DE10254166A1 - Verfahren zur Kontrolle eines zellulären Prozesses in Pflanzen - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur Kontrolle einer genetisch veränderten Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: DOLLAR A (a) Bereitstellen einer genetisch veränderten Pflanze, wobei Zellen der genetisch veränderten Pflanze eine heterologe Nukleinsäure enthalten und wobei die genetisch veränderte Pflanze inaktiv bezüglich eines gewünschten zellulären Prozesses ist, DOLLAR A (b) Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses durch direktes Einführen eines Polypeptids aus einer zellfreien Zusammensetzung in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, DOLLAR A wobei das Polypeptid und die heterologe Nukleinsäure so aufeinander abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess einschalten kann.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrolle eines gewünschten zellulären Prozesses in einer Pflanze durch ein externes Signal. Ferner betrifft diese Erfindung eine transient oder stabil genetisch veränderte Pflanze zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung, sowie eine genetisch veränderte Pflanze, die nach dem Verfahren der Erfindung kontrolliert wurde. Darüberhinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines Produktes in einer genetisch veränderte Pflanze, bei dem ein gewünschter zellulärer Prozess mit einem verschlüsselten externen Signal kontrolliert wird. Das Verfahren der Erfindung erlaubt die selektive Kontrolle über die Expression eines Transgens in einer transient oder stabil genetisch veränderten Pflanze, wobei ein gewünschter biochemischer Prozess oder eine biochemische Kaskade zu einem gewünschten Zeitpunkt selektiv eingeschaltet werden kann, wobei der Prozess oder die Kaskade zuvor nicht aktiv war.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Kontrollierbare Systeme zur Transgen-Expression in Pflanzen
  • Eines der Hauptprobleme der Pflanzen-Biotechnologie ist das Erreichen einer verlässlichen Kontrolle über die Transgen-Expression. Eine strikte Kontrolle über die Gen-Expression in Pflanzen ist wesentlich, wenn ein Produkt der Transgen-Expression wachstumsinhibierend oder toxisch ist, wie z.B. bioabbaubares Plastik (Nawrath, Poirer & Somerville, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12760-12764; John & Keller, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 12768-12773; US 6 103 956 ; US 5 650 555 ) oder Proteintoxine ( US 6 140 075 ).
  • Bestehende Technologien zur Kontrolle der Genexpression in Pflanzen beruhen üblicherweise auf gewebsspezifischen oder induzierbaren Promotoren und praktisch alle leiden an einer basalen Expressionsaktivität auch im nichtinduzierten Zustand, d.h. sie sind „leaky". Gewebsspezifische Promotoren ( US05955361 ; WO09828431) sind ein wirksames Werkzeug, jedoch ist ihre Verwendung auf sehr spezielle Anwendungsgebiete beschränkt, z.B. für die Herstellung steriler Pflanzen (WO9839462) oder für die Genexpression in Samen (WO00068388; US05608152 ). Induzierbare Promotoren können nach den Induktionsbedingungen in zwei Kategorien eingeteilt werden: solche, die durch abiotische Faktoren (Temperatur, Licht, chemische Substanzen) und solche, die durch biotische Faktoren wie zum Beispiel Pathogen- oder Schädlingsbefall induziert werden. Beispiele für die erste Kategorie sind hitzeinduzierbare ( US5,187 287 ) und kälteinduzierbare ( US 5 847 102 ) Promotoren, sowie Systeme, die durch chemische Substanzen wie Kupfer (Mett et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 4567-4571), Steroidhormone (Aoyama & Chua, 1997, Plant J., 11, 605-612; McNellis et al., 1998, Plant J., 14, 247-257; US06063985 ), Ethanol (Caddick et al., 1997, Nature Biotech., 16, 177-180; WO09321334) oder Tetracyclin (Weinmann et al., 1994, Plant J., 5, 559-569) induziert werden können. Eine der letzten Entwicklungen auf dem Gebiet der chemisch induzierbaren Systeme für Pflanzen ist ein chimärer Promotor, der mit dem Glucocorticoid Dexamethason eingeschaltet und mit Tetracyclin ausgeschaltet werden kann (Bohner et al., 1999, Plant J., 19, 87-95). Eine Übersicht über das Gebiet der chemisch induzierbaren Systeme bietet ein Artikel von Zuo & Chua (2000, Current Opin. Biotechnol., 11, 146-151). Andere Beispiele für induzierbare Promotoren sind Promotoren, welche die Expression von PR-Genen (pathogenesis-related genes) in Pflanzen kontrollieren. Diese Promotoren können durch Behandlung der Pflanzen mit Salicylsäure induziert werden, eine wichtige Komponente pflanzlicher Signalwege bei der Pathogenabwehr, oder mit anderen chemischen Verbindungen wie Benzo-1,2,3-thiadiazol oder Isonikotinsäure, die PR-Genexpression induzieren ( US05942662 ).
  • Es gibt Berichte über Systeme zur kontrollierten Transgen-Expression unter Verwendung viraler RNA/RNA-Polymerase, die über virale Infektion bereitgestellt wird (z.B. US 6 093 554 ; US 5 919 705 ). In diesen Systemen enthält eine rekombinante, pflanzliche DNA-Sequenz Nucleotid-Sequenzen eines viralen Genoms, die von der viralen RNA/RNA-Polymerase erkannt werden. Die Effizienz dieser Systeme ist begrenzt wegen der geringen Fähigkeit viraler Polymerasen, Funktionen in trans bereitzustellen, und wegen ihrer Unfähigkeit, andere Prozesse als RNA-Amplifizierung zu kontrollieren. Ein anderer Weg besteht darin, einen gewünschten Prozess in einer transgenen Pflanze mit einem genetisch veränderten Virus auszulösen, der eine heterologe Nukleinsäure bereitstellt, die für einen Schalter für einen biochemischen Prozess in einer genetisch veränderten Pflanze kodiert (WO 02068664).
  • Die oben beschriebenen Systeme sind von einigem Interesse als Möglichkeiten, gewünschte Transgen-Expressionsmuster zu erhalten, jedoch erlauben sie keine strikte Kontrolle über die Expression, da die induzierenden Agenzien (z.B. Kupfer) oder deren Analoge (Brassinosteroide im Fall von Steroid-kontrollierten Systemen) in Pflanzengeweben in Mengen vorliegen können, die ausreichen, eine Rest-Expression zu verursachen. Ferner ist die Verwendung von Antibiotika und Steroiden als chemische Induktoren unerwünscht oder ökonomisch für Anwendungen im großen Maßstab nicht durchführbar. Wenn Promotoren von PR-Genen oder virale RNA/RNA-Polymerasen zur Kontrolle von Transgenen verwendet werden, sind die Erfordernisse einer strikten Kontrolle über die Transgen-Expression ebenso nicht erfüllt, da eine zufällige Pathogen-Infektion oder Stress Expression herbeiführen kann. Gewebs- oder organspezifische Promotoren sind auf enge Anwendungsfelder beschränkt, da sie die Expression auf ein bestimmtes Organ oder eine bestimmte Entwicklungsstufe der Pflanze beschränken, es jedoch nicht erlauben, das Transgen nach Belieben einzuschalten. Rekombinante virale Schalter, wie in WO02068664 beschrieben, berücksichtigen all diese Probleme, garantieren jedoch keine strengen Erfordernisse bezüglich Umweltsicherheit, da die heterologe Nukleinsäure in dem viralen Vektor rekombinieren kann.
  • Es gibt viel Literatur, inklusive Patentanmeldungen, die die Gestaltung virusresistenter Pflanzen mittels Expression vitaler Gene oder mutierter Formen viraler RNA beschreiben (z.B. US 5 792 926 ; US 6 040 496 ). Es besteht jedoch ein Umweltrisiko bei der Verwendung solcher Pflanzen wegen der Möglichkeit, durch Rekombination zwischen dem infizierenden Virus und transgener viraler RNA oder DNA neue Viren zu bilden (Adair & Kearney, 2000, Arch. Virol, 145, 1867-1883).
  • Hooykaas und Kollegen (2000, Science, 290, 979-982; WO01/89283) beschreiben die Verwendung einer Translationsfusion der Cre-Rekombinase mit Fragmenten des vir Gens zur Agrobakterium-vermittelten Translokation in Pflanzenzellen. Cre-vermittelte in planta Rekombination führte zu einem selektierbaren Phänotyp. Die Translokation der Cre Rekombinase stellt die erste Verwendung eines translozierten Proteins als Schalter dar, um einen gewünschten Prozess in Pflanzenzellen einzuschalten. Obwohl jedoch die Translokation nicht notwendigerweise von DNA-Transfer begleitet wird, ermöglicht dieses Verfahren kein hohe Sicherheit, da der genetisch veränderte phytopathogene Mikroorganismus (Agrobakterium) eine vollständige kodierende Sequenz des Porteinschalters Cre-Rekombinase enthält. Ferner kann der gewünschte Prozess nur in Zellen eingeschaltet werden, die das Schaltprotein erhalten haben. Wenn große Zellansammlungen zu behandeln sind, wird das Verhältnis von Zellen, die das Schaltprotein erhalten, zur Gesamtzahl der Zellen sehr klein. Die Methode von Hooykaas kann daher nicht auf vollständige Pflanzen angewandt werden. Ihre Anwendbarkeit ist auf die Gewebe- oder Zellkultur beschränkt.
  • Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zum Einschalten eines gewünschten zellulären Prozess in vollständigen Pflanzen bereitzustellen. Es ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, ein für die Umwelt sicheres Verfahren zum Einschalten eines gewünschten zellulären Prozesses in Pflanzen bereitzustellen, wobei der zelluläre Prozess selektiv zu einem vorbestimmten Zeitpunkt eingeschaltet werden kann. Es ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Produktion eines Produktes in einer transgenen Pflanze bereitzustellen, wobei die Produktion des Produktes selektiv eingeschaltet werden kann, wenn die Pflanze eine gewünschte Wachstumsstufe erreicht hat, wobei das Verfahren insofern umweltsicher ist, als dass genetisches Material, das für den zellulären Prozess nötig ist, und genetisches Material, das für die Kontrollfunktion kodiert, sich nicht zusammen in der Umwelt ausbreiten können.
  • ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die obigen Aufgaben werden gelöst durch ein Verfahren zur Kontrolle einer genetisch veränderten Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Bereitstellen einer genetisch veränderten Pflanze, wobei Zellen der genetisch veränderten Pflanze eine heterologe Nukleinsäure enthalten und wobei die genetisch veränderte Pflanze inaktiv bezüglich eines gewünschten zellulären Prozesses ist,
    • (b) Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses durch direktes Einführen eines Polypeptids aus einer zellfreien Zusammensetzung in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten,
    wobei das Polypeptid und die heterologe Nukleinsäure so aufeinander abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozesses einschalten kann.
  • Die Erfindung stellt ferner genetisch veränderte Pflanzen oder Teile derselben zur Verfügung, die nach dem Verfahren der Erfindung erhältlich sind oder erhalten werden. Bevorzugte Teile der Pflanzen sind Blätter und Samen. Samen sind die bevorzugtesten Teile der Pflanzen.
  • Die Erfindung stellt ferner eine genetisch veränderten Pflanze zur Verfügung, die eine heterologe Nukleinsäure in ihren Zellen enthält, wobei die Pflanze bezüglich eines gewünschten zellulären Prozesses inaktiv ist, wobei die heterologe Nukleinsäure so vorgesehen ist, dass der gewünschte zelluläre Prozess durch direktes Einführen eines Polypeptids in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, eingeschaltet werden kann, wobei das Polypeptid und die heterologe Nukleinsäure so aufeinander abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess einschalten kann.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein System bereit zur Kontrolle eines gewünschten zellulären Prozesses in einer genetisch veränderten Pflanze, umfassend eine Pflanze wie oben definiert und ein Polypeptid zum Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses in der genetisch veränderten Pflanze, wobei die Pflanze und das Polypeptid so aufeinander abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess einschalten kann.
