CN111656190A - 改善单克隆抗体的检测结果的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种样品中的单克隆抗体的检测方法，所述方法包括以下的步骤：(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤；(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤；及(c)通过液相色谱质谱分析(LC‑MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，其为在离液试剂和还原剂的存在下、在pH8～9的条件下实施步骤(b)的选择性蛋白酶解的方法。

Description

改善单克隆抗体的检测结果的方法
技术领域
本发明涉及改善利用质谱分析进行单克隆抗体定量时的检测结果的方法。更具体而言，本发明涉及为了定量单克隆抗体而已确立的方案的改良。
背景技术
近些年，作为替代ELISA法的定量法，积极进行了使用LC-MS/MS法的抗体药物的生物催化剂的开发。
本发明人等小组发现：通过将测定对象的单克隆抗体及能将其作为底物消化的蛋白酶这两者固定化于固相，从而能够通过区域选择性的固相-固相反应而实现单克隆抗体的蛋白酶解，成功地获得了各个单克隆抗体特有的肽(专利文献1～6和非专利文献1～8)。该方法是使将单克隆抗体固定化于细孔内的多孔体、与固定化有蛋白酶的纳米颗粒在液体中接触来进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的质谱分析的前处理方法，是能够通过液相色谱质谱分析(LC-MS)对得到的肽片段进行有效地检测和定量的突破性技术。本发明人等将本方法命名为“纳米表面和分子取向限制蛋白质水解(nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis)方法(nSMOL法)”。
基于nSMOL法进行的血中抗体药物的定量是如下方法：能够仅对具有抗体药物的特异性序列的Fab域限定性胰蛋白酶解、抑制在LC-MS/MS分析中视为最棘手问题的离子抑制效果，从而提供更稳定的可靠性高的定量值。本发明人等已经确认了：在15种以上的抗体药物的血药浓度测定中，组合nSMOL法和LC-MS/MS法而使用的单克隆抗体的检测方法符合日本、美国和欧洲的用于验证生物学分析方法的准则的基准。
另一方面，已知作为生物高分子的蛋白质中存在具有非常特征性的坚硬的(刚性)结构和部位的蛋白质。例如，β淀粉样蛋白、转铁蛋白、多个跨膜型蛋白质(视紫红质、转运蛋白等)中，尽管机理不同，但已知通过采用刚性结构其作用分别得到了控制。
作为使蛋白质结构保持刚性的结构之一，有通过SS键而产生如结扣状那样的结构的半胱氨酸结结构。作为具有半胱氨酸结结构、有助于特异性信号传递的分子，可列举出血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素等细胞因子类。在肿瘤坏死因子(TNF,tumor necrosisfactor)受体所代表的细胞因子受体的细胞外结构域中也确认了同样的结状结构。另一方面，已知硫氧还原蛋白、乳球蛋白、胰岛素、胰蛋白抑制剂、结合珠蛋白、α1酸性糖蛋白等即使不具有非常强的SS键，也具有一定程度的蛋白酶抗性。
抗体分子是由2根重链和2根轻链组成的4聚体高分子量蛋白质，在各自链中存在：具有抗体特异性氨基酸序列而定义抗体结构的多样性、功能的可变区；和、分子结构相同的恒定区。在可变区中，突变的频率也特别高且决定与抗原的结合性的区域是互补决定区(CDR)；另外，在重链恒定区的CH1结构域与CH2结构域之间存在被称为铰链的灵活性非常高的结构。
由于抗体分子中存在铰链，因此使抗体结合部位(抗原结合片段：Fab,fragmentantigen binding)的立体结构学的波动得以确保，利用NMR分析等进行分子动力学解析时，尽管Fc位点几乎被三维地固定，但已知Fab位点大幅波动以至无法三维地分配。在抗原发生结合时该波动收敛而变为刚性结构。这点也已通过三维结构解析、复合体的晶体结构解析而得到了阐明。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2015/033479号
专利文献2：国际公开WO2016/194114号
专利文献3：国际公开WO2016/143224号
专利文献4：国际公开WO2016/143223号
专利文献5：国际公开WO2016/143226号
专利文献6：国际公开WO2016/143227号
非专利文献
非专利文献1：Analyst.2014 Feb 7；139(3):576-80.doi:10.1039/c3an02104a
非专利文献2：Anal.Methods,2015；21:9177-9183.doi:10.1039/c5ay01588j
非专利文献3：Drug Metabolism and Pharmacokinetics,2016；31:46-50.doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004
非专利文献4：Bioanalysis.2016；8(10):1009-20.doi:10.4155.bio-2016-0018
非专利文献5：Biol Pharm Bull,2016；39(7):1187-94.doi:10.1248/bpb.b16-00230
非专利文献6：J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci；2016；1023-1024:9-16.doi:10.1016/j.jchromb.2016.04.038
非专利文献7：Clin Pharmacol Biopharm 2016；5:164.doi:10.4172/2167-065X.1000164
