KR20120003933A - 서열 특이적 뉴클레아제의 나노입자 매개 전달 - Google Patents

서열 특이적 뉴클레아제의 나노입자 매개 전달 Download PDF

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Abstract

서열 특이적 뉴클레아제를 세포벽을 포함하는 식물 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다. 식물을 유전적으로 또는 달리 변형시키기 위한 및 세포벽을 포함하는 식물 세포에서 질병을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.

Description

서열 특이적 뉴클레아제의 나노입자 매개 전달{NANOPARTICLE MEDIATED DELIVERY OF SEQUENCE SPECIFIC NUCLEASES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2009년 4월 7일 출원된 미국 특허 가출원 61/167,389를 기초로 한 우선권의 이익을 주장한다.
나노입자의 독특한 특성은 DNA를 세포 내로 전달하기 위해 이용될 수 있다. 조사한 나노입자 (예를 들어, 텅스텐, 알루미늄, 니켈 등) 중에서, 금 나노입자 (GNP)가 DNA 전달을 위한 뛰어난 후보가 된다. 낮은 세포독성 및 생물학상 중요한 다양한 리간드를 사용한 관능화 (functionalization)의 용이함 때문에 금 나노입자가 형질전환을 위해 우선적으로 선택된다. 금 나노입자의 크기는 1.2 nm - 600 nm 범위일 수 있다. 흔히 사용되는 GNP의 합성은 20-400 nm의 입자에 대한 음전하를 띤 (예를 들어, 시트레이트 코팅) 표면을 생성시키는 반면, 보다 작은 1-10 nm 범위의 GNP는 양전하를 띤다. 그의 염기를 부분적으로 풀기 위해 충분하게 유연성인 플라스미드 DNA는 금 나노입자에 노출될 수 있다. 시트레이트 관능화된 GNP의 경우에, 플라스미드 DNA는 부분적으로 풀릴 수 있다. DNA 백본 상의 음전하는 충분하게 멀어서, 염기 및 금 나노입자 사이의 끌어당기는 반 데어 발스력 (van der Waals force) 때문에 플라스미드 DNA는 금 입자의 표면에 부착하고 코팅한다. 반면에, 양전하를 띤 GNP의 경우에, 정전기 및 반 데어 발스력이 DNA의 코팅 또는 부착에 기여할 수 있다.
금속 나노입자에 추가로, 3-5 nm 크기 범위의 반도체 나노입자 (예를 들어, 양자점 (quantum dot)) ("QD")도 또한 분자를 세포 내로 전달하기 위한 담체로서 사용되었다. DNA 및 단백질은 리간드로 다관능화된 QD 표면에 코팅되거나 연결될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Patolsky, F., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (2003)] 참조). 카르복실산 또는 아민 다관능화된 QD는 표준 생물접합 프로토콜을 이용함으로써 티올기를 함유하는 분자에 가교 결합 (예를 들어, 문헌 [Dubertret B., et al., Science 298, 1759 (2002)]; [Akerman, M. E., W. C. W. Chan, P. Laakkonen, S. N. Bhatia, E. Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12617 (2002)]; [Mitchell, G. P., C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, J. Am. Chem. Soc. 121, 8122 (1999)] 참조) 또는 N-히드록시숙신이밀 (NHS) 에스테르기를 함유하는 분자에 가교결합될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pinaud, F., D. King, H.-P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (2004)]; [Bruchez, M., M. Moronne, P. Gin, S. Weiss, A. P. Alivisatos, Science 281, 2013 (1998)] 참조). 다른 방법은 스트렙타비딘과의 접합을 통해 QD를 다관능화하는 것이다. 스트렙타비딘은 비오티닐화 단백질, 올리고 또는 항체와 접합된다 (예를 들어, 문헌 [Dahan M. et al., Science 302, 442 (2003)]; [Pinaud, F., D. King, H.-P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (2004)]; [Dahan M. et al., Science 302, 442 (2003)]; [Wu. X. Y., et al., Nature Biotechnol. 21, 41 (2003)]; [Jaiswal, J. K., H. Mattoussi, J. M. Mauro, S. M. Simon, Nature Biotechnol. 21, 47 (2003)]; 및 [Mansson, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 314, 529 (2004)] 참조).
나노입자는 플라스미드 DNA를 다양한 동물 세포에 전달하는 데 사용되어 왔다. DNA 코팅된 나노입자를 세포벽을 갖지 않는 세포와 함께 인큐베이팅할 때, 세포는 나노입자를 흡수하고, DNA 상에 코딩된 임의의 유전자를 발현하기 시작하는 것으로 밝혀졌다. 정상적으로 세포벽을 갖는 세포에 대한 나노입자 전달이 요구되는 경우에, 원형질체 (protoplast)에 입자를 첨가하기 전에 세포벽을 벗겨낸다 (문헌 [Torney, F. et al., Nature Nanotechnol. 2, (2007)] 참조). 식물 세포에서, 세포벽은 외인성으로 적용된 분자의 전달에 대한 장벽으로서 역할을 한다. 이들 벽이 있는 식물 세포 내로 유전자 및 소분자 전달을 달성하기 위해 많은 침습적인 방법, 예를 들어 유전자 총 (비오리스틱스 (biolistics)), 마이크로주사 (microinjection), 전기천공, 및 아그로박테리움 (Agrobacterium)이 사용되었다. 소분자 및 단백질을 세포벽을 가로질러 식물 세포 내로 전달하는 것은 무손상 (intact) 식물의 세포, 조직 및 기관의 시험관내 및 생체내 조작을 위한 실행가능 기술의 개발을 위해 유리할 것이다.
세균, 효모, 동물 세포 및 이끼에서 잘 확립되었지만, 유전자 부가 (예정된 게놈 위치 내로 외래 DNA의 도입)는 고등 식물에서 중대한 도전으로 남아있다. 부위-특이적 도입유전자 (transgene) 통합은, 도입하는 DNA가 숙주 DNA에 상동성인 서열의 큰 스트레치 (stretch)를 함유하는 경우에도 무작위 (random) 통합에 비해 식물 세포에서 매우 낮은 빈도로 일어난다 ([Halfter et al. 1992]; [Lee et al. 1990]; [Mia and Lam (1995)]). 예를 들어, 고도로 효율적인 아그로박테리움-기반 형질감염 시스템 및 제초제 선택은 벼에서 5x10-4 이하의 유전자 표적화 빈도를 생성시킨다. 식물에서 유전자 표적화 효율을 향상시키는 시도는 음성 선택 마커의 사용, 및 보다 높은 표적화 빈도를 나타내도록 유전 공학처리된 식물의 사용을 포함하였다. 이들 노력에도 불구하고, 비-상동성 공정을 통한 무작위 DNA 통합은 식물에서 유전자 표적화에 대해 계속하여 큰 장애가 되고 있다. 농업 및 산업 생물공학을 위한 작물의 변형에서 표적화된 유전자 부가를 위해 구상된 일반적인 유용성 (general utility)을 고려할 때, 상기 문제에 대한 해결책이 절실히 필요하다.
이와 관련하여, 숙주 세포에서 천연 세포 과정인 상동성-지정 이중 가닥 파손 (DSB) 복구를 자극하는, 특이적인 게놈 위치에서 DNA DSB의 유도 후에 넓은 범위의 식물 및 동물 모델 시스템에서 유전자 표적화의 빈도의 실질적인 증가가 관찰되었다. 그의 인식 부위가 식물 게놈 내에 드문 자연 발생하는 부위-특이적 엔도뉴클레아제가 무작위 통합을 통해 식물 게놈 내로 앞서 전달된 표적 서열 내로 도입유전자 통합을 유도하기 위해 상기 방식으로 사용되었다. 이들 연구는 식물 세포 내에서 유전자 표적화를 자극하는 표적화된 DSB 유도의 가능성을 강조하지만, 천연 로커스 내에 DSB를 도입하는 문제가 계속 존재한다.
동물 세포에서, 표적화된 게놈 조정/조작에 대한 해결책은 류신 지퍼 (zipper), 아연 핑거 (zinc finger) 단백질 등과 같은 다양한 뉴클레오티드 서열 특이적 결합 단백질을 통해 달성한다. 이들 단백질은 전사 인자로서 유전자 조절과 연관되고/되거나 천연 게놈 위치에서 DSB를 유도하기 위해 사용될 수 있다. DSB는 몇몇 상이한 클래스의 서열 특이적 뉴클레아제, 예를 들어 메가뉴클레아제, 류신 지퍼, 아연 핑거 단백질 등 및 보다 최근에 이들 단백질의 신규한 키메라 (chimeric) 버전의 개발에 의해 제공될 수 있다. 가장 잘 설명된 뉴클레오티드 특이적 결합 단백질 중 하나는 아연 핑거 단백질 (ZFP)이다. C2H2 아연 핑거는 양서류 전사 인자 TFIIIA에서 발견되었고, 그 이후에 모든 종의 후생동물에서 가장 공통적인 DNA 인식 모티프 (motif)인 것으로 밝혀졌다. C2H2 ZFP, Zif268의 X-선 결정 구조는 현저한 음절 (syllabic) 방식의 단백질-DNA 인식을 밝혔고, 여기서 각각의 아연 핑거는 직렬 (tandem) 배열의 맥락에서 3 또는 4 bp 하위부위를 지정하고, 이는 신규한 특이성을 갖는 DNA 결합 도메인을 위한 스캐폴드 (scaffold)로서 상기 펩티드 모티프를 사용할 가능성을 시사하였다. 그 이후에, 신규한 서열에 결합하도록 조작된 다수의 ZFP가 인공 전사 인자 및 다른 기능성 키메라 단백질의 맥락에서 많은 상이한 실험실에서 성공적으로 사용되었다. C2H2 아연 핑거 단백질 도메인은 서열-특이적 DNA 결합을 위한 스캐폴드로서 사용되었고 (Pavelitch and Pabo 1991), ZFN은 아연 핑거 단백질 도메인을 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제 FokI로부터 유래된 서열-비의존적 뉴클레아제 도메인과 융합시킴으로써 생산되었다 (Kim et al. 1996). 조작된 ZFN은 형질전환된 (Moehle et al. 2007) 및 1차 인간 세포 (Lombardo et al. 2007) 내에서 내인성 게놈 로커스에 대한 고-효율 표적화를 유도하기 위해 사용되었다.
식물에서 ZFN을 사용하는 최초의 시도는 유망하였다 ([Lloyd et al. 2005]; [Wright et al. 2005]; [Maeder et al. 2008]). 그의 상응하는 인식 서열과 함께 유도가능 프로모터의 제어 하에 ZFN 유전자를 보유하는 구성체는 아라비돕시스 (Arabidopsis) 내로 안정하게 통합되고, 유도된 자손체 (progeny) 묘목 사이에서 평균 7.9%의 빈도로 인식 부위에서 비-상동성 말단 연결 (end joining)에 의해 생성된 표적화된 돌연변이를 도입하는 것으로 나타났다 (Lloyd et al. 2005). 이와 유사하게, SuRA 로커스에서 절단하도록 설계된 ZFN으로 형질전환된 원형질체로부터 재생된 66개의 담배 식물 중에서, 3개가 비-상동성 말단 연결 복구의 결과로서 표적 부위에서 단일 염기쌍 결실을 나타냈다 (Maeder et al. 2008). 아연 핑거 인식 서열의 바로 측면에 인접하는 600 bp를 상실한 예비-통합된 비-기능성 리포터 유전자를 함유하는 담배 세포는, 상응하는 ZFN 유전자를 함유하는 구성체 및 상실한 600 bp를 포함하는 예비-통합된 서열에 상동성인 공여자 DNA로 동시-형질전환될 때 리포터 유전자의 상동성-지정 복구의 증거를 보여주었다 (Wright et al. 2005). 가장 최근에, 식물 엔도키티나제 유전자를 절단할 수 있는 ZFN을 확인하기 위해 효모-기반 분석을 이용하였다 (Cai et al., 2009). 엔도키티나제 로커스에 대한 상동성의 짧은 스트레치가 측면에 인접하는 pat 제초제 저항성 유전자 카세트를 포함하는 공여자 DNA 구성체와 ZFN을 모두 보유하는 Ti 플라스미드의 아그로박테리움 전달은 정확하게 ZFN 절단 부위 내로 10% 이하의 표적화된 상동성-지정 도입유전자 통합을 생성하였다. C3H1 디자인에 기초한 다른 아연 핑거 디자인이 식물에서 나타난 것을 아는 것은 중요하다 ([Shukla et al., 2009], [Cai et al. 2009]).
본 발명은 서열 특이적 뉴클레아제를 세포벽이 있는 식물 세포 내로 비-침습적으로 전달하기 위해 나노입자를 사용하는 방법에 관한 것이다.
<발명의 개요>
다음 실시양태를 예시적이고 설명적이지만 범위를 제한하지 않는 것을 의미하는 시스템, 도구 (tool) 및 방법과 함께 설명한다.
