CN115932065A - 用于检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒。提供样品调制用试剂盒,该样品调制用试剂盒用于提供不受抗体的多样性、种间差、基质等影响的、通用性极高的分析手法。提供一种用于通过高效液相质谱分析(LC‑MS)检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒,其包括:多孔体,其用于使作为测定对象的单克隆抗体固定化;纳米颗粒,其固定化有蛋白酶;反应容器,其用于使前述多孔体与前述纳米颗粒接触而选择性地消化单克隆抗体;缓冲液,其与前述纳米颗粒和多孔体一起被导入至前述反应容器内、且用于利用前述蛋白酶进行消化反应;以及、过滤膜,其用于在前述消化反应后将前述多孔体和前述纳米颗粒去除、且将前述消化反应的产物与前述缓冲液一起提取。
Description
本申请是中国专利申请201580077602.X的分案申请,原申请201580077602.X的申请日为2015年12月18日,其名称为“用于检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒”。
技术区域
本发明涉及用于通过质谱分析检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒,更具体而言,涉及用于选择性地消化包含单克隆抗体的特异性的序列的肽片段且能够进行更有效的分析的试剂盒。
背景技术
新药研发领域中的最大课题是副作用少且发挥高的药效的药物的开发。为此目前关注的是药物动力学、特别是浓度监测(therapeutic drugmonitoring(治疗药物监测),TDM)。以处方药是否为适当量、是否到达病变部位为指标进行了种子的筛选,由此早期发现漏掉的药,可以将该信息有效地用于早期新药研发开发、临床试验。以前,对也被称为订制医疗的个别化医疗有所期待,但现实中使医疗技术、药品个别化时,除了一部分富裕层以外,从医疗经济的观点出发是不现实的。因此,逐渐进行了将能够获得的医疗设备、药品送至实际上有治疗效果的患者的尝试,将其称为最佳化医疗。药品开发中的对最佳化医疗的最大尝试是使用了TDM的新药研发开发。特别是癌、自身免疫疾病等领域中,最近被称为分子靶向药的新药研发是主流。重要的是,分子靶向药的有效的药效可以通过医生自身测定是否蓄积于病变部位而发挥药效来进行判断。
作为分子靶向药,现在,以病原蛋白质为靶抗原的抗体药物受到关注。抗体是原本存在于体内的蛋白质,因此,预想副作用低,为了提高分子靶效果,也可以以高浓度给予。进而,抗体药物也适于使用多种药品的鸡尾酒疗法,也有可以显著地得到成功的症例报道。另外,作为来自靶向给药领域的解决方法,抗体上结合有低分子抗癌剂的下一代抗体药物(抗体药物缀合物)也登场。进而,也出现了通过糖链改变使药效增强的抗体;使免疫细胞活化而发挥抗癌效果的、所谓免疫检测位点抗体等,预想抗体药物的需求今后逐渐提高。
抗体在其性质上显示出极高的分子特异性,据说在成为靶标的病变蓄积,但准确验证其的技术还不存在。另外,也存在如下争议抗体药物本身的药价的问题,所谓基于适当使用的最佳化医疗对于患者在医疗经济上也是重要的。为此,通过测定抗体药物的局部存在、浓度,设定最佳的给药量也是重要的。进而,用于准确观察给予的药物的药效指标进行药理评价的、抗体药物浓度的定量也有较大的需求。
用于抗体等蛋白质的定量的最一般的技术为ELISA(酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay))。其是如下技术:制作针对测定对象的蛋白质的抗体,进而用检测用抗体进行夹心,由此简便地定量测定对象分子。ELISA是通用性极高的技术,而且也具备自动化支援环境,因此,预想今后作为诊断技术成为黄金标准。
然而,ELISA中存在如下较多课题:例如由于没有对测定对象进行直接测定,因此有时出现异常值;而且需要对每个测定对象制作抗体;耗费时间、成本;无法同时测定多个解析对象等。特别是关于抗体药物,也产生与内源性抗体的交叉反应,准确的测定较难。进而,以中和抗体与抗原结合的状态占据抗原识别部位,无法以ELISA测定的情况也较多。
另外,在动物试验阶段中采用的ELISA的分析条件下,由于种间交叉的问题也经常无法直接用于大型动物、人。即,在新药研发开发阶段和人临床试验中,不得不在各种测定条件下进行比较。病变组织中的药剂浓度的ELISA中,妨碍检测的基质成分不同,因此,为了以ELISA基础进行药物动力学,必须制作多个抗体。这导致巨大的成本、后期开发的落后等非常大的风险。
另一方面,使用了质谱分析的蛋白质的定量和结构解析与质谱分析技术、数据解析服务器·软件的发展一起,飞跃性地扩展其应用范围。特别是,使用质谱分析的绝对定量技术作为不依赖于特异性的抗体的方法而辨识度提高。
例如,对没有市售抗体的蛋白质进行定量时,以往,需要将蛋白质大量地纯化,但通过使用质谱分析省略了该步骤,因此效率飞跃性地提高。医学的领域中,以往由于病理切片的薄切方法、保存方法等医生手法的误差、设施间差等问题而免疫组织染色中出现差异,可能经常引起难以判定阳性、假阳性、阴性的情况。针对于此,通过对病理切片中的目标病原蛋白质以质谱分析进行定量,由此,可以判定是否为高表达蛋白质。进而最近,处于被称为激光显微切割的、切出一个细胞的装置能够通用的情况。例如,可以仅将癌细胞回收,对该细胞内的病原蛋白质的表达变动解析以质谱分析进行直接观察。这特别是病理、临床现场中极其划时代的技术革新,是期望分析技术的标准化等的准备的情况。
尽管是利用精度高的分析技术,但利用质谱分析检测生物学样品中的蛋白质时,大多将测定对象的蛋白质进行蛋白酶解而片段化,因此,从包含杂质的各种肽片段有效地选择目标肽片段变得重要。
专利文献1中,为了检测样品中的抗体,公开了:使用胃蛋白酶,与非免疫球蛋白蛋白质的分解一起将抗体消化,使F(ab’)2片段产生后,进一步进行胰蛋白酶消化。另外,专利文献2是在先于质谱分析的液相色谱法阶段,仅以适当分离的肽为定量对象进行选择的。非专利文献1是使用抗肽抗体将测定对象肽进行浓缩的。
另外,近年来,作为蛋白酶解的高效率化手法,在纳米颗粒等微小环境(微反应器)内进行蛋白酶解的方法受到关注。例如,非专利文献2中报道了,通过使用细孔内固定有胰蛋白酶的介孔二氧化硅,由此可以将分子量小的蛋白质选择性地进行胰蛋白酶消化。非专利文献3中报道了如下例子:在尼龙膜上固定化胰蛋白酶,使蛋白质的胰蛋白酶消化高效率化。这些方法均是使蛋白酶固定化于多孔体的细孔内,使固相表面的蛋白酶与液相内的底物蛋白质反应的方法。
非专利文献4提出了用于识别样品中的单克隆抗体与内源性的抗体的高通量法。
自经过石蜡包埋的病理切片的蛋白质回收由Agilent Technologies、AMR、Qiagen等以试剂盒的形式被销售。另外,针对经过利用自病理切片的癌细胞激光显微切割的回收、脱石蜡处理、蛋白质提取和消化,利用质谱分析进行病变蛋白质的定量和临床相关进行了发表。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2010-515020号
专利文献2:日本特开2012-197258号
非专利文献
非专利文献1:N.Leigh Anderson等,Mass Spectrometric Quantitation ofPeptides and Proteins Using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies(SISCAPA),Journal of Proteome Research,2004,3
(2),235
非专利文献2:Qianhao Min等,Size-selective proteolysis on mesoporoussilica-based trypsin nanoreactor for low-MW proteome analysis,ChemicalCommunications,2010,46,6144
非专利文献3:Fei Xu等,Facile Trypsin Immobilization in PolymericMembranes for Rapid,Efficient Protein Digestion,Analytical Chemistry,Analytical Chemistry,2010,82,10045