非专利文献8：J.Pharm Biomed Anal；2017；145:33-39.doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032
发明内容
发明要解决的问题
nSMOL法中具有如下反应机制：通过使固定在直径约200nm的纳米颗粒表面的蛋白酶与固定在细孔直径约100nm的多孔体的免疫球蛋白分子接触，从而在被限制的反应场中选择性切断免疫球蛋白分子的Fab。nSMOL法的精度/灵敏度/再现性优异，为了实施nSMOL法，LC/MS/MS用前处理试剂盒“nSMOL Antibody BA Kit”(岛津制作所)已经有所市售，还提供与试剂盒组合的方案。但本发明人等为了使nSMOL法的通用性进一步扩大，而进行了方案改良等的研究。
然而，在对各种抗体实施基于nSMOL法的检测时，确认了即使基于蛋白酶的选择性消化反应进行，也无法切断抗体特异性肽(信号肽)。实际上，存在无论基于nSMOL法的反应是否进行均无法检测信号肽的例子。
与其它蛋白质同样地，抗体蛋白质在分子内也可能具有非常刚性的区域。这样的抗体分子大多数对蛋白酶具有抗性，其结果，可认为有时使基于nSMOL法的分解受到限制。
已知：抗体分子由于类型转换和体细胞突变等而产生随机的氨基酸序列。另外，即使氨基酸序列是已知的，尤其预测其可变位点的结构也是极其困难的。因此，在基于nSMOL法的抗体的检测中，实际上无法预测对哪种抗体使用何种最优化条件。
为了将nSMOL法用于所有单克隆抗体药物，本发明提出针对如上述那样的刚性单克隆抗体的分析条件，目的在于进一步扩大其通用性。
用于解决问题的方案
本发明人等预料出：检测结果变低的情况可能是由测定对象的抗体分子的硬度引起的蛋白酶抗性所导致的，但不受理论约束。即，在这样的抗体分子中，由于某种机制而存在非常刚性的区域并发生针对蛋白酶的耐性，其结果，有可能未进行在nSMOL法中所预测的蛋白酶解。
从原理上，nSMOL法由于在立体结构上控制蛋白酶与底物的接触部位，因此假设对全部抗体的Fab域选择性地进行蛋白酶反应。也已证实了确实进行了不依赖于抗体的多样性反应。然而，抗体分子其本身为非常刚性的情况下，即使与底物接触，也可能对能抗体定量的部位不进行基于蛋白酶的的水解。
为了使nSMOL法适用于所有的单克隆抗体药物，本发明人等对针对上述那样的刚性单克隆抗体的分析条件进行了各种研究，结果发现：在使单克隆抗体与蛋白酶接触来进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解时，在离液试剂和还原剂的共存下使检测结果得到显著改善。可假想该效果使抗体的刚性立体结构松弛而促进蛋白酶解反应，同时改善通过蛋白酶解游离的肽的游离效率，但不受理论约束。
即，本发明提供以下方案。
1.一种改善样品中的单克隆抗体的检测方法中的检测灵敏度的方法，所述改善样品中的单克隆抗体的检测方法包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析(LC-MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，
所述方法在离液试剂和还原剂的存在下、在pH8～9的条件下实施步骤(b)的选择性蛋白酶解。
2.根据上述1所述的方法，其中，离液试剂选自由胍盐酸盐、尿素、硫脲、乙二醇和硫酸铵组成的组。
3.根据上述2所述的方法，其中，离液试剂为0.5～3M范围的浓度的尿素或硫脲。
4.根据上述1～3中任一项所述的方法，其中，还原剂选自由二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)或其盐酸盐、三丁基膦组成的组。
5.根据上述4所述的方法，其中，还原剂为0.1～0.5mM范围的浓度的TCEP。
6.离液试剂和还原剂的用于改善样品中的单克隆抗体的检测方法中的检测灵敏度的应用，所述样品中的单克隆抗体的检测方法包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析(LC-MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤。
7.根据上述6所述的应用，其中，离液试剂选自由胍盐酸盐、尿素、硫脲、乙二醇和硫酸铵组成的组。
8.根据上述7所述的应用，其中，离液试剂为0.5～3M范围的浓度的尿素或硫脲。
9.根据上述6～8中任一项所述的应用，其中，还原剂选自由二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其盐酸盐、三丁基膦组成的组。
10.根据上述9所述的应用，其中，还原剂为0.1～0.5mM范围的浓度的TCEP。
发明的效果
根据本发明，对于认为在结构化学上为刚性的单克隆抗体、例如阿达木单抗、曲妥珠单抗，确立了能进行分析验证的定量方法，nSMOL法能够用于比现有更广泛范围的抗体。本发明的方法不仅带来在所有抗体的检测中改善灵敏度的效果，而且还能够以更低的浓度进行检测，因此可以提供通用性得到大幅提高的nSMOL法的方案。
附图说明
图1示出阿达木单抗的重链Fab结构域(左)和轻链(右)的氨基酸序列。下划线部分示出用作信号肽的肽(序列号3)。
图2示出在pH8、pH8.5或pH9下进行nSMOL法时的信号肽的峰强度和相对于作为内部标准使用的P14R的峰强度的比率(ISTD比率)。sum表示信号肽的峰强度。
图3示出：对于作为还原剂使用2mM TCEP、在1M尿素的存在下和没有1M尿素的情况下进行nSMOL法时的信号肽的峰强度和ISTD比率在pH8、pH8.5和pH9下进行比较的结果。
图4示出：作为离液试剂使用1M尿素、使其与0.5～3mM的TCEP共存进行nSMOL法时的信号肽的峰强度和ISTD比率。
图5示出：作为离液试剂使用2M尿素、在没有TCEP的存在下、和在0.1～0.3mM的TCEP的存在下进行nSMOL法时的信号肽的峰强度和ISTD比率。