본 발명에 따라, 세포벽이 있는 식물 세포를 제공하고; 나노입자를 적어도 서열 특이적 뉴클레아제로 코팅하고; 세포벽이 있는 식물 세포 및 서열 특이적 뉴클레아제로 코팅된 나노입자를 서로 접촉하도록 배치하고; 서열 특이적 뉴클레아제로 코팅된 나노입자를 세포벽을 포함하는 식물 세포 내로 흡수시키는 것을 포함하는, 서열 특이적 뉴클레아제를 식물 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다.
상기한 예시적인 측면 및 실시양태 외에, 추가의 측면 및 실시양태는 다음의 상세한 설명에 비추어 명백해질 것이다.
도 1 및 도 2는 각각 히스티딘 태깅된 (tagged) (1) 및 히스티딘 태깅되지 않은 (2) ZFN-IL1 FokI의 이. 콜라이 (E. coli) 발현을 보여준다.
도 3은 IL-1 아연 핑거-FokI 융합 단백질에 의해 자극된 염색체간 상동성 재조합을 보여주고; 여기서 A는 표적 벡터를 나타내고 B는 재구성된 GFP 유전자를 갖는 재조합체를 나타낸다.
도 4는 플라스미드 pDAB1585의 개략도를 보여준다.
도 5는 세포의 인큐베이션 2 hr 후에 GNP 매개된 YFP 내재화를 보이는 BY2-E 단일 세포주를 보여준다; 패널 A (FITC), B (로다민), C (DIC), D (A+B), E (A+B+C), F (역전된 반사 영상): YFP 내재화는 형광 현미경을 통해 관찰함.
도 6은 메가뉴클레아제 I-SceI 단백질에 의해 자극된 염색체간 상동성 재조합을 보여준다; 여기서, A는 표적 벡터를 나타내고 B는 재구성된 GFP 유전자를 갖는 재조합체를 나타낸다.
도 7은 플라스미드 pDAB100375의 개략도를 보여준다.
다음의 상세한 설명 및 표에서, 많은 용어를 사용한다. 그러한 용어를 제공한 범위를 포함한 명세서와 특허청구범위의 명백하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 다음 정의를 제공한다:
역교배. 역교배는 사육자가 잡종 자손체를 모체 중 하나에 다시, 예를 들어, 제1 세대 잡종 F1을 F1 잡종의 모체 유전자형 중 하나와 반복적으로 교배하는 공정일 수 있다.
배아 (embryo). 배아는 성숙 종자 내에 포함된 작은 식물일 수 있다.
나노입자. 대체로 100 nm 미만의 적어도 하나의 나노 규모 치수를 갖는 미세한 입자. 본 발명에서 사용하기에 적합한 나노입자는 1 nm - 0.4 ㎛의 크기일 수 있다. 양자점은 중간 직경이 1 nm - 10 nm, 바람직하게는 2-4 nm일 수 있다. 본원에서 사용되는 나노입자는 금 나노입자, 텅스텐 나노입자, 금 코팅된 나노입자, 다공성 나노입자, 메조다공성 (mesoporous) 나노입자, 실리카 나노입자, 중합체 나노입자, 젤라틴 나노입자, 나노쉘 (nanoshell), 나노코어 (nanocore), 나노구체 (nanosphere), 나노막대 (nanorod), 자성 나노입자, 반도체 나노입자, 양자점, 나노매트릭스 (nanomatrix), 덴드리머성 (dendrimeric) 나노매트릭스 및 이들의 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
양자점. 양자점은 3개의 모든 공간 방향으로 전도대 (conduction band) 전자, 가전자대 (valence band) 정공 (hole), 또는 엑시톤 (exciton) (전도대 전자와 가전자대 정공의 결합된 쌍)의 움직임을 한정하는 반도체 나노입자이다. 한정은 정전기 포텐셜 (potential) (외부 전극, 도핑 (doping), 스트레인, 불순물에 의해 생성됨), 상이한 반도체 물질들 (예를 들어, 코어-쉘 나노결정 시스템에서) 사이의 계면의 존재, 반도체 표면 (예를 들어, 반도체 나노결정)의 존재, 또는 이들의 조합 때문일 수 있다. 양자점은 구분되는 양자화 에너지 스펙트럼을 가질 수 있다. 상응하는 파동 함수는 공간적으로 양자점 내에 위치되지만, 많은 기간의 결정 격자를 걸쳐 연장한다. 양자점은 적은 한정된 수 (1-100 차수)의 전도대 전자, 가전자대 정공, 또는 엑시톤 (즉, 한정된 수의 기본 전하량)을 함유한다.
나노매트릭스는 덴드리머를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 덴드리머는 내부의 빈 공간 내에 캡슐화되거나 표면에 부착된 분자를 운반하도록 조작된 타원형 또는 구형 나노입자이다. 분자는 반복적으로 분지된 분자이고; 분지는 표면과 벌크 (bulk) 물질 사이의 다가 상호작용을 허용한다. 덴드리머의 예는 구형 양이온성 폴리아미도아민 (PAMAM) 캐스케이드 중합체이다. 이들 중합체는 표면 상의 1차 아민 및 내부의 3차 아민으로 이루어진다. 상기 종류의 덴드리머는 가용매분해성 (solvolytic) 용매 내에서 열 처리에 의해 부분적으로 분해되어, 더 작은 입체 제한 및 더 큰 유연성을 생성시킨다. 덴드리머의 고도 양전하는 DNA과의 정전기 상호작용을 용이하게 하고, 유연한 구조는 덴드리머가 DNA에 결합될 때 압축하고 DNA로부터 방출될 때 팽창하도록 한다. 형질감염 또는 형질전환 효율은 덴드리머의 양전하 및 유연한 구조 특성의 결과로서 증가한다. 덴드리머는 퀴아젠 (Qiagen, 미국 메릴랜드주 저먼타운)으로부터 입수할 수 있고, 덴드리머는 수퍼펙트 (Superfect)™ 형질감염 시약 (Cat # 301305)으로서 대중에게 시판된다.
다관능화된. 달리 특정되지 않으면, 용어 "다관능화된"은 일- 또는 다-관능화된 나노입자를 설명하기 위해 사용될 것이다. 일-관능화된 입자는 그 위에 단일 종류의 관능기가 화학적으로 결합된 관능화된 나노입자 또는 나노입자의 응집체를 의미할 것이다. 다관능화된 입자는 적어도 2, 아마도 3가지 이상의 상이한 종류의 관능기가 화학적으로 결합된 나노입자 또는 나노입자의 응집체를 의미할 것이다.
제초제에 대한 저항성. 제초제의 투약에 대한 저항성은 비-저항성 식물의 성장을 억제하고/하거나 비-저항성 식물이 생존하는 것을 방지할 활성 성분의 투약에 의해 생존하는 식물의 능력 (즉, 식물은 죽지 않을 수 있다)을 나타낸다. 일부 경우에, 내성 식물은 일시적으로 황변하거나 달리 일부 제초제-유도된 손상 (예를 들어, 과도한 분열 (tillering) 및/또는 성장 억제)을 나타낼 수 있지만 회복한다.
안정화된. 안정화된은 동일한 품종의 근친교배한 (inbred) 식물의 하나의 세대로부터 다음 세대로 재현가능하게 전달되는 식물의 특징을 나타낸다.
흡수. 흡수는 세포벽 또는 세포막을 가로질러 입자 또는 매트릭스, 예를 들어 나노입자, 예를 들어 금, 덴드리머, 또는 양자점의 전좌 (translocation)를 나타내고, 여기서 전좌는 단지 입자가 흡수되는 세포 이외의 무언가에 의해 입자에 부여된 운동량의 결과로서 일어나지는 않는다. 단지 입자에 부여된 운동량의 결과로서 세포벽 또는 세포막을 가로질러 입자의 전좌를 일으키는 장치 또는 방법의 비-제한적인 예는 비오리스틱스, 유전자 총, 마이크로주사 및/또는 임페일펙션 (impalefection) 기술이다.
핵산. 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환가능하게 사용되고, 선형 또는 원형 입체형태의 및 단일- 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 중합체 또는 다른 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 중합체를 의미한다. 본원의 목적을 위해, 이들 용어는 중합체의 길이에 관한 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 이 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지의 유사체뿐만 아니라, 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티 (예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)에서 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 형성 특이성을 갖는다; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다.
염색체. 염색체는 세포의 게놈의 전부 또는 일부를 포함하는 염색질 (chromatin) 복합체이다. 세포의 게놈은 종종 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 집단인 그의 핵형 (karyotype)으로 특징 지워진다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다. "에피솜 (episome)"은 복제하는 핵산, 핵단백질 복합체, 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피솜의 예는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈을 포함한다. "접근가능 영역"은 핵산 내에 존재하는 표적 부위가 표적 부위를 인식하는 외인성 분자에 의해 결합될 수 있는 세포 염색질 내의 부위이다. 임의의 특정 이론에 제한되기를 원치 않지만, 접근가능 영역은 뉴클레오솜 (nucleosome) 구조 내로 싸여지지 않는 영역인 것으로 생각된다. 접근가능 영역의 구분되는 구조는 종종 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들어, 뉴클레아제에 대한 그의 감수성에 의해 검출할 수 있다. "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재하는 경우 결합 분자가 결합할 핵산의 일부를 규정하는 핵산 서열이다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다.
유전자. 본원의 목적을 위해, 유전자는 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 영역, 및 조절 서열이 코딩 및/또는 전사된 서열에 인접하는지의 여부와 무관하게 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결자 (terminator), 번역 조절 서열, 예를 들어 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 도입 부위, 인핸서, 사일렌서 (silencer), 인슐레이터 (insulator), 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 부위 및 로커스 제어 영역을 포함하고 반드시 이로 제한되지는 않는다.
발현. 용어 발현 또는 유전자 발현은 상호 교환가능하게 사용되고, 유전자 내에 함유된 정보의 유전자 생성물로의 전환을 의미한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 종류의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 또한, 유전자 생성물은 캐핑 (capping), 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집 (editing)과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다. 유전자 발현의 "조정"은 유전자 활성의 변화를 나타낸다. 발현의 조정은 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
단백질. 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 상호 교환가능하게 사용된다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
서열. 용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 원형 또는 분지형일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 임의의 길이의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 용어 "공여자 서열"은 게놈 내로 삽입된 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 공여자 서열은 임의의 길이, 예를 들어 2 내지 25,000개의 뉴클레오티드 (또는 그들 사이의 또는 그보다 큰 임의의 정수값), 바람직하게는 약 100 내지 5,000개의 뉴클레오티드 (또는 그들 사이의 임의의 정수), 보다 바람직하게는 약 200 내지 2,500개의 뉴클레오티드일 수 있다.
상동성 서열. 상동성 서열은 제2 서열과 일정 정도의 서열 동일성을 공유하고 그 서열이 제2 서열과 동일할 수 있는 제1 서열을 의미한다. "상동성 비-동일 서열"은 제2 서열과 일정 정도의 서열 동일성을 공유하고 그 서열이 제2 서열과 동일하지 않은 제1 서열을 의미한다. 예를 들어, 돌연변이체 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 돌연변이체 유전자의 서열에 상동성이고 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, 2개의 서열 사이의 상동성 정도는 정상적인 세포 메카니즘을 사용하여 그들 사이의 상동성 재조합을 허용하기에 충분한 것이다. 2개의 상동성 비-동일 서열은 임의의 길이일 수 있고, 이들의 비-상동성 정도는 단일 뉴클레오티드만큼 작거나 (예를 들어, 표적화된 상동성 재조합에 의한 게놈 점 돌연변이의 교정을 위해) 또는 10 킬로베이스 이상만큼 클 수 있다 (예를 들어, 염색체 내의 예정된 부위에서 유전자의 삽입을 위해). 상동성 비-동일 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드의 길이는 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 20 내지 10,000개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 사이에 외인성 폴리뉴클레오티드 (즉, 공여자 폴리뉴클레오티드)가 사용될 수 있다.
재조합. 재조합은 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 유전자 정보의 교환 과정을 의미한다. 본원의 개시내용의 목적을 위해, "상동성 재조합 (HR.)"은 예를 들어 세포에서 이중 가닥 파손의 복구 동안 발생하는 상기 교환의 특수 형태를 의미한다. 상기 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥 파손이 발생한 것)의 주형 복구에 "공여자" 분자를 이용하고, 공여자로부터 표적으로의 유전자 정보의 전달을 야기하기 때문에 "비-교차 유전자 전환" 또는 "짧은 구역 (tract) 유전자 전환"으로서 다양하게 알려져 있다. 임의의 특정 이론에 제한되기를 원치 않지만, 상기 전달은 파손된 표적과 공여자 사이에 형성되는 이종이중체 DNA의 부정합 (mismatch) 교정, 및/또는 표적의 일부가 되는 유전자 정보를 재합성하기 위해 공여자가 사용되는 "합성-의존성 가닥 어닐링 (annealing)" (SDSA), 및/또는 관련 과정을 수반할 수 있다. 상기 특수 HR은 종종 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오티드 내로 도입되도록 하는, 표적 분자의 서열의 변경을 야기한다.
