL) e NMP (0,25 mL) sob nitrogênio foi adicionado brometo de (ciclopropil)magnésio (1,20 mL de 0,5 M, 0,6000 mmol) em gotas. A reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi considerada incompleta e 1 mL de brometo de (ciclopropil)magnésio foi adicionado em gotas e continuado a agitar em temperatura ambiente por 5,5 horas. A reação foi despejada em um funil de separação contendo NH.CI gelado e ex- traída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos em MgSO:, filtrados e concentrados. O resíduo foi purificado através de cromatografia rápida usando EtOAc e heptano para prover — 4-[4-ciclopropil-5-[(4-metoxifenil)metóxilquinazolin-7- illmorfolina (176 mg, 84,8% de rendimento). *H-RMN (300 MHz, CDCI3) 5 8,79 (s, 1H), 7,48 - 7,35 (m, 2H), 7,00 - 6,88 (m, 2H), 6,83 (d, J =2,3 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,15 (s, 2H), 3,93 - 3,85 (m, 4H), 3,84 (s, 3H), 3,48 - 3,28 (m, 5H), 1,35 - 1,22 (m, 2H), 0,99 - 0,86 (m, 2H). ESI-MS m/z calc. 391,1896, encontrado 392,25 (M+1)*. Preparação do Composto 57: 5-[(4-metoxifenil)netóxi]-N-metil-7- morfolino-quinazolin-4-amina
O e” Na is o c ————> Nº & O (54) (57)
[00524] A uma solução de 4-[4-cloro-5-[(4- metoxifenil)metóxilquinazolin-7-il]morfolina (500 mg, 1,296 mmol) em 1,4-dioxana (6,480 mL) foi adicionada metilamina (3,240 mL de 2 M, 6,480 mmol) em THF. A reação foi aquecida por 15 minutos a 60º C. À reação foi diluída com água e extraída com EtOAc (3x). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura, concentrados até secagem, dissolvidos em EtOAc mínimo e gotejados em heptanos frios enquanto agitando vigorosamente. O produto laranja claro resultante foi filtrado e seco de um dia para o outro sob vácuo a 50º C para obter 5-[(4- metoxifenil)metóxi]-N-metil-7-morfolino-quinazolin-4-amina (378 mg, 0,9638 mmol, 74,36%). *H-RMN (300 MHz, DMSO) 5 8,22 (s, 1H), 7,88 (t, J = 4,6 Hz, 1H), 7,48 (dd, J = 9,1, 2,4 Hz, 2H), 7,02 - 6,93 (m, 2H), 6,74 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,51 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,33 (s, 2H), 3,77 - 3,71 (m, 7H), 3,28 - 3,18 (m, 4H), 2,92 (d, J = 4,7 Hz, 3H). ESI- MS m/z calc. 380,18484, encontrado 381,0 (M+1)+; Tempo de reten- ção: 0,73 minuto.
Preparação do Composto 58: 5-[(4-metoxifenil)netóxi]-N,N- dimetil-7-morfolino-quinazolin-4-amina NO o à — O NO
LS o O (168)
[00525] — 4-[4-Cloro-5-[(4-metoxifenil)metóxilquinazolin-7-il]morfolina (500 mg, 1,296 mmol), dimetilamina (Ácido Clorídrico (1)) (528,4 mg, 563,3 uL, 6,480 mmol) e trietilamina (1,311 g, 1,806 mL, 12,96 mmol) em 1,4-dioxana (6,480 mL) foram agitados a 60º C por 2 h. A mistura de reação foi diluída com água e extraída 3x EtOAc. Os orgânicos combinados foram concentrados até secagem, dissolvidos em EtOAc mínimo e gotejados em heptano frio enquanto agitando vigorosamen- te. O produto castanho resultante foi filtrado e seco de um dia para o outro sob vácuo a 50º C para prover 384 g (71,4%) de 5-[(4- metoxifenil)metóxi]-N, N-dimetil-7-morfolino-quinazolin-4-amina que foi levada adiante como é para a reação seguinte. 5-[(4- metoxifenil)metóxi]-N, N-dimetil-7 -morfolino-quinazolin-4-amina (384 mg, 0,9248 mmol, 71,36%) 1H RMN (300 MHz, DMSO) à 8,21 (s, 1H), 7,42 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 7,05 - 6,94 (m, 2H), 6,79 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,14 (s, 2H), 3,79 - 3,73 (m, 7H), 3,35 - 3,31 (m, 4H), 2,91 (s, 6H). ESI-MS m/z calc. 394,2005, encontrado 395,0 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,74 minuto. Preparação de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metóxi]-3H-quinazolin-4- ona: Composto 59 u Br. s
O SS VT nN — É
O EF 2º o (59)
[00526] A uma solução de (4-metoxifenil)metanol (31,1 g, 225,1 mmol) em DMF (279,9 mL) foi adicionado NaH (9,31 g, 232,8 mmol). À mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 1 h. 7- Bromo-5-flúor-3H-quinazolin-4-0na (27,33 g, 112,5 mmol) foi adiciona- do, e agitação foi continuada por mais 2 h. Arrefecida através da adi- ção de água (600 mL), então adicionado ACOH para realizar precipita-
ção de um sólido. O sólido foi coletado através de filtragem a vácuo, lavagem com água, então Et2O. O sólido foi seco em vácuo alto de um dia para o outro para prover 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metóxi]l-3H- quinazolin-4-ona (34,32 g, 80,2%). *H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) à 12,07 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,55 - 7,42 (m, 2H), 7,37 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,03 - 6,90 (m, 2H), 5,20 (s, 2H), 3,76 (s, 3H) Exemplo 2: ensaio biológico dos compostos da invenção A. Ensaio de Inibição de DNA-PK
[00527] Os compostos foram avaliados quanto à sua habilidade em inibidor DNA-PK cinase usando um ensaio radiométrico padrão. Em suma, nesse ensaio de cinase a transferência do *ºP-fosfato terminal em ??P-ATP para um substrato de peptídeo é interrogado. O ensaio foi realizado em placas de 384 poços para um volume final de 50 ul por cavidade contendo aproximadamente 6 nM de DNA-PK, 50 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, NaCl 25 mM, 0,01% de BSA, 1 mM de DTT, 10 ug/mL de DNA de filamento duplo cisalhado (obtido da Sigma), 0,8 mg/mL de peptídeo de DNA-PK (Glu-Pro-Pro-Leu-Ser-Gln- Glu-Ala-Phe-Ala-Asp-Leu-Trp-Lys-Lys-Lys, obtido da American Pepti- de) e 100 uM de ATP. Desta maneira, os compostos da invenção fo- ram dissolvidos em DMSO para perfazer 10 mM de soluções de esto- que iniciais. Diluições seriais em DMSO foram então feitas para obter as soluções finais para o ensaio. Uma alíquota de 0,75 ul de DMSO ou inibidor em DMSO foi adicionada a cada poço, seguido pela adição de solução de substrato de ATP contendo *ºP-ATP (obtido da Perkin Elmer). A reação foi iniciada através da adição de DNA-PK, peptídeo e ds-DNA. Depois de 45 min, a reação foi arrefecida com 25 uL de ácido fosfórico 5%. A mistura de reação foi transferida para placas PH de 384 poços MultiScreen HTS (obtidas da Millipore), deixada se ligar por uma hora e lavada três vezes com ácido fosfórico 1%. Seguindo a adi-
ção de 50 uL de cintilante de alta eficiência Ultima Gold'" (obtido da Perkin Elmer), as amostras foram contadas em um Packard TopCount NXT Microplate Scintillation and Luminescence Counter (Packard BioScience). Os valores de K; foram calculados usando Microsoft Excel Solver macros para ajustar os dados ao modelo cinético para inibição de forte ligação competitiva. Nas Tabelas 1 e 2 abaixo, Ki de menos do que 0,001 micromolar para a inibição de DNA-PK é indicado como "A"; K; igual a ou maior do que 0,001 micromolar e menos do que 0,01 mi- cromolar para a inibição de DNA-PK como "B"; K; igual a ou maior do que 0,01 micromolar e menos do que 0,1 micromolar para a inibição de DNA-PK como "C"; K; igual a ou maior do que 0,1 micromolar e menos do que 1 micromolar para a inibição de DNA-PK para "D"; e K igual a ou menor do que 1 micromolar como "E". B. Ensaio Celular de DNA-PK
[00528] —"DNA-PK é recrutado para e ativado por quebras de filamen- to duplo (DSB) em DNA e desempenha um papel crítico no mecanis- mo de reparo de união de extremidades não homólogas (NHEJ). Quando da ativação, DNA-PK sofre autofosforilação rápida em Ser2056. A medição de pDNA-PK (Ser2056) em resposta a DSBs de DNA provê um ensaio de sinalização celular para avaliar inibidores de DNA-PK cinase potenciais.