非专利文献4:Xiaotao Duan等,High-Throughput Method Development forSensitive,Accurate,and Reproducible Quantification of Therapeutic MonoclonalAntibodies in Tissues Using Orthogonal Array Optimization and Nano LiquidChromatography/Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry,AnalyticalChemistry,2012,84,4373
非专利文献5:N.Iwamoto等,Selective detection of complementaritydetermining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to thesubstrate:nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis,Analyst,2014,139,576
发明内容
发明要解决的问题
为了通过质谱分析法简便地检测·定量蛋白质,要求将测定对象的蛋白质区域选择性地切断,使该蛋白质有效地产生特异性的肽片段,减小其它肽片段的产生量。因此,抗体的情况下,必须将Fab域、特别是Fab域的可变区区域选择性地消化而另一方面抑制Fc域的消化。
本发明人等通过将作为底物的抗体与蛋白酶这两者固定化于固相,从而可以实现单克隆抗体的区域选择性的蛋白酶解(N.Iwamoto等,Selective detection ofcomplementarity determining regions of monoclonal antibody by limitingprotease access to the substrate:nano-surface and molecular-orientationlimited proteolysis,Analyst,2014,139,576)(非专利文献5)。该方法如下:使细孔内固定化有测定对象的单克隆抗体的多孔体、与固定化有蛋白酶的纳米颗粒在液体中接触,进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解,将所得肽片段通过液相色谱质谱分析(LC-MS)进行检测。作为蛋白酶,报道了,以9:1的比率使用胰蛋白酶与赖氨酰肽链内切酶(Lys-C)的二重消化是最有效的。
上述方法是使用固相-固相反应进行单克隆抗体的选择性的蛋白酶解的划时代的方法,但为了实际使用,留有进一步研究的余地。
本发明的课题在于,提供样品调制用试剂盒,所述样品调制用试剂盒用于提供不受抗体的多样性、种间差、基质等的影响的、通用性极高的分析手法。
用于解决问题的方案
本发明人等面对上述课题进行了深入研究,结果研究了:为了能进行高精度且简便的分析而不依赖于测定者的技能,对用于调制通过质谱分析进行检测的肽的条件进行各种研究,提供满足最佳条件的试剂盒,至此完成了本发明。
即,本发明包含以下的发明。
(1)一种用于通过高效液相质谱分析(LC-MS)检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒,其包括:
多孔体,其用于使作为测定对象的单克隆抗体固定化;
纳米颗粒,其固定化有蛋白酶;
反应容器,其用于使前述多孔体与前述纳米颗粒接触而选择性地消化单克隆抗体;
缓冲液,其与前述纳米颗粒和多孔体一起被导入至前述反应容器内、且用于利用前述蛋白酶进行消化反应;以及
过滤膜,其用于在前述消化反应后将前述多孔体和前述纳米颗粒去除、且将前述消化反应的产物与前述缓冲液一起提取。
(2)根据(1)所述的试剂盒,其中,前述过滤膜在不施加压力或离心力的条件下基本不能使前述缓冲液和由利用前述蛋白酶的消化反应生成的肽透过;而在施加压力或离心力的条件下能使前述缓冲液和前述肽透过。
(3)根据(1)或(2)所述的试剂盒,其中,前述过滤膜为聚偏二氟乙烯(PVDF)制的膜。
(4)根据(1)~(3)中任一项所述的试剂盒,其中,前述试剂盒为用于同时处理多个试样的试剂盒,前述过滤膜的壳体原材料为聚丙烯腈树脂。
(5)一种用于利用高效液相质谱分析(LC-MS)进行单克隆抗体检测的试剂盒,其在(1)~(4)中任一项所述的试剂盒中还包括记载有用于检测单克隆抗体的质谱分析条件的说明书。
(6)根据(1)~(5)中任一项所述的试剂盒,其还包含1个以上的内标肽,所述内标肽含有对作为测定对象的单克隆抗体特异性的氨基酸序列。
(7)根据(6)所述的试剂盒,其中,测定对象为曲妥单抗、曲妥单抗-DM1、贝伐单抗或利妥昔单抗,内标肽为具有序列号1~47中的任一个以上的氨基酸序列的肽。
(8)一种记录介质,其为如下检测方法中使用的、记录有用于执行下述质谱分析的数据的计算机能读取的记录介质;所述检测方法是:使细孔内固定化有作为测定对象的单克隆抗体的多孔体、与固定化有蛋白酶的纳米颗粒在液体中接触,进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解,对所得肽片段通过高效液相质谱分析(LC-MS)进行分析,由此进行前述单克隆抗体的检测,前述数据包含针对通过前述单克隆抗体的蛋白酶解得到的1个以上的肽的、至少母离子、碎片离子、预计保留时间、三重四级杆的各自的电压的数据。
(9)一种用于利用高效液相质谱分析(LC-MS)进行单克隆抗体检测的分析方法包,其包含:(8)所述的记录介质和前述记录介质的使用说明书。
(10)根据(8)所述的记录介质或(9)所述的分析方法包,其中,前述单克隆抗体为曲妥单抗、曲妥单抗-DM1、贝伐单抗、利妥昔单抗的1种以上。
(11)根据(8)所述的记录介质或(9)所述的分析方法包,其中,前述数据是针对具有序列号1~47中的任一个以上的氨基酸序列的肽的数据。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请号2015-047729号的公开内容。
发明的效果
本发明的试剂盒用于液相色谱质谱分析计(特别是三重四级杆型)的前处理。作为能够用于实施本发明的质谱分析装置,例如可以举出LCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050和LCMS-8080(均为株式会社岛津制作所制)。另外,为了对使用本发明的试剂盒进行了前处理的样品的解析,也可以使用LCMS-IT-TOF、LCMS-Q-TOF(株式会社岛津制作所制)。
附图说明
图1示出使用本发明的试剂盒消化抗体的方法的原理。
图2-1示出用于检测曲妥单抗消化片段的过滤膜原材料的研究的结果。为了验证肽回收率,对聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene、PTFE)和聚偏二氟乙烯(polyVinylidene difluoride、PVDF)进行比较。(A)曲妥单抗100.0μg/ml、(B)曲妥单抗33.3μg/ml。
图2-2示出用于检测曲妥单抗消化片段的过滤膜原材料的研究的结果。为了验证肽回收率,对聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯进行比较。(C)曲妥单抗11.1μg/ml、(D)曲妥单抗3.7μg/ml。
图2-3示出用于检测曲妥单抗消化片段的过滤膜原材料的研究的结果。为了验证肽回收率,对聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯进行比较。(E)曲妥单抗1.2μg/ml、(F)曲妥单抗0.4μg/ml。
图3-1示出用于检测贝伐单抗消化片段的过滤膜原材料的研究的结果。为了验证肽回收率,对聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯进行比较。(A)贝伐单抗100.0μg/ml、(B)贝伐单抗33.3μg/ml。
图3-2示出用于检测贝伐单抗消化片段的过滤膜原材料的研究的结果。为了验证肽回收率,对聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯进行比较。(C)贝伐单抗11.1μg/ml、(D)贝伐单抗3.7μg/ml。