절단. "절단", "이중 가닥 파손의 유도" 및 "자르기"는 상호 교환가능하게 사용되고, DNA 분자의 공유 백본의 파손을 의미한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하고 이로 제한되지 않는 각종 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단과 이중 가닥 절단 둘 모두가 가능하고, 이중 가닥 절단은 2개의 별개의 단일 가닥 절단 사건의 결과로서 일어날 수 있다. DNA 절단으로 인해, 무딘 (blunt) 말단 또는 엇갈린 (staggered) 말단이 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해 융합 폴리펩티드를 사용한다. "절단 도메인"은 DNA 절단을 위한 촉매 활성을 보유하는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 절단 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 함유될 수 있거나 또는 절단 활성은 2개 (또는 그 초과의) 폴리펩티드의 회합으로부터 발생할 수 있다. "절단 하프 (half)-도메인"은 제2 폴리펩티드 (동일하거나 상이함)와 연계해서, 절단 활성 (바람직하게는 이중 가닥 절단 활성)을 지닌 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다. 이중 가닥 파손 및 이중 가닥 절단은 상호 교환가능하게 사용된다.
염색질. 염색질은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA, 및 단백질 (히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질 포함)을 포함한다. 대다수의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하는데, 여기서 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 옥타머 (octamer)와 회합된 DNA의 대략 150개 염기 쌍을 포함하고; 링커 DNA (유기체에 따라 길이가 가변적임)는 뉴클레오솜 코어 사이에서 연장된다. 히스톤 HZ 분자는 일반적으로 링커 DNA와 회합된다. 본원의 개시내용의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 원핵 및 진핵성의 모든 유형의 세포 핵단백질을 포함하는 것을 의미한다. 세포 염색질에는 염색체 염색질과 에피솜 염색질 둘 모두가 포함된다.
결합. 결합은 거대분자들 사이의 (예를 들어, 단백질과 핵산 사이의) 서열-특이적 비-공유 상호 작용을 지칭한다. 총괄적으로 이러한 상호 작용이 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 성분들이 반드시 서열-특이적일 (예를 들어, DNA 백본 내의 포스페이트 잔기와 접촉할) 필요는 없다. 이러한 상호 작용은 일반적으로, 10-6M-1 이하의 해리 상수 (Kd)에 의해 특성화된다. "친화도"는 결합 강도를 나타내고, 결합 친화도 증가는 보다 낮은 Kd와 상호관련된다.
작동성 연결. 용어 "작동성 연결" 및 "작동적으로 연결된" (또는 "작동가능하게 결합된")은 2개 이상의 성분 (예를 들어 서열 요소)의 병렬과 관련하여 상호 교환가능하게로 사용되는데, 이들 성분은 두 성분이 정상적으로 기능하고 적어도 한 가지 성분이 다른 성분 중의 적어도 하나에 대해 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된다. 예시로서, 전사 조절 서열, 예를 들어 프로모터는 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 전사 조절 서열은 일반적으로 코딩 서열에 작동적으로 연결되지만, 코딩 서열에 직접 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 비록 인접하지 않지만 코딩 서열에 작동적으로 연결된 전사 조절 서열이다. 융합 폴리펩티드에 대해, 용어 "작동가능하게 결합된"은 각각의 성분이, 연결되지 않은 경우에 보이는 바와 동일한 기능을 다른 성분에 연결된 상태에서 수행한다는 사실을 나타낼 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드에 대해, 융합 폴리펩티드에서 ZFP DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있고 절단 도메인은 표적 부위 근처에서 DNA를 절단할 수 있다면, ZFP DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은 작동적으로 연결된 상태이다.
서열 특이적 뉴클레아제 (SSN) - 메가뉴클레아제, 류신 지퍼 및 아연 핑거 단백질 (이로 제한되지 않음)과 같은, 특이적이고 독특한 뉴클레오티드 서열 (천연 또는 맞춤형 (customized) 인식 부위)을 인식할 수 있는 몇몇 클래스의 이-기능성 단백질을 포함한다. 메가뉴클레아제는 2가 금속 이온 (Ca, Mn, Mg)의 존재 하에 고특이성으로 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 효소의 패밀리를 나타낸다. 그러나, 이들은 그의 인식 특성 및 구조에서 제한 엔도뉴클레아제와 상이하다 (Belfort, M. Roberts RJ. Homing endonucleases: keeping the house in order; Nucleic Acid Research 1997, 25: 3379-3388). 특히, 제한 효소가 짧은 핵산 서열 (3-8 bp)을 인식하는 경우에, 메가뉴클레아제는 보다 긴 서열 (12-40 bp)을 인식하고 - DSB의 표적화에 대한 개선된 특이성을 제공한다 (Mueller, JE, Bryk, M. Loizos, N. Belfort M. Homing endonucleases. In Nucleases 2nd Edition. Linn, SM, Lloyd, RS, Roberts, RJ (Eds) Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1993 111-143). 류신 지퍼 - 유전자 발현과 연관된 중요한 전사 인자인 많은 진핵 조절 단백질에서 단백질-단백질 상호작용에 관련되는 단백질의 클래스이다. 류신 지퍼는 동물, 식물, 효모 등을 포함한 여러 계 (kingdom) 전반에 걸쳐 이들 전사 인자에 공유된 공통의 구조적 모티프를 지칭한다. 류신 지퍼는 류신 잔기가 α-나선을 통하여 균등하게 이격되어 두 폴리펩티드의 류신 잔기가 나선의 동일한 면 상에서 종결되도록 하는 방식으로 특이적 DNA 서열에 결합하는 두 폴리펩티드 (동종이량체 또는 이종이량체)에 의해 형성된다.
아연 핑거 DNA 결합 단백질. 아연 핑거 DNA 결합 단백질, 즉 ZFP (또는 결합 도메인)은 그의 구조가 아연 이온의 배위를 통하여 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인, 하나 이상의 아연 핑거를 통하여 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질, 또는 보다 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다. 아연 핑거 결합 도메인은 예정된 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 "조작될" 수 있다. 아연 핑거 단백질을 조작하는 방법의 비제한적 예는 설계 및 선택이다. 설계된 아연 핑거 단백질은 그의 설계/조성이 주로 합리적 기준으로부터 비롯되는, 본래 천연 발생적이지 않은 단백질이다. 설계를 위한 합리적 기준에는 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이타의 정보를 저장하고 있는 데이타베이스 내의 정보를 처리하기 위한 컴퓨터화된 알고리즘 및 치환 규칙의 적용이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 6,534,261; 및 6,785,613을 참조하고; 또한 WO 98153058; WO 98153059; WO 98153060; WO 021016536 및 WO 031016496; 및 미국 특허 6,746,838; 6,866,997; 및 7,030,215를 참조한다.
게놈 서열. 게놈 서열은 염색체, 에피솜, 세포소기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 인공 염색체 및 세포 내에 존재하는 임의의 기타 유형의 핵산, 예를 들어, 증폭된 서열 이중 미세 염색체 및 내인성 또는 감염성 세균 및 바이러스의 게놈을 포함한다. 게놈 서열은 정상이거나 (즉, 야생형), 또는 돌연변이체일 수 있고, 돌연변이체 서열은 예를 들어 삽입, 결실, 전좌, 25 재배열 및/또는 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 게놈 서열은 다수의 상이한 대립유전자들 중 하나를 또한 포함할 수 있다.
식물 세포. 식물 세포는 단자엽 (단자엽식물) 또는 쌍자엽 (쌍자엽식물) 식물 또는 조류 (algae) 또는 이끼의 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 단자엽식물의 비-제한적인 예로는 곡초류, 예컨대 옥수수, 쌀, 보리, 귀리, 밀, 수수, 호밀, 사탕수수, 파인애플, 양파, 바나나, 및 코코넛이 포함된다. 쌍자엽식물의 비-제한적인 예로는 담배, 토마토, 해바라기, 면, 사탕무, 감자, 양상추, 멜론, 대두, 매욜라 (평지씨), 및 알팔파가 포함된다. 식물 세포는 식물의 임의의 부분으로부터 및/또는 임의의 식물 발생 단계로부터 수득될 수 있다.
관심 있는 영역. 관심 있는 영역은 핵산 중합체의 임의의 영역, 예를 들어 유전자 또는 유전자 내의 또는 이에 인접한 비-코딩 서열이고, 이것이 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 결합은 표적화 DNA 절단 및/또는 표적화 재조합을 위한 것일 수 있다. 관심 있는 영역은 예를 들어 염색체, 에피솜, 세포 소기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 플라스미드, 감염성 바이러스 게놈, 또는 임의의 다른 뉴클레오티드 서열 내에 존재할 수 있다. 관심 있는 영역은 유전자의 코딩 영역 내에, 전사된 비-코딩 영역, 예를 들어 리더 서열, 트레일러 (trailer) 서열 또는 인트론 내에, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류에 있는 비-전사된 영역 내에 있을 수 있다. 관심 있는 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍 정도로 작을 수 있거나, 또는 길이가 25,000개 이하의 뉴클레오티드 쌍 또는 임의의 정수 값의 뉴클레오티드 쌍일 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따라, 서열 특이적 뉴클레아제를 세포벽을 포함하는 식물 세포 내로 도입하는 방법이 제공되고, 이 방법은 서열 특이적 뉴클레아제 코팅된 나노입자를 식물 세포와 접촉시키고, 식물 세포벽을 통해 흡수되도록 하는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 임의의 나노입자일 수 있고, 가역적으로 또는 비가역적으로 아연 핑거 뉴클레아제, 및/또는 메가뉴클레아제를 함유할 수 있거나, 이로 코팅될 수 있거나, 또는 이들에 다른 방식으로 결합되고/되거나 이들을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 세포벽이 있는 식물 세포와의 접촉 전에 또는 나노입자를 세포벽이 있는 식물 세포에 도입하는 것과 동시에 나노입자에 도입될 수 있다. 본 발명의 실시양태에서 사용할 수 있는 나노입자의 예는 금, 양자점, 금 코팅된 나노입자, 다공성 나노입자, 메조다공성 나노입자, 실리카 나노입자, 중합체 나노입자, 텅스텐 나노입자, 젤라틴 나노입자, 나노쉘, 나노코어, 나노구, 나노막대, 자성 나노입자, 반도체 나노입자, 양자점, 나노매트릭스, 덴드리머 및/또는 이들의 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 실시양태에 따라, 세포벽이 있는 식물 세포는 무손상 및 전체 세포벽을 포함하는 임의의 식물 세포일 수 있다. 본 발명의 실시양태는 임의의 조직으로부터 또는 배아, 분열조직 세포, 캘러스 (callus), 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 꽃, 종자, 꼬투리 (pod), 줄기, 현탁 배양액 및 조직 배양액을 포함하고 이로 제한되지 않는, 이들이 발견되는 모든 부위로부터의 세포벽을 포함하는 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, SSN은 본 발명에 따라 식물 세포에 전달될 수 있는 임의의 ZFN일 수 있다. 예를 들어, ZFN은 절단 도메인 (또는 절단 하프-도메인) 및 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 이러한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드의 조합물을 포함할 수 있다. 아연 핑거 결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 초과의 아연 핑거)를 포함할 수 있고, 관심 있는 임의의 영역에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 절단 또는 재조합을 원하는 관심 있는 표적 게놈 영역을 확인함으로써, 본원에 개시된 방법에 따라, 상기 관심 있는 영역 내의 표적 서열을 인식하도록 조작된 아연 핑거 도메인 및 절단 도메인 (또는 절단 하프-도메인)을 포함하는 하나 이상의 융합 단백질을 구축할 수 있다. 세포 내에 상기 융합 단백질 (또는 단백질들)이 존재하면, 융합 단백질(들)의 이(들)의 결합 부위(들)에 대한 결합 및 상기 관심 있는 영역 내부 또는 근처에서의 절단이 유발될 것이다. 또한, 관심 있는 영역에 상동성인 외인성 폴리뉴클레오티드가 상기 세포 내에 또한 존재하면, 이중 가닥 파손 뉴클레오티드 서열과 외인성 폴리뉴클레오티드 사이에 높은 비율로 상동성 재조합이 발생한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 SSN을 세포에 제공하는 것은 하나 이상의 카피의 SSN 단백질을 나노입자에 의해 세포에 직접 제공하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 SSN을 세포에 제공하는 것은 SSN을 코딩하는 핵산을 포함하는 나노입자를 세포에 제공하고 세포가 상기 핵산으로부터 SSN을 생산하도록 하는 것을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포에 제공되는 하나 이상의 SSN는 하나 이상의 관심 있는 영역에서 또는 그 근처에서 개별적으로, 또는 다른 SSN과 함께 절단할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 관심 있는 영역은 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질의 코딩 서열 내에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 관심 있는 영역은 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 로커스 근처에 및/또는 내부에 존재할 수 있다. 다른 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 관심 있는 단일 영역에서의 이중 가닥 파손부일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 2개 이상의 관심 있는 영역에서의 이중 가닥 파손부일 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 이중 가닥 파손부는 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질의 코딩 서열에 위치할 수 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 이중 가닥 파손부는 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 로커스 근처에 및/또는 내부에 존재할 수 있다.
