JP6515995B2 - モノクローナル抗体の検出のためのサンプル調製用キット - Google Patents
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Description
測定対象のモノクローナル抗体を固定化するための多孔質体と、
プロテアーゼを固定化したナノ粒子と、
前記多孔質体と前記ナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体を選択的に消化するための反応容器と、
前記ナノ粒子及び多孔質体と共に前記反応容器内に導入され、前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
前記消化反応後に前記多孔質体および前記ナノ粒子を除去して、前記消化反応の生成物を前記緩衝液と共に抽出するためのろ過膜と、
を含む、上記キット。
(2)前記ろ過膜が、圧力又は遠心力を加えない条件下では前記緩衝液及び前記プロテアーゼによる消化反応によって生成するペプチドをほとんど透過せず、圧力又は遠心力を加えた条件下では前記緩衝液及び前記ペプチドを透過することができるものである、(1)記載のキット。
(3)前記ろ過膜がポリフッ化ビニリデン(PVDF)製の膜である、(1)または(2)記載のキット。
(4)前記キットが多検体を同時に処理するためのキットであり、前記ろ過膜のハウジング素材がポリアクリロニトリル樹脂である、(1)〜(3)のいずれか記載のキット。
(5)(1)〜(4)のいずれか記載のキットに、更にモノクローナル抗体の検出のための質量分析条件を記載した説明書を含む、高速液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によるモノクローナル抗体検出のためのキット。
(6)測定対象となるモノクローナル抗体に特異的なアミノ酸配列を含む1以上の内部標準ペプチドを更に含む、(1)〜(5)のいずれか記載のキット。
(7)測定対象がトラスツズマブ、トラスツズマブ-DM1、ベバシズマブ、またはリツキシマブであって、内部標準ペプチドが配列番号1〜47のいずれか1以上のアミノ酸配列を有するペプチドである、(6)記載のキット。
(8)測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、得られたペプチド断片を高速液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって分析することによって前記モノクローナル抗体の検出を行う方法に使用するための、前記質量分析を実行させるためのデータが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記データが、前記モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化によって得られるペプチドの1以上に対して、少なくとも親イオン、フラグメントイオン、予想保持時間、三連四重極のそれぞれにおける電圧のデータを含む、上記記録媒体。
(9)(8)記載の記録媒体と、前記記録媒体の使用説明書とを含む、高速液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によるモノクローナル抗体の検出のためのメソッドパッケージ。
(10)前記モノクローナル抗体が、トラスツズマブ、トラスツズマブ-DM1、ベバシズマブ、リツキシマブの1種以上である、(8)記載の記録媒体または(9)記載のメソッドパッケージ。
(11)前記データが、配列番号1〜47のいずれか1以上のアミノ酸配列を有するペプチドに対するものである、(8)記載の記録媒体または(9)記載のメソッドパッケージ。
測定対象のモノクローナル抗体を固定化するための多孔質体と、
プロテアーゼを固定化したナノ粒子と、
前記多孔質体と前記ナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体を選択的に消化するための反応容器と、
前記ナノ粒子及び多孔質体と共に前記反応容器内に導入され、前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
前記消化反応後に前記多孔質体および前記ナノ粒子を除去して、前記消化反応の生成物を前記緩衝液と共に抽出するためのろ過膜と、
を含む、上記キットに関する。
質量分析を用いた定量技術は、近年では主に三連四重極と呼ばれるハイブリッド型質量分析装置によって行われる。具体的には、イオン化された生体分子はまず、オクトポールと呼ばれる部分を通過することで、そのイオン分子振動半径を小さくする。次に第1四重極の中で、特定の質量数を持つイオンを共振させることで選択し、他のイオンを排除する。このステップはシングルイオンモニタリング(single ion monitoring, SIM)とも呼ばれる。