图6示出：作为离液试剂使用2M尿素、在0.01～0.2mM的TCEP的存在下进行nSMOL法时的信号肽的峰强度和ISTD比率。
图7示出：作为还原剂使用0.5mM TCEP、在没有尿素的存在下和在1M或2M尿素的存在下进行nSMOL法时的信号肽的峰强度和ISTD比率。
图8示出：作为离液试剂使用0～3M尿素、作为还原剂使用0.01～0.2mM的TCEP来进行nSMOL法时的信号肽的峰强度和ISTD比率。
图9示出：与在没有离液试剂和还原剂的存在下、pH8的条件(对照、左)进行比较的在2M尿素、0.2mM TCEP、pH8.5的条件(Urea/TCEP、右)下进行nSMOL法时的信号肽的峰强度和ISTD比率。
图10示出在2M尿素、0.2mM TCEP、pH8.5的条件下检测样品中的2～250μg/ml的浓度的阿达木单抗的结果，示出将横轴作为相对于设定的浓度所检测的浓度的比、将纵轴作为相对于信号肽的ISTD的峰强度(面积)比进行绘图的结果。
图11示出：对于曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗和纳武单抗，对在2M尿素、pH8.5、0.1、0.2或在0.5mM的浓度的TCEP的存在下进行检测时的峰强度进行比较的结果，以在3种TCEP浓度中将显示出最高的峰强度的情况设为1时的相对强度示出。
图12中，图12A示出：对于曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗和纳武单抗，与在没有离液试剂和还原剂的存在下、pH8的条件(对照、左)进行比较的、在2M尿素、0.2mMTCEP、pH8.5的条件(右)下进行nSMOL法时的信号肽的峰强度，以将对照条件的结果设为1时的相对强度示出。图12B放大示出对于西妥昔单抗、利妥昔单抗和纳武单抗的图12A的结果。
图13中，图13A示出；在没有离液试剂和还原剂的存在下、pH8的条件(◆)和在2M尿素、0.2mM TCEP、pH8.5的条件(■)下对样品中的0.061～250μg/ml的浓度的曲妥珠单抗进行检测的结果，其将横轴设为浓度、将纵轴设为峰强度进行绘图的结果。图13B放大示出在图13A的低浓度区域(曲妥珠单抗浓度2.5μg/ml以下)下的结果。
具体实施方式
本发明提供改善样品中的单克隆抗体的检测方法中的检测灵敏度的方法，所述样品中的单克隆抗体的检测方法包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析(LC-MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，
所述方法在离液试剂和还原剂的存在下、在pH8～9的条件下实施步骤(b)的选择性蛋白酶解。
本发明还提供离液试剂和还原剂的用于改善样品中的单克隆抗体的检测方法中的检测灵敏度中的应用，所述样品中的单克隆抗体的检测方法包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析(LC-MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤。
＜步骤(a)＞
本发明的方法的步骤(a)相当于捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤。
本说明书中，“样品”是要检测单克隆抗体存在的液体样品，没有特别限定，通常为小鼠、大鼠、兔子、山羊、牛、人等哺乳动物、特别是人被检者、主要是人患者来源的生物学样品，优选为血浆或血清或者组织均质器提取液。或者，样品可以是例如为了证实发明的效果而包含人为添加的单克隆抗体和血浆的液体样品。为了检测本发明的方法中的单克隆抗体，样品中的单克隆抗体的浓度在0.05～300μg/ml的范围内即可。
作为能成为测定对象的单克隆抗体，没有特别限定，例如可列举出帕尼单抗(Panitumumab)、奥法木单抗(offatumumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、纳武单抗(Nivolumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、阿达木单抗(Adalimumab)等人抗体；托珠单抗(Tocilizumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、曲妥珠单抗-DM1、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、吉妥单抗(Gemtuzumab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、莫加木珠单抗(Mogamulizumab)、艾库组单抗(Eculizumab)、托珠单抗(Atlizumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)等人源化抗体；利妥昔单抗(Rituximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、巴利昔单抗(Basiliximab)等嵌合抗体等。
另外，维持单克隆抗体的特异性且附加有进一步的功能的复合体、例如Fc融合蛋白质(依那西普、阿巴西普等)、抗体-药物复合体(例如本妥昔单抗、吉妥珠单抗·奥佐米星(gemtuzumab-ozogamicin)、曲妥珠单抗-艾玛坦星(trastuzumab-emtansine)等)也可以为测定对象的单克隆抗体。可以在测定之前使复合体的结合解离而仅将抗体部分供于分析，但也可以以复合体的形态直接供于分析。
单克隆抗体的氨基酸序列的信息等可以从例如京都基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)获得。