[00529] — Neocarzinostatina (NCS) foi usada como um radiomimético para induzir DSBs de DNA. O ELISA intercalado usou a plataforma de tecnologia de eletroquimioluminescência Meso Scale Discovery que provê tipicamente sensibilidade maior do que formatos de ELISA tradi- cionais. Validação interna demonstrou que esse ensaio permite medi- ção altamente específica e quantitativa de PDNA-PK (Ser2056).
[00530] Células AS49 (NSCLC humana) são plaqueadas a 25.000 células/poço em 100 ul de DMEM (No. cat. Invitrogen 11995-040) su- plementado com Pen/Estrep 1% (No. cat. Invitrogen 15070-063) e FBS
10% (No. cat. Hyclone SH30071.03HI) em placas de 96 poços de fun- do transparente pretas (Costar No. 3904) e deixadas aderir de um dia para o outro a 37º C em CO> 5%. No dia seguinte, os compostos e so- luções de NCS são preparados adicionando 100 ul de meio de cresci- mento DMEM por poço em uma placa de poço fundo de fundo em V de polipropileno Corning (No. cat. 3357). O instrumento HP Compound Dilution D300 foi usado para adicionar compostos aos poços apropria- dos usando o ajuste logarítmico e singleto de titulação de 16 pontos.
[00531] A solução de DMEM NCS foi preparada adicionando NCS ao meio DMEM a 200 ng/ml (concentração de ensaio final, 50 ng/ml). 100 ul de solução de DMEM/NCS são adicionados aos poços com os compostos. 100 ul dessa solução são então imediatamente adiciona- dos às células A549. As células são então incubadas por 15 minutos a 37º C.
[00532] O tampão de lise completo é preparado adicionando Inibi- dor de fosfatase 1% (No. cat. Sigma P2850) e Inibidor de Protease 1% (No. cat. Sigma P8340) ao tampão de lise de ensaio celular Lanthas- creen (No. cat. Invitrogen PV5598). O meio da placa foi removido sa- cudindo e batendo seco. 60 ul/poço do tampão de lise completo são adicionados a cada poço. Essas placas são então incubadas por pelo menos 5 minutos no tampão de lise em temperatura ambiente para assegurar lise completa. Nesse ponto os lisatos podem ser transferi- dos para placas de ELISA preparadas.
[00533] As placas de ELISA preparadas foram preparadas bloque- ando as placas Mesoscale Goat-Anti-Mouse (GAM) com 150 ul/poço de Bloqueador A 3% (No. cat. Mesoscale R93-BA) por uma hora em temperatura ambiente com agitação. O anticorpo de captura é prepa- rado diluindo a DNA-PK antitotal monoclonal de camundongo (No. Cat. AbCAM ab1832) para 3 ug/ml em Bloqueador A 1%. As placas blo- queadas enxaguadas uma vez com 200 uL de D-PBS. O anticorpo de captura (25 ul/poço) foi adicionado a cada poço e deixado incubar por uma hora em temperatura ambiente enquanto agitando. Isso foi enxa- guado uma vez com 200 ul de D-PBS antes da adição de 25 uL do |li- sato de célula preparado a partir das placas celulares para a placa Mesoscale GAM ELISA. O lisato é então incubado nas placas por uma hora em temperatura ambiente com agitação. O anticorpo de detecção (Epitomics coelho anti-pS2056-DNA-PK) é preparado em uma diluição 1/1000 (para uma concentração final de 450 ng/mL) em Bloqueador À 1%. As placas GAM são lavadas uma vez com 200 ul de D-PBS e en- tão 25 uL/poço do anticorpo de detecção são adicionados à placa. Isso é incubado por uma hora em temperatura ambiente com agitação. O Sulfotag é preparado adicionando anticorpo Sulfo-Tag Goa-Anti-Rabbit (No. cat. Mesoscale R32AB-1) em uma diluição 1/500 (1 ug/mL) a Blo- queador A 1%. As placas GAM são lavadas com 200 uL de D-PBS e então 25 ul da preparação Sulfotag são adicionados a cada poço. Uma vez as placas tendo sido incubadas com a solução final, o Sulfo- tag, por 1 hora, elas foram lavadas uma vez com 200 uL de D-PBS. O Tampão de Leitura 1X (No. cat. Mesoscale R32-TC) é feito diluindo o tampão 4X em ddH20O. 150 ul de tampão 1X são adicionados a cada poço da placa GAM e então a placa é lida no Sector Imager 2400. À leitura (eletroquimioluminescência) foi representada em gráfico contra a concentração de cada composto e as ICsos foram geradas usando software Prism (GraphPad Prism version 6,0e for Macintosh).
[00534] Nas Tabelas 1 e 2 abaixo, ICso de menos do que 0,10 mi- cromolar para a inibição de DNA-PK é indicada como "A"; A 1ICs5o igual a ou maior do que 0,10 micromolar e menos do que 1,0 micromolar para a inibição de DNA-PK como "B"; e IC5o igual a ou maior do que 1,0 micromolar para a inibição de DNA-PK como "C".
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É EXEMPLOS DE EDIÇÃO DE GENE
[00535] Os exemplos que seguem, incluindo os experimentos con- duzidos e resultados obtidos, são providos para propósitos ilustrativos apenas e não devem ser considerados como limitantes da presente invenção. EXEMPLO 3. Materiais e Métodos
[00536] Ensaio de repórter de luz de tráfego (TLR): a linhagem de célula estável HEK293-EGIP (Proteína Inibida Verde Fluorescente Aumentada) foi comprada da System Biosciences (SBI). A linhagem de célula HEK293-EGIP carrega uma sequência de codificação de GFP rompida com um códon de parada e um fragmento genômico de 53 pb do locus de AAVS1. As células foram mantidas em DMEM (Life Technologies, no. cat. 10313-039) com alto teor de glicose (Life Technologies, No. cat. 10313-039) suplementado com FBS inativado com calor 10% (Soro Bovino Fetal, Expression System Inc.), Glutamax e Penicilina + Estreptomicina e culturadas a 37º C e CO? 5%.
[00537] Transfecção celular e tratamento com inibidor de NHEHJ: as células estáveis a HEK293-EGIP serão transfectadas com o vetor de plasmídeo duplo gRNA/CRISPR-Cas9 dois-em-um, doador de re- paro de plasmídeo (ambos os plasmídeos da System Biosciences). Transfecção será realizada usando o sistema nucleofector Amaxa (Lonza) seguindo o protocolo do fabricante. Depois de 16 horas, as células serão tratadas com Compostos representados pela Fórmula (1) em várias concentrações, incluindo 1 UM, 2,5 uM, 5UuM e 10pUM de composto. A estrutura de Scr7 é mostrada como segue: -s Na SH
KA >YN Z2N Cc OH e pode ser usada como um controle. O meio será mudado seguindo mais 24 horas de incubação. Análise FACS será realizada 5 dias pós-transfecção; as células serão então coletadas pa- ra isolamento de DNA genômico e genotipificação de PCR.
[00538] Classificação Celular e Citometria de Fluxo: análise de ci- tometria de fluxo, células HEK293 serão tripnizadas e ressuspensas em tampão de PBS/FACS BSA 1% e analisadas com um citômetro de fluxo Fortessa (Becton Dickinson). Uma porção de células será centri- fugada e usada para o isolamento de DNA genômico.
