KR20170120178A - 모노클로날 항체의 검출을 위한 샘플 조제용 키트 - Google Patents

모노클로날 항체의 검출을 위한 샘플 조제용 키트 Download PDF

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KR20170120178A
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다카시 시마다
노리코 이와모토
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가부시키가이샤 시마즈세이사쿠쇼
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Abstract

항체의 다양성이나, 종간 차, 매트릭스 등의 영향을 받지 않는, 극히 범용성이 높은 분석 방법을 제공하기 위한, 샘플 조제용 키트를 제공한다. 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 모노클로날 항체를 검출하기 위한 샘플 조제용 키트이며, 측정 대상의 모노클로날 항체를 고정화하기 위한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자와, 상기 다공질체와 상기 나노 입자를 접촉시켜 모노클로날 항체를 선택적으로 소화하기 위한 반응 용기와, 상기 나노 입자 및 다공질체와 함께 상기 반응 용기 내에 도입되고, 상기 프로테아제에 의한 소화 반응을 시키기 위한 완충액과, 상기 소화 반응 후에 상기 다공질체 및 상기 나노 입자를 제거하여, 상기 소화 반응의 생성물을 상기 완충액과 함께 추출하기 위한 여과막을 포함하는, 상기 키트를 제공한다.

Description

모노클로날 항체의 검출을 위한 샘플 조제용 키트
본 발명은 질량 분석에 의해 모노클로날 항체를 검출하기 위한 샘플 조제용 키트에 관한 것이며, 보다 구체적으로는, 모노클로날 항체의 특이적 서열을 포함하는 펩티드 단편을 선택적으로 소화하고, 보다 효율적인 분석을 가능하게 하기 위한 키트에 관한 것이다.
창약 영역에 있어서의 최대의 과제는, 부작용이 적고 높은 약효를 발휘하는 약의 개발이다. 그를 위해 현재 착안되고 있는 것이 약물 동태, 특히 농도 모니터링(therapeutic drug monitoring, TDM)이다. 처방한 약이 적정량인지 여부, 병변 부위에 도달하였는지 여부를 지표로 시즈의 스크리닝이 행해짐으로써, 드롭 아웃할 약을 조기에 발견하고, 이 정보를 조기 창약 개발이나 임상 시험에서 유효하게 이용할 수 있게 된다. 이전에는 오더 메이드 의료라고도 일컬어지는 개별화 의료에 대한 기대가 있었지만, 현실적으로는 의료 기술이나 의약품을 개별화하는 것은, 일부 부유층을 제외하면 의료 경제의 관점에서도 현실 불가능이라고 해도 된다. 그 때문에, 입수할 수 있는 의료 기기나 의약품을, 실제로 치료 효과가 있는 환자에게 보낸다고 하는 시도로 이행되고 있으며, 이것을 최적화 의료라고 칭하고 있다. 의약품 개발에 있어서의 최적화 의료에 대한 최대 시도가 TDM을 사용한 창약 개발이다. 특히 암이나 자기 면역 질환 등의 분야에서는, 요즘에는 분자 표적약이라고 불리는 창약이 주류이다. 분자 표적약의 효과적인 약효는, 병변 부위에 축적되어 약효를 발휘하였는지 여부를 측정하고, 의사 자신이 판단할 수 있는 것이 중요하다.
분자 표적약으로서는 현재, 병원 단백질을 표적 항원으로 하는 항체 의약이 주목받고 있다. 항체는 본래 체내에 존재하는 단백질이기 때문에, 부작용이 낮을 것이 예상되며, 분자 표적 효과를 높이기 위해 고농도로 투여하는 것도 가능하다. 또한, 항체 의약은 복수의 의약품을 사용한 칵테일 요법에도 적합하며, 극적으로 성공이 얻어지는 증례 보고도 나오고 있다. 또한, 드래그 딜리버리 영역으로부터의 어프로치로서, 항체에 저분자 항암제를 결합한 차세대 항체 의약(항체 의약 콘쥬게이트)도 등장하고 있다. 또한, 당쇄 개변에 의해 약효를 증강시킨 항체나, 면역 세포를 활성화함으로써 항암 효과를 초래하는, 소위 면역 체크 포인트 항체 등도 나오고 있으며, 항체 의약의 요구는, 금후 점점 높아질 것으로 예상된다.
항체는 그 성질상, 극히 높은 분자 특이성을 나타내고, 표적이 되는 병변에 축적된다고 여겨져 왔지만, 그것을 제대로 검증하는 기술은 존재하지 않았다. 또한, 항체 의약 그 자체의 약값의 문제도 있어, 적정 사용에 의한 최적화 의료라고 하는 것이, 환자에게 있어서도 의료 경제적으로도 중요하다고 논의되게 되었다. 그를 위해서는 항체 의약의 국재나 농도를 측정함으로써, 최적의 투약량을 설정하는 것도 중요하다. 나아가, 투약한 약의 약효 지표를 제대로 관찰하여 약리 평가를 하기 위한, 항체 의약 농도의 정량에도 큰 수요가 있다.
항체 등의 단백질의 정량을 위한 가장 일반적인 기술은 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)이다. 이것은 측정 대상의 단백질에 대한 항체를 제작하고, 또한 검출용 항체 사이에 샌드위치시킴으로써, 간편하게 측정 대상 분자를 정량하는 기술이다. ELISA는 극히 범용성이 높은 기술이며, 또한 자동화 지원 환경도 정비되어 있기 때문에, 앞으로도 진단 기술로서는 골든 스탠다드가 될 것으로 예상된다.
그러나, ELISA에는, 예를 들어 측정 대상을 직접 측정하지 않기 때문에, 이상값이 나오는 경우가 있다는 점, 또한 측정 대상마다 항체를 제작할 필요가 있어, 시간이나 비용이 든다는 점, 복수의 해석 대상을 동시에 측정할 수 없다는 점 등, 많은 과제가 존재한다. 특히 항체 의약에 관해서는, 내재성 항체와의 교차 반응도 발생하여, 정확한 측정이 어렵다. 또한, 중화 항체와 항원이 결합한 상태에서는 항원 인식 부위가 막혀, ELISA로 측정할 수 없는 경우도 많다.
또한, 동물 시험 페이즈에서 채용된 ELISA의 분석 조건에서는, 종간 교차의 문제 때문에 그대로 대형 동물이나 인간에게는 응용할 수 없는 경우도 종종 있다. 즉, 창약 개발 단계와 인간 임상 시험에서는, 별개의 측정 조건에서 비교하지 않을 수 없다. 병변 조직 중의 약제 농도의 ELISA에서는, 검출을 저해하는 매트릭스 성분이 상이하기 때문에, ELISA 베이스에서 약물 동태를 행하기 위해서는, 복수의 항체의 제작이 필요해져 버린다. 이것은, 방대한 비용이나 후기 개발에 있어서의 드롭 아웃 등, 매우 큰 리스크를 내포하고 있다.
한편, 질량 분석을 사용한 단백질의 정량 및 구조 해석은, 질량 분석 기술이나 데이터 해석 서버ㆍ소프트웨어의 발전과 함께, 비약적으로 그 응용 범위를 확대하고 있다. 특히, 질량 분석을 사용한 절대 정량 기술은, 특이적 항체에 의존하지 않는 방법으로서, 인식도가 높아지고 있다.
예를 들어, 시판 항체가 없는 단백질을 정량하는 경우, 종래에는 단백질을 대량으로 정제할 필요가 있었지만, 질량 분석을 사용함으로써, 이 스텝이 생략되기 때문에, 비약적으로 효율적으로 되었다. 의학 분야에서도, 종래에는 병리 절편을 얇게 자르는 방법, 보존 방법 등 의사 기술의 오차, 시설 간 차이 등의 문제로, 면역 조직 염색에 차가 생겨 버려, 양성, 위양성, 음성의 판정이 어려운 경우는 종종 일어날 수 있었다. 이에 비해 병리 절편 중의 목적 병원 단백질을 질량 분석으로 정량함으로써, 고발현 단백질인지 여부의 판정이 가능하다. 또한, 요즘에는, 레이저 현미해부라고 불리는, 세포 하나를 잘라내 주는 장치를 범용적으로 사용할 수 있는 상황에 있다. 예를 들어, 암 세포만을 회수하고, 그 세포 내의 병원 단백질의 발현 변동 해석을, 질량 분석으로 직접 관찰하는 것이 가능하게 된다. 이것은 특히 병리나 임상의 현장에서 극히 획기적인 기술 혁신이며, 분석 기술의 표준화 등의 정비가 요망되고 있는 상황이다.
정밀도가 높은 분석 기술인 한편, 생물학적 샘플 중의 단백질을 질량 분석에 의해 검출하는 경우에는, 측정 대상의 단백질을 프로테아제 소화하여 단편화하는 경우가 많기 때문에, 협잡물을 포함하는 다양한 펩티드 단편으로부터 목적으로 하는 펩티드 단편을 효율적으로 선택하는 것이 중요해지고 있다.
특허문헌 1에서는, 샘플 중의 항체의 검출을 위해, 펩신을 사용하여 비면역 글로불린 단백질의 분해와 함께 항체를 소화하여 F(ab')2 단편을 산생시킨 후에 추가로 트립신 소화를 행하는 것이 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 2는, 질량 분석에 선행하는 액체 크로마토그래피 단계에서 적절하게 분리된 펩티드만을 정량 대상으로서 선택한다고 하는 것이다. 비특허문헌 1은 항 펩티드 항체를 사용하여 측정 대상 펩티드를 농축한다고 하는 것이다.
또한, 최근, 프로테아제 소화의 고효율화 방법으로서, 나노 입자 등의 미소 환경(마이크로 리액터) 내에서, 프로테아제 소화를 행하는 방법이 주목받고 있다. 예를 들어, 비특허문헌 2에서는, 세공 내에 트립신을 고정한 메소 다공 실리카를 사용함으로써, 분자량이 작은 단백질을 선택적으로 트립신 소화할 수 있다는 것이 보고되어 있다. 비특허문헌 3에서는, 나일론막에 트립신을 고정화하고, 단백질의 트립신 소화를 고효율화한 예가 보고되어 있다. 이들 방법은 모두, 다공질체의 세공 내에 프로테아제를 고정화하고, 고상 표면의 프로테아제와 액상 내의 기질 단백질을 반응시키는 것이다.
비특허문헌 4는, 샘플 중의 모노클로날 항체와 내재성 항체를 식별하기 위한 하이 스루풋법을 제안하는 것이다.
파라핀 포매된 병리 절편으로부터의 단백질 회수는, 애질런트, AMR, 퀴아젠 등으로부터 키트로서 판매되고 있다. 또한, 병리 절편으로부터의 암 세포 레이저 현미해부에 의한 회수, 탈 파라핀 처리, 단백질 추출 및 소화를 거쳐, 질량 분석에 의한 병변 단백질의 정량과 임상 상관에 대하여 발표되어 있다.
