JPWO2016143223A1

JPWO2016143223A1 - 外部環境変化に対する耐性が向上した固定化プロテアーゼ

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Publication number: JPWO2016143223A1
Application number: JP2017504577A
Authority: JP
Inventors: 崇史嶋田; 典子岩本
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2015-03-09
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2017-12-28
Also published as: WO2016143223A1; KR20170120691A; EP3269807A1; CN107406841A; US20180051272A1; BR112017017494A2; EP3269807A4

Abstract

本発明は、タンパク質の質量分析用のサンプル調製に用いることのできる、外部環境変化に対する安定性に優れた高活性なプロテアーゼを提供することを課題とする。本発明によれば、ナノ粒子表面に、粗精製のプロテアーゼまたは自己消化耐性処理を行っていないプロテアーゼを固定化させたことを特徴とする、固定化プロテアーゼ及びその製造方法が提供される。本発明の固定化プロテアーゼは、外部環境の変化を受けずに高い活性を維持することができるので、例えば臨床検体中のタンパク質の質量分析に供する際のサンプル調製に有効である。

Description

本発明は、タンパク質の質量分析用のサンプル調製に用いることができる、外部環境変化に対する耐性が向上した固定化プロテアーゼに関する。

質量分析技術の進展に伴い、タンパク質についても多検体処理に対応したハイスループット解析プラットフォームの開発が進んでいるが、その開発の基盤となるタンパク質解析は、ゲノム解析よりも遅れている。その原因は、ゲノム解析においては、PCRやプラスミド増幅など、サンプル調製のための非常に汎用的かつ定量的な手法が数多く存在するのに対し、タンパク質解析においては、再現性の高いサンプルを調製する技術が確立できていないことにある。第一には、タンパク質は効率的な増幅手段がまだ確立されていない。第二には、質量分析の対象が抗体等の巨大タンパク質である場合はそのままでは分析することが困難であるためその前処理としてタンパク質をプロテアーゼにより消化して断片化することが行われているが、その消化反応の再現性の確保が十分でない。

タンパク質の消化反応の再現性を高める試みとして、プロテアーゼを固相担体に結合させることが行われている。これまでトリプシンなどのプロテアーゼをガラス表面、膜、中空糸、高分子、ゲル、ゾル、多孔質シリカなどの固相担体に結合させることによって、酵素活性や反応速度が向上するという数多くの報告がある（非特許文献１〜５等）。また、プロテアーゼの基質へのアクセスを制限することによって選択的にタンパク質を加水分解する方法に、トリプシンを固定化したナノ粒子を用いることが報告されている（非特許文献６）。これらの固定化プロテアーゼの性能は、繰り返し使用が可能かどうか、短時間での消化反応に使用可能かどうか、基質タンパク質のペプチド配列回収率(シーケンスカバレージ）が十分かどうか、といった指標で評価されている。しかしながら、従来の報告はいずれも定性的な評価に過ぎず、定量的な物理化学的性質に基づく評価ではない。また、温度やpH、固定化プロテアーゼの調製や基質タンパク質との反応に用いる種々の試薬などの外部環境の変化に対する安定性については何ら検討されていない。

Junfeng Ma, et. al., Organic-Inorganic Hybrid Silica Monolith Based Immobilized Trypsin Reactor with High Enzymatic Activity, Analytical Chemistry, 2008, 80, 2949 J. Robert Freije, Et. al., Chemically Modified, Immobilized Trypsin Reactor with Improved Digestion Efficiency, Journal of Proteome Research, 2005, 4, 1805 Maria T. Dulay, et. al., Enhanced Proteolytic Activity of Covalently Bound Enzymes in Photopolymerized Sol Gel, Analytical Chemistry, 2005, 77, 4604 Jana Krenkova, et. al., Highly Efficient Enzyme Reactors Containing Trypsin and Endoproteinase LysC Immobilized on Porous Polymer Monolith Coupled to MS Suitable for Analysis of Antibodies, Analytical Chemistry, 2009, 81, 2004 Yan Li, et. al., Immobilization of Trypsin on Superparamagnetic Nanoparticles for Rapid and Effective Proteolysis, Journal of Proteome Research, 2007, 6, 3849 Noriko Iwamoto et al., Selective detection of complementarity determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate: nanosurface and molecular-orientation limited proteolysis, Analyst, 2014, 139, 576