图3-3示出用于检测贝伐单抗消化片段的过滤膜原材料的研究的结果。为了验证肽回收率,对聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯进行比较。(E)贝伐单抗1.2μg/ml、(F)贝伐单抗0.4μg/ml。
图4-1示出为了验证用于检测多个试样的过滤膜板的肽回收率,对2个膜原材料(PTFE、PVDF)和3种壳体进行比较的结果。作为肽,分别使用(A)FTISADTSK(序列号3)、(B)ASQDVNTAVAWYQQKPGK(序列号47)。
图4-2示出为了验证用于检测多个试样的过滤膜板的肽回收率,对2个膜原材料(PTFE、PVDF)和3种壳体进行比较的结果。作为肽,分别使用(C)GLEWVAR(序列号6)、(D)DTYIHWVR(序列号5)。
图5示出本发明的方法中使用的纳米颗粒的经时稳定性。(A)由于胰蛋白酶底物的切断而增加的对硝基苯胺的吸光度。纵轴:405nm下的吸光度、横轴:反应时间(分钟)、(B)酶活性。
图6示出本发明的方法中使用的纳米颗粒的经时稳定性。分别示出(A)-20℃保存的情况、(B)4℃保存的情况。
具体实施方式
本发明涉及一种用于通过高效液相质谱分析(LC-MS)检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒,其包括:
多孔体,其用于使作为测定对象的单克隆抗体固定化;
纳米颗粒,其固定化有蛋白酶;
反应容器,其用于使前述多孔体与前述纳米颗粒接触而选择性地消化单克隆抗体;
缓冲液,其与前述纳米颗粒和多孔体一起被导入至前述反应容器内、且用于利用前述蛋白酶进行消化反应;以及
过滤膜,其用于在前述消化反应后将前述多孔体和前述纳米颗粒去除、且将前述消化反应的产物与前述缓冲液一起提取。
将使用本发明的试剂盒消化单克隆抗体的方法的原理示于图1。以下,结合上述方法地对本发明进行具体说明。
<质谱分析的概要>
使用质谱分析的定量技术近年来主要通过被称为三重四级杆的混合型质谱分析装置来进行。具体而言,经过离子化的生物体分子首先通过被称为八极的部分,由此减小其离子分子振动半径。接着,在第1四级杆中,使具有特定质量数的离子共振,从而选择、排除其他离子。该步骤也被称为单离子监测(single ion monitoring,SIM)。
经过选择的离子运至第2四级杆,与氩碰撞而进行断裂。该反应称为碰撞诱导裂解(collision-induced dissociation,CID)。该断裂反应的结果,通过在第3四级杆中选择生成的特异性的片段,可以进行非常高灵敏度、且高选择性的定量。将该一系列的分析称为多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)。
使用质谱分析的生物体试样的定量有可以以生物体分子的结构特异性的离子为指标进行定量的最大优点,通过将其与高效液相色谱连接,可以进行连续的解析。现有的分析设备中,是具有基本唯一的良好的优点的技术。
为了通过质谱分析检测抗体,首先需要从血液、组织等生物体试样提取抗体,将其溶解于适当的溶剂。另外,抗体直接进行分析时分子较大,因此,通过蛋白酶分解为肽,之后以液相色谱分离,然后进行质谱分析。适于分析的肽的分子量约为1000~3000Da左右。
然而,将一般的蛋白质分子进行蛋白酶分解时,生成肽片段约100根左右;在为抗体的情况下,生成远超过200根的肽片段。因此,即便是单一的蛋白质测定,对象数就如此巨大;以复杂的生物体试样为对象时,成为巨大的样品组。
另外,抗体分子中,仅CDR区等极少一部分序列不同,剩余的部分为共同序列,因此,为了从上述巨大且复杂的样品中仅分析、定量目标特异性的序列,在质谱分析步骤前,需要高分离性能和重现性良好的液相色谱。现在,有超高速·高压色谱设备,也开发了与其对应的、粒径均匀且非常细的色谱柱树脂等,通过使用这样的高速、高分离、耐高压色谱柱,可以飞跃性地实现分离性能提高。然而,现状是,对于蛋白质组学等以蛋白质组为对象的研究领域尚不能说是充分的。
另外,作为利用高精度的质谱分析的解析中的课题,有称为“基质效应”的情况。基质效应是指如下现象:相同液滴内存在离子化妨碍物质、或者同时存在多种离子,由此目标物质的离子化效率降低。对离子化施加的能量相等,因此,离子化对象物质增加时,能量必然分散,离子量会减少。
解析对象肽的条数增加时,难以用色谱柱分离完全分离。由此,成为由基质效应所导致的离子化效率的降低、结果引起灵敏度、定量重现性的降低的因素。为了改善这种状况,在质谱分析侧形成高速通道切换功能等,来实现改善时,只要根本上不使母体(population)降低,就可以克服该基质效应。
考虑上述那样的各种问题,本发明想要边维持测定对象的特异性边减少解析对象的母体。
<抗体>
调制用于使用本发明的试剂盒、利用LC-MS进行检测的样品的测定对象是单克隆抗体。单克隆抗体是具有2条重链(分子量50kDa)和2条轻链(分子量25kDa)以二硫键连接的结构的生物体高分子。Fab域和Fc域借助铰链而连接,另外,重链和轻链分别由恒定区和可变区构成。恒定区具有保持抗体的特征性的Y字型的形态的结构(框架结构),具有与源自同一种的抗体基本共同的氨基酸序列。另一方面,可变区中具有被称为互补性决定区(complementarity-determining region,CDR)的特异性的序列的部位各存在有3个。该CDR(CDR1、CDR2、CDR3)区规定的立体结构涉及与抗原的特异性的结合,由此形成抗体-抗原复合体。
抗体的高维结构中更特征性的结构为:针对具有稳定(rigid)结构的恒定区,非常灵活(flexible)的铰链和可变区。已知,重链的C末端存在有被称为蛋白A、蛋白G的特定的蛋白质结合的部位。
近年来,作为对各种疾病能特异性发挥作用的抗体药物,开发了大量单克隆抗体。作为能成为测定对象的单克隆抗体,没有限定,例如可以举出帕尼单抗(panitumumab)、奥法木单抗(offatumumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)等人抗体;托珠单抗(tocilizumab)、曲妥单抗(trastuzumab)、曲妥单抗-DM1(trastuzumab-DM1)、贝伐单抗(bevacizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、奥可丽单抗(ocrelizumab)、莫加母丽珠单抗(mogamulizumab)、依库丽单抗(eculizumab)等人源化抗体;利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、英夫利昔(infliximab)、巴利昔单抗(basiliximab)等嵌合抗体等。需要说明的是,单克隆抗体的分子直径约为14.5nm。
另外,维持单克隆抗体的特异性且附加有进一步的功能的复合体、例如Fc融合蛋白质、抗体-药物复合体(例如吉妥珠单抗·奥佐米星(gemtuzumab-ozogamicin)、曲妥单抗-艾玛坦星(trastuzumab–emtansine)等)也包含于本发明的方法中的作为测定对象的单克隆抗体。上述情况下,可以在测定之前使复合体的结合裂解仅将抗体供至LC-MS,或者也可以保持复合体的形态不变地供至LC-MS。对于本领域技术人员来说,可以基于本说明书的记载,根据测定对象而设定用于本发明的方法的最佳的条件。
本发明的试剂盒是为了区域选择性地对单克隆抗体的Fab域进行蛋白酶解,对所得肽片段进行质谱分析,来进行抗体的鉴定、定量而使用的。
<多孔体>
本发明的试剂盒中所含的多孔体只要具有大量细孔就对其材料没有特别限定,可以使用活性炭、多孔膜、多孔树脂珠、金属颗粒等。其中,特别优选能够使抗体部位特异性地结合的物质。
图1中,图示半球形状的细孔,但对细孔的形状没有特别限定。另外,也可以使用如多孔膜那样、形成有贯通多孔体的细孔的物质。对于多孔体的细孔的大小没有特别限定,使抗体固定化时,优选的是,以应选择性地消化的部位位于细孔的表层附近的方式,考虑抗体的分子直径等来确定。多孔体的平均细孔直径D2在10nm~200nm左右的范围内且在小于纳米颗粒的平均粒径D1的范围内适当设定。多孔体的平均细孔直径D2例如优选20nm~200nm左右、更优选30nm~150nm左右。为了使抗体的Fc域固定化于细孔内并将Fab域区域选择性地进行蛋白酶解,多孔体的细孔直径优选30nm~150nm、更优选40nm~120nm、50nm~100nm、特别是进一步优选约100nm。