일본 특허 공표 제2010-515020호 일본 특허 공개 제2012-197258호
N. Leigh Anderson 등, Mass Spectrometric Quantitation of Peptides and Proteins Using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies(SISCAPA), Journal of Proteome Research, 2004, 3(2), 235 Qianhao Min 등, Size-selective proteolysis on mesoporous silica-based trypsin nanoreactor for low-MW proteome analysis, Chemical Communications, 2010, 46, 6144 Fei Xu 등, Facile Trypsin Immobilization in Polymeric Membranes for Rapid, Efficient Protein Digestion, Analytical Chemistry, Analytical Chemistry, 2010, 82, 10045 Xiaotao Duan 등, High-Throughput Method Development for Sensitive, Accurate, and Reproducible Quantification of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Tissues Using Orthogonal Array Optimization and Nano Liquid Chromatography/Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry, Analytical Chemistry, 2012, 84, 4373 N. Iwamoto 등, Selective detection of complementarity determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate: nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis, Analyst, 2014, 139, 576
질량 분석법에 의해, 단백질을 간편하게 검출ㆍ정량하기 위해서는, 측정 대상의 단백질을 위치 선택적으로 절단하고, 그 단백질에 특이적인 펩티드 단편을 효율적으로 산생시키고, 다른 펩티드 단편의 산생량을 작게 할 것이 요구된다. 따라서, 항체의 경우에는, Fab 도메인, 특히 Fab 도메인의 가변 영역을 위치 선택적으로 소화하고, 한편 Fc 도메인의 소화를 억제할 필요가 있다.
본 발명자들은, 기질이 되는 항체와 프로테아제 효소의 양쪽을 고상으로 고정화함으로써, 모노클로날 항체의 위치 선택적인 프로테아제 소화를 실현할 수 있었다(N. Iwamoto 등, Selective detection of complementarity determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate: nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis, Analyst, 2014, 139, 576)(비특허문헌 5). 이 방법은, 측정 대상의 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 속에서 접촉시켜 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 검출하는 것이다. 프로테아제로서는 트립신과 리실 엔도펩티다아제(Lys-C)를 9:1의 비율로 사용하는 이중 소화가 가장 효율적이라고 보고하였다.
상기 방법은 고상-고상 반응을 사용하여 모노클로날 항체의 선택적인 프로테아제 소화를 행하는 획기적인 방법이지만, 실제로 사용하기 위해서는 더 검토할 여지를 남기고 있다.
본 발명의 과제는, 항체의 다양성이나, 종간 차, 매트릭스 등의 영향을 받지 않는, 극히 범용성이 높은 분석 방법을 제공하기 위한, 샘플 조제용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 염두에 두고 예의 검토한 결과, 측정자의 기능에 의존하지 않고 고정밀도이면서도 간편한 분석을 가능하게 하기 위해, 질량 분석에 의해 검출하는 펩티드의 조제를 위한 조건을 여러 가지 검토하고, 최적 조건을 충족하는 키트를 제공하는 것을 검토하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 모노클로날 항체를 검출하기 위한 샘플 조제용 키트이며,
측정 대상의 모노클로날 항체를 고정화하기 위한 다공질체와,
프로테아제를 고정화한 나노 입자와,
상기 다공질체와 상기 나노 입자를 접촉시켜 모노클로날 항체를 선택적으로 소화하기 위한 반응 용기와,
상기 나노 입자 및 다공질체와 함께 상기 반응 용기 내에 도입되고, 상기 프로테아제에 의한 소화 반응을 시키기 위한 완충액과,
상기 소화 반응 후에 상기 다공질체 및 상기 나노 입자를 제거하여, 상기 소화 반응의 생성물을 상기 완충액과 함께 추출하기 위한 여과막을 포함하는, 상기 키트.
(2) 상기 여과막이, 압력 또는 원심력을 가하지 않는 조건 하에서는 상기 완충액 및 상기 프로테아제에 의한 소화 반응에 의해 생성되는 펩티드를 거의 투과하지 않고, 압력 또는 원심력을 가한 조건 하에서는 상기 완충액 및 상기 펩티드를 투과할 수 있는 것인, (1)에 기재된 키트.
(3) 상기 여과막이 폴리불화비닐리덴(PVDF)제의 막인, (1) 또는 (2)에 기재된 키트.
(4) 상기 키트가 다검체를 동시에 처리하기 위한 키트이며, 상기 여과막의 하우징 소재가 폴리아크릴로니트릴 수지인, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 키트.
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 키트에, 추가로 모노클로날 항체의 검출을 위한 질량 분석 조건을 기재한 설명서를 포함하는, 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의한 모노클로날 항체 검출을 위한 키트.
(6) 측정 대상이 되는 모노클로날 항체에 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 내부 표준 펩티드를 더 포함하는, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 키트.
(7) 측정 대상이 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM1, 베바시주맙 또는 리툭시맙이며, 내부 표준 펩티드가 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드인, (6)에 기재된 키트.
(8) 측정 대상의 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 속에서 접촉시켜 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 분석함으로써 상기 모노클로날 항체의 검출을 행하는 방법에 사용하기 위한, 상기 질량 분석을 실행시키기 위한 데이터가 기록된 컴퓨터 판독가능한 기록 매체이며, 상기 데이터가, 상기 모노클로날 항체의 프로테아제 소화에 의해 얻어지는 펩티드 중 하나 이상에 대하여, 적어도 친 이온(parent ion), 프래그먼트 이온, 예상 유지 시간, 삼련 사중극의 각각에 있어서의 전압의 데이터를 포함하는, 상기 기록 매체.
(9) (8)에 기재된 기록 매체와, 상기 기록 매체의 사용 설명서를 포함하는, 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의한 모노클로날 항체의 검출을 위한 메소드 패키지.
(10) 상기 모노클로날 항체가 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM1, 베바시주맙, 리툭시맙 중 1종 이상인, (8)에 기재된 기록 매체 또는 (9)에 기재된 메소드 패키지.
(11) 상기 데이터가 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 대한 것인, (8)에 기재된 기록 매체 또는 (9)에 기재된 메소드 패키지.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본 특허 출원 번호 제2015-047729호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명의 키트는, 액체 크로마토그래프 질량 분석계(특히 삼련 사중극형)의 전처리용으로서 사용한다. 본 발명을 실시하기 위해 사용 가능한 질량 분석 장치로서는, 예를 들어 LCMS-8030, LCMS-8040, LCMS-8050 및 LCMS-8080(모두 시마즈 세이사쿠쇼사제)을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 키트를 사용하여 전처리한 샘플의 해석을 위해, LCMS-IT-TOF, LCMS-Q-TOF(시마즈 세이사쿠쇼사제)를 사용할 수도 있다.
도 1은, 본 발명의 키트를 사용하여 항체를 소화하는 방법의 원리를 도시한다.
도 2a는, 트라스투주맙 소화 단편의 검출을 위해 사용하는 여과막 소재의 검토 결과를 도시한다. 펩티드 회수율을 검증하기 위해, 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE) 및 폴리불화비닐리덴(polyVinylidene difluoride, PVDF)을 비교하였다. (A) 트라스투주맙 100.0㎍/㎖, (B) 트라스투주맙 33.3㎍/㎖.
도 2b는, 트라스투주맙 소화 단편의 검출을 위해 사용하는 여과막 소재의 검토 결과를 도시한다. 펩티드 회수율을 검증하기 위해, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리불화비닐리덴을 비교하였다. (C) 트라스투주맙 11.1㎍/㎖, (D) 트라스투주맙 3.7㎍/㎖.
도 2c는, 트라스투주맙 소화 단편의 검출을 위해 사용하는 여과막 소재의 검토 결과를 도시한다. 펩티드 회수율을 검증하기 위해, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리불화비닐리덴을 비교하였다. (E) 트라스투주맙 1.2㎍/㎖, (F) 트라스투주맙 0.4㎍/㎖.
도 3a는, 베바시주맙 소화 단편의 검출을 위해 사용하기 위한 여과막 소재의 검토 결과를 도시한다. 펩티드 회수율을 검증하기 위해, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리불화비닐리덴을 비교하였다. (A) 베바시주맙 100.0㎍/㎖, (B) 베바시주맙 33.3㎍/㎖.
도 3b는, 베바시주맙 소화 단편의 검출을 위해 사용하기 위한 여과막 소재의 검토 결과를 도시한다. 펩티드 회수율을 검증하기 위해, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리불화비닐리덴을 비교하였다. (C) 베바시주맙 11.1㎍/㎖, (D) 베바시주맙 3.7㎍/㎖.
도 3c는, 베바시주맙 소화 단편의 검출을 위해 사용하기 위한 여과막 소재의 검토 결과를 도시한다. 펩티드 회수율을 검증하기 위해, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리불화비닐리덴을 비교하였다. (E) 베바시주맙 1.2㎍/㎖, (F) 베바시주맙 0.4㎍/㎖.
도 4a는, 다검체의 검출을 위해 사용하는 여과막 플레이트의 펩티드 회수율을 검증하기 위해, 2개의 막 소재(PTFE, PVDF) 및 하우징 3종을 비교한 결과를 도시한다. 펩티드로서 (A) FTISADTSK(서열 번호 3), (B) ASQDVNTAVAWYQQKPGK(서열 번호 47)를 각각 사용하였다.
도 4b는, 다검체의 검출을 위해 사용하는 여과막 플레이트의 펩티드 회수율을 검증하기 위해, 2개의 막 소재(PTFE, PVDF) 및 하우징 3종을 비교한 결과를 도시한다. 펩티드로서 (C) GLEWVAR(서열 번호 6), (D) DTYIHWVR(서열 번호 5)을 각각 사용하였다.
도 5는, 본 발명의 방법에 사용하는 나노 입자의 경시적 안정성을 도시한 것이다. (A) 트립신 기질의 절단에 의해 증가하는 p-니트로아닐린의 흡광도. 종축: 405nm에 있어서의 흡광도, 횡축: 반응 시간(분), (B) 효소 활성.
도 6은, 본 발명의 방법에 사용하는 나노 입자의 경시적 안정성을 도시한다. (A) -20℃ 보존의 경우, (B) 4℃ 보존의 경우를 각각 도시한다.
본 발명은, 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 모노클로날 항체를 검출하기 위한 샘플 조제용 키트이며,
측정 대상의 모노클로날 항체를 고정화하기 위한 다공질체와,
프로테아제를 고정화한 나노 입자와,
상기 다공질체와 상기 나노 입자를 접촉시켜 모노클로날 항체를 선택적으로 소화하기 위한 반응 용기와,
상기 나노 입자 및 다공질체와 함께 상기 반응 용기 내에 도입되고, 상기 프로테아제에 의한 소화 반응을 시키기 위한 완충액과,
상기 소화 반응 후에 상기 다공질체 및 상기 나노 입자를 제거하여, 상기 소화 반응의 생성물을 상기 완충액과 함께 추출하기 위한 여과막을 포함하는, 상기 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트를 사용하여 모노클로날 항체를 소화하는 방법의 원리를 도 1에 도시한다. 이하, 본 발명을, 상기 방법과 관련지어 구체적으로 설명한다.
<질량 분석의 개요>
질량 분석을 사용한 정량 기술은, 최근에는 주로 삼련 사중극이라고 불리는 하이브리드형 질량 분석 장치에 의해 행해진다. 구체적으로는, 이온화된 생체 분자는, 우선 팔중극이라고 불리는 부분을 통과함으로써, 그 이온 분자 진동 반경을 작게 한다. 다음으로 제1 사중극 중에서, 특정한 질량수를 갖는 이온을 공진시킴으로써 선택하고, 다른 이온을 배제한다. 이 스텝은 싱글 이온 모니터링(single ion monitoring, SIM)이라고도 불린다.