  • Die vorliegende Erfindung erlaubt das Einschalten eines gewünschten zellulären Prozesses in einer Pflanze durch direktes Einführen eines Polypeptids in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten. Direktes Einführen bedeutet, dass das Einführen nicht die Anwendung von Nukleinsäuren auf die Pflanze umfasst, die für das Polypeptid oder für einen funktionellen Teil des Polypeptids kodieren. Ein Teil des Polypeptids ist funktionell, wenn er den gewünschten zellulären Prozess der Erfindung einschalten kann. Durch die direkte Applikation des Polypeptids auf die Pflanze wird durch diese Erfindung ein sehr hohes Maß an biologischer Sicherheit erreicht, da die Pflanze nicht mit genetischem Material in Kontakt kommt, das den gewünschten zellulären Prozess einschalten könnte. Stattdessen wird mindestens eine für den gewünschten zellulären Prozess nötige Komponente der Pflanze als Polypeptid (ohne dafür kodierendes genetisches Material) zugeführt. Ein Hauptvorteil der Erfindung liegt darin, dass genetisches Material, das für den gewünschten zellulären Prozess nötig ist, und genetisches Material, das für das Polypeptid kodiert, nicht zusammen auf Nachkommen der Pflanze übertragen werden können oder sich auf andere Arten zusammen in der Umwelt ausbreiten können.
  • Das Verfahren von Hooykaas (2000, Science, 290, 979 bis 982; WO0189283) erlaubt das Einschalten eines gewünschten zellulären Prozesses in pflanzlichen Zellen, wobei ein Schaltprotein mit Hilfe eines pathogenen Bakteriums eingeführt wird. Da dieses Verfahren auf die Zellkultur (Labormaßstab) beschränkt ist, bestehen keine Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit wegen der Verwendung von Agrobakterien, die für das Schaltprotein kodieren. Die vorliegene Erfindung stellt erstmals ein Verfahren zur Kontrolle eines gewünschten zellulären Prozesses bereit, das in vollständigen Pflanzen effizient funktioniert und das gleichzeitig umweltsicher ist, auch wenn es im großen Maßstab wie im Gewächshaus oder auf einem Feld im Freiland durchgeführt wird.
  • In Schritt (a) des Verfahrens der Erfindung wird eine genetisch veränderte Pflanze bereitgestellt. Höhere Pflanzen, insbesondere höhere Nutzpflanzen, sind bevorzugt. Die Pflanze ist insofern genetisch modifiziert, als dass Zellen der Pflanze eine heterologe Nukleinsäure enthalten, die beim Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses beteiligt ist. In vielen Fällen wird die heterologe Nukleinsäure für ein zu exprimierendes Protein kodieren. Die in Schritt (a) bereitgestellte Pflanze kann eine transgene Pflanze sein, wobei die meisten oder alle der Zellen der Pflanze die heterologe Nukleinsäure stabil in das Genom der Zellen integriert enthalten. Die heterologe Nukleinsäure kann stabil in das Kern-Genom integriert sein oder in das Genom von Organellen, wie Mitochondrien oder, vorzugsweise, Plastiden. Die Integration der heterologen Nukleinsäure in das Plastidengenom ist vorteilhaft hinsichtlich der biologischen Sicherheit. Der Verfahren der Erfindung wird vorzugsweise mit transgenen Pflanzen durchgeführt. Alternativ kann die Pflanze transient modifiziert sein und/oder die heterologe Nukleinsäure kann in einem Teil der Zellen, jedoch nicht in anderen Zellen vorhanden sein. Eine heterologe Nukleinsäure in einer transient modifizierten Pflanze kann stabil in das Genom des Teils der Zelle integriert sein, oder sie kann episomal vorhanden sein. Die Inkorporierung der heterologen Nukleinsäure in einen Teil der Zellen der Pflanze kann durch transiente Transfektion z.B. unter Verwendung der viralen Transfektion oder der Agrobakterium-vermittelten Transformation erreicht werden. In jedem Fall ist die in Schritt (a) bereitgestellte Pflanze inaktiv hinsichtlich des gewünschten zellulären Prozesses bevor Schritt (b) ausgeführt wurde.
  • In Schritt (b) des Verfahrens dieser Erfindung wird das Polypeptid aus einer zellfreien Zusammensetzung in mindestens einige der Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, eingeführt. Wenn der Organismus transgen ist, kann das Polypeptid prinzipiell auf irgendeinen Teil oder irgendwelche Zellen der Pflanze appliziert werden. Wenn nur ein Teil der Zellen der Pflanze die heterologe Nukleinsäure enthält, wird das Polypeptid der Pflanze so appliziert, dass das Polypeptid Zellen erreichen kann, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, um den gewünschten zellulären Prozess einzuschalten. Wie oben gesagt, wird das Polypeptid direkt in Zellen der Pflanze aus einer zellfreien Zusammensetzung eingeführt. Das direkte Einführen kann ausgeführt werden durch (i) Partikelbombardierung, (ii) Applikation des Polypeptids auf mindestens einen Teil der Pflanze oder (iii) durch Injektion einer das Polypeptid enthaltenden Lösung in Gewebe der Pflanze. Bei den Methoden (ii) und (iii) ist das Polypeptid üblicherweise in einer Flüssigkeit enthalten, vorzugsweise einer wässrigen zellfreien Zusammensetzung (oder Lösung), die auf Teile der Pflanze appliziert wird. Eine solche Zusammensetzung kann appliziert werden z.B. durch Besprühen der Pflanze mit der Zusammensetzung, die das Polypeptid enthält. Ferner kann die Zusammensetzung gemäß (iii) injiziert werden.
  • Für Methoden (ii) und (iii) enthält das Polypeptid vorzugsweise eine Membran-Translokations-Sequenz (MTS), die den Eintritt des Polypeptids in Zellen der Pflanze ermöglicht. Die Membran-Translokations-Sequenz kann kovalent oder nichtkovalent mit dem Polypeptid verbunden sein. Vorzugsweise ist sie kovalent mit dem Polypeptid verbunden. Die Membran-Translokations-Sequenz kann ein Peptid sein, das das Polypeptid mit der Fähigkeit ausstattet, die Plasmamembran von Zellen der Pflanze zu durchtreten. Viele solcher Membran-Translokations-Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Häufig enthalten sie mehrere basische Aminosäuren, insbesondere Arginine. Die Größe der Membran-Translokations-Sequenzen kann in einem weiten Bereich variieren. Typischerweise beträgt sie jedoch 3 bis 100 Aminosäuren, vorzugsweise 5 bis 60 Aminosäuren. Polypeptid kann über Standard-Expressions-Techniken, z.B. in E. coli, produziert werden. Vorzugsweise wird das Polypeptid nach seiner Expression gereinigt, vorzugsweise von Nucleinsäuren, die für das Polypeptid kodieren. Nukleinsäuren können entfernt oder zerstört werden durch Hydrolyse, vorzugsweise katalysiert durch ein Enzym wie eine DNAse oder eine Ribonucleotidase (RNAse). Daneben oder zusätzlich können chromatographische Techniken verwendet werden, um Nukleinsäuren von dem Polypeptid zu entfernen. Das Polypeptid kann auf die Pflanze z.B. durch Besprühen der Pflanze mit einer flüssigen Zusammensetzung, vorzugsweise einer wässerigen Lösung, die das Polypeptid enthält, appliziert werden. Vorzugsweise werden Maßnahmen getroffen, um den Eintritt des Polypeptids in Zellen der Pflanze zu erleichtern, vorzugsweise Maßnahmen, die das Durchtreten der pflanzlichen Zellwand und/oder der äußeren Pflanzenschicht erlauben. Ein Beispiel solcher Maßnahmen ist das leichte Verwunden von Teilen der Pflanzenoberfläche, z.B. durch mechanisches Kratzen. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung von Cellulose-abbauenden Enzymen, um die Pflanzenzellwand zu schwächen oder zu perforieren.
  • Das Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses (Schritt (b)) setzt das direkte Einführen des Polypeptids aus einer zellfreien Zusammensetzung in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, voraus. Das Polypeptid und die heterologe Nukleinsäure sind so aufeinander abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess einschalten kann. Daher wird das Polypeptid hier auch als „Proteinschalter" bezeichnet.
  • Bezüglich des gewünschten zellulären Prozesses bestehen keine Beschränkungen und die Erfindung ist von sehr breiter Anwendbarkeit. Der gewünschte zelluläre Prozess kann die Bildung einer DNA, einer RNA oder eines Proteins von der heterologen Nukleinsäure sein oder umfassen. Es gibt viele Möglichkeiten, die Bildung der DNA, der RNA oder des Proteins zu erreichen. Das Polypeptid kann z.B. ein Segment enthalten, das eine Bindeaktivität zu der heterologen Nukleinsäure, z.B. zu einem Promotor, hat. Das Segment kann dann als Transkriptionsfaktor der heterologen Nukleinsäure wirken, was die Bildung der RNA oder des Proteins auslösen kann.
  • Vorzugsweise enthält das Polypeptid ein Segment, das eine enzymatische Aktivität aufweist, die die Bildung der DNA, der RNA oder des Proteins auslösen kann. Beispiele solcher Aktivitäten sind DNA- oder RNA-modifizierende Aktivitäten wie die Aktivität einer ortsspezifischen Rekombinase, Flippase, Resolvase, Integrase, Polymerase oder einer Transposase. Die enzymatische Aktivität kann die heterologe Nukleinsäure modifizieren, was zur Expression des Proteins führt, z.B. durch Rekombination. In einer Ausführungsform, bei der das Polypeptid Polymeraseaktivität hat, kann das Segment eine DNA-abhängige RNA-Polymerase sein, die auf einen Promotor der heterologen Nukleinsäure wirkt. Der Promotor wird von nativen Polymerasen des multizellulären Organismus nicht erkannt. Beispiele für solche Promotor-Polymerase-Systeme sind bakterielle, virale oder Bakteriophagen-Promotor-Polymerase-Systeme, wie das T7-Promotor-T7-Polymerase-System.
  • Ferner kann das Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses die Bildung der DNA, der RNA oder des Proteins von der heterologen Nukleinsäure umfassen oder die heterologe Nukleinsäure verwenden. Als Beispiel kann die Bildung eines exprimierbaren Operons von der heterologen Nukleinsäure oder von einem RNA-Expressionsprodukt der heterologen Nukleinsäure genannt werden.
  • Die DNA, die RNA oder das Protein kann befähigt sein, sich in andere Zellen der Pflanze auszubreiten (z.B ein viraler DNA- oder RNA-Vektor). Ein wichtiges Beispiel eines solchen zellulären Prozessess ist die Bildung eines exprimierbaren Amplikons von der heterologen Nukleinsäure oder von einem RNA-Expressionsprodukt derselben. Das Amplikon kann sich in Zellen seiner Aktivierung oder Bildung verstärken (Amplifikationsvektor). Das Amplikon kann ein exprimierbares Amplikon sein, das ein in dem gewünschten zellulären Prozess zu exprimierendes gewünschtes Gen enthält. Ferner kann das Amplikon zur Wanderung von Zelle zu Zelle (cell-to-cell-movement) oder zur systemischen Wanderung (systemic movement) in der Pflanze befähigt sein. Ein Amplikon kann auf einem pflanzlichen DNA- oder RNA-Virus beruhen. Pflanzenviren wie Tobamoviren sind hierfür bevorzugt. Die Amplifiationseigenschaften des zur Ausbreitung befähigten Proteins (siehe unten) und des Amplikons können sich synergistisch verhalten, was einen extrem starken gewünschten zellulären Prozess erlaubt, der sich über beträchtliche Teile der Pflanze ausbreiten kann (z.B. zu einer extrem starken Expression eines gewünschten Proteins von dem Amplikon führen). Das Engineering von Amplikons auf der Grundlage von Tobamoviren is bekannt (siehe z.B. Dawson et al., 1989, Virology, 172, 285-293; Yusibov et al., 1999, Curr.Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94; for review, see "Genetic Engineering With Plant Viruses", 1992, eds. Wilson and Davies, CRC Press, Inc.).