本发明的方法使作为测定对象的单克隆抗体固定化于多孔体的细孔内。通过使抗体固定化于细孔内、使其存在于固相与液相的界面这样的微细的环境,从而抗体容易引起变性,分子的波动受到振动,受到蛋白酶攻击的概率提高。另外,本发明中,如后述可以认为,通过蛋白酶固定化于纳米颗粒,立体上稳定,成为难以产生自体分解的环境,因此,蛋白酶的稳定性增加。因此,根据本发明的方法,区域选择性的蛋白酶解成为可能,而且可以维持蛋白酶的高活性。
本发明中,优选使用多孔体的细孔内固定化有与抗体部位特异性地相互作用的连接体分子的物质。作为抗体与连接体分子的相互作用,可以举出化学键、氢键、离子键、络合物形成、疏水相互作用、范德华相互作用、静电相互作用、立体选择相互作用等。
作为连接体分子,优选使用与抗体的Fc域部位特异性结合的蛋白A、蛋白G等。通过使用细孔内固定化有这些连接体分子的多孔体,抗体的Fc域被固定化于细孔内,Fab域位于细孔的表层附近。如此,通过控制细孔内的抗体的取向,基于蛋白酶的Fab域的区域选择性消化成为可能。
连接体分子的大小以抗体的选择性切断部位位于细孔的表层附近的方式选择。连接体分子与抗体结合的状态的分子尺寸优选多孔体的细孔直径的0.5倍~1.5倍左右、更优选0.6倍~1.2倍左右、进一步优选0.7倍~1.1倍左右、特别优选0.8倍~1倍左右。需要说明的是,使抗体与细孔内直接结合而不使连接体分子固定于多孔体时,优选抗体的分子直径与多孔体的细孔直径满足上述关系。
作为本发明中可以适合使用的多孔体,没有特别限定,例如可以举出蛋白GUltralink树脂(Pierce公司制)、Toyopearl、TSKgel(Tosoh Corporation制)等。例如已知,蛋白G Ultralink树脂中,与树脂结合的蛋白G的95%位于细孔内。
<抗体对多孔体的固定化>
使抗体固定化于多孔体的细孔内的方法没有特别限定,可以根据抗体和多孔体或者连接体分子的特性等而采用适当的方法。例如,使抗体固定化于细孔内固定化有蛋白A、蛋白G的多孔体时,通过将多孔体的悬浮液和包含抗体的溶液混合,可以使抗体容易地固定化于细孔内。
多孔体与抗体的量比可以根据目的而适当设定。例如,进行抗体的定量分析时,期望试样中的抗体的基本总量固定化于多孔体。因此,优选以多孔体的量相对于试样中的抗体的推定含量成为过剩的方式设定量比。
<纳米颗粒>
本发明的试剂盒中所含的纳米颗粒是使蛋白酶固定化于其表面,是为了控制蛋白酶向固定化于多孔体的细孔内的抗体的接近而使用的。因此,纳米颗粒的平均粒径D1设为大于多孔体的平均细孔直径D2,使得纳米颗粒不会进入至多孔体的细孔的深处(图1)。
纳米颗粒的形状没有特别限定,从蛋白酶向多孔体的细孔的接近的均匀化的观点出发,优选球状的纳米颗粒。另外,纳米颗粒优选分散性高、平均粒径均匀。
纳米颗粒的平均粒径D1为50nm~500nm的范围,更优选多孔体的平均细孔直径D2的1.2倍以上,进一步优选1.5倍以上,特别优选1.8倍以上、例如约2倍。例如多孔体的平均细孔直径为30~150nm左右时,纳米颗粒的平均粒径D1优选100nm以上、更优选150nm以上。多孔体的平均细孔直径为50nm~100nm左右时,纳米颗粒的平均粒径优选120nm以上、更优选150nm以上、特别优选170nm以上。纳米颗粒的平均粒径D1的上限从提高基于蛋白酶的消化效率的观点出发,优选500nm以下、进一步优选300nm以下。
纳米颗粒只要可以使上述蛋白酶固定化于表面就对其材质没有特别限定,适当使用金属、树脂等。另外,也可以使用用树脂覆盖金属表面而成的物质、用金属覆盖树脂表面而成的物质等。
作为纳米颗粒的种类,优选可以分散或悬浮于水性介质且可以通过磁性分离或磁性沉淀分离从分散液或悬浮液容易地回收的磁纳米颗粒。另外,在不易引起聚集的方面,更优选用有机聚合物覆盖其表面而成的磁纳米颗粒。作为磁纳米颗粒的基材,可以举出氧化铁(磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γ-Fe2O3))、铁氧体(Fe/M)3O4等强磁性合金。铁氧体(Fe/M)3O4中,M是指与铁离子一起使用可以形成磁性金属氧化物的金属离子,典型地可以使用Co2+、Ni2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+等。另外,作为覆盖磁纳米颗粒的有机聚合物,可以举出聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)、GMA与苯乙烯的共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯酸甲酯(PMA)等。作为用有机聚合物覆盖的磁性纳米珠的具体例,可以举出FG珠、SG珠、Adembeads、nanomag等。作为市售品,例如适合使用Tamagawa Seiki Co.,Ltd.制的FG beads(将铁氧体颗粒用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)覆盖而成的粒径约200nm的聚合物磁性纳米颗粒)。
对于上述纳米颗粒,为了非特异性的蛋白质的吸附抑制、和蛋白酶的选择性的固定化,优选用能够与蛋白酶结合的间隔物分子修饰。通过借助间隔物分子使蛋白酶固定化,蛋白酶从纳米颗粒表面的脱离被抑制,可以提高蛋白酶解的区域选择性。另外,通过调整间隔物的分子尺寸,可以使蛋白酶选择性地接近抗体的期望位置,也可以提高区域选择性。
间隔物优选能够与蛋白酶结合且不使蛋白酶失活的物质。从控制固定化于纳米颗粒表面的蛋白酶的接近范围的观点出发,优选间隔物的分子直径小。间隔物的分子直径优选5nm以下、更优选3nm以下、进一步优选2nm以下。另外,间隔物的分子量优选2000以下、更优选1500以下、进一步优选1000以下。
为上述分子直径且能够使蛋白酶固定化的间隔物分子优选非蛋白质,优选末端具有氨基、羧基、酯基、环氧基、甲苯磺酰基、羟基、巯基、醛基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、叠氮基、生物素、抗生物素蛋白、螯合物等官能团的分子。例如,胰蛋白酶的固定时,优选具有经过活化的酯基的间隔物分子。另外,间隔物分子中,除上述官能团之外的间隔臂部分可以使用聚乙二醇和其衍生物、聚丙二醇和其衍生物、聚丙烯酰胺和其衍生物、聚乙烯亚胺和其衍生物、聚(环氧乙烷)和其衍生物、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)和其衍生物等亲水性分子。
用这样的间隔物分子进行了表面修饰的纳米颗粒还可以被市售,可以利用它们。例如,利用具有用N-羟基琥珀酰亚胺活化的酯基(活性酯基)的间隔物分子修饰过的纳米颗粒以商品名“FG beads NHS”(Tamagawa Seiki Co.,Ltd.)被市售。FG beads NHS的粒径约为200nm±20nm,作为纳米颗粒是非常均质的物质。
本发明的试剂盒可以包含:使蛋白酶固定化于上述纳米颗粒的物质。然而,也可以将纳米颗粒与蛋白酶分别提供,在使用前形成固定化的形式。
<蛋白酶>
本发明的方法中,蛋白酶用于将固定化于多孔体的细孔内的抗体在特定的氨基酸序列部位切断而产生肽片段。
蛋白酶可以单独包含于试剂盒,或者可以以固定化于纳米颗粒的表面的状态包含于试剂盒。
本发明中固定化于纳米颗粒的蛋白酶的种类可以根据成为基于质谱分析的定量或鉴定的对象的蛋白质的种类而适当选择即可,没有限定,例如可以举出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、V8蛋白酶、AspN蛋白酶(Asp-N)、ArgC蛋白酶(Arg-C)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、二肽基肽酶等。蛋白酶也可以组合2种以上使用。
上述蛋白酶中,本发明中,特别优选使用胰蛋白酶。胰蛋白酶的底物特异性高,另外,在切断后的肽的C末端存在Lys或Arg,因此,可以使肽的电荷量和电荷定位均质化,特别适合于制作用于质谱分析的试样。另外,胰蛋白酶的分子直径小(约3.8nm)、且活性部位存在于分子的内部。因此,活性部位能够接近抗体的区域受到限制,可以提高蛋白酶解的区域选择性。