선택된 이온은 제2 사중극에 운반되어, 아르곤과 충돌함으로써 개열이 행해진다. 이 반응은 충돌 유기 해리(collision-induced dissociation, CID)라고 한다. 이 개열 반응 결과, 생성된 특이적인 단편을 제3 사중극에서 선택함으로써, 매우 고감도이며, 또한 고선택적인 정량이 가능하게 된다. 이 일련의 분석을 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring, MRM)이라고 칭한다.
질량 분석을 사용한 생체 시료의 정량은, 생체 분자의 구조 특이적인 이온을 지표로 정량할 수 있다고 하는 최대의 이점이 있으며, 이것을 고속 액체 크로마토그래프에 연결함으로써, 연속적 해석을 가능하게 할 수 있다. 현존하는 분석 기기 중에서, 거의 유일하다고 해도 좋을 이점을 갖는 기술이다.
질량 분석에 의해 항체를 검출하기 위해서는, 우선 혈액이나 조직 등의 생체 시료로부터 항체를 추출하고, 적절한 용매에 용해하는 것이 필요하다. 또한, 항체는 그대로 분석하기에는 분자가 크기 때문에, 프로테아제에 의해 펩티드로 분해하고, 그 후 액체 크로마토그래프로 분리한 후에 질량 분석을 행한다. 분석에 적합한 펩티드의 분자량은 약 1000 내지 3000Da 정도이다.
그러나, 일반적인 단백질 분자를 프로테아제 분해하면, 펩티드 단편이 약 100개 정도, 항체의 경우에는 200개를 훨씬 초과하는 펩티드 단편이 생성된다. 따라서, 단일의 단백질만으로도 측정 대상수는 방대하게 되어, 복잡한 생체 시료를 대상으로 한 경우에는, 거대한 샘플 세트로 된다.
또한, 항체 분자에서는, CDR 영역 등의 극히 일부의 서열만이 상이하고, 남은 부분은 공통 서열이기 때문에, 상기의 거대하고 복잡한 샘플로부터, 목적으로 하는 특이적 서열만을 분석, 정량하기 위해서는, 질량 분석 스텝 전에 고분리능 및 재현성이 좋은 액체 크로마토그래프가 필수로 된다. 현재는 초고속ㆍ고압 크로마토그래프 기기가 있으며, 그것에 대응한, 입경이 균일하고 매우 미세한 칼럼 수지 등도 개발되고 있으며, 이러한 고속, 고분리, 내고압 칼럼을 사용함으로써, 비약적으로 분리능 향상이 도모되게 되었다. 그러나, 프로테오믹스 등, 단백질 세트를 대상으로 하는 연구 분야에 있어서는 아직 충분하다고는 할 수 없는 현상이 있다.
또한, 고정밀도의 질량 분석에 의한 해석에 있어서의 과제로서, 「매트릭스 효과」라고 하는 것이 있다. 매트릭스 효과란, 동일한 액적 내에 이온화 저해 물질이 존재하거나, 혹은 동시에 다종의 이온이 존재함으로써, 목적 물질의 이온화 효율이 저감해 버리는 현상이다. 이온화에 제공되는 에너지는 동등하므로, 이온화 대상 물질이 증가하면, 필연적으로 에너지가 분산되어, 이온량이 감소되어 버린다.
해석 대상 펩티드의 개수가 증가하면, 칼럼 분리로 완전히 분리하기는 곤란하다. 따라서, 매트릭스 효과에 의한 이온화 효율의 저하, 결과적으로는 감도나 정량 재현성의 저하를 야기하는 요인이 된다. 이것을 개선하기 위해 질량 분석측에서, 고속 채널 전환 기능 등을 만들어 개선을 도모하고 있지만, 근본적으로는 모집단의 저감을 하지 않는 한, 이 매트릭스 효과를 극복할 수는 없다.
상기와 같은 여러 가지 문제점을 고려하여, 본 발명은 측정 대상의 특이성을 유지하면서, 해석 대상의 모집단을 저감시키는 것을 의도하는 것이다.
<항체>
본 발명의 키트를 사용하여 LC-MS에 의한 검출을 위한 샘플을 조제하는 측정 대상은 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는, 2개의 중쇄(분자량 50kDa)와 2개의 경쇄(분자량 25kDa)가 디술피드 결합으로 연결된 구조를 갖는 생체 고분자이다. Fab 도메인과 Fc 도메인이 힌지를 통하여 연결되어 있고, 또한 중쇄 및 경쇄는 각각 정상 영역과 가변 영역을 포함한다. 정상 영역은, 항체의 특징적인 Y자형의 형태를 유지하는 구조(프레임워크 구조)를 갖고, 동일종 유래의 항체의 대부분에서 공통된 아미노산 서열을 갖고 있다. 한편, 가변 영역에는, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, CDR)이라고 불리는 특이적인 서열을 갖는 부위가 각 3개씩 존재한다. 이 CDR(CDR1, CDR2, CDR3) 영역이 규정하는 입체 구조가 항원과의 특이적 결합에 관련되어 있으며, 그에 의해 항체-항원 복합체가 형성된다.
항체의 고차 구조에서 더 특징적인 것은, 리지드한 구조를 갖는 정상 영역에 비하여, 매우 플렉시블한 힌지 및 가변 영역이다. 중쇄의 C 말단에는 Protein A나 Protein G라고 불리는 특정한 단백질이 결합하는 부위가 존재한다는 것을 알 수 있다.
최근에는, 여러 가지 질환에 대하여 특이적으로 작용할 수 있는 항체 의약으로서, 수많은 모노클로날 항체가 개발되고 있다. 측정 대상이 될 수 있는 모노클로날 항체로서는, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 파니투무맙, 오파투무맙, 골리무맙, 이필리무맙 등의 인간 항체; 토실리주맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM1, 베바시주맙, 오말리주맙, 메폴리주맙, 겜투주맙, 팔리비주맙, 라니비주맙, 세르톨리주맙, 오크렐리주맙, 모가물리주맙, 에쿨리주맙 등의 인간화 항체; 리툭시맙, 세툭시맙, 인플릭시맙, 바실릭시맙 등의 키메라 항체 등을 들 수 있다. 또한, 모노클로날 항체의 분자 직경은 약 14.5nm이다.
또한, 모노클로날 항체의 특이성을 유지하면서 기능을 한층 더 부가한 복합체, 예를 들어 Fc 융합 단백질, 항체-약물 복합체(예를 들어 겜투주맙ㆍ오조가마이신, 트라스투주맙-엠탄신 등)도 본 발명의 방법에 있어서의 측정 대상의 모노클로날 항체에 포함시키기로 한다. 이 경우, 측정에 앞서 복합체의 결합을 해리시켜 항체만을 LC-MS에 제공해도 되고, 혹은 복합체의 형태인 채로 LC-MS에 제공할 수도 있다. 당업자라면, 본 명세서의 기재에 기초하여, 측정 대상에 따라 본 발명의 방법을 위한 최적의 조건을 설정할 수 있다.
본 발명의 키트는, 모노클로날 항체의 Fab 도메인을 위치 선택적으로 프로테아제 소화하고, 얻어진 펩티드 단편의 질량 분석에 의해, 항체의 동정이나 정량을 행하기 위해 사용하는 것이다.
<다공질체>
본 발명의 키트에 포함되는 다공질체는, 다수의 세공을 갖는 것이라면, 그 재료는 특별히 한정되지 않으며, 활성탄, 다공질막, 다공질 수지 비즈, 금속 입자 등을 사용할 수 있다. 이들 중에서도, 항체를 부위 특이적으로 결합 가능한 것이 특히 바람직하다.
도 1에서는, 반구 형상의 세공이 도시되어 있지만, 세공의 형상은 특별히 한정되지 않는다. 또한, 다공질막과 같이, 다공질체를 관통하는 세공이 형성된 것을 사용할 수도 있다. 다공질체의 세공의 크기는 특별히 한정되지 않으며, 항체를 고정화하였을 때, 세공의 표층 부근에 선택적으로 소화되어야 할 부위가 위치하도록, 항체의 분자 직경 등을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 다공질체의 평균 세공 직경 D2는, 10nm 내지 200nm 정도의 범위이며, 또한 나노 입자의 평균 입경 D1보다 작은 범위에서 적절하게 설정된다. 다공질체의 평균 세공 직경 D2는, 예를 들어 20nm 내지 200nm 정도가 바람직하고, 30nm 내지 150nm 정도가 보다 바람직하다. 항체의 Fc 도메인을 세공 내에 고정화하고, Fab 도메인을 위치 선택적으로 프로테아제 소화하기 위해서는, 다공질체의 세공 직경은, 30nm 내지 150nm가 바람직하고, 40nm 내지 120nm가 보다 바람직하고, 50nm 내지 100nm, 특히 약 100nm가 더욱 바람직하다.
본 발명에 관한 방법은, 측정 대상의 모노클로날 항체를 다공질체의 세공 내에 고정화한다. 세공 내에 항체를 고정화하고, 고상과 액상의 계면이라고 하는 미세한 환경에 존재시킴으로써, 항체는 변성을 일으키기 쉽고, 분자의 요동이 섭동을 받아, 프로테아제의 어택을 받을 확률이 향상된다. 또한, 본 발명에서는, 후술하는 바와 같이 프로테아제가 나노 입자에 고정화됨으로써, 입체적으로 안정되고, 자기 소화가 발생하기 어려운 환경으로 되므로, 프로테아제의 안정성이 증가한다고 생각된다. 그 때문에, 본 발명의 방법에 따르면, 위치 선택적인 프로테아제 소화가 가능하게 되는 것에 추가하여, 프로테아제의 고활성을 유지할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 다공질체의 세공 내에, 항체와 부위 특이적으로 상호 작용하는 링커 분자가 고정화된 것이 바람직하게 사용된다. 항체와 링커 분자의 상호 작용으로서는, 화학 결합, 수소 결합, 이온 결합, 착체 형성, 소수적 상호 작용, 반데르발스 상호 작용, 정전적 상호 작용, 입체 선택적 상호 작용 등을 들 수 있다.
링커 분자로서는, 항체의 Fc 도메인과 부위 특이적으로 결합하는 Protein A나 Protein G 등이 바람직하게 사용된다. 세공 내에 이들 링커 분자가 고정화된 다공질체를 사용함으로써, 세공 내에 항체의 Fc 도메인이 고정화되고, Fab 도메인이 세공의 표층 부근에 위치한다. 이와 같이, 세공 내에서의 항체의 배향이 제어됨으로써, 프로테아제에 의한 Fab 도메인의 위치 선택적 소화가 가능하게 된다.
링커 분자의 크기는, 항체의 선택적 절단 부위가 세공의 표층 부근에 위치하도록 선택된다. 링커 분자와 항체가 결합한 상태의 분자 사이즈는, 다공질체의 세공 직경의 0.5배 내지 1.5배 정도가 바람직하고, 0.6배 내지 1.2배 정도가 보다 바람직하고, 0.7배 내지 1.1배 정도가 더욱 바람직하고, 0.8배 내지 1배 정도가 특히 바람직하다. 또한, 다공질체에 링커 분자가 고정되어 있지 않고, 세공 내에 항체를 직접 결합시키는 경우에는, 항체의 분자 직경과 다공질체의 세공 직경이 상기 관계를 충족하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 적합하게 사용 가능한 다공질체로서, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 Protein G Ultralink 수지(Pierce사제), 도요펄, TSKgel(TOSOH사제) 등을 들 수 있다. 예를 들어 Protein G Ultralink 수지에서는, 수지에 결합한 Protein G의 95％는 세공 내에 있음을 알 수 있다.