적어도 2개의 이중 가닥 파손이 이루어지는 특정 실시양태에서, 이중 가닥 파손의 복구는 이중 가닥 파손부 사이의 서열을 절제하기 위해 이중 가닥 파손부 사이의 물질을 제거하고 뉴클레오티드 서열의 말단부를 재연결하는 것을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 절제된 서열은 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 추가의 실시양태에서, 절제된 서열은 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질의 발현을 유도하는 조절 서열을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 그러한 실시양태에서, 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질의 발현은 절단 전의 발현 수준에 비해 감소된다.
적어도 2개의 이중 가닥 파손이 이루어지는 다른 실시양태에서, 이중 가닥 파손부를 복구하는 것은 이중 가닥 파손부 사이의 물질을 제거하고 이를 공여자 서열로 교체하여 이중 가닥 파손부 사이의 서열을 공여자 서열로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제거된 서열은 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 추가의 실시양태에서, 제거된 서열은 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질의 발현을 유도하는 조절 서열을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 그러한 실시양태에서, 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질의 발현은 절단 전의 발현 수준에 비해 감소된다.
1개의 이중 가닥 파손이 이루어지는 실시양태에서, 이중 가닥 파손의 복구는 공여자 서열을 이중 가닥 파손부 내로 또는 그를 가로질러 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 공여자 서열은 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질의 코딩 서열 내로 삽입될 수 있다. 실시양태에서, 그러한 서열의 삽입은 비제한적인 예를 들어, 인-프레임 (in-frame) 중지 코돈의 존재를 통해 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질의 코딩 서열의 전사를 방해할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 공여자는 비제한적으로, 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질의 발현을 수행하는 조절 서열의 기능을 파괴할 수 있다. 실시양태에서, 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질의 발현은 절단 전의 발현 수준에 비해 감소된다.
또 다른 실시양태에서, 공여자 서열은 관심 있는 단백질을 코딩할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 공여자 서열로부터 관심 있는 단백질의 발현은 공여자 서열에 존재하는 조절 서열 및/또는 공여자 서열이 그 내부에 삽입된 서열에 존재하는 조절 서열에 의해 제어되거나, 조절되거나, 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 관심 있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 공여자 서열과 별개로 또는 공여자 서열과 함께 세포에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 서열은 관심 있는 단백질을 코딩하는 서열과 동일한 핵산 분자 내에 함유될 수 있다.
다른 실시양태에서, 높게, 보다 높게, 매우 높게, 또는 가장 높게 발현되는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 비-제한적인 예를 들어 게놈, 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 에피솜, 또는 세포 내의 다른 뉴클레오티드 구조에 위치할 수 있다.
본원에 개시된 방법의 실행 및 조성물의 제조 및 사용은, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 속하는 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야에서의 통상적인 기술을 사용한다. 이들 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001]; [Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 정기적인 개정판]; [the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego]; [Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998]; [METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999]; 및 [METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]을 참조한다.
식물 세포 내로 핵산의 전달
위에서 알 수 있는 바와 같이, DNA 구성체를 다양한 통상적인 기술에 의해 목적하는 식물 숙주 내로 (예를 들어, 목적하는 식물의 게놈 내로) 도입할 수 있다. 이러한 기술에 관한 고찰을 위해, 예를 들어 문헌 [Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463]; 및 [Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9]을 참조한다.
예를 들어, DNA 구성체는 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 마이크로주사와 같은 기술을 이용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입할 수 있거나, 또는 DNA 구성체는 비오리스틱스 방법, 예컨대 DNA 입자 충격을 이용하여 식물 조직 내로 직접 도입할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73] 참조). 별법으로, DNA 구성체는 적합한 T-DNA 측면 영역과 합하고, 이를 통상적인 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 숙주 벡터 내로 도입할 수 있다. 이원 벡터의 완화 (disarming) 및 사용을 포함하는 아그로박테륨 투메파시엔스-매개 형질전환 기술은 학술 문헌에 널리 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Horsch et al. (1984) Science 233:496-498], 및 [Fraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803]을 참조한다.
또한, 유전자 전달은 비-아그로박테리움 세균 또는 바이러스, 예컨대 리조븀 (Rhizobium) 종 NGR234, 시노리조보이움 멜리로티 (Sinorhizoboium meliloti), 메소리조븀 로티 (Mesorhizobium loti), 감자 바이러스 X, 콜리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4]을 참조한다.
또한, 나노입자 또는 서열 특이적 뉴클레아제에 융합된 세포 투과 펩티드가 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 식물 세포 내로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 세포 투과 펩티드는 발현되고, 단리된 후, 식물 세포 내 전달을 위해 나노입자, 뉴클레오티드 서열, 또는 단백질로 관능화될 수 있다. 분자를 식물 세포 내로 기능적으로 전달할 수 있는 세포 투과 펩티드는 당업계에 공지되어 있고, 다음을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다: TAT (Chugh et al., (2008) FEBS 275: 2403-2414); R9 ([Chang et al. (2005) Plant Cell Physiol 46(3): 482-488] 및 [Chen et al. (2007) FEBS Lett 581(9): 1891-1897]); MPG ([Ziegler et al. (2008) Adv Drug Deliver Rev 6: 580-597] 및 [Morris et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2730-2736]); PEP1 (Henriques et al. (2005) Biochemistry-US 44(3): 10189 - 10198); 및 식물 유래 세포 투과 펩티드.
아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 병독성 기능은, 세포가 이원 T DNA 벡터를 이용하여 세균에 의해 감염되거나 (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) 또는 동시-배양 절차 (Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231)에 의해 감염되는 경우에, 구성체 및 인접한 마커가 식물 세포 DNA 내로 삽입되도록 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질감염 시스템을 사용하여 쌍자엽 식물을 조작한다 ([Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384]; [Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641]). 아그로박테리움 형질감염 시스템을 또한 사용하여, DNA를 단자엽 식물 및 식물 세포로 전이시킬 수 있을 뿐만 아니라 형질전환시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,591,616; 문헌 [Hemalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041]; [Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764]; [Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179]; [Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40]; 및 [Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434]을 참조한다.
또 다른 유전자 전달 및 형질감염 방법은 네이키드 (naked) DNA의 칼슘-, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)- 또는 전기천공-매개 흡수를 통한 원형질체 형질감염 (문헌 [Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722]; [Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177]; [From et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828]; 및 [Shimamoto (1989) Nature 338:274-276] 참조) 및 식물 조직의 전기천공 (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 식물 세포를 형질감염시키기 위한 추가의 방법에는 마이크로주사, 탄화규소 매개 DNA 흡수 (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418), 및 미소발사체 (microprojectile) 충격 (문헌 [Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309]; 및 [Gordon-Kim et al. (1990) Plant Cell 2:603-618] 참조)이 포함된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 외인성 서열을 식물 세포 게놈 내의 예정된 위치 내로 삽입할 수 있다. 이는 식물 게놈 내로 도입된 도입유전자의 발현이 결정적으로 그의 통합 부위에 의존하기 때문에 유용하다. 따라서, 예를 들어 영양분, 항생제 또는 치료 분자를 코딩하는 유전자는 표적화 재조합에 의해, 그들의 발현에 호의적인 식물 게놈의 영역 내로 삽입될 수 있다.
상기 임의의 형질감염 기술에 의해 생성되는 형질감염된 식물 세포를 배양하여, 형질감염된 유전자형을 보유하고 따라서 목적하는 표현형을 갖는 전체 식물을 재생할 수 있다. 이러한 재생 기술은 전형적으로 목적하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초제 마커에 따라, 조직 배양 성장 배지에서 특정 식물 호르몬의 조작에 좌우된다. 배양된 원형질체로부터 식물의 재생은 문헌 [Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983]; 및 [Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 기재되어 있다. 재생은 또한, 식물 캘러스, 외식편, 기관, 화분, 배아 또는 그의 일부로부터 수득할 수 있다. 상기 재생 기술은 문헌 [Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에 일반적으로 설명되어 있다.
식물 세포 내로 도입된 핵산을 사용하여 본질적으로 임의의 식물에 대해 목적하는 형질을 부여할 수 있다. 본 개시내용의 핵산 구성체 및 상기 언급된 각종 형질감염 방법을 이용하여, 본원에 기재된 목적하는 생리학적 및 농경학적 특징을 위해 매우 다양한 식물 및 식물 세포 시스템을 조작할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조작하기 위한 표적 식물 및 식물 세포에는 단자엽 및 쌍자엽 식물, 예를 들어 곡물 작물 (예를 들어, 밀, 옥수수, 벼, 기장, 보리), 과일 작물 (예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물 (예를 들어, 알팔파), 근채류 작물 (예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 엽채류 작물 (예를 들어, 양상추, 시금치, 양배추)을 포함한 작물; 화훼 (예를 들어, 페투니아, 장미, 국화), 침엽수 (conifers) 및 소나무 (예를 들어, 소나무, 전나무, 가문비나무); 식물 환경복원에 사용되는 식물 (예를 들어, 중금속 축적 식물); 오일 작물 (예를 들어, 해바라기, 평지씨, 대두, 야자나무) 및 실험용으로 사용되는 식물 [예를 들어, 아라비돕시스 (Arabidopsis)]이 포함되고, 이로 제한되지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 아스파라구스 (Asparagus), 아베나 (Avena), 브라시카 (Brassica), 시트루스 (Citrus), 시트룰루스 (Citrullus), 캡시쿰 (Capsicum), 쿠쿠르비타 (Cucurbita), 다우쿠스 (Daucus), 글리신 (Glycine), 고시퓸 (Gossypium), 호르데움 (Hordeum), 락투카 (Lactuca), 리코페르시콘 (Lycopersicon), 말루스 (Malus), 만니호트 (Manihot), 니코티아나 (Nicotiana), 오리자 (Oryza), 페르세아 (Persea), 피숨 (Pisum), 피루스 (Pyrus), 프루누스 (Prunus), 라파누스 (Raphanus), 세칼레 (Secale), 솔라누른 (Solanurn), 소르굼 (Sorghum), 트리티쿰 (Triticum), 비티스 (Vitis), 비그나 (Vigna), 및 제아 (Zea) 속으로부터의 종을 포함하고 이로 제한되지 않는 광범위한 식물 전반에 걸쳐 사용된다.
당업자는 발현 카세트가 트랜스제닉 (transgenic) 식물에 안정적으로 도입되고 이것이 작동 가능하다는 것을 확인한 후에, 이를 유성 교배에 의해 다른 식물 내로 도입할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 교배하고자 하는 종에 따라, 많은 표준 육종 기술을 사용할 수 있다.
형질감염된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물은 형질감염성 DNA 상에 존재하는 마커 유전자에 의해 코딩되는 형질에 대해, 조작된 식물 물질을 선택 또는 스크리닝함으로써 확인하고 단리할 수 있다. 예를 들어, 선택은 조작된 식물 물질을, 형질감염성 유전자 구성체가 그에 대한 내성을 부여하는 항생제 또는 제초제의 억제량을 함유하는 배지 상에서 성장시킴으로써 수행할 수 있다. 추가로, 형질감염된 식물 및 식물 세포는 또한 재조합 핵산 구성체 상에 존재할 수 있는 임의의 가시적 마커 유전자 (예를 들어, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, B 또는 C1 유전자)의 활성에 대해 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 이러한 선택 및 스크리닝 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
또한, 물리적 및 생화학적 방법을 사용하여, 삽입된 유전자 구성체를 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질감염체를 확인할 수 있다. 이들 방법에는 1) 재조합 DNA 삽입물의 구조를 검출하고 결정하기 위한 서던 (Southern) 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구성체의 RNA 전사체를 검출하고 조사하기 위한 노던 (Northern) 블롯, 프라이머-연장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 이러한 유전자 생성물이 유전자 구성체에 의해 코딩되는 경우, 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소에 의한 분석; 4) 유전자 구성체 생성물이 단백질인 경우, 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 (Western) 블롯 기술, 면역침전 또는 효소 연결 면역분석; 5) 단일 뉴클레오티드 다형성 검출 기술, 인베이더 (invader) 분석, 피로인산 서열결정 (pyrosequencing), 솔렉사 (solexa) 서열결정이 포함되고, 이로 제한되지 않는다. 추가의 기술, 예컨대 계내 혼성화, 효소 염색 및 면역염색을 또한 사용하여, 특이적 식물 기관 및 조직 내에서의 재조합 구성체의 존재 또는 발현을 검출할 수 있다. 이들 모든 분석을 수행하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 개시된 방법을 이용하는 유전자 조작의 효과는 예를 들어 관심 있는 조직으로부터 단리된 RNA (예를 들어, mRNA)의 노던 블롯에 의해 관찰할 수 있다. 전형적으로, mRNA의 양이 증가하였다면, 상응하는 내인성 유전자가 이전보다 더 높은 비율로 발현되는 것으로 추정될 수 있다. 유전자 활성을 측정하는 다른 방법을 사용할 수 있다. 사용된 기질 및 반응 산물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라, 상이한 유형의 효소에 의한 분석을 이용할 수 있다. 또한, 발현된 단백질의 수준은 면역화학적으로, 즉 ELISA, RIA, EIA 및 당업자에게 널리 공지된 기타 항체 기반 분석, 예를 들어 전기영동적 검출 분석 (염색 또는 웨스턴 블롯팅을 이용한다)에 의해 측정할 수 있다. 도입유전자는 식물의 일부 조직에서 또는 일부 발생 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 또는 도입유전자는 실질적으로 그의 전체 생활 주기를 따라 실질적으로 모든 식물 조직에서 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합 발현 양식도 적용 가능하다.