作为用于本发明的方法的多孔体，可以使用具有多个细孔且能够使抗体部位特异性地结合的物质。多孔体的平均细孔直径可在10nm～200nm左右的范围内且在小于纳米颗粒的平均粒径的范围内适宜设定。
本发明的步骤(a)中，将测定对象的单克隆抗体固定化于多孔体的细孔内。出于该目的，优选使用多孔体的细孔内固定化有与抗体部位特异性地相互作用的连接体分子的物质。
作为连接体分子，优选使用与抗体的Fc结构域部位特异性结合的蛋白A、蛋白G等。通过使用细孔内固定化有这些连接体分子的多孔体，抗体的Fc结构域被固定化于细孔内，Fab结构域位于细孔的表层附近，因此基于蛋白酶的Fab结构域的区域选择性消化成为可能。
作为本发明中可以适合使用的多孔体，没有特别限定，例如可以举出蛋白GUltralink树脂(Pierce公司制)、Toyopearl TSKgel(Tosoh Corporation制)、ToyopearlAF-rProtein A HC-650F resin(Tosoh Corporation制)、Protein A Sepharose(GEHealthcare)、KanCapA(KANEKA)等。
使抗体固定化于多孔体的细孔内的方法没有特别限定，例如，使抗体固定化于细孔内固定化有蛋白A、蛋白G的多孔体时，通过将多孔体的悬浮液与包含抗体的溶液混合，可以使抗体容易地固定化于细孔内。多孔体与抗体的量比可以根据目的而适当设定。
＜步骤(b)＞
本发明的方法的步骤(b)相当于如下步骤：使固定化有上述步骤(a)中得到的单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触来进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解。
固定化于纳米颗粒的蛋白酶的种类根据成为基于质谱分析的定量或鉴定的对象的单克隆抗体的种类来适宜选择即可，没有限定，例如可以单独或组合使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、V8蛋白酶、AspN蛋白酶(Asp-N)、ArgC蛋白酶(Arg-C)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、二肽基肽酶。作为蛋白酶，可特别优选使用胰蛋白酶。作为能适宜用于本发明的方法的蛋白酶，例如可列举出Trypsin Gold(Promega Corporation制)、TrypsinTPCK-treated(Sigma公司制)等。
纳米颗粒的平均粒径大于多孔体的平均细孔直径，形状没有特别限定，从蛋白酶向多孔体的细孔的接近的均匀化的观点出发，优选球状的纳米颗粒。另外，纳米颗粒优选分散性高、平均粒径均匀。
作为纳米颗粒的种类，优选可以分散或悬浮于水性介质且可以通过磁性分离或磁性沉淀分离从分散液或悬浮液容易地回收的磁纳米颗粒。另外，在不易引起聚集的方面，更优选其表面被有机聚合物覆盖而成的磁纳米颗粒。作为被有机聚合物覆盖的磁性纳米珠的具体例，可以举出FG珠、SG珠、Adembeads、nanomag等。作为市售品，例如适合使用TamagawaSeiki Co.,Ltd.制的FG beads(将铁氧体颗粒用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)覆盖而成的粒径约200nm的聚合物磁性纳米颗粒)。
对于上述纳米颗粒，为了非特异性的蛋白质的吸附抑制、和蛋白酶的选择性的固定化，优选用能够与蛋白酶结合的间隔物分子修饰。通过借助间隔物分子使蛋白酶固定化，蛋白酶从纳米颗粒表面的脱离被抑制，可以提高蛋白酶解的区域选择性。另外，也可以通过调整间隔物的分子尺寸，使蛋白酶选择性地接近抗体的期望位置，从而提高区域选择性。
用这样的间隔物分子进行了表面修饰的纳米颗粒还可以被市售，例如，利用具有用N-羟基丁二酰亚胺活化的酯基(活性酯基)的间隔物分子修饰过的纳米颗粒以商品名“FGbeads NHS”(Tamagawa Seiki Co.,Ltd.)被市售。
将蛋白酶固定化于纳米颗粒的表面的方法没有特别限定，可以根据蛋白酶与纳米颗粒(或修饰纳米颗粒表面的间隔物分子)的特性等而采用适宜的方法。需要说明的是，上述的LC/MS/MS用前处理试剂盒“nSMOL Antibody BA Kit”(岛津制作所)中包含固定化有胰蛋白酶作为蛋白酶的纳米颗粒即FG beads Trypsin DART(注册商标)，可以适宜用于本发明的方法。
通过使固定化有上述单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触，从而使单克隆抗体被选择性蛋白酶解而产生肽片段。
蛋白酶解例如可以在调整至蛋白酶的最佳pH附近的缓冲溶液中实施，但为了实现本发明的目的在pH8～9的范围、特别是在pH约8.5下实施是适宜的。用于蛋白酶解的反应温度可以为37℃左右，在饱和蒸气压下以约50℃进行是适宜的。反应时间可以是30分钟～20小时、例如1小时～8小时、3～5小时的范围。没有特别限定，为了防止反应液的蒸发，优选在饱和蒸气压下维持反应。
步骤(b)通过对反应液进行搅拌而能够促进多孔体与纳米颗粒的接触，可以在整个反应时间进行搅拌，或仅在反应时间的一部分例如仅在反应初期进行搅拌，没有特别限定。
本发明中，在离液试剂和还原剂的存在下实施步骤(b)中的蛋白酶解。
离液试剂可以选自由例如胍盐酸盐、尿素、硫脲、乙二醇和硫酸铵组成的组，没有特别限定。上述中，优选不会产生损伤下述的步骤(c)的LC-MS中使用的柱内的树脂之类的不良影响的物质，另外，由于对pH不产生影响，因此离液试剂适宜的是尿素或硫脲，特别适宜的是尿素。
使用尿素或硫脲的情况，步骤(b)的反应中的浓度设为0.5～2M、尤其设为1～2M的范围是适宜的。若以超过约6M的方式使用，则使抗体蛋白质变性，检测效果反而降低。因此，上述范围是远低于作为蛋白质的变性剂使用的尿素的浓度的低浓度。