<다공질체에 대한 항체의 고정화>
항체를 다공질체의 세공 내에 고정화하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 항체와 다공질체 혹은 링커 분자의 특성 등에 따라 적절한 방법을 채용할 수 있다. 예를 들어, 세공 내에 protein A나 protein G가 고정화된 다공질체에 항체를 고정화하는 경우에는, 다공질체의 현탁액과 항체를 포함하는 용액을 혼합함으로써, 세공 내에 항체를 용이하게 고정화할 수 있다.
다공질체와 항체의 양비는, 목적에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들어, 항체의 정량 분석을 행하는 경우, 시료 중의 항체의 거의 전량이 다공질체에 고정화될 것이 요망된다. 그 때문에, 시료 중의 항체의 추정 함유량에 대하여, 다공질체의 양이 과잉으로 되도록 양비를 설정하는 것이 바람직하다.
<나노 입자>
본 발명의 키트에 포함되는 나노 입자는, 그 표면에 프로테아제를 고정화하여, 다공질체의 세공 내에 고정화된 항체에 대한 프로테아제의 액세스를 제어할 목적으로 사용된다. 그 때문에, 나노 입자는, 다공질체의 세공의 안쪽 깊이까지 들어가지 않도록, 그 평균 입경 D1이, 다공질체의 평균 세공 직경 D2보다 큰 것으로 한다(도 1).
나노 입자의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 다공질체의 세공에 대한 프로테아제의 액세스의 균일화의 관점에서, 구상의 나노 입자가 바람직하다. 또한, 나노 입자는 분산성이 높고, 평균 입경이 균일한 것이 바람직하다.
나노 입자의 평균 입경 D1은, 50nm 내지 500nm의 범위이며, 다공질체의 평균 세공 직경 D2의 1.2배 이상이 보다 바람직하고, 1.5배 이상이 더욱 바람직하고, 1.8배 이상, 예를 들어 약 2배가 특히 바람직하다. 예를 들어 다공질체의 평균 세공 직경이 30 내지 150nm 정도인 경우, 나노 입자의 평균 입경 D1은 100nm 이상이 바람직하고, 150nm 이상이 보다 바람직하다. 다공질체의 평균 세공 직경이 50nm 내지 100nm 정도인 경우, 나노 입자의 평균 입경은, 120nm 이상이 바람직하고, 150nm 이상이 보다 바람직하고, 170nm 이상이 특히 바람직하다. 나노 입자의 평균 입경 D1의 상한은, 프로테아제에 의한 소화 효율을 높인다는 관점에서 500nm 이하가 바람직하고, 300nm 이하가 더욱 바람직하다.
나노 입자는, 상기의 프로테아제를 표면에 고정화할 수 있는 것이라면, 그 재질은 특별히 한정되지 않고, 금속이나 수지 등이 적절하게 사용된다. 또한, 금속 표면을 수지로 피복한 것이나, 수지 표면을 금속으로 피복한 것 등을 사용할 수도 있다.
나노 입자의 종류로서는, 수성 매체에 분산 또는 현탁할 수 있고, 분산액 또는 현탁액으로부터 자기 분리 또는 자성 침전 분리에 의해 용이하게 회수할 수 있는 자기 나노 입자가 바람직하다. 또한, 응집이 일어나기 어렵다고 하는 점에 있어서, 그 표면이 유기 중합체로 피복된 자기 나노 입자가 보다 바람직하다. 자기 나노 입자의 기재로서는, 산화철(마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(γ-Fe2O3)), 페라이트 (Fe/M)3O4 등의 강자성 합금을 들 수 있다. 페라이트 (Fe/M)3O4에 있어서, M은 철 이온과 함께 사용하여 자성 금속 산화물을 형성할 수 있는 금속 이온을 의미하며, 전형적으로는 Co2 +, Ni2 +, Mn2 +, Mg2 +, Cu2 +, Ni2 + 등이 사용된다. 또한, 자기 나노 입자를 피복하는 유기 중합체로서는, 폴리글리시딜메타크릴레이트(폴리GMA), GMA와 스티렌의 공중합체, 폴리메타크릴산메틸(PMMA), 폴리아크릴산메틸(PMA) 등을 들 수 있다. 유기 중합체로 피복된 자성 나노 비즈의 구체례로서는, FG 비즈, SG 비즈, Adembeads, nanomag 등을 들 수 있다. 시판품으로서는, 예를 들어 다마가와 세이키 가부시키가이샤제의 FG beads(페라이트 입자를 폴리글리시딜메타크릴레이트(폴리GMA)로 피복한 입경 약 200nm의 중합체 자성 나노 입자)가 적합하게 사용된다.
상기 나노 입자는, 비특이적인 단백질의 흡착 억제와, 프로테아제의 선택적인 고정화를 위해, 프로테아제와 결합 가능한 스페이서 분자로 수식되어 있는 것이 바람직하다. 스페이서 분자를 통하여 프로테아제를 고정화함으로써, 나노 입자 표면으로부터의 프로테아제의 탈리가 억제되고, 프로테아제 소화의 위치 선택성이 높아진다. 또한, 스페이서의 분자 사이즈를 조정함으로써, 항체의 원하는 위치에 프로테아제를 선택적으로 액세스시켜, 위치 선택성을 높일 수도 있다.
스페이서는, 프로테아제와 결합 가능하며, 또한 프로테아제를 실활시키지 않는 것이 바람직하다. 나노 입자 표면에 고정화된 프로테아제의 액세스 범위를 제어한다는 관점에서, 스페이서는 분자 직경이 작은 것이 바람직하다. 스페이서의 분자 직경은, 5nm 이하가 바람직하고, 3nm 이하가 보다 바람직하고, 2nm 이하가 더욱 바람직하다. 또한, 스페이서의 분자량은 2000 이하가 바람직하고, 1500 이하가 보다 바람직하고, 1000 이하가 더욱 바람직하다.
상기 분자 직경이며 프로테아제를 고정화할 수 있는 스페이서 분자는 비단백질이 바람직하고, 말단에 아미노기, 카르복실기, 에스테르기, 에폭시기, 토실 기, 히드록실기, 티올기, 알데히드기, 말레이미드기, 숙신이미드기, 아지드기, 비오틴, 아비딘, 킬레이트 등의 관능기를 갖는 분자가 바람직하다. 예를 들어, 트립신의 고정에는, 활성화된 에스테르기를 갖는 스페이서 분자가 바람직하다. 또한, 스페이서 분자 중, 상기 관능기 이외의 스페이서 아암 부분은, 폴리에틸렌글리콜 및 그의 유도체, 폴리프로필렌글리콜 및 그의 유도체, 폴리아크릴아미드 및 그의 유도체, 폴리에틸렌이민 및 그의 유도체, 폴리(에틸렌옥시드) 및 그의 유도체, 폴리(에틸렌테레프탈산) 및 그의 유도체 등의 친수성 분자가 사용된다.
이러한 스페이서 분자로 표면 수식된 나노 입자도 또한 시판되고 있으며, 그것들을 이용하면 된다. 예를 들어, N-히드록시숙신이미드로 활성화된 에스테르기(활성 에스테르기)를 갖는 스페이서 분자로 수식된 나노 입자는, 상품명 「FG beads NHS」(다마가와 세이키 가부시키가이샤)로서 시판되고 있다. FG beads NHS의 입자 직경은 약 200nm±20nm이며, 나노 입자로서 매우 균질의 것이다.
본 발명의 키트는, 상기의 나노 입자에 프로테아제를 고정화시킨 것을 포함하는 것이 좋다. 그러나, 나노 입자와 프로테아제를 별개로 제공하고, 사용 전에 고정화하는 형태를 기도할 수도 있다.
<프로테아제>
본 발명에 관한 방법은, 프로테아제가, 다공질체의 세공 내에 고정화된 항체를 특정한 아미노산 서열 부위에서 절단하여 펩티드 단편을 발생시키는 것이다.
프로테아제는, 단독으로, 혹은 나노 입자의 표면에 고정화된 상태에서 키트에 포함시킬 수 있다.
본 발명에 있어서 나노 입자에 고정화시키는 프로테아제의 종류는, 질량 분석에 의한 정량 또는 동정의 대상이 되는 단백질의 종류에 따라 적절히 선택하면 되며, 한정되지는 않지만, 예를 들어 트립신, 키모트립신, 리실 엔도펩티다아제, V8 프로테아제, AspN 프로테아제(Asp-N), ArgC 프로테아제(Arg-C), 파파인, 펩신, 디펩티딜펩티다아제 등을 들 수 있다. 프로테아제는 2종 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.
상기 프로테아제 중에서도, 본 발명에 있어서는 트립신이 특히 바람직하게 사용된다. 트립신은 기질 특이성이 높고, 또한 절단 후의 펩티드의 C 말단에 Lys 또는 Arg가 있기 때문에 펩티드의 전하량 및 전하 국재를 균질하게 할 수 있어, 질량 분석을 위한 시료 제작을 위해 특히 적합하다. 또한, 트립신은 분자 직경이 작고(약 3.8nm), 또한 활성 부위가 분자의 내부에 존재하고 있다. 그 때문에, 활성 부위가 항체에 액세스할 수 있는 영역이 제한되어, 프로테아제 소화의 위치 선택성을 높일 수 있다.
프로테아제 소화 후의 항체의 펩티드 단편을 측정 자료로서 질량 분석에 제공하는 경우에는, 자기 소화가 적고, 절단 서열의 선택성이 높은 프로테아제를 사용하는 것이 바람직하다. 시판 중인 프로테아제를 사용하는 경우, 질량 분석 등급이나 서열 결정(시퀀스) 등급의 프로테아제를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 생체 유래의 네이티브 트립신은, 자기 소화 활성이 높거나, 키모트립신-유사의 활성을 나타내는 트립신이 포함되어 있기 때문에, 절단 부위의 특이성이 낮다는 것이 알려져 있다. 그 때문에, 질량 분석 등급으로서, 트립신의 리신 잔기를 환원 메틸화하여 자기 소화에 대한 저항성을 높인 것이 시판되고 있다.
본 발명의 방법에 있어서 적합하게 사용할 수 있는 프로테아제로서, 예를 들어 Trypsin Gold(프로메가사제), Trypsin TPCK-treated(Sigma Aldrich사제)를 들 수 있다.