또한, 본 개시내용은 도입유전자 또는 유전자 구성체를 갖는, 상기 설명된 트랜스제닉 식물의 종자를 포함한다. 본 개시내용은 추가로 도입유전자 또는 유전자 구성체를 갖는, 상기 설명된 트랜스제닉 식물의 자손체, 클론, 세포주 또는 세포를 포함한다.
용도
표적화된 절단을 위한 개시된 방법 및 조성물을 사용하여, 게놈 서열에서 돌연변이를 유도할 수 있다. 또한, 표적화된 절단을 유전자 낙-아웃 (knock-out) 또는 유전자 낙-다운 (knock-down)을 생성시키는데 (예를 들어, 기능 유전체학 (genomics) 또는 표적 확인을 위해), 및 게놈 내로의 서열의 표적화된 삽입 (즉, 유전자 낙-인 (knock-in))을 촉진하는데 사용할 수 있다. 비-제한적인 예로써, 상동성 재조합을 통한 염색체 서열의 재배치에 의해, 또는 새로운 서열 (즉, 관심 있는 영역에 존재하지 않는 서열)이 예정된 표적 부위에서 삽입되는 표적화된 통합에 의해 삽입이 이루어질 수 있다. 특정 예에서, 그러한 새로운 서열은 염색체 내의 관심 있는 영역에 상동성인 서열의 측면에 인접할 수 있다. 또한, 동일한 방법이 야생형 서열을 돌연변이체 서열로 교체하기 위해, 또는 한 대립유전자를 상이한 대립유전자로 전환하기 위해 사용할 수 있다.
감염성 또는 통합된 식물 병원체의 표적화된 절단을 사용하여, 예를 들어, 병원체의 게놈을 절단하여 그의 병원성이 감소 또는 제거되도록 함으로써 식물 숙주에서의 병원체 감염을 치료할 수 있다. 추가로, 식물 바이러스에 대한 수용체를 코딩하는 유전자의 표적화된 절단을 사용하여, 상기 수용체의 발현을 차단함으로써 식물에서의 바이러스 감염 및/또는 바이러스 확산을 방지할 수 있다.
예시적인 식물 병원체로는 식물 바이러스, 예컨대 알파모바이러스 (Alfamovirus), 알파크립토바이러스 (Alphacryptovirus), 바드나바이러스 (Badnavirus), 베타크립토바이러스 (Betacryptovirus), 비게미니바이러스 (Bigeminivirus), 브로모바이러스 (Bromovirus), 비모바이러스 (Bymovirus), 카필로바이러스 (Capillovirus), 카를라바이러스 (Carlavirus), 카르모바이러스 (Carmovirus), 카울리모바이러스 (Caulimovirus), 클로스테로바이러스 (Closterovirus), 코모바이러스 (Comovirus), 쿠쿠모바이러스 (Cucumovirus), 사이토랍도바이러스 (Cytorhabdovirus), 디안토바이러스 (Dianthovirus), 에나모바이러스 (Enamovirus), 파바바이러스 (Fabavirus), 피지바이러스 (Fijivirus), 푸로바이러스 (Furovirus), 호르데이바이러스 (Hordeivirus), 히브리게미니바이러스 (Hybrigeminivirus), 이다에오바이러스 (Idaeovirus), 일라르바이러스 (Ilarvirus), 이포모바이러스 (Ipomovirus), 루테오바이러스 (Luteovirus), 마클로모바이러스 (Machlomovirus), 마클루라바이러스 (Macluravirus), 마라피바이러스 (Marafivirus), 모노게미니바이러스 (Monogeminivirus), 나나바이러스 (Nanavirus), 네크로바이러스 (Necrovirus), 네포바이러스 (Nepovirus), 누클레오랍도바이러스 (Nucleorhabdovirus), 오리자바이러스 (Oryzavirus), 오우르미아바이러스 (Ourmiavirus), 파이토레오바이러스 (Phytoreovirus), 포텍스바이러스 (Potexvirus), 포티바이러스 (Potyvirus), 라이모바이러스 (Rymovirus), 위성 WAS, 새틀리바이러스 (satellivirus), 세퀴바이러스 (Sequivirus), 소베모바이러스 (Sobemovirus), 테누이바이러스 (Tenuivirus), 토바모바이러스 (Tobamovirus), 토브라바이러스 (Tobravirus), 톰부스바이러스 (Tombusvirus), 토스포바이러스 (Tospovirus), 트리코바이러스 (Trichovirus), 티모바이러스 (Tymovirus), 움브라바이러스 (Umbravirus), 바리코사바이러스 (Varicosavirus) 및 와이카바이러스 (Waikavirus); 진균 병원체, 예컨대 흑수병 (예를 들어, 유스틸라기날레스 (Ustilaginales)), 녹병 (유레디날레스 (Uredinales)), 맥각병 (클라비셉트스 푸푸레아 (Clavicepts pupurea)) 및 노균병; 곰팡이 (mold) (오오마이세테스 (Oomycetes)), 예컨대 파이토프토라 인펜스탐 (Phytophthora infestam) (감자 잎마름병); 세균 병원체, 예컨대 에르위니아 (Erwinia) (예를 들어, 에르위니아 헤르비콜라 (E. herbicola)), 슈도모나스 (Pseudomonas) (예를 들어, 슈도모나스 애루기노사 (P. aeruginosa), 슈도모나스 시린가에 (P. syringae), 슈도모나스 플루오레센스 (P. fluorescens) 및 슈도모나스 푸티다 (P. putida)), 랄스토니아 (Ralstonia) (예를 들어, 랄스토니아 솔라나세아룸 (R. solanacearum)), 아그로박테리움 및 잔토모나스 (Xanthomonas); 회충 (네마토다 (Nematoda)); 및 파이토믹세아 (Phytomyxea) (폴리믹사 (Polymyxa) 및 플라스모디오포라 (Plasmodiophora))가 포함되고, 이로 제한되지 않는다.
관심있는 단백질의 표적화된 재조합 제조를 위한 개시된 방법을 사용하여, 임의의 게놈 서열을 동일하지 않은 서열로 교체할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 게놈 서열을 그의 야생형 대응물로 교체함으로써, 식물 질병의 치료 방법을 제공하고, 식물 병원체에 대한 저항성을 제공하고, 작물 수율을 증가시키는 것 등이 가능하다. 유사한 방식으로, 본원에 개시된 표적화된 재조합 방법을 사용하여 유전자의 한 대립유전자를 다른 대립유전자로 교체할 수 있다.
많은 상기 사례에서, 관심 있는 영역은 돌연변이를 포함하고, 공여자 폴리뉴클레오티드는 상응하는 야생형 서열을 포함한다. 유사하게, 바람직한 경우에, 야생형 게놈 서열이 돌연변이체 서열로 교체될 수 있다. 예를 들어, 종양유전자의 과발현은 유전자를 돌연변이시킴으로써 또는 그의 제어 서열을 더 낮은 비-병리학적 수준의 발현을 지지하는 서열로 교체함으로써 역전될 수 있다. 실제로, 임의의 방식으로 특정 게놈 서열에 의존하는 모든 병상을 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 수정 또는 경감시킬 수 있다.
표적화된 절단, 삽입, 절제 및/또는 재조합은 비-코딩 서열 (예를 들어, 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 개시인자, 종결자, 스플라이스 부위)을 변경시켜 유전자 생성물의 발현 수준을 변경시키는데 또한 사용될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어 치료 목적, 기능성 유전체학 및/또는 표적 확인 연구를 위해 사용될 수 있다.
염색질 구조의 표적화된 변형을 사용하여, 세포 염색질에 대한 융합 단백질의 결합을 촉진할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 아연 핑거 결합 도메인과 재조합효소 (또는 그의 기능성 단편) 사이의 하나 이상의 융합물을 본원에 개시된 아연 핑거-절단 도메인 융합물에 추가하여 또는 이러한 융합물 대신 사용하여, 표적화된 재조합을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 6,534,261 및 [Akopian et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8688-8691]을 참조한다. 추가의 실시양태에서, 개시된 방법 및 조성물을 사용하여, 그의 활성을 위해 이량체화 (동종이량체화 또는 이종이량체화)를 필요로 하는 전사 활성화 또는 억제 도메인과 ZFP 결합 도메인의 융합물을 제공한다. 이러한 경우에서, 융합 폴리펩티드는 아연 핑거 결합 도메인 및 기능성 도메인 단량체 (예를 들어, 이량체성 전사 활성화 또는 억제 도메인으로부터의 단량체)를 포함한다. 2개의 상기 융합 폴리펩티드가 적합하게 놓인 표적 부위에 결합하면, 기능성 전사 활성화 또는 억제 도메인이 재구성되도록 이량체화를 허용한다.
또한, 상기 개시된 바와 같이, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 세포의 게놈 내의 관심 있는 영역, 예를 들어 절단이 상동성-의존성 메카니즘을 통한 삽입 (예를 들어, 예정된 게놈 서열 (즉, 표적 부위)과 동일하거나 또는 동일하지 않지만 상동성인 하나 이상의 서열과 함께 외인성 서열을 포함하는 공여자 서열의 삽입)을 향상시키는 영역 내로 외인성 서열을 표적화하여 통합시키는데 사용될 수 있다.
공여자 서열은, 외인성 서열의 측면에 인접하는 영역 내에, 게놈 서열 내의 이중 가닥 파손부의 상동성-지정 복구를 지지하는 충분한 상동성을 함유함으로써, 게놈 표적 부위에 외인성 서열을 삽입할 수 있다. 따라서, 공여자 핵산은 상동성-의존성 메카니즘 (예를 들어, 상동성 재조합)에 의한 외인성 서열의 통합을 지지하는데 충분한 임의의 크기일 수 있다. 임의의 특정 이론에 제한되기를 원치 않지만, 외인성 서열의 측면에 인접한 상동성 영역은 파손된 염색체 말단에 이중 가닥 파손 부위에서의 유전자 정보의 재합성을 위한 주형을 제공하는 것으로 생각된다. 특정 실시양태에서, 2개의 동일한 서열 또는 2개의 동일하지 않지만 상동성인 서열 (또는 각각 1개)가 외인성 서열의 측면에 인접하여 존재한다. 외인성 서열 (또는 외인성 핵산 또는 외인성 폴리뉴클레오티드)은 정상적으로는 관심 있는 영역 내에 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 서열이다.
예시적인 외인성 서열은 cDNA, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 에피토프 태그 (tag), 마커 유전자, 절단 효소 인식 부위 및 다양한 유형의 발현 구성체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 6,833,252를 참조한다. 추가의 예시적인 귀소성 (homing) 엔도뉴클레아제에는 I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, ICreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TaiIII이 포함된다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 5,420,032; 문헌 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]; [Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118]; [Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127]; [Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228]; [Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180]; [Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353] 및 [뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs) 카탈로그]을 참조한다.
마커 유전자는 항생제 내성 (예를 들어, 앰피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 푸로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 코딩하는 서열, 유색 또는 형광 또는 발광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시퍼라제)을 코딩하는 서열, 및 향상된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질 (예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 따라서, 예시적인 마커 유전자는 β-글루쿠로니다제 (GUS), 포스피노트리신 N-아세틸 트랜스페라제 (PAT, BAR), 네오마이신 포스포트랜스페라제, p-락타마제, 카테콜 디옥시게나제, a-아밀라제, 티로시나제, P-갈락토시다제, 루시퍼라제, 아에쿠오린, EPSP 합성효소, 니트릴라제, 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 달라폰 데할로게나제 및 안트라닐레이트 합성효소를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, RNA 발현 구성체, 예를 들어 마이크로 RNA 또는 siRNA의 조절된 발현을 담당하는 서열을 삽입하기 위해 표적화된 통합이 사용된다. 또한, 상기 설명된 바와 같은 프로모터, 인핸서 및 추가의 전사 조절 서열이 RNA 발현 구성체 내로 혼입될 수 있다.