本発明の課題は、タンパク質の質量分析用のサンプル調製に用いることのできる、外部環境変化に対する安定性に優れた高活性なプロテアーゼを提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、トリプシンなどのプロテアーゼをナノ粒子に固定化することによって、還元的ジメチル化などの機能強化されていない純度が低いプロテアーゼであっても、広い範囲の温度とpHで高い活性を維持でき、しかも有機溶媒や界面活性剤による影響もないことを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ナノ粒子表面に、粗精製のプロテアーゼまたは自己消化耐性処理を行っていないプロテアーゼを固定化させたことを特徴とする、固定化プロテアーゼ。
（２）ナノ粒子の粒子径が、100〜500 nmである、（１）に記載の固定化プロテアーゼ。
（３）ナノ粒子が磁性ナノ粒子である、（１）または（２）に記載の固定化プロテアーゼ。
（４）プロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、V8プロテアーゼ、AspNプロテアーゼ、ArgCプロテアーゼ、パパイン、ペプシン、またはジペプチジルペプチダーゼである、（１）〜（３）のいずれかに記載の固定化プロテアーゼ。
（５）自己消化耐性処理が還元的ジメチル化処理である、（１）〜（３）のいずれかに記載の固定化プロテアーゼ。
（６）プロテアーゼがトリプシンまたはリジルエンドペプチダーゼである、（５）に記載の固定化プロテアーゼ。
（７）ナノ粒子表面に、粗精製のプロテアーゼまたは自己消化耐性処理を行っていないプロテアーゼを固定化する工程を含む、固定化プロテアーゼの調製方法。
（８）ナノ粒子表面に、粗精製のプロテアーゼまたは自己消化耐性処理を行っていないプロテアーゼを固定化することにより、プロテアーゼに外部環境変化に対する耐性を付与する方法。
（９）プロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、V8プロテアーゼ、AspNプロテアーゼ、ArgCプロテアーゼ、パパイン、ペプシン、またはジペプチジルペプチダーゼである、（７）または（８）に記載の方法。
（１０）自己消化耐性処理が還元的ジメチル化処理である、（７）または（８）に記載の方法。
（１１）プロテアーゼがトリプシンまたはリジルエンドペプチダーゼである、（１０）に記載の方法。
本願は、2015年3月9日に出願された日本国特許出願2015-046380の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。

本発明のナノ粒子表面にプロテアーゼの固定化してなる固定化プロテアーゼは、温度やpH、添加物などの外部環境の変化を受けずに高い活性を維持することができ、安定性に優れている。よって、本発明の固定化プロテアーゼは、質量分析法によるタンパク質の定量または同定に供するペプチド断片のサンプル調製に用いることにより、質量分析により得られるデータの信頼性と再現性を向上させることができる。本発明の固定化プロテアーゼは、ナノ粒子に固定するプロテアーゼの種類や純度を問わず、質量分析グレードの優れた性能を発揮することができる。よって、本発明の固定化プロテアーゼを、質量分析によるタンパク質定量用または同定用キットの同梱試薬として利用すれば経済的であり、試薬の収益性を高めることができる。