  • In einer Hauptausführungsform der Erfindung umfasst das Einschalten des zellulären Prozesses die Bildung eines Proteins von der heterologen Nukleinsäure, wobei das Protein sich in der Pflanze ausbreiten kann, d.h. es kann eine Zelle, in der es gebildet wurde, verlassen und in andere Zellen der Pflanze eintreten (ein solches Protein wird hier auch „Proteinschalter" genannt). In anderen Zellen kann das Protein einen gewünschten zellulären Prozess einschalten, insbesondere durch Kontrolle einer zusätzlichen heterologen Nukleinsäure (siehe unten). Das Verlassen einer Zelle und das Eintreten in andere Zellen umfast vorzugsweise die Wanderung von Zelle zu Zelle und die systemische Wanderung in der Pflanze oder einem Teil derselben. Das Protein (Proteinschalter) enthält vorzugsweise einen Protein-Teil, der das Verlassen einer Zelle und Eintritt in andere Zellen ermöglicht. Der Protein-Teil kann eine Domäne eines viralen Movement-Proteins oder eines viralen Hüll-Proteins sein. Weiter kann der Protein-Teil ein pflanzlicher oder tierischer Transkriptionsfaktor oder eine Domäne eines pflanzlichen oder tierischen Transkriptionsfaktors sein, der/die zur Wanderung von Zelle zu Zelle oder zur systemischen Wanderung befähigt ist. Weiter kann der Protein-Teil ein pflanzlicher oder tierischer peptidischer intrazellulärer Messenger (Botenstoff) oder eine Domäne eines pflanzlichen oder tierischen peptidischen intrazellulären Messengers sein. Darüber hinaus kann der Protein-Teil ein künstliches Peptid sein, das die Fähigkeit zur Wanderung von Zelle zu Zelle oder zur systemischen Wanderung ermöglicht. Vorzugsweise ist oder umfasst der Protein-Teil ein virales Movement-Protein oder ein virales Hüll-Protein oder eine Domäne eines viralen Movement- oder Hüll-Proteins.
  • Wenn das zur Ausbreitung befähigte Protein der Erfindung in andere Zellen der Pflanze, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, eintritt, kann es vorzugsweise die Expression zusätzlicher Kopien des Proteins von der heterologen Nukleinsäure einschalten (induzieren). So erlaubt das Verfahren der Erfindung durch Verwenden dieses Proteins, das extern mit dem Polypeptid applizierte Schaltsignal in der Pflanze zu verstärken und fortzupflanzen. Insbesondere wenn die Anzahl der Zellen, die anfänglich von dem Polypeptid erreicht wurden, klein ist, wird das Schaltsignal effizient zu weiterein Zellen getragen. Es gibt viele Möglichkeiten, wie das Protein seine eigene Expression von der heterologen Nukleinsäure kontrollieren kann. Diese Möglichkeiten entsprechen denjenigen, die für das Polypeptid in Schritt (b), oben, angewandt werden können.
  • Neben der Fähigkeit, seine eigene Expression zu kontrollieren, weist das Protein der Erfindung die Fähigkeit auf, einen gewünschten zellulären Prozess einzuschalten. Obwohl das Einschalten eines gewünschten zellulären Prozesses bevorzugt ist, ist es offensichtlich, dass das Endergebnis eines eingeschaltenen zellulären Prozesses auch ein Ausschalten oder ein Unterdrücken eines Prozesses in Zellen der Pflanze sein kann. Um zum Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses befähigt zu sein, kann das Protein ein Segment enthalten, das den zellulären Prozess kontrollieren kann. Das Segment kann eine Binde-Aktivität oder eine enzymatische Aktivität aufweisen, die eine Nukleinsäure (insbesonere die zusätzliche heterologe Nucleinsäure), die für den gewünschten zellulären Prozess nötig ist, kontrolliert. In dem Verfahren der Erfindung kann das Einschalten des zellulären Prozesses analog zu dem Kontrollieren der Expression des Proteins von der heterologen Nukleinsäure erreicht werden. Zu diesem Zweck kann das Protein ein Segment zur Kontrolle des zellulären Prozesses und ein Segment zum Bewirken der Expression des Proteins aufweisen, wobei die Kontrollmechanismen der beiden Segmente verschieden sein können. Vorzugsweise sind die zwei Kontrollmechanismen ähnlich oder identisch, wobei ein Segment des Proteins zum Einschalten des zellulären Prozesses und zur Kontrolle der Expression des Proteins ausreichend sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Protein also zumindest ein Segment und einen Teil, der dem Protein die Fähigkeit verleiht, eine Zelle zu verlassen und in andere Zellen der Pflanze einzutreten.
  • Der gewünschte zelluläre Prozess kann wie oben gesagt die Gegenwart einer zusätzlichen heterologen Nukleinsäure in Zellen der Pflanze benötigen, wo der zelluläre Prozess kontrolliert werden soll. Die zusätzliche heterologe Nukleinsäure kann in allen Zellen oder in einem Teil der Zellen der Pflanze vorhanden sein. Die zusätzliche heterologe Nukleinsäure kann stabil in die nucleären oder die Genome von Organellen der Zellen des Organismus inkorporiert sein. Was bezüglich der heterologen Nukleinsäure der Erfindung gesagt wurde, trifft allgemein auch auf die zusätzliche Nukleinsäure zu. Vorzugsweise ist die Pflanze bezüglich der zusätzlichen heterologen Nukleinsäure und bezüglich der heterologen Nukleinsäure transgen.
  • Die zusätzliche heterologe Nukleinsäure wird z.B. verwendet, wenn die heterologe Nukleinsäure zur Bildung des zur Ausbreitung befähigten Proteins verwendet wird. Das sich ausbreitende Protein kann dann einen in der zusätzlichen heterologen Nukleinsäure kodierten gewünschten zellulären Prozess einschalten. 8 illustriert diese Ausführungsform. Der gewünschte zelluläre Prozess, der von der zusätzlichen heterologen Nukleinsäure eingeschaltet werden kann, entspricht denjenigen, die im Zusammenhang mit der heterologen Nukleinsäure genannt wurden.
  • In einer weiteren wichtigen Ausführungsform der Erfindung generieren das von der heterologen Nukleinsäure exprimierte Protein und das direkt eingeführte Polypeptid zusammen eine vorbestimmte Funktion, was zum Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses nur dann führt, wenn das Protein und das Polypeptid gemeinsam vorliegen (3). Vorzugsweise generieren das Protein und das Polypeptid gemeinsam die vorbestimmte Funktion durch Inteinvermitteltes Trans-Spleißen oder durch Intein-vermittelte Affinitätsinteraktion. Die vorbestimmte Funktion kann dann den gewünschten zellulären Prozesses der Erfindung einschalten. Die vorbestimmte Funktion kann z.B. eine Bindeaktivität oder eine enzymatische Aktivität sein, die auf die zusätzliche heterologe Nukleinsäure auf ähnliche Art wirken kann, wie oben für das Protein beschrieben. Ein wichtiger Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass die in Schritt (a) bereitgestellte Pflanze, die mit der heterologne Nukleinsäure genetisch modifiziert ist, nicht alle zum Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses nötige Komponenten enthält. Daher kann die Pflanze keine genetische Information für einen funktionellen gewünschten zellulären Prozess auf Nachkommen oder auf andere Organismen weitergeben.
  • Der gewünschte zelluläre Prozess, der wie oben beschrieben eingeschaltet wurde, muss jedoch nicht die gesamte Pflanze betreffen. Stattdessen kann der gewünschte zelluläre Prozess auf einen Teil der Pflanze beschränkt sein. Vorzugsweise betrifft der gewünschte zelluläre Prozess jedoch wesentliche Teile der Pflanze. Der Teil Pflanze, wo der zelluläre Prozess eingeschaltet wird, hängt u.a. von den Orten der Anwendung des Polypeptids ab. Üblicherweise wird der gewünschte zelluläre Prozess am stärksten in der Nachbarschaft des Applikationsortes des Polypeptids sein und mit zunehmendem Abstand von diesem Ort abnehmen. Diese Abnahme kann üblicherweise richtungsabhängig sein und von der Struktur des Gewebes der Pflanze, wo das Polypeptid appliziert wird, abhängen. Wenn z.B. ein gewünschter zellulärer Prozess in einer Pflanze eingeschaltet werden soll (z.B. es soll die Expression eines gewünschten Gens eingeschaltet werden), und das Polypeptid wird auf einen Teil eines Blattes der Pflanze appliziert, tritt der gewünschte zelluläre Prozess typischerweise innerhalb des Teils des Blattes und in der Umgebung des Teils des Blattes auf. Vorzugsweise tritt der gewünschte zelluläre Prozess im größten Teil des Blattes auf. Noch bevorzugter tritt der gewünschte zelluläre Prozess auch im Spross und in anderen Blättern auf. Am bevorzugtesten tritt der gewünschte zelluläre Prozess in einem Großteil der Pflanze auf. Das Ausmaß des gewünschten zellulären Prozesses (z.B. Expression eines gewünschten Gens) kann innerhalb der Pflanze variieren, z.B. mit dem Zell-Typ oder dem Gewebe-Typ. Natürlich ist die Applizierung des Polypeptids normalerweise nicht auf einen einzigen Punkt auf der Oberfläche einer Pflanze beschränkt. Vorzugsweise wird das Polypeptid auf mehrere Teile der Pflanze angewandt (siehe unten).
  • Der zelluläre Prozess gemäß dieser Erfindung kann eine gesamte gewünschte biochemische Kaskade, wie einen mehrstufigen Biosynthese-Weg in Zellen der Pflanze auslösen. Der gewünschte zelluläre Prozess oder die biochemische Kaskade ist in der Pflanze nicht wirksam vor der Anwendung des Polypeptids. Der zelluläre Prozess dieser Erfindung ermöglicht eine Kontrolle über einen gewünschten zellulären Prozess oder eine gewünschte biochemische Kaskade mit einer bisher unerreichbaren technischen Präzision und Umweltsicherheit. So sind neue Anwendungen in der Biotechnologie im allgemeinen, insbesondere in der Pflanzen-Biotechnologie, verfügbar zur Lösung von Problemen, die nach herkömmlichen Verfahren nicht gelöst werden können, darunter die basale Transgen-Expressionsaktivität in einer Pflanze, insbesondere wenn toxische Substanzen oder biologisch abbaubare Polymere hergestellt werden. Darüber hinaus erlaubt die präzise Kontrolle gemäß dieser Erfindung eine transgene Pflanze zu einer gewünschten Wachstumsstufe wachsen zu lassen, bei der die Pflanze z.B. zur Durchführung des gewünschten biochemischen Prozesses oder der gewünschten Kaskade geeignet ist, ohne die Pflanze mit einer basalen Expressionsaktivität zu belasten, die das Wachstum der Pflanze beeinträchtigt. Wenn die Pflanze zur effizienten Durchführung des gewünschten zellulären Prozesses oder der Kaskade geeignet ist, kann der gewünschte Prozess oder die Kaskade eingeschaltet und mit hoher Effizienz durchgeführt werden. Dementsprechend erlaubt das Verfahren dieser Erfindung, die Wachstumsphase und die Produktionsphase eines multizellulären Organismus, insbesondere einer transgenen Pflanze, voneinander zu entkoppeln. Ferner ist es möglich, ein Mehrkomponentensystem für mehrere gewünschte zelluläre Prozesse oder biochemische Kaskaden zu entwerfen, wobei einer oder mehrere gewünschte Prozesse oder Kaskaden selektiv eingeschaltet werden können.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens dieser Erfindung.
  • 2 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens dieser Erfindung, worin das Polypeptide ein aktives (funktionelles) Protein (AB) ist, C steht für eine heterologe DNA und ihre Expressionsprodukte (RNA oder Protein). RNA wird durch gebundene Ribosomen angedeutet. In der Zelle einer Pflanze kann das aktive Protein (AB) mit (1) der heterologen Nukleinsäure, (2) mit einem RNA Expressionsprodukt oder (3) mit einem Protein-Expressionsprodukt der heterologen Nukleinsäure interagieren, um einen gewünschten zellulären Prozess einzuschalten.
  • 3 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens dieser Erfindung, worin das Polypeptide ein nichtfunktionelles Protein (AB) ist, das nach direkter Einführung in die Pflanzenzelle zu einer aktiven Form A'B' umgewandelt wird unter dem Einfluss eines Faktors, der von einer heterologen Nukleinsäure kodiert wird. D deutet eine zusätzliche heterologe Nukleinsäure (oder RNA- oder Proteinexpressionsprodukt derselben) an, auf die das Protein A'B' abzielt, wobei ein gewünschter zellulärer Prozess eingeschaltet wird. Die Umwandlung zu der aktiven Form A'B' kann z.B. durch eine enzymatische Aktivität eines Expressionsproduktes von C durch Intein-vermitteltes Trans-Spleißen stattfinden.
  • 4 ist ein Schema, das Ausführungsformen zur Generierung eines aktiven Proteinschalters aus inaktiven Proteinfragmenten in einer Pflanzenzelle zeigt. A: Generierung eines aktiven Proteinschalters durch Intein-vermitteltes Trans-Spleißen von Proteinfragmenten. B: Generierung eines aktiven Proteinschalters durch Affinitätsbinden von Proteinfragmenten.