통상적인 형질전환은 일부 외국 시장에서 엄격하게 제한되는 선택되는 형질을 갖는 변형된 트랜스제닉 작물 식물을 생성하기 위해 외래 DNA의 무작위 통합을 이용한다. 또한, DNA 도입 방법에 의해 또는 도입유전자를 게놈의 민감한 영역 내로, 종종 게놈당 많은 횟수로 무작위로 삽입하는 것에 의해 바람직하지 않은 결과가 발생한다. 특히, 부정확한 삽입의 효과는, 상이한 DNA 오류 점검 (error-checking) 메카니즘이 성장, 생식, 배아 발생 및 발달 동안 활성화되기 때문에 초기 세대에서는 나타나지 않을 수 있다. 상기 결과는 농업 생물공학에서 임의의 트랜스제닉 프로그램의 비용과 시간에 대해 큰 영향을 준다. 그러나, 최근의 다우 아그로사이언시즈 (Dow AgroSciences) 발명 (WO/2008/021207)에, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 매개 상동성 재조합을 통한 도입유전자의 정확한 삽입 방법이 기재되어 있다. 반대로, ZFN 단백질이 표적 유기체의 외부에서 발현되고 정제된 후, 표적 식물 세포 내로 전달될 수 있는 경우에, 수술에 의한 특이적인 돌연변이/유전자 낙-아웃은 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)을 통해 유도될 수 있다. 따라서, 본 발명은 트랜스제닉 작물에 대한 제한을 우회하는 비-트랜스제닉 유전자 변형 식물을 생성할 수 있고, 트랜스제닉 방법을 필요로 하지 않으면서 표적화된 유전자 편집 과정을 수행할 수 있을 것이다.
서열 특이적 뉴클레아제 단백질, 예를 들어 ZFN 단백질의 이종성 발현을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 적용가능한 발현 시스템은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 시험관내 시스템의 사용, 예를 들어 밀 생식세포 미함유 시스템 (미국 특허 7,235,382, 본원에 참고로 포함됨); 슈도모나스 형광 발현 시스템 (Madduri et al. (2007) Protein Expres Purif, 55(2): 352-360); 및 피치아 (Pichia) 단백질 발현 시스템 (미국 특허 4,683,293; 4,808,537; 4,812,405; 4,818,700; 4,837,148; 4,855,231; 4,857,467; 4,879,231; 4,882,279; 4,885,242; 4,895,800; 4,929,555; 5,002,876; 5,004,688; 5,032,516; 5,122,465; 5,135,868; 5,166,329 참조, 본원에 참고로 포함됨).
본 발명의 특정 실시양태는 나노입자 (NP)에 접합되고 NP 매개 스마트한 비밀 (smart and stealthy) 전달 방법을 통해 무손상 식물 세포 내로 전달되어 이중 가닥 파손 및 NHEJ에 의한 파괴된 유전자의 기능성의 복구를 유도하는 외인성으로 발현된 기능성 ZFN을 포함한다. 다른 실시양태에서, NP에 접합된 기능성 ZFN은 NP 매개 스마트한 비밀 전달 방법을 통해 DNA의 공여자 단편과 함께 전달된다. ZFN은 게놈 내의 특이적 서열을 절단하고, 공여자 DNA는 상동성 재조합을 통해 상기 로커스 내로 통합된다. 단백질을 NP에 연결하는 전략은 다음과 같은 4가지의 주요 방법을 취하였다: (1) 정전기 흡착, (2) NP 표면 상의 리간드에 대한 접합, (3) 단백질이 인식하고 결합할 수 있는 작은 보조인자 분자에 대한 접합, 및 (4) NP 표면에 대한 직접 접합 (Aubin-Tam and Hamad-Schifferli, 2008). 다른 전략은 메딘츠 (Medintz) 등의 리뷰에 기재되어 있다. 상기 표지 전략에 수반되는 문제는 입체 구조, 또는 단백질이 리간드를 '지나쳐서' NP 표면 또는 관련 연결기에 도달할 수 있는지의 여부를 포함한다. 특이적인 연결을 유발하고 (즉, 광범한 가교결합을 야기하지 않고) 요구되는 목적에 안정한 화학의 선택도 필요한 고려사항이다. ZFN 펩티드는 높은 DDT 농도 하에 및 아연 이온의 존재 하에 관능화되는 것이 필요하다. 접합체의 안정성을 유지하기 위해서, 관능화는 문헌 [Oh et al., 2010]에 기재된 접합 절차에 따라 수행될 것이다.
본 발명은 다음 예시적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1: 시험관내 번역 또는 세균 발현을 통한 서열 특이적 뉴클레아제 (SSN)의 생산.
SSN (IL1-LO/FokI, IL1-43/FokI, IL1-8/FokI 및 I-SceI)을 조작하고, 제한 효소 부위 및 6x 히스티딘 태그에 부착하는 SSN을 함유하는 플라스미드로부터 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 클로닝 및 서열결정을 위해 TOPO 벡터 pCR2.1 내로 삽입하였다. 서열을 코딩하는 SSN을 함유하는 유전자 단편을 제한 소화를 통해 플라스미드로부터 제거하고, 발현 벡터 pET15b의 적합한 제한 부위 내로 라이게이팅하였다. 이들 샘플을 pDAB4883과 함께 BL21 발현 반응능 (competent) 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시켰다. 효과적인 발현을 위해, BL21을 또한 IPTG (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)에 의해 유도되는 프로모터의 하류에 리가제 유전자를 함유하는 pCOT4 발현 플라스미드로 이루어지는 플라스미드 pDAB4883으로 형질전환시킴으로써, BL21 이. 콜라이 DNA 내에서 SSN 단백질 손상을 감소시켰다. 이것은 과다발현 동안 BL21 세포의 게놈에 대해 SSN에 의해 이루어진 임의의 손상을 복구하는 것을 돕는다.
리가제 유전자-pCOT4 구성체 및 SSN-pET15b 구성체를 동일한 BL21 발현 세포 내로 동시-형질전환시켰다. 트랜스제닉 BL21의 배양액을 클로람페니콜, 카르베니실린, 및 ZnCl2를 함유하는 50 mL LB 배지 내에서 성장시키고, OD600nm가 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 인큐베이팅하였다. 다양한 농도의 IPTG (0.1-0.7 mM)을 사용하여 발현을 유도하고, 다양한 온도 (16-28℃)에서 인큐베이팅하고, SSN 단백질의 존재 검출을 위해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 (Western Blot)을 통해 분석하였다. 따라서, IL1-LO/FokI, IL1-43/FokI, IL1-8/FokI 및 I-SceI을 이. 콜라이 세포 내에서 발현시키고, Ni-NTA 정제하였다. 정제 후에, 발현 플라스미드로부터 특이적 단편을 방출하는 능력에 기초하여 SSN 기능을 입증하였다.
별법으로, 서열 특이적 뉴클레아제를 시험관내 번역을 통해 발현시켰다. 시판 키트 TNT® (프로메가 (Promega))은 단백질을 발현시키기 위한 효율적이고 편리한 공정을 제공한다. T7 또는 SP6 RNA 중합효소 프로모터로부터 하류에 클로닝된 서열 특이적 뉴클레아제 유전자를 함유하는 원형 플라스미드를 키트 내에 제공된 단백질 발현 효소를 사용하여 시험관내 발현시켰다. 합성된 단백질은 제조자 프로토콜에 따라 50 ㎕ 반응물 내에서 60-90분 이내에 생산하였다. 단백질의 시험관내 번역을 위해 추가의 시판 키트가 이용가능하고, 사용할 수 있는 추가의 키트는 다른 상업상 이용가능한 키트에 추가로 ActivePro™ (앰비온 (Ambion)), PROTEINscript™ II (앰비온), PURExpress™ (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 포함한다.
도 1 및 2는 히스티딘-태깅된 (1) 및 히스티딘 태깅되지 않은 (2) SSN, ZFN-IL1FokI의 이. 콜라이 발현을 보여준다. 시험관내 발현된 ZFN-IL1FokI은 플라스미드로부터 잘 규정된 ZFN-결합 부위가 측면에 인접하는 단편을 방출시킨다. 따라서, 이. 콜라이 발현된 SSN 및 시험관내 발현된 SSN은 둘 모두 표적 DNA 분자의 효율적이고 특이적인 소화를 위해 유용하고, 이들은 본 조사 내내 교대로 사용된다.
클로닝된 SSN 유전자로부터 발현된 단백질은 기능성 (즉, 공여자 DNA를 절단하는데 있어서)인 것으로 나타난다. 예를 들어, 플라스미드 pDAB1585 (도 4에 도시됨)를 ZFN-IL1FokI로 처리하였다. 소화된 플라스미드 DNA는 선형화되었다. 이어서, ZFN-IL1FokI-소화된 플라스미드로부터 선형화된 단편을 겔로부터 정제하고, 철야 시험관내 라이게이션 절차를 이용하여 자가-라이게이팅시켰다. 라이게이션 생성물을 화학적 반응능 DH5α 이. 콜라이 세포 내로 전달하였다. 몇몇 재조합 콜로니를 회수하고 제한 패턴 분석 및 DNA 서열결정 모두에 의해 분석하였고, 이는 pDAB1585가 예상된 대로 소화되었음을 입증한다.
실시예 2 - GFP 리포터 유전자 단편이 측면에 인접하는 SSN 결합 부위를 사용한 표적 세포 배양액의 생산.
표적 서열은 β-글루쿠로니다제 (uidA) 발현 카세트의 측면에 인접하는 2개의 녹색 형광 단백질 (gfp) 유전자 단편 (에브로겐 조인트 스톡 컴퍼니 (Evrogen Joint Stock Company, 러시아 모스코바))으로 이루어진다. 하나의 표적 구성체에서, 그에 대해 아연 핑거-FokI 융합 단백질이 동종이량체로서 결합할 수 있는 역전된 반복체로 이루어지는 인식 서열을 갖는 ZFN 결합 부위 (도 3)를 표적 구성체 내로 통합시켰다. 결합 부위는 IL1-FokI 융합 단백질의 인식 서열의 4개의 직렬 반복체를 포함하고, 따라서, 인식 서열이 복잡한 염색질 환경 내에서 아연 핑거-FokI 융합 단백질에 접근가능하도록 보장하기 위해 각각의 결합 부위의 크기는 ~200 bp이다. 제2 구성체에서, I-SceI 결합 부위를 표적 구성체 내로 통합시켰다 (도 6). 각각의 표적 구성체에서, 결합 부위를 N-말단에서 uidA 코딩 서열과 융합시켰다. 5' 및 3' gfp 유전자 단편은 540 bp가 겹친다. 이들 겹치는 서열은 표적 서열 내에서 상동성을 제공하고, 표적 서열로부터 기능성 gfp 전사가 없도록 보장하기 위해 중지 코돈을 5' gfp 단편의 3' 단부에 삽입하였다.
표적 서열을 아그로박테리움 형질전환을 이용하여 BY2 담배 세포 현탁 배양액 내로 안정하게 통합시켰다. BY2 배양액 (재팬 토바코 (Japan Tobacco, 일본 시즈오카 이와타)의 준 우에키 (Jun Ueki)로부터 입수함)을 6.0의 pH에서 LS 기초 염 (파이토테크놀로지 랩스 (PhytoTechnology Labs, 미국 캔자스주 쇼니 미션), #L689), 170 mg/L KH2PO4, 30 g/L 수크로스, 0.2 mg/L 2,4-D 및 0.6 mg/L 티아민-HCl을 함유하는 배지 내에 유지시켰다. 25℃ 및 125 RPM에서 회전 진탕기 상에서 250-mL 플라스크 내에서 0.25 mL PCV를 50 ml의 유지된 LS-기반 배지에 첨가함으로써, BY2 세포를 7일 마다 계대-배양하였다. 통합된 표적 서열을 갖는 트랜스제닉 BY2 세포 배양액을 생성하기 위해, 4일 후 계대-배양 현탁액의 하나의 플라스크를 4개의 10-12 mL 분취액으로 나누고, 이를 pZFN-TARGET pDAB1585 (도 4) 또는 pI-SceI-TARGET pDAB100375 (도 7)를 보유하는 100 ㎕ 아그로박테리움 균주 LBA4404가 존재하는 100x25 mm 페트리 (Petri) 접시 내에서 동시-배양하고 OD600 ~1.5로 철야 성장시켰다. 접시를 네스코필름 (Nescofilm)® (아즈웰 인크. (Azwell Inc., 일본 오사카))으로 싸고, 진탕하지 않으면서 3일 동안 25℃에서 인큐베이팅하고, 그 후 과잉의 액체를 제거하고 500 mg/L 카르베니실린을 함유하는 LS 배지 11 ml로 교체하였다. 담배 세포의 재현탁 후에, 1 mL 현탁액을 8 g/L TC 한천 (파이토테크놀로지, 미국 캔자스주 쇼니 미션)으로 응고시킨, 500 mg/L 카르베니실린 및 200 mg/L 히그로마이신을 함유하는 LS 배지의 100x25 mm 플레이트 상에 분배하였다. 플레이트를 암소에서 28℃에서 싸지 않은 상태로 인큐베이팅하였다. 이렇게 하여 단일 처리를 위해 120-144 선택 플레이트를 생성하였다. 개별 히그로마이신-내성 단리물이 플레이팅의 10-14일 후에 나타났고, 이를 개별 60x20 mm 플레이트 (플레이트당 1개의 단리물)로 옮기고, 여기서 이들을 분석 및 후속적인 재형질전환 실험을 위해 필요할 때까지 14-일 계대-배양 스케줄로 캘러스로서 선택 하에 유지하였다.