図１は、温度25℃、各pH（pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0）、添加物（urea、OTG、MeCN)存在下におけるトリプシンの酵素活性を示す（上のパネル：固定化トリプシン（FG-Gold、FG-TPCK）、下のパネル：未固定トリプシン(Gold、TPCK））。図２は、温度37℃、各pH（pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0）、添加物（urea、OTG、MeCN)存在下におけるトリプシンの酵素活性を示す（上のパネル：固定化トリプシン（FG-Gold、FG-TPCK）、下のパネル：未固定トリプシン(Gold、TPCK））。図３は、温度45℃、各pH（pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0）、添加物（urea、OTG、MeCN)存在下におけるトリプシンの酵素活性を示す（上のパネル：固定化トリプシン（FG-Gold、FG-TPCK）、下のパネル：未固定トリプシン(Gold、TPCK））。図４は、温度50℃、各pH（pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0）、添加物（urea、OTG、MeCN)存在下におけるトリプシンの酵素活性を示す（上のパネル：固定化トリプシン（FG-Gold、FG-TPCK）、下のパネル：未固定トリプシン(Gold、TPCK））。図５は、温度60℃、各pH（pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0）、添加物（urea、OTG、MeCN)存在下におけるトリプシンの酵素活性を示す（上のパネル：固定化トリプシン（FG-Gold、FG-TPCK）、下のパネル：未固定トリプシン(Gold、TPCK））。図６は、温度70℃、各pH（pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0）、添加物（urea、OTG、MeCN)存在下におけるトリプシンの酵素活性を示す（上のパネル：固定化トリプシン（FG-Gold、FG-TPCK）、下のパネル：未固定トリプシン(Gold、TPCK））。図７は、温度37℃、pH8.0、添加物（DTT、TCEP、CHAPS、SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40)存在下におけるトリプシンの酵素活性を示す（上のパネル：固定化トリプシン（FG-Gold、FG-TPCK）、下のパネル：未固定トリプシン(Gold、TPCK））。図８は、温度37℃、pH8.0、添加物（NaCl、AS、IAA、Trehalose、Glycerol、EDTA)存在下におけるトリプシンの酵素活性を示す（上のパネル：固定化トリプシン（FG-Gold、FG-TPCK）、下のパネル：未固定トリプシン(Gold、TPCK））。図９は、温度37℃、各pH（pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0）、におけるトリプシンの酵素活性を示す（FG-Gold、FG-TPCK：ナノ粒子固定化トリプシン、CR-TPCK、AR-TPCK：マイクロ粒子固定化トリプシン）。図１０は、温度37℃、pH8.0、添加物（urea、NaCl、AS、IAA、EDTA)存在下におけるトリプシンの酵素活性を示す（FG-Gold、FG-TPCK：ナノ粒子固定化トリプシン、CR-TPCK、AR-TPCK：マイクロ粒子固定化トリプシン）。図１１は、温度37℃、pH8.0、添加物（Trehalose、Glycerol）存在下におけるトリプシンの酵素活性を示す（FG-Gold、FG-TPCK：ナノ粒子固定化トリプシン、CR-TPCK、AR-TPCK：マイクロ粒子固定化トリプシン）。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の固定化プロテアーゼは、ナノ粒子を固相担体として用い、その表面にプロテアーゼを固定化させたことを特徴とする。本発明の固定化プロテアーゼは、プロテアーゼがナノ粒子に固定化されることで、粗精製のプロテアーゼまたは自己消化耐性処理を行っていないプロテアーゼであっても、外部環境の変化を受けずに高い活性を維持することができる。

本発明で用いるナノ粒子は、その表面にプロテアーゼが多点結合できる限り大きさは限定されないが、トリプシンやリジルエンドペプチダーゼ等のプロテアーゼの分子径が5 nm程度であることから、その粒子径は、100〜500 nmが好ましく、150〜400 nmがより好ましく、200〜300nm がさらに好ましい。粒子径が大きくなると（例えば、マイクロオーダーレベル）、添加剤などの影響で粒子の収縮を考慮する必要があるが、ナノ粒子でかつ粒子表面に固定化した場合、この収縮を考慮する必要がないため、より安定性のある酵素を作製することが可能となる。ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。

ナノ粒子に対して固定化するプロテアーゼの量は、ナノ粒子の粒子径、プロテアーゼの種類や純度などにより異なるが、ナノ粒子1重量％に対して、通常1〜10重量％、好ましくは2〜5重量％である。

ナノ粒子の種類としては、水性媒体に分散又は懸濁することができ、分散液又は懸濁液から磁気分離または磁性沈殿分離により容易に回収することができる磁気ナノ粒子が好ましい。また、凝集が起こりにくいという点において、その表面が有機ポリマーで被覆された磁気ナノ粒子がより好ましい。磁気ナノ粒子の基材としては、酸化鉄（マグネタイト（Fe₃O₄）、マグヘマイト（γ‐Fe₂O₃））、フェライト（Fe/M)₃O₄などの強磁性合金が挙げられる。フェライト（Fe/M)₃O₄において、Mは、鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンを意味し、典型的にはCo²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺などが用いられる。また、磁気ナノ粒子を被覆する有機ポリマーとしては、ポリグリシジルメタクリレート（ポリGMA）、GMAとスチレンのコポリマー、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)、ポリアクリル酸メチル（PMA)などを挙げることができる。有機ポリマーで被覆された磁性ナノ粒子の具体例としては、FGビーズ、SGビーズ、Adembeads、nanomagなどが挙げられる。市販品としては、例えば、多摩川精機株式会社製のFG beads（フェライト粒子をポリグリシジルメタクリレート（ポリGMA）で被覆した粒径約200nmのポリマー磁性ナノ粒子）が好適に用いられる。

上記ナノ粒子は、非特異的なタンパク質の吸着抑制と、プロテアーゼの選択的な固定化のために、プロテアーゼと結合可能なスペーサ分子で修飾されていることが好ましい。スペーサ分子を介してプロテアーゼを固定化することにより、ナノ粒子表面からのプロテアーゼの脱離が抑制され、プロテアーゼ消化の位置選択性が高められる。また、スペーサの分子サイズを調整することにより、基質タンパク質の所望の位置にプロテアーゼを選択的にアクセスさせ、位置選択性を高めることもできる。