本発明のキットを用いてLC-MSによる検出のためのサンプルを調製する測定対象はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、2本の重鎖(分子量50 kDa)と2本の軽鎖(分子量25 kDa)がジスルフィド結合でつながった構造を有する生体高分子である。FabドメインとFcドメインがヒンジを介してつながっており、また重鎖及び軽鎖はそれぞれ定常領域と可変領域から成る。定常領域は、抗体の特徴的なY字型の形を保つ構造(フレームワーク構造)を有し、同一種由来の抗体のほとんどで共通するアミノ酸配列を有している。一方、可変領域には、相補性決定領域(complementarity-determining region, CDR)と呼ばれる特異的な配列を持つ部位が各3つずつ存在する。このCDR(CDR1、CDR2、CDR3)領域が規定する立体構造が抗原との特異的結合に関わっており、それによって抗体−抗原複合体が形成される。
本発明のキットに含まれる多孔質体は、多数の細孔を有するものであれば、その材料は特に限定されず、活性炭、多孔質膜、多孔質樹脂ビーズ、金属粒子等を用いることができる。これらの中でも、抗体を部位特異的に結合可能なものが特に好ましい。
抗体を多孔質体の細孔内に固定化する方法は特に限定されず、抗体と多孔質体あるいはリンカー分子の特性等に応じて適宜の方法を採用できる。例えば、細孔内にprotein Aやprotein Gが固定化された多孔質体に抗体を固定化する場合は、多孔質体の懸濁液と抗体を含む溶液とを混合することにより、細孔内に抗体を容易に固定化できる。
本発明のキットに含まれるナノ粒子は、その表面にプロテアーゼを固定化して、多孔質体の細孔内に固定化された抗体へのプロテアーゼのアクセスを制御する目的で用いられる。そのため、ナノ粒子は、多孔質体の細孔の奥深くまで入り込まないように、その平均粒径D1が、多孔質体の平均細孔径D2よりも大きいものとする(図1)。
本発明に係る方法は、プロテアーゼが、多孔質体の細孔内に固定化された抗体を特定のアミノ酸配列部位で切断してペプチド断片を生じさせるものである。
プロテアーゼをナノ粒子の表面に固定化する方法は特に限定されず、プロテアーゼとナノ粒子(あるいはナノ粒子表面を修飾するスペーサ分子)の特性等に応じて適宜の方法を採用でき、例えば、プロテアーゼをスペーサ修飾されたナノ粒子表面に固定化する場合は、ナノ粒子の懸濁液とプロテアーゼを含む溶液とを混合することにより、ナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化できる。上記のスペーサ分子の官能基を介したナノ粒子とプロテアーゼのアミンカップリング法が好ましい。例えば、ナノ粒子に表面修飾したカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)でエステル化して活性化エステル基とし、これに、プロテアーゼのアミノ基を結合させることができる。このカップリング反応には、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)カルボジイミド(DIPC)等のカルボジイミドを縮合剤の存在下に行うことができる。また、ナノ粒子に表面修飾したアミノ基に、グルタルアルデヒド、2官能性スクシンイミド、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)、スルホニルクロリド、マレイミド、ピリジルジスルフィド等の架橋剤を用いてプロテアーゼのアミノ基を結合させてもよい。
抗体が固定化された多孔質体と、プロテアーゼが表面に固定化されたナノ粒子とを液体中で接触させることにより、抗体がプロテアーゼ消化され、ペプチド断片が産生される。ここで、「液体」とは、基質(固相)及び酵素(固相)が液相中で接触することを意味するものであり、またプロテアーゼ消化反応に適した水性媒体を意図する。
プロテアーゼ消化によって得られた目的のペプチド断片を質量分析に供するためには、多孔質体及びナノ粒子を除去することが必要である。これは、プロテアーゼ消化後のサンプルに対してろ過、遠心分離、磁気分離、透析等の操作を行うことで達成できる。
上記で得られたペプチド断片を含む試料を、LC-MSにより分析することで、抗体の同定や定量を行い得る。
本発明は、上記した高速液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によってモノクローナル抗体を検出する方法において使用するためのサンプル調製用キットであって、
測定対象のモノクローナル抗体を固定化するための多孔質体と、
プロテアーゼを固定化したナノ粒子と、
前記多孔質体と前記ナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体を選択的に消化するための反応容器と、
前記ナノ粒子及び多孔質体と共に前記反応容器内に導入され、前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
前記消化反応後に前記多孔質体および前記ナノ粒子を除去して、前記消化反応の生成物を前記緩衝液と共に抽出するためのろ過膜と、
を含む、上記キットに関する。
一サンプルずつ分析するための試薬キットは、例えば以下の構成のものである。
0.2μmのろ過膜スピンフィルター(ミリポア ウルトラフリーPVDF、0.2μm)
細孔径100 nmのProtein G樹脂スラリー(4℃保存)
粒子径200 nmのナノ粒子に固定化されたトリプシンビーズ(-20℃保存)
血漿希釈用低吸着チューブ
溶液回収マイクロチューブ
血漿希釈用バッファー(PBS + 0.1% n-オクチル-β-D-チオグリコシドもしくは相当する界面活性剤、例えばn-オクチル-β-D-グリコシド)