[00539] Ensaio de viabilidade celular quando do tratamento com composto: para avaliar a toxicidade potencial do tratamento com inibi- dor de NHEJ, viabilidade celular será avaliada após exposição a con- centrações diferentes de compostos. A viabilidade celular de HEK293- EGIP será determinada através do estojo CellTiter Glo (Promega). As células transfectadas com o doador de plasmídeo serão cultivadas na presença de composto (1 uM, 2,5 uM, 5 uM e 10 uM) por 24, 48 ou 72 horas e submetidas ao ensaio CellTiter Glo. Cada experimento será repetido três vezes independentes em triplicatas. Para manter as célu- las saudáveis capazes de entrar no S/G2, que é necessário para HDR, as células serão tratadas com composto em uma concentração de 2,5 UM.
[00540] Isolamento de DNA genômico, Genotipificação de PCR e Quantificação de Gel: pares de iniciador de POR especialmente proje- tados proverão um outro meio para avaliar edição de genoma mediada por HDR para obter células positivas para eEGFP funcionais. O par de iniciador de PCR de genotipificação é mostrado abaixo, corresponden- do às SEQ ID NOs: 6 e 7. Um produto de PCR de 219 pb corresponde a células não modificadas e um nucleotídeo de 163 pb corresponde à modificação através de HDR. A intensidade dessas faixas em um gel >2,5% permite estimativa de HDR através de densitometria usando Bio-Imager. A técnica permite a classificação relativa de melhoria de HDR por inibidores. As intensidades medidas para cada faixa serão normalizadas através do cálculo das razões de faixas de PCR corres- pondendo a “inserções' dividido por “total' (inserido e não modificado). A razão em vezes será calculada comparando a razão de inserções com composto com relação àquela sem composto. EXEMPLO 4: ensaio para monitoramento de eficiência de HDR
[00541] Os ensaios serão realizados para verificar a eficiência de HDR em células HEK293-EGIP. Para essa finalidade, um construto bicistrônico será usado, o qual se direciona ao locus de AAVSI huma- no (FIG. 1A). O sistema de vetor bicistrônico coexpressa Cas9 otimi- zada no códon humana dirigida pelo promotor EF1 bem como RNA- guia (gRNA) customizado consistindo em um transcrito de cr»RNA- tracr»RNA quimérico dirigido pelo promotor H1. O hspCas9 contém dois sinais de localização nuclear (NLS) no terminal N e no terminal C para assegurar importação eficiente da proteína hspCas9 para o núcleo. À estrutura de leitura aberta de hspCas9 (ORF) é seguida por um ele- mento “regulador chamado WPRE (elemento regulador pós- transcripcional de vírus Woodchuck) para reforçar expressão de gene e estabilizar o transcrito de MRNA.
[00542] A linhagem de célula humana engenheirada, EGIP HEK293, será usada para monitorar a eficiência de HDR usando o construto bicistrônico descrito acima e na Fig. 1A. A linhagem de célu- la repórter EGIP HEK293 foi comprada do SBI. A linhagem de célula HEK293-EGIP carrega uma sequência de codificação de GFP rompida com um códon de parada e um fragmento genômico de 53 pb de um locus de AAVS1. A linha estável foi gerada através de infecção lentivi- ral de células 293T com um promotor EF 1alfa para dirigir a expressão de eGFP seguido por seleção de puromicina. A sequência de eGFP foi modificada para inserir um inserto de 56 nucleotídeos (caso superior) do sítio seguro AAVS1 humano. Essa sequência contém um códon de parada (TAA em vermelho) após aminoácido T109 na sequência tra-
duzida de eGFP. As sequências-guia direcionadas estão em letras maiúsculas. Quando da transfecção com o guia e o doador, o sítio AAVS1dentro do eEGFP quebrado foi cortado e o construto doador pro- veu uma sequência homóloga para reparar a eEGFP, através da remo- ção do códon de parada e do inserto de AAVS1. Usando esse sistema, células editadas que sofrem reparo de doador de HDR gerarão células positivas para GFP. Portanto, cotransfecção de Cas9, gRNA se direci- onando a AAVS1 e uma sequência restaurada de doador de resgate AAVS1/EGFP por HDR para dar células GFP+.
[00543] A população de células positivas para GFP será diretamen- te proporcional à eficiência do reparo direcionado por homologia.
[00544] Para esses ensaios, vetores de modelo de doador Cas9- SAgRNAs e eGFP dois-em-um serão introduzidos nas células HEK293 EGIP através de eletroporação usando o nucleofector Amaxa (Lonza) para direcionar a síntese de Cas9-sgRNAs e do modelo de doador de eGFP. Os compostos serão adicionados 16 h pós-transfecção seguido por mudança de meio 48 horas depois. As células serão então deixa- das propagar por mais 72 horas antes da análise FACS.
[00545] A sequência modelo de doador de HDR continha um braço de homologia 5' de 266 nucleotídeos (em negrito, preto e sublinhado) e um braço de homologia 3' de 378 nucleotídeos (em itálico e subli- nhado) (vide SEQ ID NO: 1 abaixo). Quando da transfecção com o RNA-guia e modelo de doador o sítio AAVS1 dentro da eEGFP quebra- da será cortada e o construto de doador proverá uma sequência ho- móloga para reparar a eEGFP, removendo o códon de parada e o inser- to de AAVS1.
[00546] A sequência modelo de HDR a ser usada no ensaio de re- pórter de luz de tráfego é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 1):
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGC TCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGC AGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTEGTTGGCGGGTETE GGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGA GTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGA AAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGT TGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCT GGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC CAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAAA CTAGTGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAG GGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCEGTGCCCETGGCCCACCCTEGTG ACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGA CCACATGAAGCAGCACGACTTCTICAAGTCCGCCATGCCCGAAG GCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTICAAGGACGACGGCAAC TACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGT GAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTICAAGGAGGACGGCA ACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACG TCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACT TCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCC GACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGET GCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCA AAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTC GTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGTCGACACCOGG TGATATCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG AAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAG CATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCAC ATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCEGGGAAACCOT GTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAG GCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCEGCTTCCTCGCTCACTGACT CGCTGCGCTEGGTCGTTEGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCAC TCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCA
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ACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAA ATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC (SEQ ID NO: 1)
[00547] Os sítios de iniciador usados para o ensaio descrito aqui são mostrados abaixo. Esses sítios de iniciador estão localizados den- tro da sequência doadora. A reação de PCR no modelo genômico ge- rará um produto de 700 nucleotídeos com NHEJ esperada produzir fragmentos em torno de 300 nucleotídeos e 400 nucleotídeos de com- primento. Seguindo o evento de HDR, o produto de PCR esperado usando o modelo de doador fornecido é de 644 nucleotídeos. Os sítios de iniciador usados para o ensaio incluem as sequências que seguem RNA 1-guia: GTCCCCTCCACCCCACAGTG (SEQ ID NO: 2) RNA 2-guia: GGGGCCACTAGGGACAGGAT (SEQ ID NO: 3) Iniciador surveyor avançado: GCGACGTAAACGGCCACAAG (SEQ ID NO: 4) Iniciador surveyor reverso: GTCCATGCCGAGAGTGATCC (SEQ ID
NO: 5) Iniciador 1 de HDR: ACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCC (SEQ ID NO: 6) Iniciador 2 de HDR: ATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCOG (SEQID NO: 7) EXEMPLO 3. Avaliação de Inibidores de DNA-PK para Aumento de Eficácia de HDR de Edição de Genoma CRISPR
[00548] Células HEK293-EGIP serão nucleofectadas com os cons- trutos que seguem e culturadas como descrito: gRNA-Cas9 de expres- são dupla apenas, gRNA-Cas9 de expressão dupla com modelo de reparo de doador, gRNA-Cas9 de expressão dupla com modelo de doador e cultura das células com 2,5 uM de Composto 1 e gRNA-Cas9 de expressão dupla com modelo de reparo de doador e cultura das células com 2,5 uM do inibidor de ligase IV putativo Scr7. As células serão contatadas com compostos de Fórmula (1) ou com Scr7 por 24 horas.