スペーサは、プロテアーゼと結合可能であり、かつプロテアーゼを失活させないものが好ましい。ナノ粒子表面に固定化されたプロテアーゼのアクセス範囲を制御する観点から、スペーサは分子径が小さいものが好ましい。スペーサの分子径は、5nm以下が好ましく、3nm以下がより好ましく、2nm以下がさらに好ましい。また、スペーサの分子量は2000以下が好ましく、1500以下がより好ましく、1000以下がさらに好ましい。

上記分子径で、プロテアーゼを固定化できるスペーサ分子は、非タンパク質が好ましく、末端にアミノ基、カルボキシル基、エステル基、エポキシ基、トシル基、ヒドロキル基、チオール基、アルデヒド基、マレイミド基、スクシンイミド基、アジド基、ビオチン、アビジン、キレート等の官能基を有する分子が好ましい。例えば、トリプシンの固定には、活性化されたエステル基を有するスペーサ分子が好ましい。また、スペーサ分子のうち、上記官能基以外のスペーサアーム部分は、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、ポリプロピレングリコールおよびその誘導体、ポリアクリルアミドおよびその誘導体、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）およびその誘導体、ポリ（エチレンテレフタル酸）およびその誘導体などの親水性分子が用いられる。

このようなスペーサ分子で表面修飾されたナノ粒子もまた市販されており、それらを利用すればよい。例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基（活性エステル基）を有するスペーサ分子で修飾されたナノ粒子は、商品名「FG beads NHS」（多摩川精機株式会社）として市販されている。

プロテアーゼをナノ粒子の表面に固定化する方法は特に限定されず、プロテアーゼとナノ粒子（あるいはナノ粒子表面を修飾するスペーサ分子）の特性等に応じて適宜の方法を採用できるが、上記のスペーサ分子の官能基を介したナノ粒子とプロテアーゼのアミンカップリング法が好ましい。例えば、ナノ粒子に表面修飾したカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）でエステル化して活性化エステル基とし、これに、プロテアーゼのアミノ基を結合させることができる。このカップリング反応は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDAC)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC)、ビス（2,6-ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド（DIPC)等のカルボジイミドを縮合剤の存在下に行うことができる。また、ナノ粒子に表面修飾したアミノ基に、グルタルアルデヒド、2官能性スクシンイミド、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3)、スルホニルクロリド、マレイミド、ピリジルジスルフィド等の架橋剤を用いてプロテアーゼのアミノ基を結合させてもよい。

スペーサ分子の官能基を介したナノ粒子とプロテアーゼのカップリング法は、ナノ粒子の懸濁液にプロテアーゼ溶液を添加し、一定の条件下で混合撹拌するという簡便な操作で行うことができる。反応条件は特に限定はされないが、例えば、プロテアーゼを添加したナノ粒子の懸濁液を温度1〜10℃、ｐＨ7.0で、50〜200 rpmで0.5〜1時間撹拌する。

ナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化後に、ナノ粒子表面のプロテアーゼと未結合の活性部分を不活性化させることが好ましい。例えば、ナノ粒子表面にプロテアーゼが固定化されていないスペーサ分子が存在すると、未結合のスペーサ分子が、試料中の夾雑物等と結合して、プロテアーゼ消化に悪影響を及ぼしたり、プロテアーゼ消化により産生されたペプチド断片がナノ粒子に固定化される等の不具合を生じる場合がある。プロテアーゼを固定化後に、未結合のスペーサ分子をブロックすることにより、このような不具合が抑制される。プロテアーゼと未結合の活性部分を不活性化する方法としては、化学修飾が好ましい。例えば、活性化エステル基は、一級アミンとの反応によりアミド結合を形成して不活性化させることができる。

本発明においてナノ粒子に固定化させるプロテアーゼの種類は、質量分析による定量または同定の対象となるタンパク質の種類に応じて適宜選択すればよく、限定はされないが、例えば、粗精製のまたは自己消化耐性処理を行っていない、トリプシン（塩基性アミノ酸残基（ArgおよびLys）のC末端側でペプチドを切断する）、キモトリプシン（芳香族アミノ酸残基（Phe、TyrおよびTrp）のC末端側でペプチドを切断する）、リジルエンドペプチダーゼ（Lys残基のC末端側でペプチドを切断する）、V8プロテアーゼ（Glu残基のC末端側でペプチドを切断する）、AspNプロテアーゼ（Asp残基のN末端側でペプチドを切断する）、ArgCプロテアーゼ（Arg残基のC末端側でペプチドを切断する）、パパイン、ペプシン、ジペプチジルペプチダーゼなどが挙げられる。上記プロテアーゼの中でも、本発明においては、トリプシンが特に好ましく用いられる。トリプシンは分子径が小さく、かつ活性部位が分子の内部に存在している。そのため、活性部位が基質タンパク質にアクセスできる領域が制限され、プロテアーゼ消化の位置選択性を高めることができる。特に、基質タンパク質が抗体の場合には、プロテアーゼとしてトリプシンを用いることが好ましい。