  • 5 ist ein Schema, das die Assemblierung eines funktionellen Proteins (AB) aus nichtfuntionellen Proteinfragmenten A und B durch Intein-vermitteltes Trans-Spleißen (5A) oder durch Affinitätsinteraktion (5B) zeigt. Fragment A ist das Polypeptid der Erfindung, das in die Zelle importiert wird. Fragment B wird intern exprimiert von einer heterologen Nukleinsäure.
  • 6 ist ein allgemeines Schema, das das Einschalten eines gewünschten zellulären Prozesses über einen Proteinschalter zeigt, der zum intrazellulären Wandern (trafficking) und zum Verursachen seiner eigenen Expression in anderen Zellen befähigt ist. PS steht für Proteinschalter, TP steht für Trafficking-Protein, das zum intrazellulären Trafficking (d.h. zum Verlassen einer Zelle und zum Eindringen in andere Zellen) befähigt ist, PS:TP steht für ein PS-TP-Fusionsprotein, hNA steht für eine zusätzliche heterologe Nucleinsäure.
    (A) zeigt eine heterologe Nucleinsäure, die für PS:TP kodiert, und eine zusätzliche heterologe Nukleinsäure hNA. Es wird kein externes Polypeptid eingeführt, so dass der Proteinschalter nicht exprimiert wird.
    (B) ein externes (zellpermeables) Polypeptid, das die Expression des Proteinschalters PS:TP veranlasst, wird eingeführt. Der Proteinschalter kann einen zellulären Prozess kontrollieren, indem er auf hNA in den Zellen seiner Expression wirkt. Ferner kann der Proteinschalter die Zelle, die durch das extern eingeführte Polypeptid betätigt wurde, verlassen und in andere Zellen eintreten. In den anderen Zellen kann der Proteinschalter seine eigene Expression induzieren und außerdem einen zellulären Prozess durch Einwirkung auf hNA kontrollieren.
    (C) zeigt eine heterologe Nucleinsäure, die für zwei Proteinschalter kodiert: PS1 und PS2. Die Expression von PS1 wird durch ein extern appliziertes Signal (das Polypeptid der Erfindung) verursacht, was zu PS1:TP führt. Wie oben kann PS1:TP sich auf andere Zellen ausbreiten und die Expression von PS2 aktivieren. PS2 kann wiederum einen zellulären Prozess kontrollieren, indem er auf hNA wirkt.
  • 7 zeigt in (A) das Konstrukt pICHGFPinv, das einen nicht-funktionellen TMV-basierten Provektor enthält, und in (B) ein funktionelles Derivat dieses Konstrukts, das bei der Integrasevermittelten Rekombination entsteht. Die Pfeile unten zeigen RNAs und subgenomische (sg) RNAs inklusive ihrer Orientierung an, die von dem in (B) gezeigten Konstrukt gebildet werden können. sgp steht für subgenomischer Promotor.
  • 8 zeigt schematisch ein Verfahren gemäß der Erfindung, bei dem ein zellpermeables Polypeptid (MTS:Rekombinase) Rekombinationsereignisse in erreichten Zellen auslöst, was zur Synthese eines Proteinschalters von einer heterologen Nukleinsäure führt, der zum intrazellulären Trafficking befähigt ist (Rekombinase:TP). Der Proteinschalter kann ferner Rekombinationsereignisse auslösen, die zur Umordnung eines auf einem Pflanzenvirus beruhenden Provektors (eine zusätzliche heterologe Nukleinsäure gemäß der Erfindung) führt, was zur Expression eines gewünschten Gens (GOI) führt. MTS:Membran-Translokations-Sequenz; TP: Protein, das zum intrazellulären Trafficking befähigt ist; SM: Selektionsmarker; RS: Rekombinationsstelle, die von einer ortsspezifischen DNA-Rekombinase/Integrase erkannt wird; ter1 und ter2: Transkriptions-Terminations-Regionen; PROM: Promotor, der in Pflanzen aktiv ist; RdRp: virale RNA-abhängige RNA-Polymerase; MP: Movement-Protein; 3'NTR: 3'-nicht-translatierte Region eines pflanzlichen RNA-Virus. Pfeile zeigen die Orientierung von kodierenden und regulatorischen Sequenzen an.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Grundlage dieser Erfindung ist die Verwendung eines Polypeptids, das zum Verlassen von Zellen und zum Eintritt in andere Zellen einer Pflanze befähigt ist, was zum Einschalten eines gewünschten zellulären Prozesses ohne Zufuhr in Zellen von Nukleinsäuren führt, die für das Polypeptid oder einen funktionellen Teil kodieren. Vorzugsweise umfasst das Einschalten eines gewünschten zellulären Prozesses die Bildung eines Proteins, das seine eigene Expression veranlassen kann. Das allgemeine Prinzip und schematische Darstellungen des Verfahrens gemäß der Erfindung sind in den 1 bis 8 gezeigt.
  • Wahl des Kontrollproteins für die Schaltfunktion
  • Es gibt unzählige gewünschte zelluläre Prozesse, die irreversibel durch das Kontrollprotein der Erfindung (Proteinschalter) betätigt werden können. Der Proteinschalter (in 2 mit AB bezeichnet) kann z.B. die Expression eines gewünschten Transgens (in 2 mit C bezeichnet) auf viele verschiedene Arten kontrollieren. Zum Beispiel kann er DNA-Rekombination oder -Transkription, RNA-Prozessierung oder -Translation, posttranslationale Protein-Modifikationen (2) usw. betätigen. Zusätzlich kann der Proteinschalter von dem Polypeptid nach dessen Verabreichung in die Pflanzenzelle aktiviert werden und dann als Schalter funktionieren (3). Natürlich hängt die Wahl des Proteinschalters von der Gestaltung/Wahl des in der Pflanze zu kontrollierenden zellulären Prozesses ab. Der zelluläre Prozess kann durch Nucleinsäure-Umordnungen (rearrangement) oder durch Modifikationen in Zellen, in denen das Protein vorliegt, oder in Zellen, in die das Protein eingewandert ist, kontrolliert, insbesondere eingeschaltet, werden. In einem solchen Fall kann der Proteinschalter ein DNA- oder RNA-modifizierendes Enzym enthalten, wie eine ortsspezifische Endonuclease, eine Replikase, eine Rekombinase, eine Methylase, eine Integrase, eine Transposase, eine Polymerase usw.
  • Andere Ausführungsformen dieser Erfindung sind u.a. das Auslösen von Reaktionen wie DNA-Restriktion und/oder DNA-Replikation. Ein Beispiel einer biochemischen Kaskade, die durch Restriktion ausgelöst werden kann, ist ein Zweikomponentensystem, bei dem eine einen Replikationsursprung (origin of replication) enthaltende heterologe Nukleinsäure, die in das Kerngenom integriert ist, spezifisch herausgeschnitten und in ein automsomal replizierendes Plasmid umgewandelt wird durch ein selten schneidendes Restriktionsenzym, das als Proteinschalter dient, was die Kaskade auslöst.
  • Es gibt viele Reaktionen an RNA-Molekülen, die zum Auslösen des zellulären Prozesses der Erfindung verwendet werden können. Dazu gehören unter anderem Reaktionen wie RNA-Replikation, reverse Transkription, Editing, Silencing oder die Translation. Es gibt viel Stand der Technik, der detailliert beschreibt, wie z.B. eine Rekombinase, Integrase oder Transposase, einen gewünschten Prozess durch DNA-Exzision, -Inversion oder -Insertion in Zellen, insbesondere in Pflanzenzellen, auslösen kann (Zuo, Mollen & Chua, 2001, Nat. Biotech.,19, 157-161; Hoff, Schnorr & Mundy, 2001, Plant Mol. Biol., 45, 41-49; US 5 225 341 ; WO 9911807; WO 9925855; US 5 925 808 ; US 6 110 736 ; WO 0140492; WO 0136595). Ortsspezifische Rekombinasen/Integrasen aus Bakteriophagen und Hefen werden zur Manipulation von DNA in vitro sowie in Pflanzen und Tieren viel verwendet. Bevorzugte Rekombinasen-Rekombinationsstellen zur Verwendung in dieser Erfindung sind die folgenden: Cre-Rekombinase-LoxP-Rekombinationsstellen, FLP-Rekombinase-FRT-Rekombinationsstellen, R-Rekombinase-RS-Rekombinationsstellen, die C31-Integrase aus Phagen, die attP/attB-Stellen erkennt usw. Transposons werden viel zur Entschlüsselung von Gen-Funktionen in Pflanzen verwendet. Bevorzugte Transposon-Systeme zur Verwendung in dieser Erfindung unter anderem Ac/Ds, En/Spm, Transposons der "mariner"-Familie usw.
  • Heterologe Transkriptionsfaktoren und RNA-Polymerasen können in einem Proteinschalter gemäß der Erfindung ebenso verwendet werden. Zum Beispiel kann das Einschleusen der T7-Polymerase in Zellen einer Pflanze, die ein Transgen unter der Kontrolle des T7-Promotors trägt, die Expression eines Transgens induzieren.
  • Die Expression eines pflanzlichen Transgens (z.B. der zusätzliche heterologe Nukleinsäure der Erfindung), das unter der Kontrolle eines Bakteriophagen-Promotors (z.B. T3, T7, SP6, K11) ist, mit der entsprechenden DNA/RNA-Polymerase, die in Zellen einer Pflanze eingeführt wird, kann ein wirkungsvoller Ansatz für die Entwicklung von Proteinschaltern gemäß dieser Erfindung sein. Ein anderer nützlicher Ansatz kann die Verwendung von heterologen oder chimären oder anderen künstlichen Promotoren sein, die heterologe oder künstlich veränderte Transkriptionsfaktoren für ihre Aktivierung benötigen. Heterologe Transkriptionsfaktoren können auch verwendet werden, um die Expression eines gewünschten Transgens unter der Kontrolle des durch den Transkriptionsfaktor erkennbaren Promotors zu induzieren. Beispiele für solche Transkriptionsfaktoren sind unter anderem der Metalloresponsive ACE1-Transkriptionsfaktor aus Hefe, der spezifische Sequenzen im Hefe-MT(Metallothionein)-Promotor erkennt (Mett et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 4567-4571), verschiedene chimären Transkriptionsfaktoren, die eine sequenz-spezifische DNA-Bindungsdomäne und eine Aktivierungsdomäne aufweisen, wie einen Transkriptionsfaktor, der eine Fusion aus einem Sechs-Zink-Finger-Protein 2C7 und einer Aktiverungsdomäne des Herpes simplex-Virus VP16-Transkriptionsfaktors enthält (Ordiz, Barbas & Beachy, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99, 13290-13295), ein Transkriptionsfaktor, der einen 434-Repressor voller Länge und die C-terminalen 80 Aminosäuren des VP16-Transkriptionsaktivators aufweist (Wilde et al., 1994, Plant Mol. Biol., 24, 381-388), ein Transkriptionsfaktor, der in Steroid-induzierbaren Systemen verwendet wird (Aoyama & Chua, 1997, Plant J., 11, 605-612; McNellis et al., 1998, Plant J., 14, 247-257; US 06 063 985 ) oder ein Tetracyclin-induzierbarem System (Weinmann et al., 1994, Plant J., 5, 559-569). In einigen Fällen können bereits bestehende Systeme zur Transgen-Expression verwendet werden. Alternativ dazu können heterologe Transkriptionsfaktoren so modifiziert werden, dass kein aktivierender Ligand-Induktor nötig ist, um den Transkriptionsfaktor in den aktivierten Zustand zu überführen. Chimäre Transkriptionsfaktoren sind für die Verwendung in dieser Erfindung von Vorteil, da sie hochgradig sequenzspezifische DNA-Bindungsdomänen und hocheffiziente Aktivierungsdomänen vereinigen, was einen maximalen Effekt nach dem Einschleusen eines solchen Faktors in die Pflanzenzelle erlaubt.