[00549] A quantidade de células HEK-EGIP editadas no genoma com CRISPR em comparação com o aumento da condição de gRNA- Cas9 e modelo de doador apenas será avaliada. Adição dos compos- tos de Fórmula (1) ao meio de cultura de células HEK293-EGIP nucleo- fectadas com gRNA-Cas9 e modelo de doador será avaliada quanto ao aumento na quantidade de células HEK-EGIP editadas no genoma com CRISPR em comparação com condição de gRNA-Cas9 e modelo de doador apenas.
[00550] Em algumas modalidades, a razão de aumento em melho- ria do processo de reparo de DNA usando o sistema CRISPR-Cas9 na presença de um modelo de reparo de doador será quantificada pelo Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS). Análise de citometria de fluxo 10 dias pós-transfecção será conduzida. Experimentos de cito- metria de fluxo serão realizados em triplicata.
[00551] Em algumas modalidades, o ensaio "Repórter de Luz de Tráfego" (TLR) robusto será usado (FIG. 1B) para quantificar a razão de aumento em melhoria de processo de reparo de DNA mediado por HDR no sistema CRISPR-Cas9. No sistema TLR, a linhagem de célula estável HEK293-EGIP expressando a proteína verde fluorescente "quebrada" eGFP se baseia em reparo mediado por HDR para gerar eGFP funcional na presença de modelo doador de DNA (vide FIGS. 1B e 1C). Como mostrado no fluxo de trabalho experimental na FIG. 1C, células positivas para GFP funcionais aparecem através da via de HDR onde a inserção de 56 nt é substituída com a sequência de DNA correta. Quarenta e oito horas após a transfecção através de eletropo- ração, células positivas para GFP geralmente vão emergir. Análise de citometria de fluxo será conduzida em triplicata. EXEMPLO 5. Comparação de Inibidores de NHEJ de Molécula Pe- quena para Aumento de Edição de Genoma de HDR
[00552] — Experimentos adicionais serão conduzidos utilizando a |li- nhagem de célula HEK293-EGIP para verificar a eficiência de HDR seguindo contato com um inibidor de DNA-PK para qualquer um dos compostos descritos aqui.
[00553] Para esses experimentos, células HEK293-EGIP serão nu- cleofectadas com modelo de doador apenas ou modelo de doador e Cas9-gRNA. Para testar a habilidade dos compostos descritos aqui em aumentar a edição de HDR, as células que serão nucleofectadas ou com modelo de doador apenas ou modelo de doador e Cas9-sgRNA serão administradas ou com Scr7 ou um inibidor de DNA-PK descrito aqui.
[00554] Estado de recombinação de HDR será verificado através de genotipificação e quantificação de iniciador de PCR de "ponto final" tradicional com base em intensidades de faixa de agarose. Os inicia- dores produziram Amplicons distintos: uma faixa de nucleotídeo de
219 pb correspondia a células não modificadas e um produto de nu- cleotídeo de 163 pb para caso de HDR. A intensidade dessas faixas em um gel a >2,5% permite a estimativa de HDR através de densito- metria usando um Bio-Imager. A técnica permite a classificação relati- va de condições para melhoria de HDR por inibidores de NHEJ. Os pares de iniciador de PCR de genotipificação para esses ensaios são mostrados abaixo. Iniciador 1 de HDR: ACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCC (SEQ ID NO: 6) Iniciador 2 de HDR: ATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCG(SEQ ID NO: 7)
[00555] A proteína Cas9 e saRNAs podem ser administrados na forma de RNAs sintéticos ao invés dos sistemas de vetor comprados da SBl. Em adição ao reforço da eficiência de HDR, os experimentos de edição de genoma internos da requerente indicaram viabilidade ce- lular maior seguindo transfecção de proteína ribonucleoproteína (RNP) comparado com transfecção de DNA. Ainda, sincronização celular da fase de S/G2 pode também estimular HDR (Lin, S. e outros, Elife 2014Dez 15;3, 2014). Essas novas estratégias e detecção robusta de edição de genoma tal como PCR de gotícula digital e sequenciamento de próxima geração serão usadas para simplificar edição de genoma para ambos propósitos terapêutico e de pesquisa. EXEMPLO 6. Avaliação de Administração de Compostos Inibidores de DNA-PK para Edição de Gene Aumentada
[00556] Os ensaios serão realizados para verificar a habilidade de um inibidor de DNA-PK em permitir a edição de um gene-alvo. Para esses ensaios, a edição do gene Serpin A1 a partir da forma M a Z se- rá avaliada. Para essa finalidade, células de carcinoma hepatocelular Huh7 serão nucleofectadas com gRNA e proteína Cas9, com ou sem um modelo de reparo de doador em que um sítio Kpnl foi introduzido.
As células nucleofectadas serão então culturadas na presença de DMSO ou 2,5 um de compostos inibidores de DNA-PK descritos aqui por três dias, seguindo o que DNA genômico será amplificado e avali- ado quanto à introdução do sítio Kpn.
[00557] O ensaio funciona como segue: quando o gene SerpinA1 é editado, endonuclease Kpn é capaz de digerir o fragmento de gene, resultando no aparecimento de uma faixa digerida em um gel apenas quando o gene SerpinA1 é editado. Por outro lado, quando o SerpinA1 não é editado, a endonuclease Kpn não é capaz de cortar o fragmento de gene, e então não será uma aparência de uma faixa digerida, nova, em um gel.
[00558] “Embora a invenção acima tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplos para propósitos de clareza de compreensão, será prontamente aparente àqueles de habilidade na técnica à luz dos ensinamentos da presente invenção que certas mu- danças e modificações podem ser feitas na mesma sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações apensas.
[00559] Todas as referências providas aqui são incorporadas aqui a título de referência em sua totalidade. Como aqui usado, todas as abreviações, símbolos e convenções estão de acordo com aqueles na literatura científica contemporânea. Vide, por exemplo, Janet S. Dodd, ed., The ACS Style Guide: A Manual for Authors and Editors, 2nd Ed., Washington, D.C.: American Chemical Society, 1997.