还原剂可以选自由例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)或其盐酸盐、三丁基膦组成的组，没有特别限定。这些还原剂可以从Sigma-Aldrich Co.LLC、NACALAI TESQUE,INC.、Funakoshi Co.,Ltd.等获得。适宜地，还原剂是在广泛的pH范围内具有良好的还原能力的TCEP。
使用TCEP的情况，步骤(b)的反应中的TCEP浓度优选设为0.05～1mM、特别优选设为0.1～0.5mM范围的浓度、例如0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM、0.45mM或0.5mM。为了能完全切断反应中存在的SS键，这样的浓度范围是远低于使用TCEP作为还原剂时的通常的浓度的范围。
如上所述，令人惊讶的是，本发明中使用的离液试剂和还原剂的为了实现本发明的效果而成为最优的浓度范围均显著低于本领域中通常使用的浓度。通过使这样的低浓度的离液试剂和还原剂共存，从而能使成为底物的抗体与纳米颗粒表面上的蛋白酶充分接触，并且能够提高被切断而游离的肽的稳定性，可认为能够防止肽吸附至容器、由与空气的接触所致的氧化而有助于检测灵敏度的改善。
上述的通过蛋白酶解而酶解的肽溶解于反应液中并被释放。因此，为了将目标肽片段供于质谱分析，需要去除多孔体和纳米颗粒。这可以通过对蛋白酶解后的样品进行过滤、离心分离、磁性分离、透析等操作来实现。
例如通过使用聚偏氟乙烯(PVDF)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PVDF(低结合亲水性PVDF)、孔径0.2μm、Millipore公司制)、聚四氟乙烯(PTFE)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PTFE(低结合亲水性PTFE)、孔径0.2μm、Millipore公司制)等进行过滤，可以将多孔体和纳米颗粒简便地去除。过滤设为离心过滤时，可以进行迅速且简便的过滤。
如上所述，若选择TCEP作为还原剂，则因步骤(b)结束时微量残留的还原剂而造成之后的操作出现问题的可能性低，另外还可期待改善肽的稳定性，故而是适宜的。
＜步骤(c)＞
本发明的方法的步骤(c)相当于通过液相色谱质谱分析(LC-MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤。
质谱分析中的离子化法和经离子化的试样的分析方法没有特别限定。另外，可以使用三重四极型质谱分析装置等来进行MS/MS分析、或MS3以上的多个阶段质谱分析、多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)。
本发明的方法中特别适合的装置没有特别限定，例如可以列举出LCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050、LCMS-8060(均为岛津制作所)、LCMS-IT-TOF(岛津制作所)。
通过质谱分析等来检测包含对于目标单克隆抗体特异性的Fab域例如重链和/或轻链的CDR1区域、CDR2区域、CDR3区域的氨基酸序列的肽片段，从而能够进行目标单克隆抗体的鉴定/定量。
有意作为抗体药物使用的单克隆抗体的氨基酸序列信息等已被公开，可以获得重链和轻链的氨基酸序列、Fab和Fc结构域、互补决定区(CDR)、二硫键等信息。因此，基于nSMOL法通过蛋白酶解而可以得到多个肽，只要可以获得针对每个肽的氨基酸序列信息，就能够容易地理解该肽存在于单克隆抗体中任意的位置。因此，源自Fab域的多个肽中，可以选择特别适合的肽作为分析对象。如此选择的肽被称为“信号肽”。
nSMOL法的详细情况公开于如下文献：例如WO2015/033479号；WO2016/143223号；WO2016/143224号；WO2016/143226号；WO2016/143227号；WO2016/194114号；Analyst.2014Feb 7；139(3):576-80.doi:10.1039/c3an02104a；Anal.Methods,2015；21:9177-9183.doi:10.1039/c5ay01588j；Drug Metabolism and Pharmacokinetics,2016；31:46-50.doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004；Bioanalysis.2016；8(10):1009-20.doi:10.4155.bio-2016-0018；Biol Pharm Bull,2016；39(7):1187-94.doi:10.1248/bpb.b16-00230；J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci；2016；1023-1024:9-16.doi:10.1016/j.jchromb.2016.04.038；Clin Pharmacol Biopharm 2016；5:164.doi:10.4172/2167-065X.1000164；和J.Pharm Biomed Anal；2017；145:33-39.doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032等。这些文献的公开内容通过参照而引入本说明书中。
现有的nSMOL法的方案的例子如下。
＜步骤(a)＞
1.将包含单克隆抗体的生物学样品5-10μL用约10-20倍量的PBS+0.1％正辛基硫代糖苷(OTG)稀释。
2.加入多孔体悬浮液(TOYOPEARL AF-r蛋白A HC-650F,50％研磨液)25μL。
3.平缓地涡漩搅拌5分钟左右。