  • Ein anderer Proteinschalter gemäß dieser Erfindung kann auf einer posttranslationalen Modifizierung eines oder mehrerer Expressionsprodukte einer zusätzlichen heterologen Nukleinsäuren beruhen, was zur Aktivierung des Expressionsproduktes führen kann. Es gibt viele mögliche Implementierungen solcher Proteinschalter, die z.B. durch Kontrolle der Polypeptidfaltung, der Oligomerbildung, dem Entfernen von Zielsignalen, der Überführung eines Proenzyms in ein Enzym, durch Blockierung der enzymatischen Aktivität usw. funktionieren. Zum Beispiel kann das Einschleusen einer ortsspezifischen Protease in Zellen eines multizellulären Organismus einen gewünschten zellulären Prozess auslösen, wenn ein genetisch veränderter Wirt spezifisch ein Proenzym spaltet, wobei es in ein aktiviertes Enzym überführt wird, wenn ein Produkt in ein spezielles zelluläres Kompartiment geleitet wird, wegen der Fähigkeit des Wirts, ein Zielmotif zu spalten oder zu modifizieren, oder wenn ein Produkt infolge des Entfernens einer spezifischen Bindesequenz mobilisiert wird. Die Spaltung eines translationalen Fusionsproteins kann mit Hilfe einer Peptidsequenz erreicht werden, die von einer viralen ortsspezifischen Protease erkannt wird, oder mittels eines katalytischen Peptids (Dolja et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10208-10212; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; US 5 162 601 ; US 5 766 885 ; US 5 491 076 ). Andere Beispiele für ortsspezifische Proteasen für diese Erfindung sind Enterokinasen aus Säugern, z.B. die leichte Kette der menschlichen Enterokinase, die die Sequenz DDDK-1 erkennt (Kitamoto et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 7588-7592) und spezifisch Lys-Ile-Bindungen spaltet; virale Proteasen, wie Hc-Pro (Carrington JC & Herndon KL, 1992, Virology, 187, 308-315), die die Proteolyse zwischen dem Gly-Gly-Dipeptid katalysiert, jedoch 4 Aminosäuren für die Erkennung der Spaltstelle benötigt; ortsspezifische Proteasen des Semliki Forest Virus (Vasiljeva et al., 2001, J. Biol.
  • Chem., 276, 30786-30793); und Proteasen, die beim Prozessieren von Polyubiquitin beteiligt sind, Ubiquitin-Carboxy-terminale Hydrolasen (Osava et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 283, 627-633).
  • Direktes Einführen des Polypeptids (Proteinschalters) in Zellen einer Pflanze
  • a) Mikroprojektilbombardierung (particle bombardment)
  • Verschiedene Methoden können für das direkte Einschleusen (direct delivery) des Polypeptids in Zellen der Pflanze verwendet werden. Unter den einfachsten Methoden ist das direkte Einschleusen mit Hilfe einer mechanischen Interaktion mit dem Pflanzengewebe. Zum Beispiel kann die Mikroprojektilbombardierung mit mit dem Polypeptid beschichteten Partikeln das Polypeptid in eine Pflanzenzelle einschleusen. Das Protokoll kann denen für das Einschleusen von DNA bei der Transformation von Pflanzen ( US 05 100 792 ); EP 00 444 882 ; EP 00 434 616 ) ähneln. Dabei werden die Partikel anstelle von DNA mit dem Polypeptid beschichtet. Es gibt eine Beschreibung eines biolistischen Verfahrens, bei dem die Partikel nach einem ausreichend schonenden Verfahren zur Bewahrung der Aktivität des Polypeptids beschichtet werden (Sandford, Smith & Russell, 1993, Methods in Enzymol., 217, 483-509). Im Prinzip können auch andere Transformationsmethoden für Pflanzen verwendet werden, z.B. die Mikroinjektion (WO 09209696; WO 09400583; EP 175 966 ) oder das Liposomen-vermittelte Einschleusen (für eine Übersicht siehe: Fraley & Papahadiopoulos, 1982, Curr. Top Microbiol. Immunol., 96, 171-191).
  • b) Verwendung von Membran-Translokations-Aminosäuresequenzen
  • Das gewünschte Polypeptid kann extern auf Zielzellen der Pflanze appliziert werden, indem eine kovalente Fusion oder eine nicht-kovalente Interaktion mit einer Membran-Translokations-Sequenz verwendet wird. Viele Beispiele für Membran-Translokations-Sequenzen (MTS), ob natürlich oder synthetisch, sind im Stand der Technik bekannt. Sie werden als Fusionen mit peptidischen Arzneistoffen und therapeutischen Proteinen viel verwendet, um deren Membrangängigkeit zu erhöhen. Ein MTS kann eine einfache Aminosäure-Wiederholung sein, z.B. ein kationisches Peptid, das 11 Arginine RRRRRRRRRRR enthält (Matsushita et al., 2001, J. Neurosci., 21, 6000-6007). Ein anderes kationisches MTS ist ein Transportan aus 27 Aminosäuren (GWTLNSAGYL LGKINLKALA ALAKKIL) (Pooga et al., 1998, FASEB J., 12, 67-77). Es ist sehr wahrscheinlich, dass solche Peptide für die Penetration der Zelle die Asymmetrie der zellulären Plasmamembran ausnutzen: Die Lipid-Einzelschicht, die dem Cytoplasma zugewandt ist, enthält anionische Phospholipide (Buckland & Wilton, 2000, Biochim. Biophys. Acta/Mol. Cell. Biol. of Lipids, 1483, 199-216). Verschiedene Proteine enthalten Untereinheiten, die ihre aktive Translokation über die Plasmamembran in Zellen ermöglichen. Hierzu gehört die basische Domäne von HIV-1 Tat49-57(RKKRRQRRR) (Wender et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 97, 13003-13008), Antennapedia43-58 (RQIKIWFQNRRMKWKK) (Derossi et al, 1994, J. Biol. Chem., 269, 10444-10450), die MTS des Kaposi-Fibroblasten-Wachstumsfaktors (AAVALLPAVL LALLAP) (Lin et al., 1995, J. Biol. Chem., 170, 14255-14258); die VP22-MTS (Bennet, Dulby & Guy, 2002, Nat. Biotechnol., 20, 20; Lai et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 97, 11297-302); Homeodomänen aus Drosophila melanogaster Fushi-Tarazu und Engrailed Proteinen (Han et al , 2000, Mol. Cells, 10, 728-732). Es wurde gezeigt, dass all diese positiv geladenen MTS von sich aus und als Fusionen mit anderen Proteinen, wie GFP, den Eintritt in Zellen (Zhao et al., 2001, J. Immunol. Methods, 254, 137-145; Han et al., 2000, Mol. Cells, 10, 728-732), Cre-Rekombinase (Peitz et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 4489-4494) energieunabhängig ermöglichen. Jedoch ist die Fusion nicht notwendigennreise für den Proteintransport in die Zelle nötig. Es wurde ein Peptid-Träger Pep-1 aus 21 Resten entworfen (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV), welcher über nicht-kovalente hydrophobe Interaktionen mit verschiedenen Arten von Proteinen, wie GFP, b-Gal, oder spezifischen Antikörpern voller Länge Komplexe bilden kann. Diese Komplexe können effizient in Zellmembranen eindringen (Morris et al., 2001, Nature Biotechnol., 19, 1173-1176). Diese Liste von MTS könnte fortgesetzt werden. Ganz allgemein kann jedes synthetische oder natürliche Arginin-reiche Peptid zur Durchführung dieser Erfindung verwendet werden (Futaki et al., 2001, J. Biol. Chem., 276, 5836-5840).
  • Da kein wesentlicher struktureller Unterschied zwischen pflanzlichen und tierischen Zellmembranen besteht, der die allgemeine Architektur und physiko-chemischen Eigenschaften beeinflusst, können diese Fusionen von MTS mit einem gewünschten Polypeptid auch für das Eindringen in Pflanzenzellen verwendet werden. Im Unterschied zu tierischen Zellen besitzen pflanzliche Zellen eine stabile Zellwand (Varner & Linn, 1989, Cell, 56, 231-239; Minorsky, 2002, Plant Physiol., 128, 345-53). Dies Hindernis kann mit Hilfe einfacher Techniken überwunden werden. Zum Beispiel kann die Injektion eines (z.B. rohen) Protein-Extrakts, das ein MTS enthaltendes Polypeptid enthält, in den pflanzlichen Apoplasten die Translokation des Polypeptids in die Pflanzenzellen erleichtern. Ein anderer Ansatz zur Überwindung der Zellwand und zum Erreichen der Zellmembran von Pflanzenzellen kann die Anwendung von zellulytischen Enzymen sein, von denen viele kommerziell erhältlich sind. Wenn sie zu einer das Polypeptid enthaltenden Zusammensetzung gegeben werden, entfernen oder schwächen diese Enzym die Zellwand, aber lassen jedoch die Zellmembran intakt und für die Penetration des Polypeptids mit der MTS exponiert. Solche Cellulose abbauenden Enzyme aus Bakterien und Schimmelpilzen sind kommerziell erhältlich im industriellen Maßstab und werden viel verwendet (z.B. "Onozuka" R-10, Enzympräparat aus Trichoderma harzianum usw.) in der Zellkultur pflanzlicher Zellen zur Herstellung von pflanzlichen Protoplasten (Sidorov & Gleba, 1979, Tsitologia, 21, 441-446; Gleba & Gleba, 1978, Tsitol. Genet., 12, 458-469; Ghosh et al., 1994, J. Biotechnol., 32, 1-10; Boyer, Zaccomer & Haenni, 1993, J. Gen. Virol., 74, 1911-1917; Hilbricht, Salamini und Bartels, 2002, Plant J., 31, 293-303). Cellulose abbauende Enzyme können auch für Anwendungen dieser Erfindung in großem Maßstab eingesetzt werden. Eine Mischung von Cellulose abbauenden Enzymen mit einem Zell-permeablen Polypeptid kann über genetisch modifizierte Pflanzen oder deren Teile gesprüht werden. Cellulasen können Zellmembranen für Zellmembran-permeable Polypeptide zugänglich machen. Nach der Translokation in die Zelle kann das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess und die Expression des Kontrollproteins in der Pflanze auslösen.
  • Zusätzlich zu den obigen Delivery-Methoden für das Polypeptid wird vorzugsweise eine wirksame Ausbreitung des Proteinschalters in der Pflanze für Amplifizierungszwecke angewandt. Um ferner die Gesamtmethode sicher zu machen, ist eine strikte Kontrolle über die heterologe Nukleinsäure nötig.
  • Um diese Probleme zu lösen, wird hier vorgeschlagen, ein "split genes"-Ansatz zur Kontrolle der Segregation eines für den Proteinschalter kodierenden Transgens zu verwenden. In dieser Ausführungsform wird ein aktiver Proteinschalter entweder durch Intein-vermitteltes Protein-Trans-Spleißen (4-A und 5-A) oder durch Affinitäts-Interaktion (4-B und 5-B) aufgebaut. In diesem Fall wird der Proteinschalter nicht von einer kontinuierlichen DNA-Sequenz kodiert, und seine Verwendung kann viel besser kontrolliert werden. Besonders wichtig ist, dass diese Ausführungsform eine außergewöhnliche biologische Sicherheit aufweist.
  • Intein-vermitteltes Trans-Spleißen von Protein unter Wiederherstellung ihrer Aktivität ist aus dem Stand der Technik bekannt und in vielen Publikationen beschrieben. Die Affinitäts-Interaktion und/oder das Trans-Spleißen von Proteinen kann mit Hilfe von veränderten Inteinen (4-A) erreicht werden. Inteine wurden ursprünglich als Protein-Sequenzen identifiziert, die in-frame in Proteinvorläufern eingefügt sind und bei der Proteinreifung herausgeschnitten werden (Perler et al., 1994, Nucleic Acids Res., 22, 1125-1127; Perler, F.B., 1998, Cell, 92, 1-4). Alle Informationen und katalytischen Gruppen, die zum Selbst-Spleißen nötig sind, liegen in dem Intein und zwei flankierende Aminosäuren. Der chemische Mechanismus des Proteinspleißens wird im Detail von Perler und Kollegen (1997, Curr. Opin. Chem. Biol., 1, 292-299) und von Shao & Kent (1997, Chem. Biol., 4, 187-194) beschrieben. Inteine bestehen üblicherweise aus N- und C-terminalen Spleißregionen und einem zentralen Homing-Endonucleasen-Bereich oder einer kleinen Linkerregion. Über 100 Inteine aus Kern- und Organell-Genomen verschiedener Orgasnismen, darunter Eukaryoten, Archaebakterien und Eubakterien sind bekannt (http://www.neb.com/neb/inteins.html). Es wurde gezeigt, dass Inteine zum Trans-Spleißen befähigt sind. Das Entfernen des Homing-Endonucleasen-Bereichs hat keinen Effekt auf das Selbst-Spleißen des Inteins. Dies ermöglichte unter anderem die Entwicklung von Trans-Spleiß-Systemen, bei denen die N-terminalen und C-terminalen Fragmente des Inteins als getrennte Fragmente koexprimiert werden und, wenn sie mit Exteinen verbunden sind (Protein-Fragmente, die mit Hilfe eines Inteins verbunden werden können), in vivo zum Trans-Spleißen befähigt sind (Shingledecker et al., 1998, Gene, 207, 187-195). Ebenso wurde mit den N- und C-terminalen Segmenten des RecA-Inteins aus Mykobakterium tuberculosis gezeigt, dass Protein-Trans-Spleißen in vitro stattfinden kann (Mills et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3543-3548). Dieses Phänomen wurde auch am DnaE-Protein aus Synechocystis Sp.-Stamm PCC6803 gefunden (Wu et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9226-9231). Dieses Protein wird von zwei Genen kodiert, die auf entgegengesetzten DNA-Strängen mehr als 700 Kb.p. entfernt liegen. Es wurde gezeigt, dass die von diesen Genen kodierten Intein-Sequenzen ein gespaltenes Mini-Intein darstellen und in Esherichia coli Trans-Spleißing-Aktivität haben. Ein Intein aus derselben Quelle (DnaE-Intein aus Synechocystis sp.-Stamm PCC6803) wurde zur Herstellung funktioneller Herbizidresistenz über Acetolactat-Synthase II aus zwei nicht verknüpften Fragmenten (Sun et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol., 67, 1025-29) und von 5-Enolpyruvylschikimat-3-Phosphat-Synthase (EPSPS) (Chen et al., 2001, Gene, 263, 39-48) in E. coli verwendet.