本発明において使用するプロテアーゼは、粗精製のプロテアーゼまたは自己消化耐性処理を行っていないプロテアーゼであって、純度は問わない。よって、市販のプロテアーゼを用いる場合、質量分析グレードや配列決定（シーケンス）グレードのプロテアーゼには限定されず、生体由来のネイティブのプロテアーゼであってよい。例えば、トリプシンの場合、生体由来のネイティブのトリプシンは、自己消化によりキモトリプシン様の活性を示す疑似トリプシンを生成するため、N-トシル-L-フェニルアラニンクロロメチルケトン（TPCK）処理することでキモトリプシン活性を低下させたもの、もしくはトリプシンのリジン残基を還元的ジメチル化処理して自己消化に対する抵抗性を高めたものが質量分析グレードのトリプシンとして市販されているが、本発明において使用するトリプシンはこのようなリジン残基の還元的ジメチル化処理を行っていないトリプシンであってもよい。

上記のようにしてナノ粒子に結合させたプロテアーゼは、外部環境変化に対する耐性が飛躍的に向上する。ここで、外部環境とは、温度（熱）、pH、有機溶媒、タンパク質変性剤、タンパク質還元・アルキル化剤、タンパク質保護・安定化剤、タンパク質の可溶化用界面活性剤、塩析剤、塩類などをいう。タンパク質変性剤としては、例えば、尿素、塩酸グアニジン、ジチオトレイトール（DTT）、メルカプトエタノール等が挙げられる。タンパク質還元・アルキル化剤としては、例えば、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩(TCEP)、ヨードアセトアミド(IAA)等が挙げられる。タンパク質保護・安定化剤としては、例えば、EDTAなどのキレート剤、グリセロールなどのポリオール、トレハロース、グルコース、ショ糖などの糖類等が挙げられる。有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤（Triton X-100, Tween 20/40/60/80、Nonidet P-40(NP-40)等)、アルキルグリコシド系非イオン界面活性剤（n-オクチル-β-D-グルコシド（OG)、n-オクチル-β-D-チオグルコシド(OTG)、n-ドデシル-β-D-マルトシド（DDM)、n-ノニル-β-D-マルトシド（NG)等)、両性界面活性剤（3-［（3-コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-１-プロパンスルホン酸（CHAPS）または3-［（3-コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（CHAPSO)等）、陽イオン性界面活性剤（セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)等)が挙げられる。塩析剤としては、例えば、硫酸アンモニウム(AS)、塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。

本発明の固定化プロテアーゼを用いて基質タンパク質を消化する場合は、その条件は特に限定されず、一般的なプロテアーゼ消化と同様の条件を採用できる。例えば、プロテアーゼの至適pH近傍に調整された緩衝溶液中で、通常37℃程度の温度で、1時間〜20時間程度インキュベートすることが好ましい。また、基質タンパク質と、固定化プロテアーゼとの混合量比も特に制限されず、基質タンパク質の量に応じたプロテアーゼ量となるように設定すればよい。なお、一般的なプロテアーゼ消化条件は、基質タンパク質：プロテアーゼが100:1〜10:1（重量比）程度である。

本発明の固定化プロテアーゼによる基質タンパク質の消化により産生されたペプチド断片から、基質タンパク質の同定や定量を行うには、質量分析が適している。質量分析は、アミノ酸配列を決定可能であるため、ペプチド断片が抗体等の特定のタンパク質に由来のペプチド断片であるか否かを判別可能である。また、ピーク強度に基づいて試料中のペプチド断片の濃度を決定できる。質量分析におけるイオン化法は特に限定されず、電子イオン化（EI）法、化学イオン化（CI）法、電界脱離（FD）法、高速原子衝突（FAB）法、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法等を採用することができる。イオン化された試料の分析方法も特に限定されず、磁場偏向型、四重極（Q）型、イオントラップ（IT）型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（FT-ICR）型等を、イオン化法に応じて適宜に決定できる。また、三連四重極型質量分析装置等を用いて、MS/MS分析、あるいはMS3以上の多段階質量分析を行うこともできる。