以蛋白酶解后的抗体的肽片段为测定资料供至质谱分析时,优选使用自体分解少、且切断序列的选择性高的蛋白酶。使用市售的蛋白酶时,优选使用质谱分析级、序列确定(测序)级的蛋白酶。例如已知,源自生物体的天然的胰蛋白酶的自体分解活性高、或包含显示胰凝乳蛋白酶样的活性的胰蛋白酶,因此,切断部位的特异性低。因此,作为质谱分析级,市售有使胰蛋白酶的赖氨酸残基进行还原甲基化而提高对自体分解的抗性的产品。
作为本发明的方法中可以适合使用的蛋白酶,例如可以举出Trypsin Gold(Promega Corporation制)、Trypsin TPCK-treated(TPCK处理的胰蛋白酶)(SigmaAldrich公司制)。
<蛋白酶对纳米颗粒的固定化>
使蛋白酶固定化于纳米颗粒表面的方法没有特别限定,可以根据蛋白酶和纳米颗粒(或者修饰纳米颗粒表面的间隔物分子)的特性等而采用适当的方法,例如,使蛋白酶固定化于经过间隔物修饰的纳米颗粒表面时,通过将纳米颗粒的悬浮液和包含蛋白酶的溶液混合,可以使蛋白酶固定化于纳米颗粒表面。优选借助上述间隔物分子的官能团的纳米颗粒与蛋白酶的胺偶联法。例如,将对纳米颗粒进行了表面修饰的羧基用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯化制成活化酯基,再使其与蛋白酶的氨基结合。该偶联反应中,可以使1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、双(2,6-二异丙基苯基)碳二亚胺(DIPC)等碳二亚胺在缩合剂的存在下进行。另外,可以使用戊二醛、2官能性琥珀酰亚胺、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸盐(BS3)、磺酰氯、马来酰亚胺、二硫吡啶等交联剂,使对纳米颗粒进行了表面修饰的氨基与蛋白酶的氨基结合。
借助间隔物分子的官能团的纳米颗粒与蛋白酶的偶联法可以以如下简便的操作进行:在纳米颗粒的悬浮液中添加蛋白酶溶液,在一定条件下进行混合搅拌。
优选的是,使蛋白酶固定化于纳米颗粒表面后,使与纳米颗粒表面的蛋白酶未结合的活性部分失活。例如,在纳米颗粒表面存在有未固定化蛋白酶的间隔物分子时,未结合的间隔物分子与试样中的夹杂物等结合,对蛋白酶解造成不良影响,或者有时产生由蛋白酶解产生的肽片段固定化于纳米颗粒等不良情况。使蛋白酶固定化后,通过使未结合的间隔物分子封端,这样的不良情况被抑制。作为使与蛋白酶未结合的活性部分失活的方法,优选化学修饰。例如,活化酯基可以通过与伯胺的反应而形成酰胺键使其失活。
<蛋白酶解>
通过使固定化有抗体的多孔体、与表面固定化有蛋白酶的纳米颗粒在液体中接触,抗体被蛋白酶解,而产生肽片段。此处,“液体”是指,使底物(固相)和酶(固相)在液相中接触的物质,另外,是指适于蛋白酶解反应的水性介质。
本发明中的蛋白酶解的条件没有特别限定,可以适当采用与一般的蛋白酶解同样的条件。例如,优选的是,在调整至蛋白酶的最佳pH附近的缓冲溶液中,通常以37℃左右的温度,培养1小时~20小时左右。
固定化有抗体的多孔体、与表面固定化有蛋白酶的纳米颗粒的混合量比也没有特别限制,可以设定为与抗体的量相对应的蛋白酶量。需要说明的是,一般的蛋白酶解条件为底物:蛋白酶=100:1~20:1(重量比)左右。与此相对,本发明中,通过多孔体与纳米颗粒的组合,抗体与蛋白酶的接近以物理的方式被限制,因此,与一般的蛋白酶解相比,优选增加蛋白酶量。例如,优选抗体:蛋白酶=30:1~3:1左右,更优选15:1~4:1左右,进一步优选10:1~5:1左右。
本发明的方法中,以使抗体固定化于多孔体的状态直接进行蛋白酶解。由蛋白酶解而产生的肽片段存在于液相内,因此,可以不进行抗体的洗脱、变性操作而得到区域选择性的目标肽片段。根据本发明的方法,与现有法相比,可以以简便的操作且区域选择性地进行肽片段的回收。
更具体而言,例如使抗体的C末端侧固定化于细孔直径100nm的蛋白G树脂上,使抗体的可变区总是向溶液侧取向。接着,使蛋白酶固定化于粒径200nm的纳米颗粒表面。通过限制蛋白酶与抗体的接触可以形成反应场以进行可变区选择性的抗体分解反应。另外,通过将相对表面积非常大的纳米颗粒表面用作蛋白酶反应场,可以提高与抗原的接触概率。
对于蛋白酶解没有特别限定,可以在基于缓慢的旋转的搅拌的同时,在伴随定期轻敲的轻敲旋转下进行。“缓慢的旋转”例如是指3~10rpm左右的转速,另外,“轻敲”是指,轻弹那样的、或者、施加冲击那样的瞬间动作(频率:例如,每1分钟1~5次、优选2~4次)。由此,边使固定化有抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒均保持分散状态,边有效地进行接触,可以提高蛋白酶解反应效率。
<多孔体和纳米颗粒的去除>
为了将由蛋白酶解得到的目标肽片段供至质谱分析,必须将多孔体和纳米颗粒去除。这可以通过对蛋白酶解后的样品进行过滤、离心分离、磁性分离、透析等操作来达成。
通过过滤去除多孔体和纳米颗粒时,使用的过滤膜的孔径可以在上述多孔体和纳米颗粒无法通过而消化的肽能够通过的范围内选择。例如通过使用聚偏二氟乙烯(PVDF)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PVDF、孔径0.2μm、Millipore公司制)、聚四氟乙烯(PTFE)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PTFE、孔径0.2μm、Millipore公司制)等进行过滤,可以将多孔体和纳米颗粒简便地去除。过滤设为离心过滤时,可以进行迅速且简便的过滤。
对于过滤膜没有限定,可以适合使用能够进行离心过滤的二重结构的滤管形态的过滤膜。例如为了调制一个样品,适合使用0.2μm的过滤膜自旋过滤器、例如MilliporeUltrafree PVDF、0.2μm、Millipore UFC30LG00Ultrafree-C3LCR、0.2μm。另外,为了同时调制多个样品,可以适合使用0.2μm的过滤膜板例如Millipore MultiScreen PVDF、Barex、0.2μm。
使用这些管形态的过滤膜时,可以将管作为用于蛋白酶解反应的反应容器而使用。上述情况下,向管内加入用于使固定化有蛋白酶的纳米颗粒与固定化有抗体的多孔体反应的介质(包含缓冲液),可以进行蛋白酶解。或者另外,也可以在管内进行样品中的抗体对多孔体的固定化,进行清洗操作后,添加固定化有蛋白酶的纳米颗粒。对于本领域技术人员来说,可以适当改变使用本发明的试剂盒的蛋白酶解反应、多孔体和纳米颗粒的去除等一系列的操作步骤。
<液相色谱质谱分析(LC-MS)>
通过LC-MS对包含上述中所得肽片段的试样进行分析,由此可以进行抗体的鉴定、定量。
为了使肽片段的分离更确实、提高分析精度等,将供至质谱分析前的试样通过液相色谱(LC)进行分离·浓缩。通过LC进行试样的分离时,可以将来自LC的洗脱液直接离子化,供至质谱分析。也可以通过组合了LC与串联质谱分析的LC/MS/MS、LC/MSn进行分析。另外,可以将来自LC的洗脱液进行一次分级后供至质谱分析。LC的色谱柱没有特别限定,可以适当选择肽的分析中一般使用的C30、C18、C8、C4等疏水色谱柱、亲水性亲和色谱法用的载体等而使用。
质谱分析由于能够确定氨基酸序列,因此,可以判定肽片段是否为源自抗体等特定的蛋白质的肽片段。另外,可以基于峰强度来确定试样中的肽片段的浓度。本发明中,抗体区域选择性地经蛋白酶处理,因此,试样中所含的肽片段的种类减少。因此,可以容易设定基于质谱分析等的分析条件。分析时,可以根据需要进行脱盐、增溶、提取、浓缩、干燥等处理后将试样用于分析。
质谱分析中的离子化法没有特别限定,可以采用电子电离(EI)法、化学电离(CI)法、场解吸(FD)法、快速原子轰击(FAB)法、基质辅助激光解吸电离(MALDI)法、电喷雾离子化(ESI)法等。经过离子化的试样的分析方法也没有特别限定,可以根据离子化法而适当确定磁场偏转型、四级杆(Q)型、离子阱(IT)型、飞行时间(TOF)型、傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)型等。另外,也可以使用三重四级杆型质谱分析装置等,进行MS/MS分析、或者MS3以上的多级质谱分析。
特别适于使用本发明的方法的装置没有特别限定,例如可以举出LCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050、和LCMS-8080(均为岛津制作所)、LCMS-IT-TOF、LCMS-Q-TOF(岛津制作所)。