Claims (109)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula que segue: e
LS O N Rº ' o o (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o Anel A é um sistema de anel aromático selecionado de
RS
TX XX Í 1 ou ! ; o Anel B é um sistema de anel selecionado de
CISO O O, O, O, O o “o , em que o anel B é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em —F, -OH e C14 alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em —F, -CI, - OH e -OC1.2 alquila; o Anel C é um grupo Cas cicloalquila, heteroarila de 5-6 membros ou fenila, em que o Anel C é opcionalmente substituído mais com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em halogênio, C1-2 alquila, -OH e -OC71-2 alquila; X é —-NH-, -O-, -OC14 alquila-, -S- ou —-CH2-; cada um de R' e R? é, independentemente, hidrogênio, - C(O)NHRI, -C(O0)ORº, -NHC(OJ)RI, -NHC(O0)JORI, -NHC(O)NHRS, - NHS(O)2Rº, -NHRº, -C1-4 alquil-NHRº, -ORº ou R7 em que R' e Rº não podem ser simultaneamente hidrogênio;
cada R? independentemente é hidrogênio, -C1-1alquila, ha- logênio, -OC1-2alquila, -C(O0)OH, -C(0)OC7.2alquila, -CN, -C(O)NHC1- 2alquila, -C(O)NH>2, C3x4 cicloalguila ou -NRR', em que cada uma da dita R$ alquila e cicloalquila independentemente é opcionalmente subs- tituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistin- do em -F, -Cl, -OH e -OC1.2 alquila;
cada Rº independentemente é hidrogênio, Ci4alquila, Ca-4 alquenila, C24 alquinila, C3-10 cicloalquila, arila de 6-10 membros, hete- roarila de 5-10 membros ou heterociclila de 4-10 membros, em que cada um dos ditos grupos Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em -Br, -Cl, -F, Cisalguila, CN, NO>z, Coalquenila, C2 4alquinila, Ca-.ecicloalquila, Co-4 alquil-Ca-s cicloalquila, Cos alquil-O-C1+4 alquila, Cos alquil-O-Co4s alquil-Ca.5 cicloalquila, C(0)OC14 alquila, C(0)OCo-1 alquil-C3.5 cicloalquila, Cos alquil-C(O)NH2, C(O)NHC14 al- quila, C(O)N(Ci1 alquila>), C(O)NH(Cos alquil-C3s cicloalquila), CH2OR$, Co-4 alquil-C(O)R5, Cox alquil-C(O)N(R5$)2, Coxs alquil-C(O0)ORS, Co-4 alquil-NHC(O)RS, Cos alquil-N(Ró)2, heterociclila de 5-6 membros, - O(C1- alquila)ORS, -OR* e oxo, e em que cada um dos ditos substituin- tes Rº opcionais é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em - F, -Cl, Ci4alquila, -OH, -OC1-4alquila, -SC1-4alquila, -C(O0)C1-4 alquila, - C(0)OC1-: alquila e -C(0)OCo4 alquil-C3-5 cicloalquila; e cada Rº independentemente é hidrogênio, Cialquila, feni- la, heteroarila de 5-6 membros ou heterocíclila de 4-7 membros, em que cada Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em -F, - Cl, Ci-2alquila, -CH20H, -CN, -OH, -OC1-2alquila, heteroarila de 5-6 membros e heterociíclila de 4-7 membros, ou dois grupos Rº junto com o átomo de nitrogênio interveniente formam opcionalmente um anel morfolina, anel azetidina, anel pirrolidina, anel piperidina ou anel pipe- razina; e Rº é hidrogênio ou C1.4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em - F, -Cl, -CH20H, -CN, -OH e -OC1.2alquila; R' é arila de 6-10 membros, heteroarila de 5-10 membros ou heterociclila de 4-7 membros, cada uma das quais é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em -F, -Cl, C1-2alquila, -CH20H, -CN e -OR; e cada um de R e R' é independentemente hidrogênio ou C1- 4alquila ou R e R' junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados formam opcionalmente um anel morfolina, anel azetidina, anel pirrolidina, anel piperidina ou anel piperazina.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que o dito grupo arila para Rº é opcionalmente substitu- ido e selecionado de fenila ou naftaleno; o grupo heteroarila para Rº é opcionalmente substituído e selecionado de um pirrol, imidazol, pira- zol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pi- rimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolpirimidi- na, benzimidazol|, benzotiazol ou benzoxazol; e o dito grupo heteroci- clila para Rº é opcionalmente substituído e selecionado de um tetra- hidrofurano, oxetano, tetra-hidropirano, di-hidroisoxazol, pirimidino- 2,4(1H,3H)-diona, di-hidrofuropirimidina, di-hidropiranopirimidina, di- hidropirrolpirimidina, tetra-hidropiridopirimidina, di-hidropiridopirimidina, di-hidrofuropiridina, di-hidropiridopiridina, tetra-hidropteridina ou isoin- dolino-1,3-diona.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que o dito grupo heterocíclico para os substituin- tes Rº é opcionalmente substituído e selecionado de oxetano, azetidi- na, tetra-hidrofurano, di-hidropirano, tetra-hidropirano, morfolina, pipe-
ridina, pirrolidina, piperazina, furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol, oxadiazol ou tetrazol.
4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-3, caracterizado pelo fato de que o dito grupo heteroarila para Rº é opcionalmente substituído e selecionado de imidazol, triazol, ti- azol, piridina ou pirimidina, e em que o dito grupo heterociclila para Rº é opcionalmente substituído e selecionado de oxetano, tetra- hidrofurano ou tetra-hidropirano.
5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-4, caracterizado pelo fato de que o Anel C é Ca. cicloalquila opcionalmente substituída ou heteroarila de 5-6 membros opcional- mente substituída.
6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-5, caracterizado pelo fato de que X é -O- ou -NH-.
7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica-
T ções 1-6, caracterizado pelo fato de que é opcionalmente substi-
OSSO tuído e selecionado de “0”, “O, O ou O.
8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-7, caracterizado pelo fato de que cada Rº é independentemente hidrogênio, -C1-4 alquila, halogênio, -OC1-2alquila, -CN, -C3-4 cicloalquila ou -NRR', em que cada uma da dita Rº alquila e cicloalquila é inde- pendentemente opcionalmente substituída.
9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-8, caracterizado pelo fato de que cada Rº é independentemente hidrogênio ou um grupo opcionalmente substituído selecionado de C1- 4alquila, Co4alquenila, Cz-4alquinila, Ca-scicloalquila ou fenila.
10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 1-8, caracterizado pelo fato de que cada Rº é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado de um pirrol, imi- dazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pi- rimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolpirimidina, — benzimidazol, — benzotiazol, — benzoxazol, tetra- hidrofurano, oxetano, tetra-hidropirano, di-hidroisoxazol, pirimidina- 2,4(1H,3H)-diona, di-hidrofuropirimidina, di-hidropiranopirimidina, di- hidropirrolpirimidina, tetra-hidropiridopirimidina, di-hidropiridopirimidina, di-hidrofuropiridina, di-hidropiridopiridina, tetra-hidropteridina ou isoin- dolino-1,3-diona.
11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-8, caracterizado pelo fato de que cada Rº é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado de um imidazol, pira- zol, pirimidina, furopirimidina, oxetano ou di-hidrofuropirimidina.
12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-8, caracterizado pelo fato de que cada Rº é independentemente hidrogênio ou um grupo opcionalmente substituído selecionado de C1-4 Nx alquila, Re go ou um grupo de anel selecionado de Ca.5 cicloal- quila, pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, tetra- hidrofurano, oxetano, tetra-hidropirano, di-hidroisoxazol ou fenila, em que X' é N ou CR*; X? é N ou CRº, em que X' e X? não podem ser simultane- amente N; cada um de Rºº, R*?”, e R*º é independentemente hidrogê- nio, F, CI, Br, CN, NO;>, Ci alquila, Cos alquil-Ca-5 cicloalquila, Co-s alquil-O-C14 alquila, Cox al- quil-O-Co-4 alquil-C3-5 cicloalquila, C24 alquenila, C24 alquinila, C(O0)OC14 alquila, C(0)OCo4a alquil-C3-5 cicloalquila, C(O)NH2, C(O)NHC1-4 alquila, C(O)N(C14 alqui- la), C(O)NH(Co-4 alquil-Ca-5 cicloalquila), um grupo heterocíclico sele- cionado de oxetano, azetidina, tetra-hidrofurano, di-hidropirano, tetra- hidropirano, morfolina, piperidina ou piperazina ou um grupo heteroari- la selecionado de furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol ou tetrazol; ou R*º e R*º ou R*, junto com os átomos intervenientes, forma opcionalmente um grupo de anel heterocíclico di-hidrofurano, di- hidropirano, tetra-hidropiperidina
R*º é independentemente hidrogênio, F, Cl, Br, CN, NO>, C1-1 alquila, Co-4 alquil-O-C1-4 alquila,
C24 alquenila, C24 alquinila, C(O0)OC1-4 alquila, C(O)NH>, C(O)NHC1-1 alquila ou C(O)N(C14 alquila)>;
em que cada um dos grupos do anel Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecio- nados do grupo consistindo em F, CI, Br, CN, NO», C14 alquila, Cos al- quil-C3.5 cicloalquila, Cos alquil-O-C1-4 alquila, Co alquil-O-Co4 alquil- C3-5 cicloalquila,
C2-4 alquenila, C2.4 alquinila, C(O0)OC14 alquila, C(0)OCo-4 alquil-C3-5 cicloalquila, C(O)NH2, C(O)NHC1-4 alquila, C(O)N(C14 alqui- la), C(O)NH(Co4 alquil-C3-5 cicloalquila), um grupo heterocíclico sele- cionado de oxetano, azetidina, tetra-hidrofurano, di-hidropirano, tetra- hidropirano, morfolina, piperidina ou piperazina e um grupo heteroarila selecionado de furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol ou te- trazol;
cada um dos ditos grupos heterocíclicos e heteroarila para R%*º, R** e R** e para os substituintes de Rº é opcionalmente e inde- pendentemente substituído com um ou mais substituintes seleciona- dos do grupo consistindo em -F, C14 alquila, -OH, -C(O)C14 alquila, - C(0)OC1-+4 alquila ou -C(0)OCo4 alquil-C3-5 cicloalquila; e em que cada um dos ditos grupos alquila e cicloalquila para R*º, R?º e R** e para os substituintes de Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em — F e -OH.