표적 서열의 단일의 전장 통합된 카피를 함유하는 히그로마이신-내성 트랜스제닉 세포 배양액을 선택하고 이를 사용하여 ~250-500 mg의 캘러스 조직을 100 mg/L 히그로마이신을 함유하는 LS 기초 배지 40-50 ml에 넣고 상기한 바와 같이 7일 마다 계대-배양함으로써 현탁 배양을 재개시하였다.
세포 클러스터 (cluster) 및 단일 세포 (DAS 단일 세포 특허 출원, WO/2008/083233에 설명된 바와 같이 생산됨)를 실험에서 사용하였다. 실험 3 내지 4일 전에, 2 ml의 BY2 현탁 응집물을 250-mL 플라스크 내에서 4-클로로-1,5-디페닐-1H-피라졸-3-일옥시)-아세트산 에틸 에스테르 (특허 WO/2008/083233에 설명된 바와 같이), 1-3% 글리세롤, 및 0.05-0.1% (v/v) DMSO의 원액 농도를 함유하는 LSBY2 배지 40 ml에 전달함으로써, 1주령 현탁 배양액을 신선한 배지로 계대-배양하였다. 단일 세포를 유도하기 위해 처리 후 3.5일 또는 7일에 단일 세포를 수집하였다. BY2 단일 세포를 유동-세포측정기 (Flow-cytometer)를 통해 처리하여 세포의 생활력을 결정하고 또한 공초점 현미경을 통해 세포의 안정성을 평가하였다. 안정성은 존재하는 경우에 배경 형광의 수준을 관찰함으로써 검출하였다. 적은 비율의 세포는 죽은 세포에 일치하는 배경 형광을 보이고, 이것은 배경 형광이 괴사를 겪은 세포로부터 기인함을 나타낸다. 배경 형광에 대해 시험한 후에 단일 세포 및 보통의 현탁액 응집을 실험에서 사용하였다.
실시예 3- 식물 세포 내로 전달하기 위해 SSN 을 사용한 나노입자 ( NP )의 코팅.
크기 150 nm 직경의 금 콜로이드 (비비아이 인터내셔널 (BBI International), GC150), 5-((2-(및-3)-S (아세틸메르캅토)숙시노일)아미노)플루오레세인 (SAMSA 플루오레세인: 인비트로겐 (Invitrogen), A-685), 크기 80 및 90 nm의 의 나노입자 카르복실산 다관능화된 금 콜로이드 (테드펠라 (TedPella), 32019), 술포-NHS (N-히드록시술포숙신이미드), EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염) (피어스 바이오테크놀로지 (Pierce Biotechnology), 24510, 22980), MES (2-[N-모르폴리노]에탄 술폰산) (피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific), AC32776-1000), 포스페이트 완충 염수 버퍼 패킷 (packet) (시그마, P5368-10PAK), 히스티딘 태깅된 GFP (에브로겐, 최대 여기 - 482 nm, 최대 방출 - 502 nm, FP611), 터보 YFP (에브로겐, 최대 여기 - 525 nm, 최대 방출 - 538 nm, FP611), 프로피듐 요오다이드 (시그마-P4864), 플루오레세인 디아세테이트 (시그마, F7378)가 SSN으로 코팅되고 표적 세포 배양액 내로 전달을 위해 사용되는 다관능화된 NP의 종류이다.
(i) 나노입자 접합체의 제조
(a) 대조 처리를 위한 SSN이 없는 금-플루오레세인 접합체의 합성: 금-플루오레세인 접합체는 SSN이 없이 BY2 클러스터 또는 단일 세포 내에서 입자를 전달 및 추적하기 위해 이전에 설명된 방법 (Cannone et al. 2006)에 의해 제조하였다. 1 mg의 SAMSA 플루오레세인을 100 ㎕의 0.1 M NaOH 내에 용해시키고, 티올을 보호하는 아세틸기를 제거하기 위해 15분 동안 볼텍싱하였다. 이어서, 활성화된 SAMSA를 100 ㎕의 150 nm 금 콜로이드 (~109 입자/mL)과 혼합하였다. 이어서, 상기 용액을 반응 완료를 보장하기 위해 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 50 ㎕의 1 M HCl을 첨가하여 용액을 중화시켰다. 용액을 3000 RPM에서 30분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 수득한 황색 펠렛을 200 ㎕의 0.1 M PBS 내에 재현탁시켜, 오렌지색 용액을 얻었다. 유리 SAMSA 플루오레세인의 제거를 보장하기 위해, 상기 정제 단계를 2회 반복하였다. 금에 대한 SAMSA의 부착 방식은 주로 티올 결합을 통한 것이다. 유의한 정전기 반발력 때문에 (SAMSA는 pH>7에서 이가 음이온성이다), SAMSA는 금 콜로이드성 표면에 대해 수직으로 누워있는 것으로 생각된다 (Cannone et al. 2006). 그러한 NP는 주어진 조건에서 세포 순종성 (amenability)의 표시의 척도로서 세포 내로 들어오는 그러한 형광 입자의 수의 진입 (entry)을 추적하기 위해 사용된다.
(b) SSN으로 코팅된 금 나노입자 (GNP)의 합성: GNP-SSN 접합체를 문헌 [Grabarek and Gergely, 1990]에 설명된 약간 변형된 프로토콜을 이용하여 합성하였다. 0.25 ml의 20-150 nm 카르복실산 다관능화된 금 콜로이드성 용액 (~109 입자/mL)을 3000 RPM에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 폐기한 후, 적색 펠렛을 1 ml의 활성화 버퍼 (0.1 M MES, 0.5 M NaCl, pH 6.0) 내에 현탁시켰다. 그 후, 0.4 mg EDC 및 1.1 mg의 술포-NHS를 상기 용액에 첨가하고 15분 동안 실온에서 볼텍싱하였다. 이어서, 9 ㎕의 ZFN-IL1FokI을 첨가하고, 단백질 및 금이 완전히 반응하도록 생성되는 용액을 암소에서 실온에서 2시간까지 인큐베이팅하였다. 상기 반응에서 사용된 금 콜로이드 및 단백질의 비는 금 콜로이드 상에 존재하는 카르복실산의 수를 밝힘으로써 결정하였다. 먼저, 하나의 금 콜로이드 상에 존재하는 제1의 카르복실기의 수를, 하나의 금 입자 (구체 가정)의 표면적을 하나의 카르복실기가 차지하는 표면 (0.20 nm2 (Kimura et al. 2002))으로 나눔으로써 계산하였다. 이어서, 상기 결과에 존재하는 금 콜로이드의 총 수를 곱하여, 전체 금 콜로이드성 용액 내에 존재하는 카르복실기의 총 수를 얻었다. 이것을 주어진 양의 단백질 내에 존재하는 아미노기의 수와 동등시한다. 금 콜로이드는 금 콜로이드 상에 존재하는 카르복실산 및 단백질 상에 존재하는 아미노기 사이의 아미드 결합의 형성을 통해 단백질에 부착한다 (Grabarek and Gergely, 1990). 대략 127,285개의 단백질 분자가 하나의 금 나노입자에 묶여 있다.
( ii ) 세포 처리:
a) 금 흡수 및 세포 생활력의 시간 경과: 다음 샘플을 24 웰 멸균 플레이트에서 제조하였다: (i) 500 ㎕의 표적 현탁액 클러스터 또는 단일 세포 (대조군); (ii) 500 ㎕의 BY2 현탁액 클러스터 또는 단일 세포 + 20 ㎕의 GNP + 25 ㎕의 플루오레세인 디아세테이트 (FDA) + 25 ㎕의 프로피듐 요오다이드; 및 (iii) 다른 처리제는 세포 및 세포 생활력 염색과 함께 40, 60, 80 ㎕의 GNP를 단독으로 및 ZFN-IL1FokI과 조합으로 포함한다. 세포 생활력을 확인하기 위해, 처리된 샘플을 5, 20, 120 min에 및 마지막으로 24-48 hr 후에 형광 현미경 하에 검사하였다.
b) 금-SAMSA 플루오레세인 처리: 실험 전에 다음 샘플을 24 웰 멸균 플레이트에서 제조하였다: (i) 500 ㎕의 표적 현탁액 클러스터 또는 단일 세포 (대조군); (ii) 500 ㎕의 표적 현탁액 클러스터 또는 단일 세포 + 20 ㎕의 SAMSA-플루오레세인 (대조군); 및 (iii) 표적 현탁액 클러스터 또는 단일 세포 + 20 ㎕의 GNP-SAMSA-플루오레세인을 처리하고, 입자의 진입을 확인하기 위해 현탁액을 암소에서 실온에서 20분 동안 인큐베이팅하였다.
c) GNP 코팅된 (예를 들어, 태깅된) ZFN-IL1FokI 처리 - 세포 또는 현탁액 클러스터 처리 전에 다음 샘플을 24 웰 멸균 플레이트에서 제조하였다: (i) 500 ㎕ 표적 현탁액 클러스터 또는 단일 세포 (대조군); (ii) 500 ㎕ 표적 현탁액 클러스터 또는 단일 세포 + 9-20 ㎕의 ZFN (대조군); 및 (iii) 500 ㎕의 단일 세포 + 10-40 ㎕의 GNP-코팅된 (예를 들어, 태깅된) ZFN-IL1FokI. 처리된 세포 및 클러스터를 실험 전에 암소에서 실온에서 2시간까지 인큐베이팅하였다.
비-침습적 투과 및 실험에서 지침으로서 사용되는 최적 진입의 타이밍을 보장하기 위해, GFP/GNP에 묶인 YFP를 사용한 대조군 처리를 모든 실험에 포함시켰다 (도 5 참조). 또한, 표적 현탁액 클러스터 및 단일 세포 내로 입자의 실시간 진입을 추적하기 위해, 융합 세포 투과 펩티드 (CPP)를 NP에 융합시켰다 (예를 들어, 다관능화시켰다).
실시예 4: 양자점 ( QD )-태깅된 SSN 접합체의 합성.
발광 반도체 나노결정 QD는 많은 증명된 생물학적 용도를 갖는 강력한 원형적인 예를 제공한다 ([Thermes V, et al. 2002]; [Windbichler et al., 2007]; [Fajardo-Sanchez et al., 2008]; [Arnould S, et al., 2006]). 그의 유용성은 독특한 광물리학적 특징 및 큰 단백질에 대등한 크기의 조합에서 기인한다. 친수성 CdSe-ZnS QD의 수력학적 반지름은 ~5 nm (분자 리간드로 교환된 나노결정 캡 (cap)에 대해)에서 ~20 nm (블록 공중합체 내의 캡슐화된 나노결정에 대해)까지 변한다 (Smith J, et al., 2006). 단일 QD는 몇몇 생물분자 (예를 들어 항체, 펩티드, DNA)와 접합되어, 결합력 (avidity)이 향상된 코팅된 QD 생물접합체를 제공한다.
그의 세포내 흡수 및 적절한 표적 DNA 부위로의 전달을 촉진하기 위한 별도의 전략으로서 친수성 QD에 접합된 (예를 들어, 코팅된) ZFN-IL1FokI의 사용을 본 실시예에서 설명한다. 방법은 일반적으로 DAS 특허 출원 65502에 설명된 바와 같이 살아있는 세포 내로 QD-단백질 수송체 (cargo)의 내재화를 위한 절차를 따른다.
(i) QD 합성: 510 및 540 nm에서 중심이 있는 최대 방출을 갖는 CdSe-ZnS 코어-쉘 QD를 문헌 [Lu et al., 2007]; [Doyon et al. 2006]; [Collins et al., 2003]; [Lanio et al., 2000]에 설명된 절차에 따라 고온 배위 용매 혼합물 내에서 유기금속 전구체의 단계식 반응을 이용하여 합성하였다. 나노결정을 다관능화하고, 주로 트리옥틸 포스핀 및 트리옥틸 포스핀 옥시드 (TOP/TOPO)로 구성된 천연 캐핑 쉘을 이전에 설명된 바와 같이 이기능성 리간드로 교환함으로써 친수성으로 만들었다 ([Lie et al., 2002]; [Mani et al., 2005]; [Desjarlais and Berg, 1993]). 2 세트의 친수성 QD를 사용하였다: (1) 디히드로리포산으로만 캐핑된 나노결정; 및 (2) 9:1 몰비의 리간드를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)-부가된 디히드로리포산 (PEG Mw ≒ 600, DHLA-PEG) 및 비오틴-종결된 DHLA-폴리(에틸렌 글리콜) (PEG Mw ≒ 400, DHLA-PEG-비오틴)의 혼합물로 캐핑된 나노결정. 이들을 각각 DHLA-QD 및 DHLA-PEG-비오틴-QD로 칭한다.