为了基于质谱分析结果而鉴定抗体,也可以使用现有的数据库。本发明中,由于使用抗体位置特异性地被蛋白酶解的肽片段,因此,可以提高基于数据库检索的命中率、数据的准确度。另外,通过多级质谱分析等,通过确定肽片段的氨基酸序列,也可以鉴定抗体。如果可以检测到对抗体具有特异性的氨基酸序列、例如包含CDR2区的氨基酸的氨基酸序列的肽片段,则可以对目标抗体进行鉴定·定量。
需要说明的是,基于检测结果进行抗体的鉴定、定量时,作为检测对象的肽的氨基酸残基数优选5~30左右,更优选7~25左右。氨基酸残基数过度小时,难以与杂质、源自同一蛋白质的其他部位的肽片段区别,可能成为误检等的原因。另外,氨基酸残基数过度大时,出于离子化变困难等理由,有时检测变困难、或定量性降低。
对抗体的浓度进行定量时,可以基于检测到的肽片段离子(多级MS的情况下,为由母离子的裂解而得到的碎片离子)的峰面积、峰强度而算出抗体的量。例如,通过预先求出的标准曲线(校正曲线)与峰面积的关系、源自试样中添加的内标的峰面积与源自试样的峰面积的关系等,算出试样中的肽片段的浓度,基于肽片段浓度,算出抗体的量、浓度。
<本发明的样品调制用试剂盒>
本发明为一种用于通过上述高效液相质谱分析(LC-MS)检测单克隆抗体的方法的样品调制用试剂盒,其包括:
多孔体,其用于使作为测定对象的单克隆抗体固定化;
纳米颗粒,其固定化有蛋白酶;
反应容器,其用于使前述多孔体与前述纳米颗粒接触而选择性地消化单克隆抗体;
缓冲液,其与前述纳米颗粒和多孔体一起被导入至前述反应容器内、且用于利用前述蛋白酶进行消化反应;以及
过滤膜,其用于在前述消化反应后将前述多孔体和前述纳米颗粒去除、且将前述消化反应的产物与前述缓冲液一起提取。
基于质谱分析的测定可以进行非常高精度的分析,另一方面,适当的样品调制和适当的分析条件的设定是非常重要的。例如临床的情况下为了更简便地得到准确的检查结果,本发明提供:为了实施上述方法而能够利用的样品调制用试剂盒。
本发明的试剂盒中所含的多孔体和纳米颗粒如上述。作为反应容器,只要为可以使固定化于多孔体的单克隆抗体、与固定化于纳米颗粒的蛋白酶在液相中接触的容器就没有特别限定,如果考虑质谱分析中检测的样品调制用,则优选为微管、板。考虑用于进行反应的基于涡流混合器或转子的混合、用于使反应后的肽与多孔体和纳米颗粒分离的过滤等反应工序,对于本领域技术人员来说,可以想到适当的反应容器。
本发明的试剂盒中所含的缓冲液与前述纳米颗粒和多孔体一起被导入至前述反应容器内,用于进行基于前述蛋白酶的消化反应,提供适于蛋白酶解的反应条件。反应条件可以根据选择性的蛋白酶等而适当确定,缓冲液的组成也可以适当确定。
本发明的试剂盒还包括如下过滤膜:其用于在蛋白酶解反应后将前述多孔体和前述纳米颗粒去除,将消化反应的产物与前述缓冲液一起提取。为了将由蛋白酶解得到的目标肽片段供至质谱分析,必须将多孔体和纳米颗粒去除。
另外,本发明的试剂盒中的过滤膜优选的是,在不施加压力或离心力的条件下基本不能使缓冲液和由蛋白酶解生成的肽透过而作为“反应容器的底”发挥功能,且离心分离等操作时作为可以使缓冲液和肽透过的“滤网”发挥功能。
作为为了可以使缓冲液和肽透过而对过滤膜施加的离心分离条件,没有限定,例如优选3000~10000g的范围。
作为本发明的试剂盒中可以适合使用的过滤膜,例如可以举出聚偏二氟乙烯(PVDF)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PVDF、孔径0.2μm、Millipore公司制)。
作为用于同时处理多个试样的试剂盒,例如可以使用过滤膜为PVDF制、壳体原材料为聚丙烯腈树脂、例如Barex(注册商标)((Mitsui Fine Chemicals,Inc.制)的试剂盒。
本发明的试剂盒中还可以包括:记载有试剂盒的使用方法和/或用于检测单克隆抗体的质谱分析条件的说明书。
本发明的试剂盒还可以包含1个以上的内标肽。内标肽通过与测试体同时地、或别个地以相同条件进行分析,由此提供更确实的分析结果。内标肽设为如下肽:包含作为测定对象的单克隆抗体的特异性的氨基酸序列、且由利用本发明的试剂盒中所含的蛋白酶的消化而产生的。
例如测定对象为曲妥单抗、曲妥单抗-DM1、贝伐单抗或利妥昔单抗时,内标肽可以选自具有序列号1~47中的任一个以上的氨基酸序列的肽。
更具体而言,作为测定对象的单克隆抗体为曲妥单抗或曲妥单抗-DM1、且蛋白酶为Trypsin Gold(Promega Corporation制)时,内标肽可以设为具有序列号1~7所示的氨基酸序列的肽中的1个以上。
作为测定对象的单克隆抗体为贝伐单抗、且蛋白酶为Trypsin Gold(PromegaCorporation制)时,内标肽可以设为具有序列号8~12所示的氨基酸序列的肽中的1个以上。
作为测定对象的单克隆抗体为利妥昔单抗、且蛋白酶为Trypsin Gold(PromegaCorporation制)时,内标肽可以设为具有序列号13~19所示的氨基酸序列的肽中的1个以上。
作为测定对象的单克隆抗体为曲妥单抗或曲妥单抗-DM1、且蛋白酶为TrypsinTPCK-treated(Sigma-Aldrich制)时,内标肽可以设为:在具有序列号1~7所示的氨基酸序列的肽的基础上,还具有序列号20~28、46和47所示的氨基酸序列的肽中的1个以上。
作为测定对象的单克隆抗体为贝伐单抗、且蛋白酶为Trypsin TPCK-treated(Sigma-Aldrich制)时,内标肽可以设为:在具有序列号8~12所示的氨基酸序列的肽的基础上,还具有序列号29~38所示的氨基酸序列的肽中的1个以上。
作为测定对象的单克隆抗体为利妥昔单抗、且蛋白酶为Trypsin TPCK-treated(Sigma-Aldrich制)时,内标肽可以设为:在具有序列号13~19所示的氨基酸序列的肽的基础上,还具有序列号39~45所示的氨基酸序列的肽中的1个以上。
内标肽优选设为:包含对作为测定对象的单克隆抗体特异性的氨基酸序列的肽;更具体而言由包含Fa域的氨基酸序列、更优选源自重链或轻链的CDR2域的氨基酸的氨基酸序列构成的肽。
通过使用本发明的试剂盒,可以使得用于鉴定·定量单克隆抗体的肽片段调制的操作更简便,也容易得到利用装置的自动化。特别是,胰蛋白酶等在固定化于纳米颗粒表面的状态下也可以保持活性,因此蛋白酶如果以固定化于纳米颗粒表面的状态作为试剂盒的构成要素而提供,则可以使肽片段调制的操作进一步简略化。
本发明的试剂盒更具体而言,例如以以下的构成提供。
<1.信号分析用>
用于分析每一个样品的试剂试剂盒例如为以下的构成。
0.2μm的过滤膜自旋过滤器(Millipore Ultrafree PVDF、0.2μm)
细孔直径100nm的蛋白G树脂浆料(4℃保存)
固定化于粒径200nm的纳米颗粒的胰蛋白酶珠(-20℃保存)
血浆稀释用低吸附管
溶液回收微管
血浆稀释用缓冲液(PBS+0.1%正辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷(n-octyl-β-D-thioglycoside)或者相当的表面活性剂、例如正辛基-β-D-配糖体)
珠清洗用缓冲液(PBS)
蛋白酶反应用缓冲液(25mM Tris-HCl,pH 8.0+蛋白酶反应促进添加剂)
10%甲酸水溶液
使用说明书
<2.多样品分析用>
例如能够同时分析96个样品的多个试样处理用的试剂盒例如为以下的构成。
0.2μm的过滤膜板(Millipore MultiScreen PVDF、Barex、0.2μm)细孔直径100nm的蛋白G树脂浆料(4℃保存)
固定化于粒径200nm的纳米颗粒的胰蛋白酶和蛋白酶珠(-20℃保存)
血浆稀释用低吸附板
溶液回收用板
溶液废弃用板容器
蛋白酶珠用板
血浆稀释用缓冲液(PBS+0.1%正辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷或者相当的表面活性剂、例如正辛基-β-D-配糖体)
珠清洗用缓冲液(PBS)
蛋白酶反应用缓冲液(25mM Tris-HCl,pH 8.0+蛋白酶反应促进添加剂)
10%甲酸水溶液
板盖密封
自动进样器用DMSO耐性、可针刺板(needle-pierceable plate)盖密封使用说明书
<3.附加的试剂>