4.回收全部超自由低蛋白结合Durapore PFDF(0.22μm)。
5.离心去除上清液(10000g×1分钟)。
6.加入PBS+0.1％OTG 300μL，离心去除上清液(10000g×1分钟)。
7.重复步骤6。
8.为了去除表面活性剂，加入PBS 300μL，离心去除上清液(10000g×1分钟)。
9.重复步骤8。
10.加入反应溶液(25mM Tris-HCl、pH8)75-100μL。在该溶液中预先添加10fmol/μL的P14R合成肽。
＜步骤(b)＞
11.加入固定化有化学修饰胰蛋白酶的纳米颗粒(0.5mg/ml FG beads悬浮液)5-10μL。
12.在饱和蒸气压下50℃下边平缓地搅拌边进行4-6小时反应。
13.通过在反应液中加入10％甲酸10μL而使反应停止。
14.进行离心过滤(10000g×1分钟)，回收溶液。
15.置于磁力架上，静置约1-2分钟，去除残余的树脂。
＜步骤(c)＞
16.供于LCMS分析。
本发明的方法中，作为上述的方案中的“10.”中的反应液，可以使用包含离液试剂和还原剂的Tris-HCl，来代替使用Tris-HCl、pH8。需要说明的是，Tris-HCl是本领域中惯用的缓冲剂，即使使用PBS、Bis-Tris、Tricine、Bicine、HEPES、CAPS、MES、MOPS、磷酸盐缓冲液等其它缓冲剂也能够进行同样的反应，本发明中缓冲剂没有特别限定。
作为具有刚性结构的单克隆抗体的一个例子而记载于本说明书中的阿达木单抗是能与TNF-α特异性结合的人单克隆抗体，可以以HUMIRA的商品名获得。
如上所述，本发明的方法对于基于nSMOL法检测具有刚性结构的单克隆抗体是特别有利的，但可以对所有单克隆抗体进行实施。然而，例如在利用现有的nSMOL法的检测结果显著低于所预料的结果的情况下，或者在预料到预先在单克隆抗体的Fab域包含刚性结构的情况下，推荐选择本发明的方法。
本发明的方法没有特别限定，例如在使用现有的nSMOL法的情况下，难以以0.5μg/mL以下、1μg/mL以下、5μg/mL以下或10μg/mL以下的浓度进行检测，可以适宜地用于无法检测比由药代动力学试验的结果所预料的定量范围还低很多的浓度范围的单克隆抗体、或能够检测的单克隆抗体中的任意种。
作为能够适宜地利用本发明的方法的具体的单克隆抗体，没有特别限定，例如可列举出以下的实施例中还记载的上述的阿达木单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗和纳武单抗。
利用本发明的方法，nSMOL法中的检测灵敏度依赖于抗体的种类地改善约2～100倍左右，另外，能够检测和定量的下限值也能够改善约3～30倍左右。
实施例
通过以下的实施例对本发明进行进一步具体地说明。以下的数据示出通过大量的实验而得到的数据的一部分，本发明不限定于这些实施例。
[实施例1阿达木单抗检测的pH依赖性]
作为测定对象使用阿达木单抗，对用于利用nSMOL法检测样品中的阿达木单抗的方案的改良进行了研究。
图1示出阿达木单抗的重链和轻链的可变区的氨基酸序列(序列号1和2)。为了检测阿达木单抗而选择了能利用nSMOL法检测的多个肽候补，通过将成为与人血浆中可能存在的其它抗体来源的肽相同的序列的肽排除在外的选择等，作为存在于阿达木单抗的Fab域的信号肽而选择了具有以下划线所示的序列APYTFGQGTK(序列号3)的肽。
向多孔体悬浮液(TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F,50％slurry)12.5μL中加入PBS 90μL，在其中加入将阿达木单抗(AbbVie Inc.)以100μg/mL添加至人血浆(KOHJINBIO CO.,INC.制、用5μm的过滤器过滤后，用0.8μm的过滤器过滤后的血浆)中得到的样品5μL，轻轻搅拌5分钟左右。
将得到的悬浮液移至滤杯(Millipore公司Ultrafree MC-GV)中，进行离心分离(10000g×1分钟)并去除了上清液。
进行离心分离(10000g×1分钟)并去除上清液后，重复3次加入包含0.1％辛基硫代糖苷的PBS 300μL并进行离心分离的操作。接着，重复3次加入PBS 300μL并进行离心分离的操作。
作为反应溶液，制备pH8、pH8.5和pH9的溶液(25mM Tris-HCl)，将任意的反应溶液80μL加入样品中，进而加入固定化有蛋白酶的纳米颗粒(FG beads Trypsin DART)5μL，在饱和蒸汽压下以50℃进行5小时反应。
加入反应停止溶液(10％甲酸)5μL，进行离心过滤，通过磁性分离回收了溶液。
使用NexeraX2系统(岛津制作所)和LCMS-8050(岛津制作所)进行了LCMS分析。
对上述的序列号3的肽实施了测定。测定条件如下所示。
溶剂A：含0.1％甲酸的水溶液
溶剂B：含0.1％甲酸的乙腈溶液
流速：0.4ml/分钟或1ml/分钟
平衡浓度：％B＝1.0
柱：Shimpack GISSC18,2mm x 50mm(岛津制作所)
柱温度：50℃
HPLC条件：
Figure BDA0002607555700000171
接口条件：
Figure BDA0002607555700000172
Figure BDA0002607555700000181
碰撞分离感应气体条件：
使用气体 氩气
使用分压 270kPa
MRM瞬态条件：
[表1]
Figure BDA0002607555700000182
其结果，如图2所示，pH越高越可以得到高的信号强度。另一方面，与作为内部标准使用的P14R的比率，pH8.5时最高，pH9时降低。高pH条件致使P14R降解，而且诱发目标蛋白质的随机的水解，因此pH的最优值为pH8.5。
[实施例2离液试剂依赖性]