13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-12, caracterizado pelo fato de que cada Rº é independente- mente C1-4 alquila ou um grupo de anel selecionado de C3-5 cicloalquila, [HI É É nº Sr cms CCL LO! pirazol, imidazol, oxetano, o ; O ou , em que a dita Rº C14 alquila é opcionalmente substituída com um ou mais substi- tuintes selecionados do grupo consistindo em -Br, -Cl, -F e -O(C1+« al- quila) e em que cada um dos ditos grupos do anel Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes sele- cionados do grupo consistindo em -Br, -Cl, -F, Ci4alquila, -CN, -O(C14 alquila), Ca.ecicloalquila, Cos alquil-O-C1-4 alquila, C(O)NHC1+4 alquila, C(O)N(C1-1 alquila)2 e a piperazina, em que cada um dos ditos substi- tuintes Rº opcionais é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em - F, Ciaalquila, -OH e -OCi-4alquila.
14. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zado pelo fato de que a dita Rº Cia alquila é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em - F e -O(C14 alquila) e em que cada um dos ditos grupos do anel Rº é opcionalmente e independentemente substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em C1-4alquila, -O(C14 alquila), Co-s alquil-O-C1-4 alquila, C(O)NHC14 alquila, C(O)N(C1-4 alqui- la)2 e a piperazina, em que cada um dos ditos substituintes Rº opcio- nais é opcionalmente substituído com uma ou mais C1.4alquila.
15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-14, caracterizado pelo fato de que cada um de R' e R? é inde-
pendentemente hidrogênio, -C(ONHRº, -C(O)JORº, -NHC(OJ)RÍ, - NHC(0)OR?, -Co4 alquil-NHRº, -ORº ou R”.
16. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-5, caracterizado pelo fato de que R' é opcionalmente substituí- do e selecionado de um pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazi- na, quinolona, furopirimidina, pirrolpirimidina, benzimidazol, benzoti- azol, benzoxazol, tetra-hidrofurano, oxetano, tetra-hidropirano, di- hidroisoxazol, pirimidino-2,4(1H,3H)-diona, di-hidrofuropirimidina, di- hidropiranopirimidina, di-hidropirrolpirimidina, tetra- hidropiridopirimidina, di-hidropiridopirimidina, di-hidrofuropiridina, di- hidropiridopiridina, tetra-hidropteridina ou isoindolino-1,3-diona.
17. Composto de acordo com a reivindicação 16, caracteri- zado pelo fato de que R' é opcionalmente substituído e selecionado de uma pirimidina, imidazol, pirazol, tiazol, furopirimidina, pirrolpirimidina, benzimidazol, benzotiazol, benzoxazol, oxetano, di-hidrofuropirimidina ou isoindolino-1,3-diona.
18. Composto de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pelo fato de que R' é opcionalmente substituído e selecionado de uma pirimidina, pirazol, furopirimidina, tiazol ou isoindolino-1,3-diona.
19. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-18, caracterizado pelo fato de que X é —O-.
20. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1| a 9, caracterizado pelo fato de que o Anel C é Ca. cicloalquila opcionalmente substituída.
21. Composto de acordo com a reivindicação 20, caracteri- zado pelo fato de que o anel C é ciclo-hexano opcionalmente substitu- ido.
22. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, representado pela fórmula que segue:
O) O ú O (Il) ou um sal farmaceuticamente acei- tável do mesmo, caracterizado pelo fato de que R' é -C(O)NHR?, -C(0)JORº, -NHC(OJ)Rº, -NHC(O)ORS, - NHC(O)NHRº, -NHS(O)2Rº, -Co-4 alquil-NHRº, -ORº ou R; e R? é hidrogênio.
23. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 22, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmu- la que segue: ? ? o. q Rº O. i | DO O. Y
OO LS o (II-A-1) ou (I1I-B-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
24. Composto de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que cada R' é independentemente -C(O)NHRS, - C(O0)OR?, -NHC(O)Rº, -NHC(O)ORº, —C14 alquil-NHRº, -NHRº, -ORº ou R'.
25. Composto de acordo com a reivindicação 24, caracteri- zado pelo fato de que R' é -C1-4 alquil-NHRº, -NHRº ou -OR?.
26. Composto de acordo com a reivindicação 25, caracteri- zado pelo fato de que R' é -NHRº.
27. Composto de acordo com a reivindicação 25, caracteri- zado pelo fato de que R' é -ORº.
28. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-22, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula:
Rô 3 3 Os NR?
OX O
OO OS o (I1I|-A-2) ou (111-B-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
29. Composto de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pelo fato de que cada R' é independentemente -C(O)NHRS, - C(0)OR, -NHC(O)Rº, -NHC(O) OR, -Co.4 alquil-NHRº, -ORº ou R”.
30. Composto de acordo com a reivindicação 29, caracteri- zado pelo fato de que R'? é -Co.4 alquil-NHRº ou -OR?.
31. Composto de acordo com a reivindicação 30, caracteri- zado pelo fato de que R' é -NHRº.
32. Composto de acordo com a reivindicação 30, caracteri- zado pelo fato de que R' é -ORº.
33. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-32, caracterizado pelo fato de que cada R? independentemente é hidrogênio, metila, -Cl, - OCH;3, -CN, ciclopropila, -NHCH;3 ou -N(CH3)2; e R$ é hidrogênio ou metila.
34. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-19, caracterizado pelo fato de que o Anel C é heteroarila de 5-6 membros opcionalmente substituída.
35. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica-
T À ções 1-34, caracterizado pelo fato de que é Ç opcionalmente substituído.
36. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o Anel C é fenila opcio-
nalmente substituída.
37. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-36, caracterizado pelo fato de que X é -OC14 alquil-.
38. Composto de acordo com a reivindicação 37, represen- tado pela fórmula que segue: NW o. O N CO (IV) ou um sal farmaceuticamente acei- tável do mesmo, caracterizado pelo fato de que: R' é hidrogênio, -C(O)NHRº, -C(O0)JORº, -NHC(OJ)R!, - NHC(O0)ORº, -NHC(O)NHRº, -NHS(O)2Rº, -Cos alquil-NHRº, -ORº ou R.
39. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica-
SO ções 36-38, caracterizado pelo fato de que é O opcionalmente substituído.
40. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36-39, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmu- la que segue: 6 R$o, Ro. R Rº NQÇORô ON Rº o. 2N O. 2N
O Q o (V-A) ou o (V-B) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
41. Composto de acordo com a reivindicação 40, caracteri- zado pelo fato de que
R? é hidrogênio, metila, ciclopropila, -F, -Cl, -OC1-2alquila, - NRR' ou -CN, em que cada uma da dita Rº alquila é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em—F, -OH e -O(C1-2 alquila); cada Rº independentemente é C1.4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes selecionados do grupo con- sistindo em —F, -OH e -O(C1-2 alquila); R e R' são cada um independentemente hidrogênio ou C1.2 alquila.
42. Composto de acordo com a reivindicação 41, caracteri- zado pelo fato de que cada R? independentemente é hidrogênio, metila, -Cl, - OCH, -CN, ciclopropila, -NHCH3 ou -N(CH3)2; e R$ é hidrogênio ou metila.
43. Composto caracterizado pelo fato de que é selecionado da lista de compostos nas Tabelas 1 e 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
44. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1-43 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
45. Método de sensibilização de uma célula a um agente te- rapêutico ou estado de doença que induz uma lesão em DNA, caracte- rizado pelo fato de que compreende a etapa de contato da célula com o composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1-43 ou uma composição farmacêutica compreendendo o dito composto.