本発明の固定化プロテアーゼは、ナノ粒子表面に固定化された状態で安定に高い活性を保持することできるため、質量分析法によるタンパク質の定量または同定に供するペプチド断片のサンプル調製用キットの構成要素として提供できる。本発明の固定化プロテアーゼは特に、抗体の検出や定量に適しており、Fab領域を選択的にプロテアーゼ消化して、得られたペプチド断片試料の質量分析により、相補性決定領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片の配列や量を決定できる。本発明の固定化プロテアーゼはまた、薬物動態の解析、抗原抗体反応を用いた相互作用の解析、各種のインタラクトーム解析、免疫沈降タンパク質の同定等の基礎研究、抗体医薬等の生体分子医薬の配列解析、品質保証、後発医薬品の同一性確認試験等にも利用できる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

以下の実施例において使用した試薬等について、特に記載のないものは和光純薬工業より入手した。また以下のバッファーは、精密pHメーターを用いてpHを調整した。
HEPESバッファー： 25 mM HEPES-NaOH， pH 7.0
エタノールアミンバッファー： 1M ethanolamine-HCl, pH 8.0
Trisバッファー： 25 mM Tris-HCl， pH 8.0

（実施例１）固定化プロテアーゼの調製
プロテアーゼ固定化用のナノ粒子として、カルボキシ基がN-ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたスペーサ（下記化学式（Ｌはナノ粒子表面への結合部位）参照、スペーサ長さ1nm)で修飾された、平均粒径190 nm（分散範囲±20 nm）のFG beads（多摩川精機、FG beads NHS）を用いた。

FG beads 1mgのイソプロパノール懸濁液50μLを、4℃で遠心（15000rpm，5分）してナノ粒子を沈降させ、上清を取り除いた後、メタノールで洗浄した。50μgのプロテアーゼを含む溶液を200μLのHEPESバッファーに溶解したものを、上記のナノ粒子に加えて、ナノ粒子を懸濁させた。なお、懸濁に際しては、懸濁液の温度が上昇しないように、数秒の超音波処理を行った。

このナノ粒子の懸濁液を、4℃で30分撹拌した後、4℃で遠心（15000rpm，5分）してナノ粒子を沈降させ、上清を取り除いた。続いて、エタノールアミンバッファー200μLを加えて粒子を懸濁させ、4℃で30分撹拌して、ナノ粒子表面の余剰のN-ヒドロキシスクシンイミド基をエタノールアミンによりブロックし、ナノ粒子固定化プロテアーゼ（50 μg/mg固相)を得た。その後、4℃で遠心（15000rpm，5分）してナノ粒子を沈降させ、上清を取り除いた後、Trisバッファーによる洗浄と遠心を２回繰り返し、Trisバッファー（100μL)中に懸濁させた（懸濁液中のプロテアーゼ濃度：0.5μg/μL）。

（実施例２）酵素安定性試験１(ナノ粒子固定化プロテアーゼと未固定プロテアーゼの比較）
プロテアーゼ基質としてN-α-ベンゾイル-DL-アルギニン-p-ニトロアニリド塩酸塩（MW=434.9）を用い、プロテアーゼとしてTrypsin Gold, Mass Spec Grade（プロメガ社製）(以下、「Gold」と表記する）およびTrypsin TPCK Treated from bovine pancreas, Product Number T1426（Sigma Aldrich社製）(以下、「TPCK」と表記する）の2種のトリプシン、ならびに「Gold」、「TPCK」をそれぞれ実施例１に記載の方法に従ってナノ粒子に固定化した「FG-Gold」、「FG-TPCK」を用いて、種々の条件下で酵素反応を行い、酵素安定性を調べた。「Gold」は、キモトリプシン失活処理（TPCK処理）に加え、還元的ジメチル化処理を施すことによって、自己消化に対して抵抗性を有し、温度やpHに依存することなくブロードに高い活性を維持している質量分析グレードのプロテアーゼである。一方、「TPCK」は、キモトリプシン失活処理をしているが、精製度が低いために不純物由来のキモトリプシンが残存し、完全にキモトリプシン活性を抑えているものではなく、また還元的ジメチル化など自己消化耐性処理などもしていないため、熱耐性に乏しく、pH許容範囲や適合緩衝液およびそのpHも限られているプロテアーゼである。

プロテアーゼ基質を終濃度10 mMとなるようにDMSOに溶解してストック溶液とした。基質溶液、反応緩衝液、未固定（フリーな）プロテアーゼ溶液または固定化プロテアーゼ懸濁液を表１の割合で混合して酵素反応液を調製した。