作为还原剂使用2mM TCEP(Sigma-Aldrich Co.LLC制)，确认了在与作为离液试剂使用1M尿素(Sigma-Aldrich Co.LLC制)共存的情况下的效果。在1M尿素的存在下和没有1M尿素的存在下、以pH8、pH8.5和pH9的条件进行与实施例1同样的nSMOL法。其结果，如图3所示，与实施例1同样地，确认了：在离液试剂的存在下和没有离液试剂的存在下中的任意条件下均是pH越高越可以得到高的信号强度，另外，取决于离液试剂的共存而使收率提高。
离液试剂在高浓度下还具有变性作用，因此认为需要对浓度的最优化进行研究。
[实施例3还原剂浓度依赖性1]
作为离液试剂使用1M尿素，改变还原剂的浓度对效果进行了研究。具体而言，使其与0.5～3mM的TCEP共存，在pH8.5下进行与实施例1同样的nSMOL法。其结果，如图4所示，明确了还原剂浓度越低，反应收率和内部标准比率越高。
因此，认为需要对更低浓度的还原剂的使用进行研究。
[实施例4还原剂浓度依赖性2]
作为离液试剂使用2M尿素，在没有TCEP的存在下和在低于实施例3的浓度的0.1～0.3mM的TCEP的存在下、以pH8.5进行与实施例1同样的nSMOL法。
其结果，如图5所示，在没有还原剂的存在下峰强度低，在0.1～0.3mM的浓度下得到高的峰强度。因此，使用2M尿素并以pH8.5进行反时，在阿达木单抗的检测中显示出存在0.1～0.2mM的TCEP是最佳的。
上述的结果显示出：若考虑到还原剂的通常的使用浓度为5～10mM这一情况，确认了本发明的方法以其约1/50左右的低浓度使收率提高。
[实施例5还原剂浓度依赖性3]
作为离液试剂使用2M尿素，在比实施例4更低浓度的0.01～0.2mM的TCEP的存在下进行与实施例1同样的nSMOL法(pH8.5)。
其结果，如图6所示，确认了：在阿达木单抗的检测中使用0.05～0.2mM的浓度、尤其是0.1～0.2mM的TCEP是最佳的。
[实施例6离液试剂浓度依赖性]
作为还原剂使用0.5mM TCEP，在没有尿素的存在下、在1M或2M尿素的存在下进行与实施例1同样的nSMOL法(pH8.5)。
其结果，如图7所示，确认了：在本发明中使用的低浓度还原剂的使用条件中，作为离液试剂使用2M尿素是最佳的。通常的蛋白质变性作用发生在约7M的尿素中，因此可认为本浓度可能有助于例如游离肽的稳定化、游离效率等，而并非变性作用、离液作用。
[实施例7由离液试剂和还原剂的共存带来的效果]
在低浓度还原剂的使用条件下，研究了阿达木单抗在基于nSMOL法的检测中的离液试剂浓度依赖性。具体而言，作为离液试剂使用0～3M尿素，且作为还原剂使用0.01～0.2mM的TCEP进行与实施例1同样的nSMOL法(pH8.5)。
其结果，如图8所示，使用3M尿素的情况，确认了收率依赖于还原剂浓度而降低。另一方面，可知添加ISTD使游离肽过度上升。由这些结果可认为，作为离液试剂使用2M尿素、作为还原剂使用0.1～0.2mM TCEP是最佳的。
[实施例8阿达木单抗检测灵敏度改善效果]
由上述的实施例所示的结果和其它研究的各种结果，为了进行基于nSMOL法的阿达木单抗的检测，在如下情况下：作为离液试剂使用2M尿素、作为还原剂使用0.2mM TCEP并在pH8.5的条件进行反应的情况；及在没有离液试剂和还原剂的存在下并在pH8的条件下进行反应的情况，其它条件相同地比较了检测出的峰强度。
其结果，如图9所示，在本发明的方法(尿素/TCEP)中，得到比现有的方法(对照)高约30倍的值，得到了显著的改善效果。
[实施例9校正曲线的制作]
使用在上述的实施例8中灵敏度改善效果得以确认的条件(2M尿素、0.2mM TCEP、pH8.5)，利用nSMOL法对含有2～250μg/mL的浓度范围的阿达木单抗的样品进行了分析。
其结果，如图10所示，得到了与浓度成正比的几乎直线状的定量结果(r＝0.9967745)，并且完成了分析指导标准。即，证实了本发明的方法是可靠性高的分析方法。
[实施例10使用多个抗体的还原剂浓度依赖性的研究]
使用各种抗体进行了与阿达木单抗同样的研究。对于曲妥珠单抗(中外制药株式会社)、西妥昔单抗(Bristol-Myers Squibb公司)、利妥昔单抗(全药工业株式会社)、纳武单抗(小野药品工业株式会社)，分别基于氨基酸序列信息等选择表3所示的信号肽，在0.1mM、0.2mM、0.5mM TCEP的存在下比较了检测结果(2M尿素、pH8.5)。
[表2]
抗体 信号肽 序列编号
曲妥珠单抗 IYPTNGYTR 4
西妥昔单抗 SQVFFK 5
利妥昔单抗 GLEWIGAIYPGNGDTSYNQK 6
纳武单抗 ASGITFSNSGMHWVR 7
其结果，如图11所示，显示出根据抗体的种类不同而带来最大峰强度的TCEP浓度条件不同。在阿达木单抗、以及本实施例和一直以来作为参照条件使用的曲妥珠单抗中，作为用于检测所研究的4种抗体的通用条件，可认为0.2mM的TCEP浓度是适宜的。
[实施例11多个抗体中的检测灵敏度改善效果]
使用实施例10中研究的0.2mM的TCEP浓度，对于曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、纳武单抗，比较了在没有离液试剂和还原剂的存在下、在pH8的条件(对照)及在2M尿素、0.2mM TCEP、pH8.5的条件下分别进行nSMOL法时的信号肽的峰强度。
图12中，对于曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、纳武单抗，示出将对照的峰强度设为1时的相对峰强度。在任意抗体的情况下，在TCEP的存在下的反应可以得到明显的灵敏度改善效果，特别是在曲妥珠单抗的检测中可以得到灵敏度显著增大超过60倍。对于西妥昔单抗、利妥昔单抗、纳武单抗，也确认了灵敏度上升约2～3倍。
[实施例12用于检测曲妥珠单抗的校正曲线范围的扩大]
使用在上述的实施例11中得到显著的灵敏度改善效果的2M尿素、0.2mM TCEP、pH8.5的条件，利用nSMOL法对含有2～250μg/mL的浓度范围的曲妥珠单抗的样品进行了分析。将序列号4的肽作为信号肽进行了测定。