(ii) 양자점 생물접합체의 자가 조립: QD-ZFN-IL1FokI 접합체를 목적하는 원자가에서 자가 조립하기 위해, 적절한 몰비의 His-ZFN을 10 mM 트리스 (Tris)-Cl (pH 8) 버퍼 내에서 0.3 μM의 510-nm 방출 DHLA-캐핑된 QD에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 유사하게, b-PE-스트렙타비딘을 포스페이트 완충 염수 (137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트, 2.7 mM KCl, pH 7.4, PBS) 내에서 0.3 μM의 540-nm 방출 QD (DHLA-PEG:DHLA-PEG-비오틴 9:1 비로 캐핑된)에 첨가하고 4℃에서 철야 인큐베이팅하였고; 이 경우에 접합체 형성은 스트렙타비딘-비오틴 상호작용에 의해 유도된다. 접합체를 겔 전기영동을 이용하여 특성 결정하였고, 여기서 His-부가된 ZFN 또는 스트렙타비딘-표지된 b-PE와 조립된 QD의 전기영동적 이동성의 변화를 모니터링하였다. 샘플을 1x TBE 버퍼 (0.09 M 트리스, 0.002 M Na2-EDTA 0.09 M 붕산 (pH 8.3)) 내에 희석하고, QD-b-PE 및 YFP 접합체에 대해 각각 1% 또는 2% 아가로스 겔 상에서 진행시켰다. 특히, 추적을 위해 형광 단백질에 융합되는 경우에 QD 생물접합체 당 ZFN-IL1 FokI 분자의 수를 변화시킨 효과를 모니터링하였다. QD 및/또는 단백질을 여기시키고 겔 내에서 분리된 밴드의 형광 영상을 포획함으로써, 겔 영상을 수집하였다. 접합체 형성은 자가 조립 시에 QD 및 형광 단백질 사이에서 에너지 전달의 변화를 모니터링함으로써 확인하였다. 형광 스펙트럼을 325 nm 여기를 이용하여 테칸 (Tecan) 사파이어 이중 단색화장치 (Safire Dual Monochromator) 다기능 미량역가 플레이트 판독기 (테칸 (Tecan, 미국 노쓰캐롤라이나 리서치 트라이앵글 파크)) 상에서 수집하였다. 세포내 전달 및 영상화 실험을 위해, QD를 공칭 ZFN:QD 몰비로 ZFN-IL1FokI의 혼합물과 자가 조립하였다.
(iii) 양자점의 세포내 흡수 - 형광 단백질 접합체: 세포 내재화 실험을 앞서 설명된 바와 같이 멸균 조건에서 수행하였다. QD 생물접합체를 완전 배양 배지로 희석하고, 세포 배양액에 첨가하고, 37℃에서 1 hr 동안 40-150 ㎍/mL에서 인큐베이팅하였다. 1:1 내지 1:2.5의 조립 원자가를 갖는, 1:5 또는 1:10 QD/ZFN 및 QD/b-PE로 이루어지는 혼합 표면 QD 코팅된 접합체를, QD당 50 CPP로 CPP와 함께, 상이한 QD 접합체 농도에서 세포 배양액과 함께 인큐베이팅하였다. 과잉의 결합되지 않은 QD 접합체는 배양액을 PBS 또는 세포 배양 배지로 적어도 3회 세척함으로써 제거하였다. 이어서, 세포를 3.7% 파라포름알데히드 내에서 10분 동안 실온에서 고정시키고, PBS로 2회 세척하고, 핵 염색을 위해 DAPI 염료 (인비트로겐)를 함유하는 프로롱 안티페이드 (ProLong Antifade) 마운팅 매질 내에 마운팅하였다. 에피형광 영상 수집은 라이카 (Leica) 현미경을 사용하여 수행하였다. 병렬 (side-by-side) 스플릿 (split) 형광 영상을 수집하고 565 nm 이색성 필터가 장치된 DualView 시스템을 사용하여 정량하였다. 510 nm QD-YFP/ZFN 세포 영상화를 위해, 샘플을 488 nm에서 여기시키고, 방출 광을 565 nm 이색성 필터로 수집하고/분리시키고, 디컨볼루션 (deconvolution)시켰다. QD 형광을 λ<565 nm에서 수집하고, YFP 형광 꼬리를 λ>565 nm에서 수집하였다. QD 창 내로 YFP 누출을 디컨볼루션의 일부로서 공제하였다. 540 nm QD 및 b-PE를 488 nm에서 여기시키고, 그들의 각각의 방출 광을 565 nm 이색성 필터로 분리시키고, 디컨볼루션하였다. DAPI 형광은 Xe 램프를 사용하여 여기시키고, 방출 광을 DAPI 큐브 (여기를 위해 D350/50x, 이색성 400DCLP, 검출을 위해 D460/50m)를 사용하여 수집하였다. AF647-TF는 Xe 램프를 사용하여 여기시키고, Cy5 큐브 (여기 HQ620/60x, 이색성 Q660LP, 방출 HQ700/75m)를 사용하여 형광을 검출하였다. 여기/검출 큐브는 둘 모두 크로마 테크놀로지 (Chroma Technology)에서 제공되었다. 차등 간섭 대비 (DIC) 영상은 밝은 광원을 사용하여 수집하였다.
(iv) ZFN-IL1FokI 코팅된 QD 확인: His 상호작용은 직접적으로 나노결정의 Zn-풍부 무기 표면과 일어난다. 작은 스페이서 (spacer)에 의해 분리된 2개의-(His)6 서열을 보유한 N-말단을 갖는 ZFN-IL1FokI, 및 N-말단 (His)8 서열을 갖는 CPP를 조작하면 단단한 QD-단백질/펩티드 복합체의 형성을 허용한다. 비오틴-아비딘 결합은 그의 강한 상호작용 (KD ~10-15 M) 때문에 당업계에 공지된 널리 사용되는 생물접합 전략이다. 히드록실- 및 비오틴-종결된 PEG의 혼합물로 표면이 캐핑된 QD (DHLA-PEG-비오틴-QD)를 사용하는 것은 상업상 이용가능한 b-PE-스트렙타비딘에 대한 용이한 접합 (예를 들어, 코팅)을 허용한다.
(v) QD-ZFN-IL1FokI 접합체의 세포내 전달: YFP/ZFN-IL1FokI 수송체로 코팅된 다관능화된 (예를 들어, 표면 관능화된) QD의 흡수가 나노결정 표면 상의 CPP의 존재에 의해 매개됨을 입증하기 위해, 표적 BY2 세포주를 3가지 종류의 접합체와 함께 따로 인큐베이팅하였다: QD-CPP 접합체 (QD 당 10-100 CPP), QD-ZFN-IL1FokI/CPP, 및 ZFN-IL1FokI 및 CPP의 혼합물과 조립된 QD (접합체 당 ~10 ZFN-IL1FokI 및 ~50 CPP를 갖는 QD-ZFN-IL1FokI-CPP). 세포를 510-nm 방출 QD 접합체의 용액 (~75 nM 농도에서)과 함께 인큐베이팅하고, 임의의 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세정하고, 후속적으로 에피형광 현미경을 사용하여 영상화하였다. 또한 각각 핵 및 엔도좀의 시각화를 허용하기 위해 세포를 DAPI로 대비-염색하였다. 추가의 CPP가 QD 표면 (혼합 표면 QD-ZFN-IL1FokI-CPP 접합체) 상에 존재할 때, 두 세트의 세포에 대해 측정된 현저한 형광 강도로 나타나는 바와 같이 접합체의 실질적인 세포내 흡수는 일어난다. 또한, 두 배양액에 대해 수집된 영상은 QD 및 ZFN-IL1FokI/YFP의 형광 패턴 사이에 거의 완전한 겹침이 존재함을 보여준다. 염색 패턴 및 동시-국재화 패턴의 평가는 핵주위 분포를 나타내고, 주로 엔도좀 구획 내에 한정된다. CPP의 존재 하에 세포주에 의한 QD 접합체의 효율적인 내재화는 CPP가 ZFN-IL1FokI-형광 융합 단백질 수송체로 다관능화된 (예를 들어, 표면 관능화된) QD의 세포내 흡수를 촉진함을 입증한다.
단일 세포 및 응집 클러스터를 나노입자 부문에서 설명된 NP 처리와 유사하게 처리하고 선택제 없이 플레이팅하고, 실험의 2-4주 후에 GFP 발현 콜로니에 대해 모니터링하였다.
실시예 5: GNP 및 QD 를 통한 담배 세포 내로의 SSN 전달 이후 상동성 -지정 복구
상기 설명된 바와 같이 입자에 묶인 ZFN-IL1FokI 또는 I-SceI로 처리된 통합된 ZFN 또는 I-SceI 결합 부위를 갖는 표적 세포주를 페트리 접시 내에서 배지 상에 플레이팅하였다. 세포를 처리 후에 비-선택 배지 상으로 플레이팅하였다. 녹색 형광 포커스는 7일 후에 보였다. 관찰된 형광이 기능성 gfp 유전자의 재구성으로부터 생성되는 것임을 확인하기 위해, 형광 조직 세그먼트의 풀 (pool)을 단리하고, 선택적 계대-배양액의 수회 통과를 통해 수동으로 증균 (enrichment)시켰다. 이들 형광 조직으로부터 게놈 DNA를 단리하고, gfp 유전자 단편 상에 고정된 프로브를 사용하는 PCR에 의해 분석하였다. SSN-처리된 형광 조직으로부터 증균된 샘플은 증폭될 때, 예측된 0.6 kb PCR 생성물을 생성시켰고, 이것은 예상된 재조합이 이들 조직 내에서 기능성 gfp 유전자를 재구성하였음을 나타낸다. 추가의 4.1 kb PCR 생성물이 또한 증균된 샘플 내에서 관찰되었고, 이것은 세포 집단 내에 비-재조합된 리포터 서열의 존재를 나타낸다. gfp-양성 세포 증균을 달성하기 위해 사용된 형광 조직의 시각적 선택 방법을 감안할 때 이것은 예기지 못한 것은 아니다.
많은 예시적인 측면 및 실시양태가 상기 논의되지만, 당업자는 특정 변형, 치환, 부가 및 이들의 하위-조합을 인지할 것이다. 따라서, 다음 첨부된 청구항 및 이후 도입되는 청구항은 그의 진정한 취지와 범위 내에 있는 바와 같이 그러한 모든 변형, 치환, 부가 및 하위-조합을 포함하는 것으로 해석되는 것을 의도한다.

Claims (16)

  1. 세포벽이 있는 식물 세포를 제공하고;
    나노입자를 서열 특이적 뉴클레아제 (SSN)로 코팅하고;
    세포벽이 있는 세포 및 코팅된 나노입자를 서로 접촉하도록 배치하고;
    나노입자 및 SSN을 세포벽을 포함하는 식물 세포 내로 흡수시키는 것
    을 포함하는, SSN을 식물 세포 내로 도입하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 나노입자를 SSN으로 코팅하는 것이 나노입자의 표면 상의 비공유 흡수를 통해 SSN을 고정하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, SSN을 나노입자 내로 흡수시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 나노입자를 세포벽을 포함하는 식물 세포의 구획 (compartment) 내로 흡수시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 나노입자를 세포 투과 펩티드 및/또는 아세포성 (subcellular) 구획 표적화 단백질로 코팅하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 구획이 시토졸 (cytosol), 핵, 토노플라스트 (tonoplast), 색소체, 황백화 색소체, 유색체, 백색체, 엘라이오플라스트 (elaioplast), 단백질체 (proteinoplast), 녹말체, 엽록체, 및 이중막의 내강 (lumen)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 세포벽을 포함하는 식물 세포가 담배, 당근, 옥수수, 캐놀라, 평지씨, 면, 야자, 땅콩, 대두, 오리자 (Oryza) 종, 아라비돕시스 (Arabidopsis) 종, 피마자 (Ricinus) 종, 및 사탕수수 세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 식물 세포가 배아, 분열조직, 캘러스, 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 꽃, 종자, 꼬투리 및 줄기로 이루어진 군 중에서 선택되는 조직으로부터의 세포인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 나노입자가 금 나노입자, 금 코팅된 나노입자, 다공성 나노입자, 메조다공성 (mesoporous) 나노입자, 실리카 나노입자, 중합체 나노입자, 텅스텐 나노입자, 젤라틴 나노입자, 나노쉘 (nanoshell), 나노코어 (nanocore), 나노구체 (nanosphere), 나노막대 (nanorod), 자성 나노입자, 반도체 나노입자, 양자점 (quantum dot), 나노매트릭스 (nanomatrix), 덴드리머성 나노매트릭스 및 이들의 조합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 나노입자의 표면의 유도체화를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, SSN이 서열-비의존적 뉴클레아제 도메인과 함께 아연 핑거 단백질을 포함하는 아연 핑거 뉴클레아제인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 서열-비의존적 뉴클레아제 도메인이 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제 FokI로부터 유래되는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, ZFN이 안정하게 통합된 세포를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 선택된 세포가 재생가능한 세포인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 재생가능한 세포로부터 식물을 재생하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 나노입자가 다관능화된 나노입자인 방법.
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