ビーズ洗浄用バッファー(PBS)
プロテアーゼ反応用バッファー(25 mM Tris-HCl, pH 8.0 + プロテアーゼ反応促進添加剤)
10%ギ酸水溶液
使用説明書
例えば96サンプル同時分析を可能とする多検体処理用の試薬キットは、例えば以下の構成のものである。
0.2μmのろ過膜プレート(ミリポア マルチスクリーンPVDF、Barex、0.2 μm)
細孔径100 nmのProtein G樹脂スラリー(4℃保存)
粒子径200 nmのナノ粒子に固定化されたトリプシンおよびプロテアーゼビーズ(-20℃保存)
血漿希釈用低吸着プレート
溶液回収用プレート
溶液廃棄用プレートリザーバー
プロテアーゼビーズ用プレート
血漿希釈用バッファー(PBS + 0.1% n-オクチル-β-D-チオグリコシドもしくは相当する界面活性剤、例えばn-オクチル-β-D-グリコシド)
ビーズ洗浄用バッファー(PBS)
プロテアーゼ反応用バッファー(25 mM Tris-HCl, pH 8.0 + プロテアーゼ反応促進添加剤)
10%ギ酸水溶液
プレートカバーシール
オートサンプラー用DMSO耐性、ニードルピアシブルプレートカバーシール
使用説明書
本発明のキットに場合によって含めるものとして、例えば内部標準ペプチドがある。これは、バイオ医薬品定量用ペプチドの定量精度を高めるためのものであって、バイオ医薬ごとに複数のペプチドを用意し、別売することが望ましい。内部標準ペプチドには、安定同位体アミノ酸でラベルしたものを含めても良く、その場合、同位体を含まないペプチドと比較すると質量分析定量条件が異なるため、内部標準用定量条件を同封することが好ましい。
内部標準ペプチド(例えばトラスツズマブ用として、配列番号1〜7のペプチドのいずれか1以上)
試薬品質保証データ(質量分析データ、および原子純度測定結果)
定量条件ファイルパッケージ
使用説明書
本発明はまた、測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、トリプシンを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的トリプシン消化を行い、得られたペプチド断片を高速液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって分析することによって前記モノクローナル抗体の検出を行う方法に使用するための、メソッドパッケージを提供する。本明細書において、「メソッドパッケージ」とは、特定の測定対象に対する液体クロマトグラフ質量分析の分析条件を読取り可能な形態で含み、単独で流通可能なものをいう。メソッドパッケージに含まれるデータをLC-MSにインポートすることで、詳細な検討の末に得られた最適測定条件で分析することが可能となる。
・最適化※されたペアレントイオンm/z値
・最適化されたフラグメントイオンm/z値
・最適化されたQ1 pre bias電圧値
・最適化されたQ2 collision energy電圧値
・最適化されたQ3 pre bias電圧値
・目的イオンの予想保持時間および質量分析時間
・定量値換算式
・解析結果レポート出力機能
※:各条件項目を実測し、最もイオン強度の高いもの、および最も再現性のあるm/z値を採択し、これを最適値とする。
単一サンプルの分析のために、以下の構成のキットを準備する。
(1) PBS緩衝液(PBS + 0.1% n-オクチル-β-D-チオグルコシド, Dojindo)
(2) 酵素反応緩衝液(25 mM Tris-HCl, pH8.0)
(3) 酵素反応停止液(10% ギ酸)
(4) フィルターチューブ(Low-binding hydrophilic PVDF、孔径0.2μm、ミリポア社)
(5) 低吸着チューブ(リッチェル マイクロレシコチューブ 92017)
(6) LCMSバイアル、インサート(島津GLC GLC4010-VPターゲットバイアルVP、C4010-630P Target PP Polyspring)
(7) 多孔質体(Pierce 53126 Protein G UltraLink Resin、40 μl分注)
(8) ナノ粒子(トリプシン固定化FGビーズ(トリプシン 40 μg))
(9) 使用説明書
1. 血液サンプル20 μlを低吸着チューブ(5)にとり、緩衝液(1)を180 μlで希釈する。
2. 多孔質体(7)を卓上遠心機にて遠心し、上清を捨てる。緩衝液(1)を100 μl加え、軽く攪拌後遠心し、上清を捨てる。この操作を3回行う。その後40 μlの緩衝液(1)を加え懸濁した後、フィルターチューブ(4)へ移す。この操作はフィルターチューブ(4)上で行ってもよい。
3. ステップ1の血液希釈サンプルを、フィルターチューブ(4)へ移す。
4. タッピングロータリーミキサー(日伸理化)で軽くタッピングしながら、室温で1時間攪拌する。
5. 遠心ろ過(10,000g x 1 分)し、溶液を分離する。緩衝液(1)を200 μl加え遠心ろ過し、ろ液を廃棄する。この操作を3回行う。
6. PBS緩衝液(1)を200 μl加え、軽く攪拌後遠心ろ過し、ろ液を捨てる。この操作を1回行う。
7. ステップ6の多孔質体に、緩衝液(2)を200μl加える。