<나노 입자에 대한 프로테아제의 고정화>
프로테아제를 나노 입자의 표면에 고정화하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 프로테아제와 나노 입자(혹은 나노 입자 표면을 수식하는 스페이서 분자)의 특성 등에 따라 적절한 방법을 채용할 수 있으며, 예를 들어 프로테아제를 스페이서 수식된 나노 입자 표면에 고정화하는 경우에는, 나노 입자의 현탁액과 프로테아제를 포함하는 용액을 혼합함으로써, 나노 입자 표면에 프로테아제를 고정화할 수 있다. 상기의 스페이서 분자의 관능기를 통한 나노 입자와 프로테아제의 아민 커플링법이 바람직하다. 예를 들어, 나노 입자에 표면 수식한 카르복실기를 N-히드록시숙신이미드(NHS)로 에스테르화하여 활성화 에스테르기로 하고, 이것에 프로테아제의 아미노기를 결합시킬 수 있다. 이 커플링 반응은, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDAC), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 비스(2,6-디이소프로필페닐)카르보디이미드(DIPC) 등의 카르보디이미드를 축합제의 존재 하에 행할 수 있다. 또한, 나노 입자에 표면 수식한 아미노기에, 글루타르알데히드, 2관능성 숙신이미드, 비스(술포숙신이미딜)수베레이트(BS3), 술포닐 클로라이드, 말레이미드, 피리딜디술피드 등의 가교제를 사용하여 프로테아제의 아미노기를 결합시켜도 된다.
스페이서 분자의 관능기를 통한 나노 입자와 프로테아제의 커플링법은, 나노 입자의 현탁액에 프로테아제 용액을 첨가하고, 일정한 조건 하에서 혼합 교반한다고 하는 간편한 조작으로 행할 수 있다.
나노 입자 표면에 프로테아제를 고정화한 후에, 나노 입자 표면의 프로테아제와 미결합의 활성 부분을 불활성화시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 나노 입자 표면에 프로테아제가 고정화되지 않은 스페이서 분자가 존재하면, 미결합의 스페이서 분자가, 시료 중의 협잡물 등과 결합하여, 프로테아제 소화에 악영향을 미치거나, 프로테아제 소화에 의해 산생된 펩티드 단편이 나노 입자에 고정화되는 등의 문제를 발생시키는 경우가 있다. 프로테아제를 고정화한 후에, 미결합의 스페이서 분자를 블록함으로써, 이러한 문제가 억제된다. 프로테아제와 미결합의 활성 부분을 불활성화하는 방법으로서는, 화학 수식이 바람직하다. 예를 들어, 활성화 에스테르기는, 1급 아민과의 반응에 의해 아미드 결합을 형성하여 불활성화시킬 수 있다.
<프로테아제 소화>
항체가 고정화된 다공질체와, 프로테아제가 표면에 고정화된 나노 입자를 액체 속에서 접촉시킴으로써, 항체가 프로테아제 소화되고, 펩티드 단편이 산생된다. 여기서, 「액체」란, 기질(고상) 및 효소(고상)가 액상 중에서 접촉하는 것을 의미하는 것이며, 또한 프로테아제 소화 반응에 적합한 수성 매체를 의도한다.
본 발명에 있어서의 프로테아제 소화의 조건은 특별히 한정되지 않으며, 일반적인 프로테아제 소화와 마찬가지의 조건을 적절하게 채용할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제의 최적 pH 근방으로 조정된 완충 용액 중에서, 통상 37℃ 정도의 온도에서, 1시간 내지 20시간 정도 인큐베이션하는 것이 바람직하다.
항체가 고정화된 다공질체와, 프로테아제가 표면에 고정화된 나노 입자의 혼합량비도 특별히 제한되지 않으며, 항체의 양에 따른 프로테아제량으로 되도록 설정하면 된다. 또한, 일반적인 프로테아제 소화 조건은, 기질:프로테아제=100:1 내지 20:1(중량비) 정도이다. 이에 비해, 본 발명에서는 다공질체와 나노 입자의 조합에 의해, 항체와 프로테아제의 액세스가 물리적으로 제한되기 때문에, 일반적인 프로테아제 소화에 비하여, 프로테아제량을 많게 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항체:프로테아제=30:1 내지 3:1 정도가 바람직하고, 15:1 내지 4:1 정도가 보다 바람직하고, 10:1 내지 5:1 정도가 더욱 바람직하다.
본 발명의 방법에서는, 다공질체에 항체를 고정화시킨 채의 상태로 프로테아제 소화가 행해진다. 프로테아제 소화에 의해 산생된 펩티드 단편은 액상 내에 존재하기 때문에, 항체의 용출이나 변성 조작을 행하지 않고, 위치 선택적으로 목적으로 하는 펩티드 단편이 얻어진다. 본 발명의 방법에 따르면, 종래법에 비하여 간편한 조작으로, 또한 위치 선택적으로 펩티드 단편의 회수를 행할 수 있다.
보다 구체적으로는, 예를 들어 세공 직경 100nm의 Protein G 수지 상에 항체의 C 말단측을 고정화하고, 항체의 가변 영역은 반드시 용액측으로 배향되도록 한다. 이어서, 입자 직경 200nm의 나노 입자 표면에 프로테아제를 고정화한다. 프로테아제의 항체에 대한 접촉을 제한함으로써, 가변 영역 선택적인 항체 분해 반응을 행하는 반응장을 형성하는 것이 가능하게 된다. 또한, 상대 표면적이 매우 큰 나노 입자 표면을 프로테아제 반응장으로서 사용함으로써, 항원과의 접촉 확률을 향상시키는 것이 가능하게 된다.
프로테아제 소화는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 완만한 회전에 의한 교반과 함께 정기적인 탭핑을 수반하는 탭핑 로테이션 하에서 행할 수 있다. 「완만한 회전」은, 예를 들어 3 내지 10rpm 정도의 회전수를 가리키고, 또한 「탭핑」은, 튕기는, 혹은 쇼크를 부여하는 순간 동작(빈도: 예를 들어, 1분간 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회)을 가리킨다. 이에 의해, 항체를 고정화한 다공질체와 프로테아제를 고정화한 나노 입자가 모두 분산 상태를 유지하면서 효과적으로 접촉하고, 프로테아제 소화 반응 효율을 높일 수 있다.
<다공질체 및 나노 입자의 제거>
프로테아제 소화에 의해 얻어진 목적으로 하는 펩티드 단편을 질량 분석에 제공하기 위해서는, 다공질체 및 나노 입자를 제거하는 것이 필요하다. 이것은 프로테아제 소화 후의 샘플에 대하여 여과, 원심 분리, 자기 분리, 투석 등의 조작을 행함으로써 달성할 수 있다.
여과에 의해 다공질체 및 나노 입자를 제거하는 경우, 사용하는 여과막의 구멍 직경은, 상기 다공질체 및 나노 입자를 통과할 수 없고, 또한 소화된 펩티드의 통과를 가능하게 하는 범위에서 선택된다. 예를 들어 폴리불화비닐리덴(PVDF)제의 여과막(Low-binding hydrophilic PVDF, 구멍 직경 0.2㎛, 밀리포어사제), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)제의 여과막(Low-binding hydrophilic PTFE, 구멍 직경 0.2㎛, 밀리포어사제) 등을 사용하여 여과함으로써, 다공질체 및 나노 입자를 간편하게 제거할 수 있다. 여과는, 원심 여과로 하면 신속하면서도 간편한 여과가 가능하다.
여과막은 한정되는 것은 아니지만, 원심 여과를 가능하게 하는 이중 구조의 필터 튜브 형태의 것을 적합하게 사용할 수 있다. 예를 들어 하나의 샘플의 조제를 위해서는 0.2㎛의 여과막 스핀 필터, 예를 들어 밀리포어 울트라프리 PVDF, 0.2㎛나 밀리포어 UFC30LG00 울트라프리 C3LCR, 0.2㎛를 사용하는 것이 적합하다. 또한, 복수의 샘플을 동시에 조제하기 위해서는 0.2㎛의 여과막 플레이트, 예를 들어 밀리포어 멀티스크린 PVDF, Barex, 0.2㎛를 적합하게 사용할 수 있다.
이들 튜브 형태의 여과막을 사용하는 경우, 튜브를 프로테아제 소화 반응을 위한 반응 용기로서 사용할 수 있다. 이 경우, 프로테아제를 고정화한 나노 입자와 항체를 고정화한 다공질체를, 반응을 위한 매체(완충액을 포함함)와 함께 튜브 내에 넣어 프로테아제 소화를 행할 수 있다. 혹은, 또한, 샘플 중의 항체의 다공질체에 대한 고정화를 튜브 내에서 행하고, 세정 조작을 행한 후에, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 첨가할 수도 있다. 당업자라면, 본 발명의 키트를 사용한 프로테아제 소화 반응, 다공질체 및 나노 입자의 제거 등의 일련의 조작 수순을 적절히 개변할 수 있다.
<액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)>
상기에서 얻어진 펩티드 단편을 포함하는 시료를, LC-MS에 의해 분석함으로써, 항체의 동정이나 정량을 행할 수 있다.
펩티드 단편의 분리를 보다 확실하게 하여 분석 정밀도를 높이는 등의 목적으로, 질량 분석에 제공하기 전의 시료를, 액체 크로마토그래프(LC)에 의해 분리ㆍ농축한다. LC에 의해 시료의 분리를 행하는 경우, LC로부터의 용출액을 직접 이온화하여 질량 분석에 제공해도 된다. LC와 탠덤 질량 분석을 조합한 LC/MS/MS나 LC/MSn에 의해 분석을 행할 수도 있다. 또한, LC로부터의 용출액을 한번 분취하고 나서, 질량 분석에 제공해도 된다. LC의 칼럼은 특별히 한정되지 않으며, 펩티드의 분석에 일반적으로 사용되는 C30, C18, C8, C4 등의 소수 칼럼이나, 친수성 어피니티 크로마토그래피용 담체 등을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
질량 분석은, 아미노산 서열을 결정 가능하기 때문에, 펩티드 단편이 항체 등의 특정한 단백질로부터 유래하는 펩티드 단편인지 여부를 판별 가능하다. 또한, 피크 강도에 기초하여 시료 중의 펩티드 단편의 농도를 결정할 수 있다. 본 발명에서는, 항체가 위치 선택적으로 프로테아제 처리되기 때문에, 시료 중에 포함되는 펩티드 단편의 종류가 감소되어 있다. 그 때문에, 질량 분석 등에 의한 분석 조건의 설정을 용이하게 이룰 수 있다. 분석 시에는, 필요에 따라, 탈염, 가용화, 추출, 농축, 건조 등의 처리를 행한 후, 시료를 분석에 사용해도 된다.
질량 분석에 있어서의 이온화법은 특별히 한정되지 않으며, 전자 이온화(EI)법, 화학 이온화(CI)법, 전계 탈리(FD)법, 고속 원자 충돌(FAB)법, 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화(MALDI)법, 일렉트로 스프레이 이온화(ESI)법 등을 채용할 수 있다. 이온화된 시료의 분석 방법도 특별히 한정되지 않으며, 자장 편향형, 사중극(Q)형, 이온 트랩(IT)형, 비행 시간(TOF)형, 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FT-ICR)형 등을, 이온화법에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 또한, 삼련 사중극형 질량 분석 장치 등을 사용하여, MS/MS 분석, 혹은 MS3 이상의 다단계 질량 분석을 행할 수도 있다.
본 발명의 방법의 사용에 있어서 특히 적합한 장치는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 LCMS-8030, LCMS-8040, LCMS-8050 및 LCMS-8080(모두 시마즈 세이사쿠쇼), LCMS-IT-TOF, LCMS-Q-TOF(시마즈 세이사쿠쇼)를 들 수 있다.