46. Método de potencialização de um regime terapêutico para o tratamento de câncer em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar ao dito paciente uma quan- tidade eficaz do composto como definido em qualquer uma das reivin- dicações 1-43 ou uma composição farmacêutica compreendendo o dito composto.
47. Método de tratamento de câncer ou inibição de cresci- mento de célula de câncer em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito paciente uma quantidade eficaz do composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1-43 ou uma composição farmacêutica compreendendo o dito composto, ou sozinho ou em combinação com um ou mais agente terapêutico adici- onal.
48. Método de preparação de um composto representado pela Fórmula (1):
A
LS O N Rº : S CE (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que as variáveis de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer uma das reivindicações 1-43, e em que o método compreende: reagir o Composto (X-1) com Composto (Y-1) para formar um composto representado pela Fórmula (1) ou um sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo: (a) x N NX (a) R' SJ O
ST R2 LV (E) (X-1) (1) em que: L' do Composto (X-1) é um halogênio, toluenossulfonato, metanossulfonato ou trifluormetanossulfonato, e as outras variáveis do composto (X-1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer uma das reivindicações 1-43; e H H H B(ORº) B(ORº)
OGRO O o composto (Y-1) é O, O, Oo, ,'Oo ou “o em que Rº é —H ou dois Ra, junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão |i- gados, formam um anel dioxano opcionalmente substituído com uma ou mais C1.2 alquila.
49. Método de preparação de um composto caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula que segue: () x N
SO R2? CE (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R' é -NHC(O)R%, -NHC(O)OR?, -NHC(O)NHR?, - NHS(O)2Rº, -NHRº ou -OR$; e as outras variáveis de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer uma das reivindicações 1-43; e em que o método compreende: reagir composto (X-2) com Composto (Y-2) para formar um composto representado pela Fórmula (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: (A (a) x AN x N OW — SS O Q ) (Y-2) R2?
DO O (X-2) É ; caracterizado pelo fato de que Q' do Composto (X-2) é -NH2 ou -OH e as outras variáveis do Composto (X-2) são cada um e independentemente como descrito em qualquer uma das reivindicações 1-43; e o Composto (Y-2) é RI-C(O)-L?, RI-O-C(O)-L?, NHR$-C(O)- L?, R*S(O)2-L?, R+-L2, R(C(0)OR!? ou R$-N=C=O, em que cada Rº é como descrito em qualquer uma das reivindicações 1-43, Lº é um ha- logênio, toluenossulfonato, metanossulfonato ou trifluormetanossulfo- nato e Rv é C14 alquila.
50. Método de preparação de um composto caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula que segue: e
LS O N Rº ' S O (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que X é -NH- ou —O-, e as outras variáveis de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer uma das reivindicações 1-43, e em que o método compreende: (i) reagir o Composto (X-3) com Composto (Y-3) para for- mar um composto representado pela Fórmula (1) ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo:
A : 7
R
LISAS : O (Y-3) X-3) dou (ii) reagir o Composto (X-4) com Composto (Y-4) para for- mar um composto representado pela fórmula (|) ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo:
A
SS : > (X-41) o (1) em que L3 é um halogênio; Lº é um halogênio, toluenossulfonato, me- tanossulfonato ou trifluormetanossulfonato, e em que as variáveis de cada um dos compostos (X-3), (X-4), (Y-3) e (Y-4) são cada uma e in- dependentemente como descrito em qualquer uma das reivindicações 1-43.
51. Método de preparação de um composto caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula que segue: (A) x N R' SI O ' o o (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R' é -C(O)NHRº%, -C(O0)JOR%, -NHC(OJ)RI, - NHC(O0)ORº, -NHC(O)NHRº, -NHS(O)2Rº, -NHRº, -C14 alquil-NHRS, - ORº ou R”; R? é hidrogênio; cada um de Rº é independentemente hete- roarila de 5-10 membros substituída com -OR$; R' é independente- mente uma heteroarila de 5-10 membros substituída com OR; R, Re as outras variáveis de fórmula (|) são cada um e independentemente como descrito em qualquer uma das reivindicações 1-43, contanto que ambos R e Rº não sejam hidrogênio, e em que o método compreende: reagir o Composto (X-5) com RºOH ou ROH para formar um composto representado pela fórmula (1) ou um sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo:
(a) Ca) x N x N 5º ss SS o Re RºOH or ROH né o O O (X-5) (1) em que: OQ? é uma ligação, -C(O)NH-, -C(0)O-, -NHC(O)-, - NHC(0)O-, -NHC(O)NH-, -NHS(O)2-, -NH-, -C14 alquil-NH- ou -O-, o Anel D é heteroarila de 5-10 membros; Ló é um halogênio; e R de ROH, Rº de RºOH e as outras variáveis do Composto (X-5) são cada um e independentemente como descrito em qualquer uma das reivindicações 1-43, contanto que ambos R e Rº não sejam hidrogênio.
52. Método de preparação de um composto caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula que segue: (A x N Rº SI O " S CE) (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que X é —O-, e as outras variáveis de Fórmula (1) são cada uma e independentemente como descrito em qualquer uma das reivin- dicações 1-43, e em que o método compreende:
e Ls v SI O N d Jj Ri 6 | '
O O (Y-6) X-6) O) em que Lô é -OH; L7 é —-OH; e as variáveis restantes de ca- da um dos Compostos (X-6) e (Y-6) são cada uma e independente- mente como descrito em qualquer uma as reivindicações 1-43.
53. Método de edição de uma ou mais regiões genômicas- alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1-43 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que a uma ou mais regiões genômicas-alvo são editadas.
54. Método de reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas-alvo por meio de uma via de reparo direcio- nado por homologia (HDR), caracterizado pelo fato de que compreen- de: administrar a uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1-43 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o sistema de edição de genoma interage com um ácido(s) nucleico das regiões genômicas-alvo, resultando em uma quebra de DNA, e em que a quebra de DNA é reparada pelo menos em parte por meio de uma via de HDR.
55. Método de inibição ou supressão de reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas-alvo por meio de uma via de união de extremidades não homólogas (NHEJ), caracteri- zado pelo fato de que compreende: administrar a uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1-43 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o sistema de edição de genoma interage com um ácido(s) nucleico da uma ou mais regiões genômicas-alvo, resultando em uma quebra de DNA, e em que reparo da quebra de DNA por meio de uma via de NHEJ é inibido ou reprimido.
56. Método de modificação da expressão de um ou mais genes ou proteínas, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas-alvo um sistema de edição de genoma e um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1-43 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
57. Método de acordo com a reivindicação 54 ou 55, carac- terizado pelo fato de que a quebra de DNA compreende quebra de fi- lamento duplo de DNA (DSB).
58. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53-57, caracterizado pelo fato de que o composto é um cocristal compreendendo um composto tendo uma estrutura de Fórmula (1) e um formador de cocristal selecionado de ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico ou ácido benzoico.
59. Método de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que a eficiência de edição das regiões genômicas-alvo na uma ou mais células é aumentada comparado com aquela em célu- la ou células de outro modo idênticas, mas sem o composto.
60. Método de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que a eficiência do reparo da quebra de DNA nas regi-
ões genômicas-alvo na uma ou mais células por meio da via de HDR é aumentada comparado com aquela em célula ou células de outro mo- do idênticas, mas sem o composto.
61. Método de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que a eficiência de inibição ou supressão do reparo da quebra de DNA nas regiões genômicas-alvo na uma célula ou mais células por meio da via de NHEJ é aumentada comparado com aquela em célula ou células de outro modo idênticas, mas sem o composto.
62. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59-61, caracterizado pelo fato de que a dita eficiência é aumen- tada em pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 ve- zes comparado com aquela em célula ou células de outro modo idênti- cas, mas sem o composto.
63. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59-62, caracterizado pelo fato de que a dita eficiência é medida através da frequência de integração de polinucleotídeo direcionado.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59-62, caracterizado pelo fato de que a dita eficiência é medida através da frequência de mutagênese direcionada.
65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracteriza- do pelo fato de que a mutagênese direcionada compreende mutações por ponto, deleções e/ou inserções.