其结果，如图13所示，在任意浓度下均可观察到利用本发明的方法的灵敏度的改善效果。另外，在没有还原剂和离液试剂的存在下、pH8下的检测情况，能进行可靠的检测下限为1.95μg/ml，而利用本发明的方法的检测下限为0.061μg/ml，证实了：本发明的方法不仅能够增大灵敏度，而且能够进行在显著低的浓度下的检测。
图13所示的结果示出：与通过在没有还原剂和离液试剂的存在下的反应而制作的校正曲线相比，本发明的方法能够以高的可靠性检测更低浓度的抗体浓度。
产业上的可利用性
根据本发明，使nSMOL法的方案得到改良，改善使用了质谱分析的单克隆抗体的检测方法的通用性。特别是在药代动力学试验、治疗药物监测试验中，能够对包括现有的方法中有时得到低的检测结果的抗体在内的各种抗体药物广泛地使用nSMOL法。
本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请直接通过引用并入本说明书。
序列表
<110> 株式会社岛津制作所（Shimadzu Corporation）
<120> 改善单克隆抗体的检测结果的方法
<130> PH-7281-PCT
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 阿达木单抗H链Fab域（Adalimumab H-chain Fab domain）
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 阿达木单抗L链（Adalimumab L-chain）
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 阿达木单抗信号肽（Adalimumab signature peptide）
<400> 3
Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 曲妥珠单抗信号肽（Trastuzumab signature peptide）
<400> 4
Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 西妥昔单抗信号肽（Cetuximab signature peptide）
<400> 5
Ser Gln Val Phe Phe Lys
1 5
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 利妥昔单抗信号肽（Rituximab signature peptide）
<400> 6
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser
1 5 10 15
Tyr Asn Gln Lys
20
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 纳武单抗信号肽（Nivolumab signature peptide）
<400> 7
Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种改善样品中的单克隆抗体的检测方法中的检测灵敏度的方法，所述样品中的单克隆抗体的检测方法包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析即LC-MS来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，
所述方法在离液试剂和还原剂的存在下、在pH8～9的条件下实施步骤(b)的选择性蛋白酶解。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，离液试剂选自由胍盐酸盐、尿素、硫脲、乙二醇和硫酸铵组成的组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，离液试剂为0.5～3M范围的浓度的尿素或硫脲。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，还原剂选自由二硫苏糖醇即DTT、三(2-羧乙基)膦即TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)或其盐酸盐、三丁基膦组成的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，还原剂为0.1～0.5mM范围的浓度的TCEP。
6.离液试剂和还原剂的用于改善样品中的单克隆抗体的检测方法中的检测灵敏度的应用，所述样品中的单克隆抗体的检测方法包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析即LC-MS来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，离液试剂选自由胍盐酸盐、尿素、硫脲、乙二醇和硫酸铵组成的组。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，离液试剂为0.5～3M范围的浓度的尿素或硫脲。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的应用，其中，还原剂选自由二硫苏糖醇即DTT、三(2-羧乙基)膦即TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)或其盐酸盐、三丁基膦组成的组。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，还原剂为0.1～0.5mM范围的浓度的TCEP。
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