질량 분석 결과에 기초하여, 항체를 동정하기 위해, 기존의 데이터베이스를 사용할 수도 있다. 본 발명에서는, 항체가 위치 특이적으로 프로테아제 소화된 펩티드 단편이 사용되기 때문에, 데이터베이스 검색에 의한 히트율이나 데이터의 확실도가 높아진다. 또한, 다단계의 질량 분석 등에 의해, 펩티드 단편의 아미노산 서열을 특정함으로써, 항체를 동정할 수도 있다. 항체에 특이적인 아미노산 서열, 예를 들어 CDR2 영역의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 단편을 검출할 수 있다면, 목적으로 하는 항체를 동정ㆍ정량할 수 있다.
또한, 검출 결과에 기초하여, 항체의 동정이나 정량을 행하는 경우, 검출 대상의 펩티드는, 아미노산 잔기수가 5 내지 30 정도인 것이 바람직하고, 7 내지 25 정도가 보다 바람직하다. 아미노산 잔기수가 과도하게 작으면, 협잡물이나 동일 단백질의 다른 부위로부터 유래하는 펩티드 단편과의 구별이 가기 어렵고, 오검출 등의 원인이 될 수 있다. 또한, 아미노산 잔기수가 과도하게 크면, 이온화가 곤란해지는 등의 이유에 의해, 검출이 곤란해지거나, 정량성이 저하되는 경우가 있다.
항체의 농도를 정량하는 경우, 검출된 펩티드 단편 이온(다단계 MS의 경우에는, 친 이온의 개열에 의해 얻어진 프래그먼트 이온)의 피크 면적이나 피크 강도에 기초하여, 항체의 양을 산출할 수 있다. 예를 들어, 미리 구해진 검량선(교정 곡선)과 피크 면적의 관련짓기나, 시료 중에 첨가된 내부 표준으로부터 유래하는 피크 면적과 시료 유래의 피크 면적의 관련짓기 등에 의해, 시료 중의 펩티드 단편의 농도가 산출되고, 펩티드 단편 농도에 기초하여, 항체의 양이나 농도가 산출된다.
<본 발명의 샘플 조제용 키트>
본 발명은, 상기한 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 모노클로날 항체를 검출하는 방법에 있어서 사용하기 위한 샘플 조제용 키트이며,
측정 대상의 모노클로날 항체를 고정화하기 위한 다공질체와,
프로테아제를 고정화한 나노 입자와,
상기 다공질체와 상기 나노 입자를 접촉시켜 모노클로날 항체를 선택적으로 소화하기 위한 반응 용기와,
상기 나노 입자 및 다공질체와 함께 상기 반응 용기 내에 도입되고, 상기 프로테아제에 의한 소화 반응을 시키기 위한 완충액과,
상기 소화 반응 후에 상기 다공질체 및 상기 나노 입자를 제거하여, 상기 소화 반응의 생성물을 상기 완충액과 함께 추출하기 위한 여과막을 포함하는, 상기 키트에 관한 것이다.
질량 분석에 의한 측정은, 매우 고정밀도의 분석이 가능한 한편, 적절한 샘플 조제와 적정한 분석 조건의 설정이 매우 중요하다. 예를 들어 임상 장소에 있어서 보다 간편하게 정확한 검사 결과가 얻어지도록 하기 위해, 본 발명은 상기의 방법을 실시하기 위해 이용할 수 있는 샘플 조제용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 포함되는 다공질체 및 나노 입자는, 상기한 바와 같다. 반응 용기로서는, 다공질체에 고정화된 모노클로날 항체와, 나노 입자에 고정화된 프로테아제를 액상 중에서 접촉시키는 것이 가능한 용기라면 어느 것이어도 되며, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 질량 분석으로 검출하는 샘플 조제용인 것을 고려하면, 마이크로튜브나 플레이트로 하는 것이 바람직하다. 반응을 위해 행하는 보르텍스 또는 로테이터에 의한 혼합, 반응 후의 펩티드와 다공질체 및 나노 입자와의 분리를 위한 여과 등의 반응 공정을 고려하여, 당업자라면 적절한 반응 용기를 상정할 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 완충액은, 상기 나노 입자 및 다공질체와 함께 상기 반응 용기 내에 도입되고, 상기 프로테아제에 의한 소화 반응을 시키기 위한 것이며, 프로테아제 소화를 위해 적합한 반응 조건을 제공하는 것이다. 반응 조건은, 선택되는 프로테아제 등에 의해 적절히 결정할 수 있으며, 완충액의 조성도 적절히 결정할 수 있다.
본 발명의 키트는, 또한, 프로테아제 소화 반응 후에 상기 다공질체 및 상기 나노 입자를 제거하여, 소화 반응의 생성물을 상기 완충액과 함께 추출하기 위한 여과막을 포함한다. 프로테아제 소화에 의해 얻어진 목적으로 하는 펩티드 단편을 질량 분석에 제공하기 위해서는, 다공질체 및 나노 입자를 제거하는 것이 필요하다.
또한, 본 발명의 키트에 있어서의 여과막은, 압력 또는 원심력을 가하지 않는 조건 하에서는 완충액 및 프로테아제 소화에 의해 생성되는 펩티드를 거의 투과하지 않고 「반응 용기의 바닥」으로서 기능하고, 또한 원심 분리 등의 조작 시에는 완충액 및 펩티드를 투과할 수 있는 「체」로서 기능하는 것이면 바람직하다.
여과막이 완충액 및 펩티드를 투과할 수 있게 하기 위해 제공하는 원심 분리 조건으로서는, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 3,000 내지 10,000g의 범위가 바람직하다.
본 발명의 키트에 있어서 적합하게 사용 가능한 여과막으로서는, 예를 들어 폴리불화비닐리덴(PVDF)제 여과막(Low-binding hydrophilic PVDF, 구멍 직경 0.2㎛, 밀리포어사제)을 들 수 있다.
키트가 다검체를 동시에 처리하기 위한 키트인 경우, 예를 들어 여과막이 PVDF제이고, 하우징 소재가 폴리아크릴로니트릴 수지, 예를 들어 Barex(등록 상표)(미츠이 가가쿠 파인 가부시키가이샤제)인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 키트에는, 또한, 키트의 사용 방법, 및/또는 모노클로날 항체의 검출을 위한 질량 분석 조건을 기재한 설명서를 포함시킬 수 있다.
본 발명의 키트는, 또한, 하나 이상의 내부 표준 펩티드를 포함시킬 수 있다. 내부 표준 펩티드는, 검체와 동시에, 또는 별개로 동일한 조건에서 분석함으로써, 보다 확실한 분석 결과를 제공한다. 내부 표준 펩티드는, 측정 대상의 모노클로날 항체의 특이적 아미노산 서열을 포함하고, 본 발명의 키트에 포함되는 프로테아제에 의한 소화에 의해 발생하는 펩티드로 한다.
예를 들어 측정 대상이 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM1, 베바시주맙 또는 리툭시맙인 경우, 내부 표준 펩티드는 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드로부터 선택할 수 있다.
보다 구체적으로는, 측정 대상의 모노클로날 항체가 트라스투주맙 또는 트라스투주맙-DM1이며, 프로테아제가 Trypsin Gold(프로메가사제)인 경우, 내부 표준 펩티드는 서열 번호 1 내지 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 중 하나 이상으로 할 수 있다.
측정 대상의 모노클로날 항체가 베바시주맙이며, 프로테아제가 Trypsin Gold(프로메가사제)인 경우, 내부 표준 펩티드는 서열 번호 8 내지 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 중 하나 이상으로 할 수 있다.
측정 대상의 모노클로날 항체가 리툭시맙이며, 프로테아제가 Trypsin Gold(프로메가사제)인 경우, 내부 표준 펩티드는 서열 번호 13 내지 19로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 중 하나 이상으로 할 수 있다.
측정 대상의 모노클로날 항체가 트라스투주맙 또는 트라스투주맙-DM1이며, 프로테아제가 Trypsin TPCK-treated(시그마사제)인 경우, 내부 표준 펩티드는 서열 번호 1 내지 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 추가하여, 서열 번호 20 내지 28, 46 및 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 중 하나 이상으로 할 수 있다.
측정 대상의 모노클로날 항체가 베바시주맙이며, 프로테아제가 Trypsin TPCK-treated(시그마사제)인 경우, 내부 표준 펩티드는 서열 번호 8 내지 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 추가하여, 서열 번호 29 내지 38로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 중 하나 이상으로 할 수 있다.
측정 대상의 모노클로날 항체가 리툭시맙이며, 프로테아제가 Trypsin TPCK-treated(시그마사제)인 경우, 내부 표준 펩티드는 서열 번호 13 내지 19로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 추가하여, 서열 번호 39 내지 45로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 중 하나 이상으로 할 수 있다.
내부 표준 펩티드는, 측정 대상이 되는 모노클로날 항체에 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 보다 구체적으로는 Fa 도메인의 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 중쇄 또는 경쇄의 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 키트를 사용함으로써, 모노클로날 항체의 동정ㆍ정량을 위한 펩티드 단편 조제의 조작을 보다 간편하게 행할 수 있고, 장치에 의한 자동화도 용이하게 이룰 수 있다. 특히, 트립신 등은, 나노 입자 표면에 고정화된 상태에서도 활성을 유지할 수 있기 때문에, 프로테아제가 나노 입자 표면에 고정화된 상태에서 키트의 구성 요소로서 제공되면, 펩티드 단편 조제의 조작을 더 간략화할 수 있다.
본 발명의 키트는, 보다 구체적으로는, 예를 들어 이하와 같은 구성으로 제공된다.
<1. 싱글 분석용>
1 샘플씩 분석하기 위한 시약 키트는, 예를 들어 이하의 구성의 것이다.
0.2㎛의 여과막 스핀 필터(밀리포어 울트라프리 PVDF, 0.2㎛)
세공 직경 100nm의 Protein G 수지 슬러리(4℃ 보존)
입자 직경 200nm의 나노 입자에 고정화된 트립신 비즈(-20℃ 보존)
혈장 희석용 저흡착 튜브
용액 회수 마이크로튜브
혈장 희석용 버퍼(PBS+0.1％ n-옥틸-β-D-티오글리코시드 혹은 상당하는 계면 활성제, 예를 들어 n-옥틸-β-D-글리코시드)
비즈 세정용 버퍼(PBS)
프로테아제 반응용 버퍼(25mM Tris-HCl, pH8.0+프로테아제 반응 촉진 첨가제)
10％ 포름산 수용액
사용 설명서
<2. 멀티샘플 분석용>
예를 들어 96 샘플 동시 분석을 가능하게 하는 다검체 처리용 시약 키트는, 예를 들어 이하의 구성의 것이다.
0.2㎛의 여과막 플레이트(밀리포어 멀티스크린 PVDF, Barex, 0.2㎛)
세공 직경 100nm의 Protein G 수지 슬러리(4℃ 보존)
입자 직경 200nm의 나노 입자에 고정화된 트립신 및 프로테아제 비즈(-20℃ 보존)
혈장 희석용 저흡착 플레이트
용액 회수용 플레이트
용액 폐기용 플레이트 리저버
프로테아제 비즈용 플레이트
혈장 희석용 버퍼(PBS+0.1％ n-옥틸-β-D-티오글리코시드 혹은 상당하는 계면 활성제, 예를 들어 n-옥틸-β-D-글리코시드)
비즈 세정용 버퍼(PBS)
프로테아제 반응용 버퍼(25mM Tris-HCl, pH8.0+프로테아제 반응 촉진 첨가제)
10％ 포름산 수용액
플레이트 커버 시일
오토샘플러용 DMSO 내성, 니들 피어서블 플레이트 커버 시일
사용 설명서
<3. 부가적 시약>
본 발명의 키트에 경우에 따라 포함시키는 것으로서, 예를 들어 내부 표준 펩티드가 있다. 이것은, 바이오 의약품 정량용 펩티드의 정량 정밀도를 높이기 위한 것이며, 바이오 의약마다 복수의 펩티드를 준비하고, 별도 판매하는 것이 바람직하다. 내부 표준 펩티드에는, 안정 동위체 아미노산으로 라벨한 것을 포함시켜도 되며, 그 경우, 동위체를 포함하지 않는 펩티드와 비교하면 질량 분석 정량 조건이 상이하기 때문에, 내부 표준용 정량 조건을 동봉하는 것이 바람직하다.