  • Das Trans-Spleißen von Proteinfragmenten (darunter die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen Exteinen) ist nicht notwendigerweise nötig, um eine ursprüngliche Protein-Funktion wiederherzustellen. In vielen Fällen reicht eine Affinitäts-Interaktion zwischen Protein-Teilen ohne Bildung einer Peptidbindung aus, um eine Protein-Funktion wiederherzustellen (4-B). Dieser Ansatz ist am erfolgreichsten (wie im Fall des Intein-vermittelten Trans-Spleißens) mit Proteinen, die zwei oder mehr funktionelle Domänen aufweisen. In einem solchen Fall können die Domänen voneinander getrennt werden, indem die kodierende Sequenz gespalten und auf zwei Transkriptionsvektoren verteilt wird, und durch Protein-vermittelte Affinitäts-Interaktion zusammengebracht werden. Protein-Domänen können ohne Verwendung von Intein-Teilen interagieren. Es gibt ein Beispiel der Rekonstitution der Aktivität der IS10-Transposase, die aus zwei strukturellen Domänen besteht, die durch einen Proteolyse-sensitiven Linker verbunden sind (Kwon, Chalmers & Kleckner, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8234-8238). Jede der Domänen ist für sich alleine unfähig, die Funktion der Transposase auszuüben. Wenn sie gemeinsam verwendet werden, können sie jedoch Transpositionen ausführen, auch wenn sie nicht durch einen Linker verbunden sind. Es gibt viele weitere Beispiele der funktionellen Protein-Rekonstitution aus isolierten Fragmenten ohne Peptid-Bindungsbildung. Der effiziente Aufbau einer funktionellen Insulin-Rezeptor-Bindestelle wurde durch einfaches Mischen nichtfunktioneller Fragmente erreicht (Kristensen et al., 2002, J. Biol. Chem., 277, 18340-18345). Die Rekonstitution aktiver Proteine durch einfaches Mischen zweier inaktiver Peptid-Fragmente wurde für die Leucin-Dehydrogenase (Oikawa et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 280, 1177-1182), das Ca2+-Binde-Protein Calbindin D28k (Berggard et al., 2000, Protein Sci., 9, 2094-2108; Berggard et al., 2001, Biochemistry, 40, 1257-1264), der Entwicklungsregulator COP1 (development regulator) aus Arabidopsis (Stacey et al., 2000, Plant Physiol., 124, 979-990), Diopamin-D-Rezeptor (Scarselli et al., 2000, Eur. J. Pharmacol., 397, 291-296), Mikroplasminogen (De Los Santos, Wang & Reich, 1997, Ciba Found. Symp., 212, 76-83) und viele andere gezeigt.
  • Affinitäts-Interaktionen können entwickelt werden, indem natürlich vorkommende Protein-Interaktionsdomänen verwendet werden, oder indem solche Domänen mit Hilfe des two-hybrid-Systems (Fields & Son, 1989, Nature, 340, 245-246; Chien et al., 1991, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 88, 9578-9582; Yeast Protocol Handbook, Clontech Laboratories, Inc., 2000) oder des Phage-Display-Systems identifiziert werden. Zum Beispiel kann Phage-Display dazu benutzt werden, ein 5- bis 12-mer Oligopeptid mit hoher Affinität zu einem gewünschten Protein-Fragment zu selektieren. Mehrere solcher Systeme sind jetzt kommerziell erhältlich. Phage-Display ist eine Selektionstechnik bei der ein kurzes variables 5- bis 12-mer Oligopeptid in ein Hüll-Protein eines Bakteriophagen inseriert werden kann. Die für das variable Oligopeptid kodierende Sequenz wird in das entsprechende Gen des Hüll-Proteins des Bakteriophagen inkorporiert. Üblicherweise hat eine 7-mer Phage-Display-Bibliothek mindestens 109 unabhängige Klone, die verschiedene Kombinationen von 7-mer Aminosäuren in verschiedenen Oligopeptiden tragen. Phage-Display wurde dazu benutzt, Affinitätskomplexe zwischen Bakteriophagen und einem gewünschten Protein zu schaffen, was die schnelle Identifizierung von Peptid-Liganden für ein gegebenes Zielprotein mittels einer in-vitro-Selektionsmethode erlaubt, die "panning" genannt wird (Parmley, Smith, 1988, Gene, 73, 305-318; Cortese et al., 1995, Curr. Opin. Biotechnol., 6, 73-80). Der Phagen-Protein-Komplex aus der Panning- Prozedur kann dissoziiert werden, und ein Phage mit Affinität zu einem Zielprotein kann amplifiziert werden. Üblicherweise werden diese Panning-Zyklen dazu benötigt, Bakteriophagen mit hoher Affinität zu bekommen. Nach drei Runden können individuelle Klone durch Sequenzieren der variablen Region in der genomischen DNA charakterisiert werden. Dieses System kann gut für die Identifizierung kurzer interagierender Oligopeptide angewandt werden, die dann als Affinitäts-Tags verwendet werden können, um Protein-Fragmente zusammen zu bringen.
  • Ein anderer Ansatz verwendet natürlich vorkommende interagierende Domänen, wie Leucinreiche Wiederholungen (Kobe & Deisenhofer, 1994, Trends Biochem. Sci., 19, 415-421; Kobe & Kajava, 2001, Curr. Opin. Struct. Biol., 11, 725-732), Zink-Finger (Grossley, Merika & Orkin, 1995, Mol. Cell. Biol., 15, 2448-2456), Ankyrin-Wiederholungen (Thompson, Brown & McKnight, 1991, Science, 253, 762-768), Chromo-Domänen (Paro & Hogness, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 263-267; Singh et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 789-793) und vielen anderen, die in Protein-Protein-Interaktionen involviert sind. Jedoch sollte die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, bei dem Protein-Protein-Interaktionen nicht nur die durch Engineering erhaltenen Protein-Fragmente mit den Fusionen zu verwenden, sondern auch endogene Proteine.
  • Die Verwendung von Protein-Protein-Interaktionen zum Einschalten eines gewünschten zellulären Prozesses wie die Genexpression hat unter anderem die folgenden Vorteile: Erstens kann das System hochgradig spezifisch gestaltet werden, da die gewünschte Funktion das Ergebnis einer hochspezifischen Protein-Protein- oder Protein-Nukleinsäure-Interaktion ist, die im nichtinduzierten Zustand auf null ist und keine nichtspezifische basale Expression im nichtinduzierten Zustand (leakiness) aufweist. Dies ist bei Systemen des Standes der Technik wie auf kleinen Molekülen beruhenden Schaltern anders, da diese inhärent weniger spezifisch sind und immer ein gewisses Maß ein Leakiness zeigen. Zweitens kann ein Proteinschalter oder ein Fragment desselben direkt in eine Zelle eingeführt werden ohne einen Nukleinsäurevektor, der für das Protein kodiert, was eine genaue Dosierung des Proteins erlaubt. Dies macht das direkte Einschleusen des Proteinschalters in Zellen vergleichbar mit der Verwendung kleiner Moleküle zum Auslösen eines benötigten Prozesses in den Zellen. Drittens ist das System inhärent umweltsicherer als Systeme des Standes der Technik, die die volle genetische Information für das gewünschte Protein enthalten (entweder in Form einer linearen Nukleinsäure oder Fragmenten derselben), da der fragliche Organismus nicht die gesamte genetische Information enthält, die für die Expression eines funktionellen Proteins benötigt wird. Gemäß des zentralen Dogmas der Molekularbiologie können biologische Systeme Proteine nicht rückwärts zu Nukleinsäuren translatieren. Daher ist das Rückwärts-Engineering der genetischen Information, die für die Expression eines funktionellen Merkmals in einem lebenden Organismus ausreichend ist, nicht möglich. Viertens stellt das System ein spezifisches Schloss dar, das verwendet werden kann, um die nichtauthorisierte Verwendung des Systems zu verhindern. Die Verwendung eines Proteinschalters als Komponente eines rohen Proteinextrakts aus Organismen, die das Protein oder das Proteinfragment exprimieren, macht es praktisch sehr schwierig, die aktive Komponente des Extrakts zu identifizieren.
  • Ausbreitung des Proteinschalters in einer Pflanze zum Auslösen eines gewünschten zellulären Prozesses
  • Im folgenden wird ein Ansatz beschrieben, um das Problem der geringen Anzahl der Zellen einer Pflanze, die mit dem extern-applizierten Polypeptid erreicht werden können, zu lösen: Das Polypeptid kann zur Bildung eines intrazellulären Proteinschalter-Moleküls führen, das zur Wanderung von Zelle zu Zelle oder zur systemischen Wanderung befähigt ist. Ferner kann das Polypeptid zur Bildung eines auf einem Virus basierenden Vektors (Amplicons) führen, der ein gewünschtes Gen oder ein Teil desselben exprimiert und zur Wanderung von Zelle zu Zelle (cell-to-cell-movement) oder zur systemischen Wanderung (systemic movement) in der Pflanze befähigt ist. In diesen Ausführungsformen kann die Bewegung entweder eines viralen Vektors oder von Proteinschalter-Molekülen oder beidem zur Ausbreitung eines zellulären Prozesses und/oder einer biochemischen Kaskade über beträchtliche Teile der Pflanze und sogar in der gesamten genetisch modifizierten Pflanze führen.