作为本发明的试剂盒中根据情况包含的物质,例如有内标肽。其用于提高生物药品定量用肽的定量精度,理想的是,每种生物药物准备多个肽,分别销售。内标肽中也可以包含用稳定同位素氨基酸标记过的物质,此时,如果与不含同位素的肽相比,则质谱分析定量条件不同,因此,优选随附内标用定量条件。
<构成:>
内标肽(例如作为曲妥单抗用,为序列号1~7的肽中的任1个以上)试剂品质保证数据(质谱分析数据和原子纯度测定结果)
定量条件文件包
使用说明书
<分析方法包>
本发明还提供一种分析方法包,其用于如下检测方法:使细孔内固定化有测定对象的单克隆抗体的多孔体、与固定化有胰蛋白酶的纳米颗粒在液体中接触,进行单克隆抗体的选择性的胰蛋白酶解,对所得肽片段通过高效液相质谱分析(LC-MS)进行分析,由此进行前述单克隆抗体的检测。本说明书中,“分析方法包”是指,以能够读取的形态包含对特定的测定对象的液相色谱质谱分析的分析条件,可以单独流通的物质。通过将分析方法包中所含的数据导入至LC-MS,由此可以在详细的研究最后得到的最佳测定条件下进行分析。
如上述,基于质谱分析的测定可以进行非常高精度的分析,另一方面,根据目标离子而分析条件完全不同,因此,适当的分析条件的设定不仅非常重要而且非常困难,为了条件设定而需要巨大的时间。通过预先准备这样的条件,由此可以提高实际上进行质谱分的使用者的便利性。本申请人至此为了使用者例如可以更简便地进行农药、动物药品的质谱分析,提供了用于基于这些LC-MS的分析的分析方法包。因此,本发明还提供用于试样中的单克隆抗体的基于LC-MS的鉴定·定量的分析方法包。
即,本发明提供一种记录介质,其为如下检测方法中使用的、记录有用于执行前述质谱分析的数据的计算机能读取的记录介质;所述检测方法是:使细孔内固定化有作为测定对象的单克隆抗体的多孔体、与固定化有蛋白酶的纳米颗粒在液体中接触,进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解,对所得肽片段通过高效液相质谱分析(LC-MS)进行分析,由此进行前述单克隆抗体的检测,前述数据没有限定,包含例如针对通过前述单克隆抗体的蛋白酶解得到的肽、例如Fab域、更优选具有包含CDR区的氨基酸的氨基酸序列的1个以上的肽中的、至少母离子、碎片离子、预计保留时间、三重四级杆的各自(第1四级杆、第2四级杆、第3四级杆)的电压的数据。需要说明的是,上述预计保留时间、电压数据等是根据使用的设备和测定条件等而变动的数值,优选根据设备而提供。另外,如本领域技术人员可以理解那样,优选针对根据条件而变动的数值,也一并提供其变动幅度。
记录介质可以为任意形态,没有特别限定。例如可以举出能够将信息以磁方式、光学方式记录的光盘、存储器。
更具体而言,上述分析方法包中例如可以包含以下的信息和软件功能。
·最佳化※的母离子m/z值
·最佳化的碎片离子m/z值
·最佳化的Q1预偏置电压值
·最佳化的Q2碰撞能量电压值
·最佳化的Q3预偏置电压值
·目标离子的预计保留时间和质谱分析时间
·定量值换算式
·解析结果报告输出功能
※:实测各条件项目,选择离子强度最高者和重现性最佳者的m/z值,将其作为最佳值。
本发明还提供一种用于利用高效液相质谱分析(LC-MS)进行单克隆抗体检测的分析方法包,其包含:上述记录介质和记录介质的使用说明书。
作为上述记录介质或分析方法包的例子,可以举出仅包含特定的单克隆抗体中限定的信息的例子。因此,单克隆抗体例如为曲妥单抗、曲妥单抗-DM1、贝伐单抗或利妥昔单抗时,可以提供记载有适于它们的分析条件的记录介质或分析方法包。
上述情况下,记录介质中所含的数据例如可以涉及:针对具有序列号1~47中的任一个以上的氨基酸序列的肽的分析条件。
分析方法包可以记载多个质谱分析装置中共同的数据,或者也可以记载适于基于特定的质谱分析装置的分析的各种数据。
记录介质或分析方法包可以与上述本发明的试剂盒一起、或者与试剂盒分别地提供。
实施例
根据以下的实施例,对本发明进一步进行具体说明,但本发明不受实施例的限定。
[实施例1样品调制用试剂盒]
为了分析单一个样品,准备以下构成的试剂盒。
(1)PBS缓冲液(PBS+0.1%正辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷,Dojindo)
(2)酶反应缓冲液(25mM Tris-HCl,pH8.0)
(3)酶反应停止液(10%甲酸)
(4)滤管(Low-binding hydrophilic PVDF、孔径0.2μm、Millipore公司)
(5)低吸附管(Richell Microresico tube 92017)
(6)LCMS进样瓶、嵌入(岛津GLC GLC4010-VP Target vial VP、C4010-630PTarget PP Polyspring)
(7)多孔体(Pierce 53126蛋白G UltraLink Resin、40μl分注)
(8)纳米颗粒(胰蛋白酶固定化FG珠(胰蛋白酶40μg))
(9)使用说明书
<流程(使用说明书(9)中记载)>
1.将血液样品20μl取至低吸附管(5),用180μl缓冲液(1)稀释。
2.将多孔体(7)以台式离心机离心,弃去上清。加入缓冲液(1)100μl,轻轻搅拌后离心,弃去上清。进行该操作3次。之后加入40μl的缓冲液(1)进行悬浮后,移至滤管(4)。该操作可以在滤管(4)上进行。
3.将步骤1的血液稀释样品移至滤管(4)。
4.边用轻敲回转式混合机(Nissin Rika),边在室温下搅拌1小时。
5.进行离心过滤(10000g×1分钟),分离溶液。加入缓冲液(1)200μl,进行离心过滤,废弃滤液。进行该操作3次。
6.加入PBS缓冲液(1)200μl,轻轻搅拌后离心过滤,弃去滤液。进行该操作1次。
7.在步骤6的多孔体中加入缓冲液(2)200μl。
8.将纳米颗粒(8)在冰上溶解。迅速在超声波清洗机或者涡流混合器中均匀分散,加入至步骤7。
9.在滤管上安装溶液回收用管,在盖子侧使用封口膜等进行密封。边以轻敲回转式混合机轻轻轻敲,边以37℃搅拌6小时,进行蛋白质分解。
10.将反应混合液离心过滤(10000g×1分钟),去除树脂。回收滤液。
11.在步骤10中加入酶反应停止液(3)15μl。
12.移至LC-MS进样瓶组(6),去除底的气泡。
13.安装于LC-MS的自动进样器,进行分析。
14.LC-MS分析条件清单另附(表1~表6)。
<抗体药物定量用肽的质谱分析条件(包含于记录介质)>
[表1]
曲妥单抗和曲妥单抗-DM1的定量肽和其质谱分析信息
使用的固相酶:Trypsin Gold(Promega)
*包含C的肽进行了还原烷基化处理
[表2]
贝伐单抗的定量肽和其质谱分析信息
使用的固相酶:Trypsin Gold(Promega)
*包含C的肽进行了还原烷基化处理
[表3]
利妥昔单抗的定量肽和其质谱分析信息
使用的固相酶:Trypsin Gold(Promega)
*包含C的肽进行了还原烷基化处理
[表4]
曲妥单抗和曲妥单抗-DM1的定量肽和其质谱分析信息
使用的固相酶:Trypsin TPCK-treated(Sigma-Aldrich)
*包含C的肽进行了还原烷基化处理
[表5]
贝伐单抗的定量肽和其质谱分析信息
使用的固相酶:Trypsin TPCK-treated(Sigma-Aldrich)
*包含C的肽进行了还原烷基化处理
[表6]
利妥昔单抗的定量肽和其质谱分析信息
使用的固相酶:Trypsin TPCK-treated(Sigma-Aldrich)
*包含C的肽进行了还原烷基化处理
[实施例2过滤膜的研究1]
为了利用过滤中使用的膜原材料验证肽回收率的差异,对聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene、PTFE)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride、PVDF)这两种膜原材料进行比较。
回收率的验证以100μg/ml曲妥单抗为开始,制成3倍稀释系列(N=4),用固定化有胰蛋白酶的纳米颗粒(Trypsin TPCK treated)进行蛋白酶解后,针对记载有序列的各肽(LFPPKPK(序列号46)、LYSGVPSR(序列号21)、FTISADTSK(序列号3)、ASQDVNTAVAWYQQKPGK(序列号47)、GLEWVAR(序列号6)、DTYIHWVR(序列号5)),利用质谱分析法(LCMS-8040(株式会社岛津制作所制))定量肽回收率。将以PRFE的结果为基准的PVDF的结果作为相对值(变化倍率)示于图2。显著性检验使用T检验,标记p<0.05(*)、p<0.01(**)。