<구성>
내부 표준 펩티드(예를 들어 트라스투주맙용으로서, 서열 번호 1 내지 7의 펩티드 중 어느 하나 이상)
시약 품질 보증 데이터(질량 분석 데이터 및 원자 순도 측정 결과)
정량 조건 파일 패키지
사용 설명서
<메소드 패키지>
본 발명은, 또한, 측정 대상의 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 트립신을 고정화한 나노 입자를 액체 속에서 접촉시켜 모노클로날 항체의 선택적 트립신 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 분석함으로써 상기 모노클로날 항체의 검출을 행하는 방법에 사용하기 위한, 메소드 패키지를 제공한다. 본 명세서에 있어서, 「메소드 패키지」란, 특정한 측정 대상에 대한 액체 크로마토그래프 질량 분석의 분석 조건을 판독 가능한 형태로 포함하고, 단독으로 유통 가능한 것을 말한다. 메소드 패키지에 포함되는 데이터를 LC-MS에 임포트함으로써, 상세한 검토 끝에 얻어진 최적 측정 조건에서 분석하는 것이 가능하게 된다.
상기한 바와 같이, 질량 분석에 의한 측정은, 매우 고정밀도의 분석이 가능한 한편, 목적으로 하는 이온에 의해 분석 조건이 전혀 상이하기 때문에, 적정한 분석 조건의 설정이 매우 중요하면서, 매우 곤란하고, 조건 설정을 위해 방대한 시간을 요한다. 이러한 조건을 미리 준비해 둠으로써, 실제로 질량 분석을 하는 유저의 편리성을 향상시킬 수 있다. 본 출원인은 이제까지, 유저가 예를 들어 농약이나 동물 의약품의 질량 분석을 보다 간편하게 행하는 것을 가능하게 하기 위해, 이들 LC-MS에 의한 분석을 위한 메소드 패키지를 제공해 왔다. 따라서, 본 발명은 시료 중의 모노클로날 항체의 LC-MS에 의한 동정ㆍ정량을 위한 메소드 패키지도 제공한다.
즉, 본 발명은 측정 대상의 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 속에서 접촉시켜 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 분석함으로써 상기 모노클로날 항체의 검출을 행하는 방법에 사용하기 위한, 상기 질량 분석을 실행시키기 위한 데이터가 기록된 컴퓨터 판독가능한 기록 매체이며, 상기 데이터가, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 상기 모노클로날 항체의 프로테아제 소화에 의해 얻어지는 펩티드, 예를 들어 Fab 도메인, 보다 바람직하게는 CDR 영역의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 중 하나 이상에 대하여, 적어도 친 이온, 프래그먼트 이온, 예상 유지 시간, 삼련 사중극의 각각(제1 사중극, 제2 사중극, 제3 사중극)에 있어서의 전압의 데이터를 포함하는, 상기 기록 매체를 제공한다. 또한, 상기 예상 유지 시간, 전압 데이터 등은, 사용하는 기기 및 측정 조건 등에 따라 변동되는 수치이며, 기기에 맞추어 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 당업자에게는 이해되는 바와 같이, 조건에 따라 변동되는 수치에 대해서는 그 변동폭도 함께 제공하는 것이 바람직하다.
기록 매체는 어떠한 형태의 것이어도 되며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 정보를 자기적, 광학적으로 기록하는 것이 가능한 디스크나 메모리를 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 메소드 패키지 중에는, 예를 들어 이하의 정보 및 소프트 기능을 포함할 수 있다.
ㆍ최적화※된 친 이온 m/z값
ㆍ최적화된 프래그먼트 이온 m/z값
ㆍ최적화된 Q1 pre bias 전압값
ㆍ최적화된 Q2 collision energy 전압값
ㆍ최적화된 Q3 pre bias 전압값
ㆍ목적 이온의 예상 유지 시간 및 질량 분석 시간
ㆍ정량값 환산식
ㆍ해석 결과 리포트 출력 기능
※: 각 조건 항목을 실측하고, 가장 이온 강도가 높은 것, 및 가장 재현성이 있는 m/z값을 채택하고, 이것을 최적값으로 한다.
본 발명은, 또한, 상기 기록 매체와, 기록 매체의 사용 설명서를 포함하는, 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의한 모노클로날 항체의 검출을 위한 메소드 패키지를 제공한다.
상기 기록 매체 또는 메소드 패키지의 예로서, 특정한 모노클로날 항체에 한정된 정보만을 포함하는 것을 들 수 있다. 따라서, 모노클로날 항체가, 예를 들어 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM1, 베바시주맙 또는 리툭시맙인 경우, 그것들에 적합한 분석 조건을 기재한 기록 매체 또는 메소드 패키지를 제공할 수 있다.
이 경우, 기록 매체에 포함되는 데이터는, 예를 들어 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 대한 분석 조건에 관한 것으로 할 수 있다.
메소드 패키지는, 복수의 질량 분석 장치에서 공통의 데이터를 기재하는 것이어도 되고, 혹은 특정한 질량 분석 장치에 의한 분석에 적합한 여러 가지 데이터를 기재하는 것이어도 된다.
기록 매체 또는 메소드 패키지는, 상기의 본 발명의 키트와 함께, 혹은 키트와 별개로 제공할 수 있다.
<실시예>
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1 샘플 조제용 키트]
단일 샘플의 분석을 위해, 이하의 구성의 키트를 준비한다.
(1) PBS 완충액(PBS+0.1％ n-옥틸-β-D-티오글루코시드, Dojindo)
(2) 효소 반응 완충액(25mM Tris-HCl, pH8.0)
(3) 효소 반응 정지액(10％ 포름산)
(4) 필터 튜브(Low-binding hydrophilic PVDF, 구멍 직경 0.2㎛, 밀리포어사)
(5) 저흡착 튜브(릿첼 마이크로레시코 튜브 92017)
(6) LCMS 바이얼, 인서트(시마즈 GLC, GLC4010-VP, 타깃 바이얼 VP, C4010-630P Target PP Polyspring)
(7) 다공질체(Pierce 53126 Protein G UltraLink Resin, 40㎕ 분주)
(8) 나노 입자(트립신 고정화 FG 비즈(트립신 40㎍))
(9) 사용 설명서
<프로토콜(사용 설명서(9)에 기재)>
1. 혈액 샘플 20㎕를 저흡착 튜브(5)에 취하고, 완충액(1)을 180㎕로 희석한다.
2. 다공질체(7)를 탁상 원심기에서 원심하고, 상청을 버린다. 완충액(1)을 100㎕ 첨가하고, 가볍게 교반한 후 원심하고, 상청을 버린다. 이 조작을 3회 행한다. 그 후 40㎕의 완충액(1)을 첨가하여 현탁한 후, 필터 튜브(4)로 옮긴다. 이 조작은 필터 튜브(4) 상에서 행해도 된다.
3. 스텝 1의 혈액 희석 샘플을, 필터 튜브(4)로 옮긴다.
4. 탭핑 로터리 믹서(닛신 리카)로 가볍게 탭핑하면서, 실온에서 1시간 교반한다.
5. 원심 여과(10,000g×1분)하고, 용액을 분리한다. 완충액(1)을 200㎕ 첨가하여 원심 여과하고, 여과액을 폐기한다. 이 조작을 3회 행한다.
6. PBS 완충액(1)을 200㎕ 첨가하고, 가볍게 교반한 후 원심 여과하고, 여과액을 버린다. 이 조작을 1회 행한다.
7. 스텝 6의 다공질체에, 완충액(2)을 200㎕ 첨가한다.
8. 나노 입자(8)를 빙상에서 용해한다. 신속하게 초음파 세정기 혹은 보르텍스 믹서로 균일하게 분산시키고, 스텝 7에 첨가한다.
9. 필터 튜브에 용액 회수용 튜브를 설치하고, 덮개측에 파라필름 등을 사용하여 시일한다. 탭핑 로터리 믹서로 가볍게 탭핑하면서, 37℃에서 6시간 교반하여, 단백질 분해를 행한다.
10. 반응 혼합액을 원심 여과(10,000g×1분)하고, 수지를 제거한다. 여과액을 회수한다.
11. 스텝 10에, 효소 반응 정지액(3)을 15㎕ 첨가한다.
12. LC-MS 바이얼 세트(6)로 옮기고, 바닥의 기포를 제거한다.
13. LC-MS의 오토샘플러에 세팅하고, 분석을 행한다.
14. LC-MS 분석 조건 리스트는, 별지에 첨부한다(표 1 내지 표 6).
<항체 의약 정량용 펩티드의 질량 분석 조건(기록 매체에 포함시킴)>
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
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Figure pct00009
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Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
[실시예 2 여과막의 검토 1]
여과에 사용하는 막 소재에 의한 펩티드 회수율의 상이를 검증하기 위해, 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE) 및 폴리불화비닐리덴(polyvinylidene difluoride, PVDF)의 2개의 막 소재를 비교하였다.
회수율의 검증은, 100㎍/㎖ 트라스투주맙을 개시로 하여, 3배 희석 계열을 작성(N=4)하고, 트립신을 고정화한 나노 입자(Trypsin TPCK treated)로 프로테아제 소화를 행한 후, 서열을 기재한 각각의 펩티드(LFPPKPK(서열 번호 46), LYSGVPSR(서열 번호 21), FTISADTSK(서열 번호 3), ASQDVNTAVAWYQQKPGK(서열 번호 47), GLEWVAR(서열 번호 6), DTYIHWVR(서열 번호 5))에 대하여, 질량 분석법(LCMS-8040(시마즈 세이사쿠쇼사제))으로 펩티드 회수율을 정량하였다. PRFE의 결과를 기준으로 한 PVDF의 결과를 상대값(변화 배율)으로 하여 도 2에 도시한다. 유의차 검정은 T 검정을 사용하고, p<0.05(*), p<0.01(**)을 마크하였다.
그 결과, 고농도의 펩티드인 경우에는 차가 없지만, 펩티드가 저농도인 경우에는 회수율에 큰 유의차가 발생하여, 여과막으로서 PVDF가 적합함이 판명되었다.
[실시예 3 여과막의 검토 2]
실시예 2와 마찬가지의 실험을 베바시주맙을 사용하여 검증하였다. 결과를 도 3에 도시한다.
그 결과, 실시예 2와 마찬가지로, 고농도의 펩티드인 경우에는 차가 없었지만, 펩티드가 저농도인 경우에는 회수율에 큰 유의차가 발생하여, 여과막으로서 PVDF가 적합함이 판명되었다.