8. ナノ粒子(8)を氷上で溶解する。手早く超音波洗浄機もしくはボルテックスミキサーで均一に分散し、ステップ7へ加える。
9. フィルターチューブに溶液回収用チューブをとりつけ、ふた側にパラフィルムなどを用いシールをする。タッピングロータリーミキサーで軽くタッピングしながら、37℃で6時間攪拌して、タンパク質分解を行う。
10. 反応混合液を遠心ろ過(10,000g x 1 分)し、樹脂を除去する。ろ液を回収する。
11. ステップ10に、酵素反応停止液(3)を15 μl加える。
12. LC-MSバイアルセット(6)に移し、底の気泡を除去する。
13. LC-MSのオートサンプラーにセットし、分析を行う。
14. LC-MS分析条件リストは、別紙添付する(表1〜表6)。
ろ過に使用する膜素材によるペプチド回収率の相違を検証するため、ポリテトラフルオロエチレン(polytetrafluoroethylene、PTFE)およびポリフッ化ビニリデン(polyvinylidene difluoride、PVDF)の2つの膜素材を比較した。
実施例2と同様の実験を、ベバシズマブを用いて検証した。結果を図3に示す。
多検体の測定に用いるためのろ過膜プレートのペプチド回収率を検証するため、2つの膜素材(PTFE、PVDF)およびハウジング3種を比較した。マルチスクリーンプレートとして、1) PTFE membrane/Solvinert housing(メルク社)、2) PVDF membrane/Acryl clear housing(メルク社)、3) PVDF membrane/Barex white housing(メルク社)を用いて比較した。
ナノ粒子に固定化するプロテアーゼ(トリプシン)の活性の安定性をモニターするために、酵素活性測定を行った。ナノ粒子が基質吸光度を阻害するので、従来法に対し、いくつかの改変を加えた。
プロテアーゼ基質を終濃度10 mMとなるよう、DMSOに溶解し、ストック溶液とする。
下記のように混合する。
・基質 10μl(100 nmol)
・反応緩衝液(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH8.0) 200μl
・固定化酵素懸濁液(0.5 mg/ml) 2μl
プロテアーゼ固定化ナノ粒子の大量製造に対し、プロテアーゼ活性に変化が生じるか否かを検証した。測定方法は、実施例5と同様の改変に加え、反応緩衝液を50 mM Tris-HCl、pH8.0に変更した。
ナノ粒子の大量製造に伴い、洗浄工程が不十分となる可能性が考えられる。洗浄工程の効率化を図る目的で、固定化後の洗浄液に界面活性剤を使用し、その効果を検証した。
マスキングなし(detergent -)FGビーズトリプシン:5.784E-03
マスキングあり(detergent +)FGビーズトリプシン:5.902E-03
となり、界面活性剤洗浄による酵素失活はないと判断できた。
Claims (6)
- 高速液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によってモノクローナル抗体を検出するためのサンプル調製用キットであって、
測定対象のモノクローナル抗体を固定化するための多孔質体と、
プロテアーゼを固定化したナノ粒子と、
前記多孔質体と前記ナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体を選択的に消化するための反応容器と、
前記ナノ粒子及び多孔質体と共に前記反応容器内に導入され、前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
前記消化反応後に前記多孔質体および前記ナノ粒子を除去して、前記消化反応の生成物を前記緩衝液と共に抽出するためのろ過膜と、
を含み、前記ろ過膜が、圧力又は遠心力を加えない条件下では前記緩衝液及び前記プロテアーゼによる消化反応によって生成するペプチドをほとんど透過せずに前記反応容器の底として機能し、圧力又は遠心力を加えた条件下では前記緩衝液及び前記ペプチドを透過することができるものである、前記キット。 - 前記ろ過膜がポリフッ化ビニリデン(PVDF)製の膜である、請求項1記載のキット。
- 前記キットが多検体を同時に処理するためのキットであり、前記ろ過膜のハウジング素材がポリアクリロニトリル樹脂である、請求項1または2記載のキット。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載のキットに、更にモノクローナル抗体の検出のための質量分析条件を記載した説明書を含む、高速液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によるモノクローナル抗体検出のためのキット。
- 測定対象となるモノクローナル抗体に特異的なアミノ酸配列を含む1以上の内部標準ペプチドを更に含む、請求項1〜4のいずれか1項記載のキット。
- 測定対象がトラスツズマブ、トラスツズマブ-DM1、ベバシズマブ、またはリツキシマブであって、内部標準ペプチドが配列番号1〜47のいずれか1以上のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項5記載のキット。
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