  • In Beispiel 1 der Erfindung enthält der Proteinschalter eine PhiC31 Integrase, um einen Vorläufer-Vektor eines viralen Vektors in einen viralen Vektor umzuwandeln. Der virale Vektor ist zur Amplifizierung, zur Wanderung von Zelle zu Zelle und zur systemischen Wanderung befähigt. Die Integrase-vermittelte Rekombination zwischen attP und attB-Stellen von pICHGFPinv (7-A) führt zur Inversion eines DNA-Fragments, das von den Stellen flankiert wird, und zur Bildung eines viralen Vektors, der amplifiziert werden kann und ein gewünschtes Gen (GFP) exprimieren kann (7-B). Dies wird dadurch erreicht, dass virale Komponenten (3'NTR – 3'-nicht-translatierte Region; CP – Hüll-Protein), die für die Vektor-Amplifizierung und den systemischen Transport nötig sind, bezüglich eines in dem fraglichen multizellulären Organismus aktiven Promotors in Sense-Orientierung gebracht werden, z.B. der Actin-2-Promotor. Dies führt zusammen mit anderen Komponenten des viralen Vektors (RdRp und CP) zur Bildung einer cDNA, die infolge der durch den Actin-2-Promotor betriebenen Transkription einen viralen RNA-Vektor bildet, der zur Amplifizierung, zur Wanderung von Zelle zu Zelle und zur systemischen Wanderung befähigt ist. Wahlweise kann der Vektor weiter modifiziert werden, indem das CP-Gen (Hüll-Protein) entfernt wird. Ein Vektor, dem das CP-Gen fehlt, ist noch immer zur Wanderung von Zelle zu Zelle befähigt. Die Konstruktion von Expressionssystemen auf der Basis von pflanzlichen Viren für die Expression von nicht-viralen Genen in Pflanzen wurde in mehreren Publikationen beschrieben (Dawson et al., 1989, Virology, 172, 285-293; Brisson et al., 1986, Methods in Enzymology, 118, 659; MacFarlane & Popovich, 2000, Virology, 267, 29-35; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; Voinnet et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14147-14152) und Übersichtsartikel (Porta & Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol., 5, 209-221; Yusibov et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94) und kann leicht von Fachleuten ausgeführt werden. Expressionssysteme auf der Basis viraler Vektoren erlauben eine deutlich höhere Ausbeute des Produktes eines Transgens, verglichen mit pflanzlichen nucleären Transgenen. Zum Beispiel kann das Maß an Transgen-kodiertem Protein 5 bis 10% des zellulären Gesamt-Proteins der Pflanze erreichen, wenn es von einem viralen Vektor exprimiert wird (Kumagai et al., 2000, Gene, 245, 169-174; Shivprasad et al., 1999, Virology, 255, 312-323). RNA-Viren sind am besten geeignet, da sie ein höheres Expressionslevel ermöglichen verglichen mit DNA-Viren. Es gibt mehrere veröffentlichte Patente, die virale Vektoren beschreiben, die für die systemische Expression transgenen Materials in Pflanzen geeignet sind ( US 5 316 931 ; US 5 589 367 ; US 5 866 785 ). Im allgemeinen können diese Vektoren ein Fremd-Gen als Translationsfusion mit einem viralen Protein exprimieren ( US 5 491 076 ; US 5 977 438 ), von einem zusätzlichen subgenomischen Promotor ( US 5 466 788 ; US 5 670 353 ; US 5 866 785 ) oder von polycistronischer viraler RNA unter Verwendung eines IRES- (internal ribosome entry site)-Elements zur unabhängigen Protein-Translation ( DE 100 495 87 ). Der erste Ansatz, die Translationsfusion eines rekombinanten Proteins mit einem viralen Struktur-Protein ergibt eine gute Ausbeute eines rekombinanten Protein-Produkts (Hamamoto et al., 1993, Biotechnology, 11, 930-932; Gopinath et al. 2000, Virology, 267, 159-173; JP 6169789 ; US 5 977 438 ). Der Nutzen dieser Methode ist jedoch begrenzt, da das rekombinante Protein nicht leicht von dem viralen abgetrennt werden kann. Eine Alternative zu dieser Methode verwendet eine Translationsfusion über eine Peptidsequenz, die von einer viralen ortsspezifischen Protease oder über ein katalytisches Peptid erkannt wird (Dolja et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10208-10212; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; US 5 162 601 ; US 5 766 885 ; US 5 491 076 ). Expressionsprozesse unter Verwendung viraler Vektoren auf der Basis von heterologen subgenomischen Promotoren erlauben das bislang größte Ausmaß an Protein-Produktion ( US 5 316 931 ). Der größte Nachteil viraler Vektoren und vieler anderer Vektoren ist ihre beschränkte Kapazität bezüglich der Größe der DNA, die amplifiziert werden soll. Normalerweise nehmen stabile Konstrukte Inserts von nicht mehr als 1 kb auf. In einigen Gebieten der funktionellen Genom-Analyse von Pflanzen mag das keine sehr ernste Beschränkung sein, da G. della-Cioppa et al. (WO 993651) die Verwendung TMV-basierter viraler Vektoren zur Expression von pflanzlichen cDNA-Bibliotheken beschrieb, mit dem Ziel, endogene Gene herunter zu regulieren (Silencing). Zwei-Komponenten-Amplifikationssysteme, die Hilfsviren verwenden (helper viruses), ermöglichen eine etwas bessere Kapazität ( US 5 889 191 ). Andere Systeme, die auf Expressions-Kassetten beruhen, die stabil in das pflanzliche Genom integriert werden, enthalten den starken 35S-Promotor, der die Expression von Amplicons, die auf viralen Vektoren beruhen, antreibt. Diese Systeme werden gewöhnlich von posttranskriptionalem Gene-Silencing (PTGS) betroffen (Angel) & Baulcombe, 1997, EMBO J., 16, 3675-3684). Die Verwendung von PTGS-Suppressoren ist nötig, um das Silencing zu bewältigen (WO 0138512). Das Kreuzen von Pflanzen, die das vom Silencing betroffene Amplicon tragen, mit Pflanzen, die die Quelle des PTGS-Suppressors tragen, ist nötig, um mit einem solchen System die Produktion eines gewünschten Proteins im großen Maßstab zu erreichen (Mallon et al., 2002, Nature Biotechnol., 20, 622-625). Es ist offensichtlich, dass ein solches System keine flexible und strikte Kontrolle der Transgen-Expression erlaubt und auf die Herstellung von Proteinen beschränkt ist, die nicht mit dem Wachstum der Pflanze und deren Entwicklung interferieren.
  • Unsere Erfindung erlaubt es, die Beschränkungen der oben beschriebenen viralen Vektor-Systeme, insbesondere ihre beschränkte Kapazität für die Größe des zu exprimierenden Gens und den Mangel an Flexibilität bezüglich der Kontrolle der Expression zu überwinden. In unserer Erfindung ist der virale Vorläufer-Vektor (Provektor) vorzugsweise in jeder Zelle der transgenen Pflanze vorhanden. Im Fall der Expression großer Gene (über 1 kb) ist die Wanderung des Proteinschalters bevorzugt im Vergleich zur Wanderung eines viralen Vektors. Virale Vektoren können in Zellen effizient amplifizieren, und die Größe des Inserts eines viralen Vektors beeinflusst vor allem die Fähigkeit zur Wanderung von Zelle zu Zelle und die systemische Wanderung. Daher löst das Einschleusen eines beweglichen Proteinschalters in viele oder sogar in alle Zellen der Wirtspflanze das oben genannte Problem, sofern der Proteinschalter einen viralen Vektor aktivieren kann. Um ferner ein System mit einer effizienten Schaltfunktion bereitzustellen, die die Amplifikation eines solchen Vektors in den meisten, wenn nicht in allen Zellen der Wirtspflanze, anschalten kann, werden in dieser Erfindung Proteinschalter verwendet, die zur Wanderung von Zelle zu Zelle und zur systemischen Wanderung befähigt sind.
  • Zu diesem Zweck kann der Proteinschalter einen Protein-Teil enthalten, der den Proteinschalter zur Bewegung von Zelle zu Zelle und zur systemischen Wanderung befähigt. Beispiele für solche Protein-Teile, die interzellulär wandern können, sind im Stand der Technik bekannt. Es gibt Hinweise, dass pflanzliche Transkriptionsfaktoren, bei der Abwehr beteiligte Proteine und virale Proteine durch Plamodesmata wandern können (für eine Übersicht siehe: Jackson & Hake, 1997, Curr. Opin. Genet. Dev., 7, 495-500; Ding, B., 1998, Plant Mol. Biol., 38, 279-310; Jorgensen RA., 2000, Sci STKE, 58, PE2; Golz & Hudson, 2002, Plant Cell, 14, S277-S288). Es wurde gezeigt, dass eine Fusion des 3a-Movement-Proteins des Gurken-Mosaik-Virus mit GFP über Plasmodesmata in Nachbarzellen wandern kann (Itaya et al., 2002, Plant Cell, 14, 2071-2083). Diese Fusion zeigte auch die Bewegung durch das Phloem vom transgenen Wurzelstock in einen nicht-transgenen Pfropf. Das Movement-Protein des Tabak-Mosaik-Virus (TMV), P30, wandert zwischen Zellen durch Plasmodesmata und erleichtert durch Beeinflussung der Größe der Plasmodesmata die Bewegung vieler anderer großer Makromoleküle, die sonst nicht wandern (Citovsky et al., 1999, Phil. Trans. R. Soc. London B Biol. Sci., 354, 637-643; Ding, Itaya & Woo, 1999, Int. Rev. Cytol., 190, 251-316). Die P30:GFP-Fusion zeigte Wanderung zwischen den Zellen unabhängig von den physiologischen Bedingungen, während die ungezielte GFP-Diffusion durch Plasmodesmata stark vom physiologischen Zustand der Pflanzenzellen abhängt (Crawford & Zambryski, 2001, Plant Physiol., 125, 1802-1812). Die Fusion von GFP mit dem Transkriptionsfaktor knotted 1 zeigt ebenso die Fähigkeit zum interzellulären Trafficking. Das GFP:KN1-Fusionsprotein zeigte Wanderung von den internen Geweben des Blattes zur Epidermis, zwischen Epidermis-Zellen und in das apikale Meristem des Sprosses der Tabakpflanze (Kim et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 4103-4108). Plasmodesmata spielen eine wichtige Rolle bei dieser Wanderung und ihr physiologischer Zustand und Struktur sind für die Effizienz dieses Trafficking wichtig. Zum Beispiel erlauben einfache Plasmodesmata das nicht-spezifische Trafficking von Proteinen in sich entwickelnden Tabakblättern, während verzweigte dies nicht erlauben (Oparka et al., 1999, Cell, 98, 5-8). Das Ermöglichen der Wanderung von Makromolekülen inklusive Proteinen scheint eine normale Funktion der Plasmodesmata zu sein, was von Pflanzenviren für ihre Ausbreitung von Zelle zu Zelle ausgenutzt worden ist (Fujiwara et al., 1993, Plant Cell, 5, 1783-1794). Es ist allgemein akzeptiert, dass Plasmodesmata und das Phloem eine wichtige Rolle beim Transport und beim Einschleusen von Informations-Makromolekülen (Proteine und Nucleinsäuren) spielen (Ruiz-Medrano et al., 2001, Curr. Opin. Plant Biol., 4, 202-209). Saft-Proteine des Phloems aus Cucurbita maxima und Ricinum communis haben die Fähigkeit zur Wanderung von Zelle zu Zelle durch Plasmodesmata (Balachandran et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 14150-14155).
  • 8 zeigt schematisch Möglichkeiten zum Erreichen der interzellulären Wanderung des erfindungsgemäßen Proteinschalters. Ein extern verabreichter Proteinschalter (z.B. das Polypeptid) und der in einer Zelle synthetisierte Proteinschalter können Fusionen derselben oder verschiedener Protein-Segmente mit Translokations- oder Trafficking-Signalen sein. In unserem Beispiel (8) wird das gleiche Protein-Segment, z.B. eine Rekombinase, entweder mit einem Membran-Translokationssignal (MTS) für Zellmembran-Permeabilität verbunden, oder mit einem Protein-Teil (TP), der die interzelluläre Wanderung (Trafficking) ermöglicht. Es ist sehr wahrscheinlich, dass für kleine Proteine (wie GFP und kleinere) eine Fusion mit TP nicht nötig ist, da sie zur effizienten Bewegung von Zelle zu Zelle durch einfache Diffusion fähig sein können. Für größere Proteinschalter ist eine Fusion mit einem TP oder einem aktiven Fragment desselben jedoch vorteilhaft. Unter allen Proteinen, die beim interzellulären Trafficking beteiligt sind, sind virale Proteine am besten untersucht. Daher sind sie die bevorzugtesten Kandidaten zur Verwendung in einem Proteinschalter. Wie in 8 gezeigt, kann ein extern verabreichtes Polypeptid (MTS:Rekombinase) die Expression eines Transgens, das für einen Proteinschalter mit derselben enzymatischen Aktivität (Rekombinase:TP) kodiert, auslösen, der dann zum Verlassen einer Zelle und zum Eintritt in andere Zellen (interzelluläres Trafficking) befähigt ist. Der zum Trafficking befähigte Proteinschalter betätigt die Expression des Proteinschalters in allen betroffenen Zellen, was eine Kettenreaktion darstellt. Die Verfügbarkeit des Proteinschalters in der Zelle ist die Voraussetzung für die Expression eines gewünschten Gens (gene of interest – GOI) in Zellen durch DNA-Umordnung, was die Bildung eines auf einem viralen Vaktor basierenden Amplicons verursacht. Die Größe des gewünschten Gens, das von einem solchen Amplicon exprimiert wird, ist kein limitierender Faktor für die Effizienz der GOI-Expression, da Amplicon-Stabilität und Bewegung von Zelle zu Zelle in diesem System nicht nötig sind: Der virale Provektor kann in jeder der Zellen der Pflanze vorliegen, und die Ausbreitung des Proteinschalters kann die Expression des gewünschten Gens in jeder dieser Zellen auslösen. Vorzugsweise trägt jedoch die Ausbreitung des Amplicons zur Effizienz der GOI-Expression bei.