[실시예 4 여과막의 검토 3]
다검체의 측정에 사용하기 위한 여과막 플레이트의 펩티드 회수율을 검증하기 위해, 2개의 막 소재(PTFE, PVDF) 및 하우징 3종을 비교하였다. 멀티스크린 플레이트로서, 1) PTFE membrane/Solvinert housing(머크사), 2) PVDF membrane/Acryl clear housing(머크사), 3) PVDF membrane/Barex white housing(머크사)을 사용하여 비교하였다.
회수율의 검증은, 400㎍/㎖ 트라스투주맙을 개시로 하여, 2배 희석 계열을 작성(N=4)하고, 효소 소화를 행한 후, 각각의 펩티드에 대하여, 회수율을 질량 분석법(LCMS-8040)으로 정량하였다. 결과를 도 4에 도시한다. 유의차 검정은 T 검정을 사용하고, p<0.05(*), p<0.01(**)을 마크하였다.
그 결과, 펩티드의 고농도측에서는 PTFE가 우위지만, 저농도측에서는 PVDF가 우위였다. 임상적으로는 5 내지 20㎍/㎖가 요구되는 펩티드 농도 범위이기 때문에, PFDV Barex를 선정하는 것이 유효하다고 판정하였다. Barex 수지를 사용한 경우의 고농도의 펩티드에서의 포화에 대해서는, 단백질 성분의 응집이 고려된다. 임상적으로 상정되는 혈액 샘플에서는, 다량으로 항체가 포함되고, 또한 계면 활성제에 의한 세정 공정이 있기 때문에, 이 포화 현상은 해소될 것이라고 생각된다. 또한, 아크릴 수지는 물리 흡착에 의한 펩티드 손실이 커서, 선정에서 제외하였다.
[실시예 5 프로테아제 활성의 안정성 평가]
나노 입자에 고정화하는 프로테아제(트립신)의 활성의 안정성을 모니터하기 위해, 효소 활성 측정을 행하였다. 나노 입자가 기질 흡광도를 저해하므로, 종래법에 대하여 몇 가지 개변을 가하였다.
프로테아제로서 Trypsin Gold, Mass Spec Grade(프로메가사제)(이하, 「Gold」라고 표기함) 및 Trypsin TPCK Treated from bovine pancreas, Product Number T1426(Sigma Aldrich사제)(이하, 「TPCK」라고 표기함)의 2종의 트립신, 그리고 「Gold」, 「TPCK」를 각각 실시예 1에 기재된 키트를 사용하여 나노 입자에 고정화한 「FG-Gold」, 「FG-TPCK」를 사용하여, 여러 가지 조건 하에서 효소 반응을 행하여, 효소 안정성을 조사하였다. 또한, 「Gold」는, 키모트립신 실활 처리(TPCK 처리)에 추가하여, 환원 디메틸화 반응을 실시함으로써, 자기 소화에 대하여 저항성을 갖고, 온도나 pH에 의존하지 않고 브로드하게 높은 활성을 유지하고 있는 질량 분석 등급의 프로테아제이다. 한편, 「TPCK」는 키모트립신 실활 처리를 하였지만, 키모트립신이 잔존하는 프로테아제이다.
기질로서, N-α-벤조일-DL-아르기닌-p-니트로아닐리드 염산염(MW=434.9)을 사용하고, 가수분해 반응에 의해 기질로부터 유리되는 파라니트로아닐린(p-NA)의 흡광도(405nm, 흡광 계수=9920M-1ㆍ㎝-1)를 측정함으로써 효소 활성을 측정하였다.
<프로토콜>
프로테아제 기질을 최종 농도 10mM이 되도록 DMSO에 용해하고, 스톡 용액으로 한다.
하기와 같이 혼합한다.
ㆍ기질 10㎕(100nmol)
ㆍ반응 완충액(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH8.0) 200㎕
ㆍ고정화 효소 현탁액(0.5mg/㎖) 2㎕
나노 입자(FG 비즈) 자체의 현탁에 의한 흡광도, 및 벽면에 대한 물리 흡착에 의한 FG 비즈의 손실이 있기 때문에, 대조군으로서 기질이 없는 샘플 웰을 만들어, 동시 측정을 행한다. 각 샘플 N=2의 측정을 행하고, 평균값을 흡광도로 한다. FG 비즈는, 첨가 전에 충분히 현탁한다.
각각의 조건에서 프로테아제 소화 반응을 1.5시간, 보르텍스 교반 하에서 행하였다. 반응 종료 시에는 2N-HCl을 50㎖ 첨가하여 반응을 완전히 정지하였다. 멀티스크린 필터 플레이트(밀리포어 멀티스크린 PVDF, Barex, 0.2㎛)로 여과하고, 나노 입자를 제거한 후, 옵티컬 바텀 플레이트(코스모 바이오 가부시키가이샤제)에 분주하고, 마이크로플레이트 리더(TECAN Infinite M200Pro, 테칸 재팬 가부시키가이샤제)를 사용하여 기질로부터 유리된 파라니트로아닐린(p-NA)의 흡광도(405nm, 흡광 계수=9920M-1ㆍ㎝-1)를 측정하고, 효소 활성을 평가하였다.
25℃ 실온에서, 1분마다 장치 내 보르텍스 교반 직후에 흡광도 측정을 120회 연속으로 측정한다. 흡광도 증가에 수반하는 근사 직선을 작성하고, 그 기울기를 효소 반응 속도로 한다.
트립신을 고정화한 나노 입자는, 4℃ 및 -20℃에서 보존하고, 약 3개월 모니터함으로써, 그 효소 활성을 평가하였다. 결과를 도 5에 도시하는 바와 같이, 보존 안정성은 온도에 좌우되지 않으며, 키트로서 제공하는 데 있어서, 보관 온도는 4℃로 하면 된다는 것이 판명되었다.
[실시예 6 스케일 업에 의한 영향 평가]
프로테아제 고정화 나노 입자의 대량 제조에 대하여, 프로테아제 활성에 변화가 발생하는지 여부를 검증하였다. 측정 방법은, 실시예 5와 마찬가지의 개변에 추가하여, 반응 완충액을 50mM Tris-HCl, pH8.0으로 변경하였다.
비교를 위해, 초기 투입 나노 입자량을 실험실 스케일(5mg, Scale A), 밀리그램 스케일(20mg, Scale B), 라지 스케일(200mg, Scale C)로 비교를 행하였다. 효소 활성은 약 2개월 모니터를 행하였다. 결과를 도 6에 도시한다.
그 결과, 스케일 업에 의한 효소 활성의 저하는 없는 것이라고 판단할 수 있었다.
[실시예 7 스케일 업에 의한 영향 평가]
나노 입자의 대량 제조에 수반하여, 세정 공정이 불충분해질 가능성이 고려된다. 세정 공정의 효율화를 도모할 목적으로, 고정화 후의 세정액에 계면 활성제를 사용하여, 그 효과를 검증하였다.
효소 활성 평가의 결과,
마스킹 없음(detergent -) FG 비즈 트립신: 5.784E-03
마스킹 있음(detergent +) FG 비즈 트립신: 5.902E-03
으로 되어, 계면 활성제 세정에 의한 효소 실활은 없다고 판단되었다.
<산업상 이용가능성>
본 발명의 키트를 사용하면, 시료 중의 모노클로날 항체의 동정ㆍ정량이 간편하게 되고, 또한 기술의 오차를 저감시키는 것이 가능하다. 또한, 대상이 되는 이온종이 결정되어 있기 때문에, 유저의 질량 분석 조건의 설정은 불필요하다.
특히 항체 의약의 질량 분석에 의한 농도 정량 기술은, 현행 ELISA법을 치환시킬 포텐셜이 있어, 본 발명은 임상 약리 분야로의 진출, 시장 확대에 공헌할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 원용되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Shimadzu Corporation <120> Sample Preparation Kit for Detecting a Monoclonal Antibody <130> PH-6401-PCT <150> JP 2015-047729 <151> 2015-03-10 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 1 Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 2 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 3 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 4 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 5 Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 6 Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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30 Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 31 Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 32 Gly Met Asn Trp Val Arg 1 5 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 33 Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg 1 5 10 15 <210> 34 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 34 Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 35 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His 1 5 10 <210> 36 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 36 Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 15 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 20 <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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Claims (11)

  1. 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 모노클로날 항체를 검출하기 위한 샘플 조제용 키트이며,
    측정 대상의 모노클로날 항체를 고정화하기 위한 다공질체와,
    프로테아제를 고정화한 나노 입자와,
    상기 다공질체와 상기 나노 입자를 접촉시켜 모노클로날 항체를 선택적으로 소화하기 위한 반응 용기와,
    상기 나노 입자 및 다공질체와 함께 상기 반응 용기 내에 도입되고, 상기 프로테아제에 의한 소화 반응을 시키기 위한 완충액과,
    상기 소화 반응 후에 상기 다공질체 및 상기 나노 입자를 제거하여, 상기 소화 반응의 생성물을 상기 완충액과 함께 추출하기 위한 여과막을 포함하는, 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 여과막이, 압력 또는 원심력을 가하지 않는 조건 하에서는 상기 완충액 및 상기 프로테아제에 의한 소화 반응에 의해 생성되는 펩티드를 거의 투과하지 않고, 압력 또는 원심력을 가한 조건 하에서는 상기 완충액 및 상기 펩티드를 투과할 수 있는 것인, 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 여과막이 폴리불화비닐리덴(PVDF)제의 막인, 키트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트가 다검체를 동시에 처리하기 위한 키트이며, 상기 여과막의 하우징 소재가 폴리아크릴로니트릴 수지인, 키트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 키트에, 추가로 모노클로날 항체의 검출을 위한 질량 분석 조건을 기재한 설명서를 포함하는, 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의한 모노클로날 항체 검출을 위한 키트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    측정 대상이 되는 모노클로날 항체에 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 내부 표준 펩티드를 더 포함하는, 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    측정 대상이 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM1, 베바시주맙 또는 리툭시맙이며, 내부 표준 펩티드가 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드인, 키트.
  8. 측정 대상의 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 속에서 접촉시켜 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 분석함으로써 상기 모노클로날 항체의 검출을 행하는 방법에 사용하기 위한, 상기 질량 분석을 실행시키기 위한 데이터가 기록된 컴퓨터 판독가능한 기록 매체이며,
    상기 데이터가, 상기 모노클로날 항체의 프로테아제 소화에 의해 얻어지는 펩티드 중 하나 이상에 대하여, 적어도 친 이온(parent ion), 프래그먼트 이온, 예상 유지 시간, 삼련 사중극의 각각에 있어서의 전압의 데이터를 포함하는, 컴퓨터 판독가능한 기록 매체.
  9. 제8항에 기재된 컴퓨터 판독가능한 기록 매체와, 상기 컴퓨터 판독가능한 기록 매체의 사용 설명서를 포함하는, 고속 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의한 모노클로날 항체의 검출을 위한, 메소드 패키지.
  10. 상기 모노클로날 항체가 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM1, 베바시주맙, 리툭시맙 중 1종 이상인, 제8항에 기재된 컴퓨터 판독가능한 기록 매체 또는 제9항에 기재된 메소드 패키지.
  11. 상기 데이터가 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 대한 것인, 제8항에 기재된 컴퓨터 판독가능한 기록 매체 또는 제9항에 기재된 메소드 패키지.
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