調製した酵素反応液を用いて以下の条件を設定して酵素反応を行った。（c)の添加剤は、反応緩衝液(25mM Tris)に所定の終濃度となるよう添加した。

(a)温度
25℃, 37℃, 45℃, 50℃, 60℃, 70℃
(b)pH
6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0
(c)添加剤(タンパク質変性剤、界面活性剤、有機溶媒など/温度37℃, pH 8.0）
1M, 2M尿素 (urea)
0.1% n-オクチル-β-D-チオグルコシド（OTG)
10%, 20%, 50%アセトニトリル(MeCN)
5 mM, 10 mM, 20 mMジチオトレトール（DTT）
1 mM, 5 mM, 10 mM トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩(TCEP)
0.1％ CHAPS
0.1％ SDS
0.1％ Tween 20
0.1％ Triton X-100
0.1％ NP-40
50 mM, 150 mM, 500 mM NaCl
50 mM, 150 mM, 500 mM AS
50 mM IAA
50 mM, 500 mM トレハロース(Trehalose)
10% グリセロール (Glycerol)
10 mM EDTA

それぞれの条件で酵素反応を1.5時間、ボルテックス攪拌下にて行った。反応終了時は、2N-HClまたは10%硫酸を50μL加えて酵素反応を完全に停止した。マルチスクリーンフィルタープレートでろ過し、ナノ粒子を除去後、Optical bottom plateに分注し、マイクロプレートリーダー(TECAN Infinite M200Pro)を用いて基質より遊離したパラニトロアニリン（p-NA）の吸光度（405 nm, 吸光係数＝9920 M^-1・cm^-1）を測定し、酵素活性を評価した。

結果を図１〜８に示す。GoldはpHや添加物の存在を問わず、25〜70℃という非常に広い温度範囲でトリプシン活性を有するのに対し、TPCKはトリプシン活性が弱く、特に60℃以上では顕著に低かった（図１〜６の下のパネル参照）。これに対し、FG beadsに固定したTPCK（FG-TPCK)は、温度やpHに関係なく、飛躍的にトリプシン活性が増加し、FG beadsに固定したGold（FG-Gold)を上回るまたは同程度の結果となった（図１〜６の上のパネル）。特に、プロテオミクスでよく用いられるタンパク質変性剤である尿素存在下では、TPCKはトリプシンの至適pH（pH8）であるにも関わらず、トリプシン活性が失活しているのに等しい状態であるのに対し、FG-TPCKはFG-Goldを上回る活性を維持した（図１〜６の上のパネル参照）。その他の添加物(タンパク質変性剤、界面活性剤、有機溶媒など）の添加環境下においても、FG-TPCKはTPCKに比べて顕著にトリプシン活性が増加し、FG-TPCKとFG-Goldはほぼ同一の挙動をとった（図７、８参照）。

（実施例３）酵素安定性試験２(ナノ粒子固定化プロテアーゼと通常粒子固定化プロテアーゼの比較）
ナノ粒子としてFG beads（多摩川精機、FG beads NHS）を用い、実施例１と同様にして、「Gold」、「TPCK」をそれぞれ固定化して「FG-Gold」、「FG-TPCK」を調製し、Trisバッファー（100μL)中に懸濁させた（懸濁液中のプロテアーゼ濃度：0.5μg/μL）。通常粒子（マイクロ粒子）固定化プロテアーゼとして、市販品のPromega Immobilized Trypsin（Cellulose resin）(以下、「CR-TPCK」と表記する）またはPierce Immobilized TPCK Trypsin（4% crosslinked Agarose resin）(以下、「AR-TPCK」と表記する）を用いた。粒子は25 mM Tris pH8.0にて5回洗浄し、その後75mlのスラリーとした。

プロテアーゼ基質（N-α-ベンゾイル-DL-アルギニン-p-ニトロアニリド塩酸塩）を終濃度10 mMとなるようにDMSOに溶解してストック溶液とした。反応緩衝液(25mM Tris) 500 μLに対し、基質溶液50 μL、ナノ粒子固定化プロテアーゼ懸濁液25μLまたは通常粒子（マイクロ粒子）固定化プロテアーゼ懸濁液12.5μLを加えて酵素反応液を調製した。