66. Método de acordo com a reivindicação 56, caracteriza- do pelo fato de que a expressão de um gene(s) e/ou proteína(s) a ju- sante associado(s) com o(s) gene(s)-alvo é aumentada comparado com o nível de expressão de linha basal na uma célula ou mais células antes da administração.
67. Método de acordo com a reivindicação 66, caracteriza- do pelo fato de que a dita expressão é aumentada em pelo menos
10%,20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou vezes comparado com o nível de expressão na linha basal na uma ou mais células antes da administração.
68. Método de acordo com a reivindicação 56, caracteriza- do pelo fato de que a expressão de um gene(s) e/ou proteína(s) a ju- sante associado(s) com o(s) gene(s)-alvo é diminuída comparado com o nível de expressão na linha basal na uma ou mais células antes da administração.
69. Método de acordo com a reivindicação 68, caracteriza- do pelo fato de que a expressão do gene é diminuída em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% comparado com o nível de expressão de linha basal na uma célula ou mais células antes da administração.
70. Método de acordo com a reivindicação 56, caracteriza- do pelo fato de que a expressão de um gene(s) e/ou proteína(s) a ju- sante associado(s) com o(s) gene(s)-alvo é substancialmente elimina- da na uma célula ou mais células.
71. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53-70, caracterizado pelo fato de que a célula é sincronizada na fase do ciclo celular S ou G2.
72. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53 a 71, caracterizado pelo fato de que a uma célula ou mais cé- lulas que são administradas ou contatadas com o dito composto têm sobrevivência aumentada em comparação com uma célula ou mais células que não foram administradas ou contatadas com o dito com- posto.
73. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53 a 72, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma e o composto são administrados à uma célula ou mais células simultaneamente.
74. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53 a 72, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma e o composto são administrados a uma célula ou mais células sequencialmente.
75. Método de acordo com a reivindicação 74, caracteriza- do pelo fato de que o sistema de edição de genoma é administrado à uma célula ou mais células antes do composto.
76. Método de acordo com a reivindicação 74, caracteriza- do pelo fato de que o composto é administrado à uma célula ou mais células antes do sistema de edição de genoma.
77. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53 a 76, caracterizado pelo fato de que a uma célula ou mais cé- lulas são células culturadas.
78. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53-76, caracterizado pelo fato de que a uma célula ou mais célu- las são células in vivo dentro de um organismo.
79. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53 a 76, caracterizado pelo fato de que a uma célula ou mais cé- lulas são células ex vivo de um organismo.
80. Método de acordo com a reivindicação 78 ou 79, carac- terizado pelo fato de que o organismo é um mamífero.
81. Método de acordo com a reivindicação 78 ou 79, carac- terizado pelo fato de que o organismo é um ser humano.
82. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53 a 81, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma e o composto são administrados por meio da mesma rota.
83. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53 a 81, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma e o composto são administrados por meio de rotas diferentes.
84. Método de acordo com a reivindicação 83, caracteriza- do pelo fato de que o sistema de edição de genoma é administrado intravenosamente e o composto é administrado oralmente.
85. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53-84, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de ge- noma é selecionado de um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease dedo-de-zinco (ZFN), um sistema de Nuclease Baseado em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TA- LEN), um sistema à base de CRISPR ou um sistema à base de NgA- go.
86. Método de acordo com a reivindicação 85, caracteriza- do pelo fato de que o sistema de edição de genoma é um sistema ba- seado em CRISPR.
87. Método de acordo com a reivindicação 86, caracteriza- do pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas ou CRISPR-Cpf.
88. Método de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema ba- seado em CRISPR-Cas e em que o sistema CRISPR-Cas compreen- de: (a) pelo menos um elemento de RNA-guia compreendendo: (i) um RNA direcionador compreendendo uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo na uma região ou mais regiões genômicas-alvo ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA direcionador; (ii) e um RNA ativador compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com o RNA direcionador ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA ativador; e (b) um elemento de proteína Cas com- preendendo uma proteína Cas ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando a proteína Cas.
89. Método de acordo com a reivindicação 88, caracteriza- do pelo fato de que os ditos RNA direcionador e RNA ativador são fundidos como uma molécula única.
90. Método de acordo com a reivindicação 88, caracteriza- do pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas9 do Tipo-ll.
91. Método de acordo com a reivindicação 90, caracteriza- do pelo fato de que a proteína Cas9 é uma SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, Fokl-dCas9 ou D1OA nickase ou quaisquer combinações das mesmas.
92. Método de acordo com a reivindicação 90, caracteriza- do pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cpf e em que o sistema CRISPR-Cpf compreende: (a) pelo menos um elemento de RNA-guia ou um ácido nucleico compreen- dendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o elemento de RNA-guia, o RNA-guia compreendendo um RNA direcionador que compreende uma sequência de nucleotídeo substancialmente com- plementar a uma sequência de nucleotídeo na uma ou mais regiões genômicas-alvo; e (b) um elemento de proteína Cpf compreendendo uma proteína Cpf ou um ácido nucleico compreendendo uma sequên- cia de ácido nucleico codificando a proteína Cpf.
93. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53 a 92, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é administrado por um ou mais vetores.
94. Método de acordo com a reivindicação 93, caracteriza- do pelo fato de que o um vetor ou mais vetores são selecionados de vetores virais, plasmídeos ou ssDNAs.
95. Método de acordo com a reivindicação 94, caracteriza- do pelo fato de que os vetores virais são selecionados do grupo con- sistindo em vetores virais retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoas- sociados e de herpes simplex.
96. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53 a 95, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é administrado através de RNA sintético.
97. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 53 a 95, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é administrado através de uma nanoformulação.
98. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o composto é repre- sentado pela Fórmula (II), (III-A-1), (I11-A-2), (II1I-B-1), (I11-B-2), (IV), (V- A) ou (V-B) ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
99. Estojo ou composição para edição de uma ou mais re- giões genômicas-alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: um sistema de edição de genoma; e um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 43 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
100. Estojo ou composição de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nu- clease dedo-de-zinco (ZFN), um sistema de Nuclease baseado em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR ou um sistema baseado em NgAgo.
101. Estojo ou composição de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em CRISPR.
102. Estojo ou composição de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas ou um sistema CRISPR-Cpf.
103. Estojo ou composição de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas e em que o sistema CRISPR-Cas compre-
ende: (a) pelo menos um elemento de RNA-guia compreendendo: (i) um RNA direcionador compreendendo uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo na uma ou mais regiões genômicas-alvo ou um ácido nucleico compreen- dendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA direciona- dor; (ii) e um RNA ativador compreendendo uma sequência de nucleo- tídeo que é capaz de hibridizar com o RNA direcionador, ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA ativador; e (b) um elemento de proteína Cas compreendendo uma proteína Cas ou um ácido nucleico compreendendo uma sequên- cia(s) de nucleotídeo codificando a proteína Cas.
104. Estojo ou composição de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas9 do Tipo-ll.
105. Estojo ou composição de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas9 é uma SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, Fokl-dCas9 ou D1O0A nickase ou qualquer combinação das mesmas.
106. Estojo ou composição de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cpf, e em que o sistema CRISPR-Cpf compreen- de: (a) um RNA direcionador compreendendo uma sequência de nu- cleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleo- tídeo na uma região ou mais regiões genômicas-alvo, ou um ácido nu- cleico compreendendo uma sequência(s) de nucleotídeo codificando o RNA direcionador; e (b) um elemento de proteína Cpf compreendendo uma proteína Cpf ou um ácido nucleico compreendendo uma sequên- cia(s) de nucleotídeo codificando a proteína Cpf.
107. Estojo ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 99-106, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma está incluído ou empacotado em um ou mais veto- res.
108. Estojo ou composição de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que o um vetor ou mais vetores são selecionados de vetores virais, plasmídeos ou ssDNAs.
109. Estojo ou composição de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que os vetores virais são selecionados do grupo consistindo em vetores virais retrovirais, lentivirais, adenovi- rais, adenoassociados e de herpes simplex.
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