其结果表明:高浓度的肽的情况下没有差异,但肽为低浓度时,回收率产生大的显著性差异,作为过滤膜,PVDF是适合的。
[实施例3过滤膜的研究2]
使用贝伐单抗验证与实施例2同样的实验。将结果示于图3。
其结果表明:与实施例2同样地,高浓度的肽的情况下没有差异,但肽为低浓度时,回收率产生大的显著性差异,作为过滤膜,PVDF是适合的。
[实施例4过滤膜的研究3]
为了验证用于多个试样测定的过滤膜板的肽回收率,对2种膜原材料(PTFE、PVDF)和3种壳体进行比较。作为MultiScreen板,使用1)PTFE membrane(膜)/Solvinert housing(壳体)(Merck公司)、2)PVDF membrane/Acryl clear housing(Merck公司)、3)PVDFmembrane/Barex white housing(Merck公司)进行比较。
回收率的验证以400μg/ml曲妥单抗为开始,制成2倍稀释系列(N=4),进行酶消化后,对各肽,用质谱分析法(LCMS-8040)定量回收率。将结果示于图4。显著性检验使用T检验,标记p<0.05(*),p<0.01(**)。
其结果,在肽的高浓度侧,PTFE是占优势的,而在低浓度侧PVDF占优势。由于临床上5-20μg/ml为要求肽浓度范围,因此判定选定PFDV Barex是效的。对于使用Barex树脂时的高浓度的肽中的饱和,考虑蛋白质成分的聚集。临床上想到的血液样品中,有大量包含抗体的情况、和利用表面活性剂的清洗工序,因此考虑消除该饱和现象。需要说明的是,丙烯酸类树脂的基于物理吸附的肽损失大,从选定中排除。
[实施例5蛋白酶活性的稳定性评价]
为了监测固定化于纳米颗粒的蛋白酶(胰蛋白酶)的活性稳定性,进行酶活性测定。纳米颗粒妨碍底物吸光度,因此,对于现有法加入了几个改变。
作为蛋白酶,使用:Trypsin Gold,质谱分析级别(Promega Corporation制)(以下,记作“Gold”)和来源于牛胰腺的TPCK处理的胰蛋白酶,产品号T1426(Sigma Aldrich社制)(以下,记作“TPCK”)这2种胰蛋白酶、以及使用实施例1中记载的试剂盒将“Gold”、“TPCK”分别固定化于纳米颗粒而成的“FG-Gold”、“FG-TPCK”,在各种条件下进行酶反应,调查酶稳定性。需要说明的是,“Gold”是在胰凝乳蛋白酶失活处理(TPCK处理)的基础上实施还原二甲基化反应,由此对自体分解具有抗性,不依赖于温度、pH地广泛地维持高的活性的质谱分析级的蛋白酶。另一方面,“TPCK”是进行胰凝乳蛋白酶失活处理、但胰凝乳蛋白酶残留的蛋白酶。
作为底物,使用N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐(MW=434.9),通过水解反应,测定从底物游离的对硝基苯胺(p-NA)的吸光度(405nm,吸光系数=9920M-1·cm-1),由此测定酶活性。
<流程>
将蛋白酶底物溶解于DMSO,使其终浓度成为10mM,作为储备液。
如下述进行混合。
·底物10μl(100nmol)
·反应缓冲液(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH8.0)200μl
·固定化酶悬浮液(0.5mg/ml)2μl
存在纳米颗粒(FG珠)本身的悬浮产生的吸光度、和对壁面的物理吸附所产生的FG珠的损失,因此,作为对照制成无底物的样品孔,同时进行测定。各样品进行N=2的测定,将平均值作为吸光度。FG珠在添加前充分悬浮。
在各条件下进行蛋白酶解反应1.5小时、在涡流混合器搅拌下进行。反应结束时,加入2N-HCl 50ml使反应完全停止。用MultiScreen滤板(Millipore MultiScreen PVDF、Barex、0.2μm)过滤,去除纳米颗粒后,分注至光学底板(Cosmo Bio Co.,Ltd.制),使用酶标仪(TECAN Infinite M200Pro、Tecan Japan株式会社制),测定从底物游离的对硝基苯胺(p-NA)的吸光度(405nm,吸光系数=9920M-1·cm-1),评价酶活性。
在25℃室温下,每隔1分钟在装置内涡流混合器刚刚搅拌后进行吸光度测定,进行120次连续测定。制成伴随着吸光度增加的近似直线,将其斜率作为酶反应速度。
固定化有胰蛋白酶的纳米颗粒以4℃和-20℃保存,监测约3个月,由此评价其酶活性。将结果如图5所示,表明:保存稳定性不受温度左右,以试剂盒的形式提供时,保管温度可以设为4℃。
[实施例6由放大产生的影响评价]
针对蛋白酶固定化纳米颗粒的大量制造,验证蛋白酶活性是否产生变化。测定方法在与实施例5同样的改变的基础上,将反应缓冲液变更为50mM Tris-HCl、pH8.0。
为了比较,对初始投入的纳米颗粒量以实验室规模(5mg、规模A)、毫克规模(20mg、规模B)、大规模(200mg、规模C)进行比较。对酶活性进行约2个月监测。将结果示于图6。
其结果可以判断:没有由放大所产生的酶活性的降低。
[实施例7由放大产生的影响评价]
伴随着纳米颗粒的大量制造,考虑清洗工序变得不充分的可能性。为了实现清洗工序的效率化,对固定化后的清洗液使用表面活性剂、验证其效果。
酶活性评价的结果成为:
无掩蔽(去污剂-)FG珠胰蛋白酶:5.784E-03
有掩蔽(去污剂+)FG珠胰蛋白酶:5.902E-03,
可以判断:没有由表面活性剂清洗所产生的酶失活。
产业上的可利用性
根据本发明的试剂盒,试样中的单克隆抗体的鉴定·定量变简便,且可以减少手法的误差。另外,为了确定作为对象的离子种类,无需设定使用者的质谱分析条件。
特别是抗体药物的基于质谱分析的浓度定量技术有代替现行ELISA法的优势,本发明可以贡献于对临床药理领域的扩展、市场扩大。
本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请直接通过引用并入本说明书。
Claims (8)
1.一种用于制备通过高效液相质谱分析LC-MS检测单克隆抗体的样品的方法,所述方法包括提供:
多孔体,其细孔内固定化有作为测定对象的单克隆抗体;
纳米颗粒,其固定化有蛋白酶;
反应容器;
缓冲液;以及
过滤膜,其作为反应容器的底,
在反应容器中使所述多孔体与所述纳米颗粒在缓冲液中接触而进行选择性蛋白酶水解反应,
所述过滤膜在不施加压力或离心力的条件下基本不能使所述缓冲液和由所述蛋白酶水解反应生成的肽透过而作为所述反应容器的底发挥功能;在施加压力或离心力的条件下能使所述缓冲液和所述肽透过。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,测定对象为曲妥单抗、曲妥单抗-DM1、贝伐单抗或利妥昔单抗。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述纳米颗粒的平均粒径大于所述多孔体的平均细孔直径。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述多孔体的平均细孔直径在10nm~200nm的范围内。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述纳米颗粒的平均粒径在50nm~500nm的范围内,该纳米颗粒的平均粒径为所述多孔体的平均细孔直径的1.2倍以上。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,所述过滤膜具有所述多孔体和所述纳米颗粒无法透过而消化的肽能够透过的孔径,使所述消化的肽透过所述过滤膜时去除所述多孔体及所述纳米颗粒。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,所述过滤膜的壳体原材料为聚丙烯腈树脂,所述过滤膜为聚偏二氟乙烯PVDF制的膜。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,所述多孔体的细孔内固定化有与抗体的Fc域部位特异性结合的连接体分子,以及所述选择性蛋白酶水解反应为基于蛋白酶的Fab域的区域选择性消化反应。
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