調製した酵素反応液を用いて以下の条件を設定して酵素反応を行った。（b)の添加剤は、反応緩衝液(25mM Tris)に所定の終濃度となるよう添加した。

(a)pH (温度:37℃）
6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0
(b)添加剤 (タンパク変性剤など/pH 8.0, 温度37℃)
1M, 2M尿素 (urea)
50 mM, 150 mM, 500 mM NaCl
50 mM, 150 mM, 500 mM AS
50 mM IAA
10 mM EDTA
50 mM, 500 mM トレハロース(Trehalose)
10% グリセロール (Glycerol)

それぞれの条件で酵素反応を1.5時間、ボルテックス攪拌下にて行った。反応終了時は、10%硫酸を50μL加えて酵素反応を完全に停止した。マルチスクリーンフィルタープレートでろ過し、ナノ粒子を除去後、Optical bottom plateに分注し、マイクロプレートリーダー(TECAN Infinite M200Pro)を用いて基質より遊離したパラニトロアニリン（p-NA）の吸光度（405 nm, 吸光係数＝9920 M^-1・cm^-1）を測定し、酵素活性を評価した。なお、上記市販品の酵素活性の評価は、pH8.0の酵素活性を1とした相対酵素活性で比較した。

結果を図９〜１１に示す。中性付近(pH7.0〜7.5）ではナノ粒子固定化プロテアーゼのほうがマイクロ粒子固定化プロテアーゼよりも酵素活性が高く、また、アルカリ側を含めて広いpH範囲で活性を維持できた（図９）。この結果から、ナノ粒子固定化プロテアーゼは、例えばpH7程度のヒト体液や血液などのサンプルを消化する場合には有利である。また、タンパク質変性剤(urea)、塩類(NaCl)、塩析剤（AS)、タンパク質還元・アルキル化剤（IAA)、タンパク質保護・安定化剤（EDTA、Trehalose、Glycerol)添加環境下においてナノ粒子固定化プロテアーゼのほうがマイクロ粒子固定化プロテアーゼよりも高い酵素活性を示した（図１０、１１）。特に、マイクロ粒子固定化プロテアーゼは、NaClに対する耐性がないのが致命的であるが、ナノ粒子固定化プロテアーゼでは、高濃度のNaClの存在下でも安定であった。マイクロ粒子固定化プロテアーゼは、安定化剤が存在した場合にかえって酵素活性が低下するという傾向が認められた。これに対し、ナノ粒子固定化プロテアーゼでは安定化剤が存在しても酵素活性が低下しないのは、粒子がナノサイズであるために、溶液の粘性増加に伴う分散性（基質との接触確率）の低下が起こりにくいことが要因と考えられる。以上から、ナノ粒子固定化プロテアーゼは、粗精製の生体試料中のタンパク質などを分析対象とする臨床検査試験などへの応用に適しているといえる。

本発明は、抗体医薬品、タンパク質製剤などのバイオ医薬品の開発における製品の評価や分析試験、医療現場における臨床検査のための試薬製造分野において利用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。

Claims

ナノ粒子表面に、粗精製のプロテアーゼまたは自己消化耐性処理を行っていないプロテアーゼを固定化させたことを特徴とする、固定化プロテアーゼ。
ナノ粒子の粒子径が、100〜500 nmである、請求項１に記載の固定化プロテアーゼ。
ナノ粒子が磁性ナノ粒子である、請求項１または２に記載の固定化プロテアーゼ。
プロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、V8プロテアーゼ、AspNプロテアーゼ、ArgCプロテアーゼ、パパイン、ペプシン、またはジペプチジルペプチダーゼである、請求項１〜３のいずれかに記載の固定化プロテアーゼ。
自己消化耐性処理が還元的ジメチル化処理である、請求項１〜３のいずれかに記載の固定化プロテアーゼ。
プロテアーゼがトリプシンまたはリジルエンドペプチダーゼである、請求項５に記載の固定化プロテアーゼ。
ナノ粒子表面に、粗精製のプロテアーゼまたは自己消化耐性処理を行っていないプロテアーゼを固定化する工程を含む、固定化プロテアーゼの調製方法。
ナノ粒子表面に、粗精製のプロテアーゼまたは自己消化耐性処理を行っていないプロテアーゼを固定化することにより、プロテアーゼに外部環境変化に対する耐性を付与する方法。
プロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、V8プロテアーゼ、AspNプロテアーゼ、ArgCプロテアーゼ、パパイン、ペプシン、またはジペプチジルペプチダーゼである、請求項７または８に記載の方法。
自己消化耐性処理が還元的ジメチル化処理である、請求項７または８に記載の方法。
プロテアーゼがトリプシンまたはリジルエンドペプチダーゼである、請求項１０に記載の方法。