  • Das ultimative Ziel des Proteinschalter-Systems dieser Erfindung ist eine operative Kontrolle eines gewünschten zellulären Prozesses oder einer biochemischen Kaskade in einem pflanzlichen Produktionssystem. Eine biochemische Kaskade ist eine Kette biochemischer Reaktionen in einem Produktionssystem eines Wirts, die schlussendlich ein spezifisches Produkt, Wirkung oder Merkmal ergibt. Die hier beschriebenen Ansätze bieten ein effizientes Produktionskontrollverfahren und sind vielfältig einsetzbar und leakage-sicher. Das oben beschriebene Zwei-Komponenten-Verfahren ist im wesentlichen ein Schlüssel-Schloss-System, womit ein Unternehmen effizient den Zugang zur Produktion kontrollieren kann, indem sie die Proteinschalter-Komponente verkauft.
  • Bevorzugte Pflanzen zur Verwendung in dieser Erfindung sind u.a. alle Pflanzenarten, vor allem jedoch Pflanzenarten, die in der Landwirtschaft oder im Gartenbau wichtig sind. Übliche Nutzpflanzen zur Verwendung in dieser Erfindung sind u.a. Alfalfa, Gerste, Bohnen, Raps, Futtererbsen, Baumwolle, Mais, Klee, Lotus, Linsen, Lupinen, Hirse, Hafer, Erbsen, Erdnüsse, Reis, Roggen, Süßklee, Sonnenblumen, süße Erbsen, Sojabohnen, Sorghum triticale, Yams-Bohnen, Seidenbohnen, Wicken, Weizen, Wisteria und Nusspflanzen.
  • Bevorzugte Pflanzenarten für die Durchführung dieser Erfindung sind u.a. solche, die zu den Gramineae, Kompositeae, Solanaceae und Rosaceae gehören. Weitere Pflanzenarten für diese Erfindung sind solche der folgenden Gattungen: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea, und Olyreae, Pharoideae und viele andere.
  • In dieser Erfindung sind Pflanzenarten, die nicht in die Nahrungskette eingehen, besonders bevorzugt für die Erzeugung pharmazeutischer oder technischer Proteine. Unter diesen sind Nikotiana-Arten besonders bevorzugt, da diese Arten leicht zu transformieren und zu kultivieren sind und es gut entwickelte Expressionsvektoren (insbesondere virale Vektoren) gibt.
  • Bevorzugte multizelluläre Organismen nicht-pflanzlicher Herkunft zur Verwendung in dieser Erfindung sind Zellkulturen von Säugern, Insekten sowie nicht-menschliche transgene Organismen.
  • Gewünschte Gene, deren Fragmente oder deren künstliche Derivate, die mit dieser Erfindung exprimiert und isoliert werden können, sind unter anderem: Stärke-modifizierende Enzyme (Stärke-Synthase, Stärke-phosphorylierendes Enzym, debranching enzyme, Stärke- verzweigendes Enzym, Stärke-verzweigendes Enzym II, granule bound Stärke-Synthase), Sucrosephosphat-Synthase, Sucrose-Phosphorylase, Polygalacturonase, Polyfructan-Sucrase, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, Cyclodextrin-Glycosyltransferase, Fructosy-Transferase, Glycogen-Synthase, Pectin-Esterase, Aprotinin, Avidin, Bacterielle Levansucrase, E.coli glgA Protein, MAPK4 und Orthologe, Stickstoff-Assimilierungs/Methabolismus-Enzyme, Glutamin-Synthase, pflanzliches Osmotin, 2S Albumin, Thaumatin, ortspezifische Recombinasen/Integrasen (FLP, Cre, Recombinase, Int, SSVI Integrase R, Integrase phiC31, oder ein aktives Fragment oder Variante derselben), Isopentenyl-Transferase, Sca M5 (Sojabohnen-Calmodulin), Coleopteran-artige Toxine oder ein insektizidaktives Fragment, Fusionsproteine des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms (E2), Enzyme die Lipide, Aminosäuren, Zucker, Nukleinsäuren und Polysaccharide metabolisieren, Superoxide-Dismutase, inaktives Proenzym einer Protease, pflanzliche Proteintoxine, Merkmale die in faserproduzierenden Pflanzen Fasern verändern, gegen Coleoptera-aktives Toxin von Bacillus thuringiensis (Bt2 Toxin, Insektizides Kristallprotein (ICP), CryIC Toxin, Delta-Endotoxin, Polyopeptidtoxin, Protoxin etc.), insektenspezifisches Toxin AaIT, Cellulose-abbauende Enzyme, E1 Cellulase von Acidothermus celluloticus, Lignin-modifizierende Enzyme, Cinnamoylalkohol-Dehydrogenase, Trehalose-6-phosphat-Synthase, Enzyme des Cytokinin metabolic pathway, HMG-CoA Reductase, Thaumatin, E. coli anorganische Pyrophosphatase, Samenlagerungsprotein (seed storage protein), Erwinia herbicola Lycopen-Synthase, ACC Oxidase, pTOM36 kodiertes Protein, Phytase, Ketohydrolase, Acetoacetyl-CoA-Reductase, PHB (Polyhydroxybutanoate)- Synthase, Acyl-carrier-protein, Napin, EA9, Phytoen-Synthase aus nichthöheren Pflanzen, pTOM5-kodiertes Protein, ETR (Ethylen-Rezeptor), plastidäre Pyruvat-Phosphat-Dikinase, Nematoden-induzierbares Transmembranporenprotein, merkmalsfördernde photosynthetische oder plastidäre Funktion der Pflanzenzelle, Stilben-Synthase, Enzyme, die Phenole hydroxylieren können, Catechol-Dioxygenase, Catechol-2,3-Dioxygenase, Chloromuconat-Cycloisomerase, Anthranilat-Synthase, Brassica AGL15 Protein, Fructose-1,6-Biphosphatase (FBPase), AMV RNA3, PVY Replicase, PLRV Replikase, Potyvirus-Hüllprotein, CMV-Hüllprotein, TMV-Hüllprotein, Luteovirus Replicase, MDMV messenger RNA, mutierte geminivirale Replicase, Umbellularia californica C12:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, pflanzliche C10 or C12:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, C14:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase (luxD), pflanzlicher Synthasefaktor A, pflanzlicher Synthasefaktor B, 6-Desaturase, ein Protein mit einer enzymatischen Aktivität in der peroxysomalen b-Oxidation von Fettsäuren in Pflanzenzellen, Acyl-CoA-Oxidase, 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase, Lipase, Acetyl-CoA-Carboxylase aus Mais, 5-Enolpyruvylschikimat-3-Phosphat- Synthase (EPSP), Phosphinothricin-Acetyl-Transferase (BAR, PAT), CP4 Protein, ACC-Deaminase, Proteine mit posttranslationaen Spaltstellen, DHPS Gen, das Sulfonamid-Resistenz verleiht, bakterielle Nitrilase, 2,4-D Monooxygenase, Acetolactat-Synthase oder Acetohydroxysäure-Synthase (ALS, AHAS), Polygalacturonase, Taq Polymerase, viele andere Enzyme aus Bakterien oder Phagen, darunter Restriktionsendonucleasen, Methylasen, DNA- und RNA-Ligasen, DNA-und RNA-Polymerasen, Reverse Transcriptase, Nucleasen (Dnasen und Rnasen), Phospatasen, Transferasen, usw.
  • Die Erfindung kann auch für die Zwecke der molekularen Landwirtschaft (molecular farming) und zur Reinigung von kommerziell wertvollen und pharmazeutisch wichtigen Proteinen verwendet werden, darunter industrielle Enzyme (Cellulasen, Lipasen, Proteasen, Phytase, etc.) Jedes humane oder tierische Protein kann nach der Erfindung exprimiert und gereinigt werden. Beispiele für solche gewünschten Proteine sind u.a. Immunantwort-Proteine (monoklonale Antikörper, Einzelketten-Antikörper, T-Zell-Rezeptoren usw.), Antigene (darunter solche aus pathogenen Mikroorganismen), Kolonie-Stimulationsfaktoren, Relaxine, Polypeptid-Hormone (darunter Somatotropin HGH und Proinsulin), Cytokine und deren Rezeptoren, Interferone, Wachstumsfaktoren und Koagulationsfaktoren, enzymatisch aktive lysosomale Enzyme, fibrinolytische Polypeptide, Blutgerinnungsfaktoren, Trypsinogen, a1-Antitrypsin (AAT), humanes Serumalbumin, Glucocerebrosidase, natives Cholera-Toxin B, sowie funktionskonservative Proteine, wie Fusionsproteine, mutierte Varianten und synthetische Derivate all dieser Proteine.
  • BEISPIEL 1
  • Verwendung einer von einem Proteinschalter ausgelösten ortsspezifischen DNA-Rekombination, um einen Amplifikationsvektor aus Provektor-Teilen zusammenzufügen, die stabil in das Pflanzen-Genom integriert wurden Ein Binärvektor pICHGFPinv (7), der T-DNA mit zwei Provektor-Teilen trägt, wurde nach Standardmethode der Molekularbiologie (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York) hergestellt. Provektor-Elemente und Prinzipien ihrer Herstellung und Funktion sind im Detail in den Patentanmeldungen PCT/EP 02/03476 und in DE 101 21 283 beschrieben. Der Vektor enthält einen Transformationsmarker (NPTII-Gen), das 5'-Ende von TMV hinter dem Pflanzenpromotor des Arabidopsis-Actin2-Gens (An et al., 1996, Plant J., 10, 107-121) und enthält eine RNA-abhängige RNA Polymerase (RdRp) und das Movement-Protein (MP) gefolgt von einem subgenomischen Promotor. Der Vektor enthält ferner das 3'-Ende des Provektors, der das gewünschte Gen (GFP), das virale Hüll-Protein (CP), das die systemische Wanderung ermöglicht, und die 3'-nicht-translatierte Region des viralen Vektors (3' NTR) enthält. Der 3'-Provektor zusammen mit 2 Transkriptions-Terminationssignalen wird von Rekombinationsstellen flankiert, die von der Phagen-Integrase PhiC31 erkannt werden (Thomason, Calendar & Ow, 2001, Mol. Genet. Genomics, 265, 1031-1038).
  • Transgene Nicotiana benthamiana Pflanzen, die die T-DNA von pICHGFPinv enthält, wurden durch Agrobakterium-vermittelte Transformation von Blattscheiben erhalten, wie von Horsch et al. (1985, Science, 227, 129-131) beschrieben. Blattscheiben wurden 30 Minuten mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101, der mit dem gewünschten Konstrukt transformiert war, inkubiert. Nach dreitägiger Inkubation im Medium (MS-Medium 0,1 mg/l NAA, 1 mg/l BAP) ohne Selektionsmittel, wurden Transformanten auf demselben MS-Medium, das mit 100 mg/l Kanamycin versetzt war, selektioniert. Um das Wachstum des Agrobacteriums zu reduzieren, wurde das Medium ferner mit 300 mg/l Carbenicilin und 300 mg/l Cefotaxim versetzt. Regeneranten wurden auf Selektionsmedium (MS-Medium) ohne Hormone, jedoch mit derselben Konzentration der Selektionsmittel inkubiert, um die Wurzelbildung zu induzieren. Die Anwesenheit des Transgens in segregierenden T2-Populationen wurde durch PCR-Analyse bestätigt.
  • Die Exposition der Blätter transgener Pflanzen mit zellpermeabler Integrase bewirkt die ortsspezifische Rekombination zwischen attP und attB Stellen. Diese Rekombination führt zum Umdrehen des 3'-Provektors, was zur Bildung einer vollständigen cDNA eines viralen Amplikons unter der Kontrolle des Actin2 Promoters führt (7B). Das TMV-basierte RNA-Amplicon, das GFP exprimiert, ist zur Wanderung von Zelle zu Zelle und zur systemischen Wanderung befähigt. Die GFP-Expression in N. benthamiana-Pflanzen kann visuell leicht detektiert werden unter Verwendung einer UV-Lampe oder durch Betrachten von Pflanzengewebe unter einem LEICA-Stereo-Fluoreszenz-Mikroskop (Anregung bei 450-490 nm, Emission bei 500-550 nm). Das in unseren Experimenten verwendete sGFP kann mit blauem und mit UV-Licht angeregt werden.

Claims (30)

  1. Verfahren zur Kontrolle einer genetisch veränderten Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer genetisch veränderten Pflanze, wobei Zellen der genetisch veränderten Pflanze eine heterologe Nukleinsäure enthalten und wobei die genetisch veränderte Pflanze inaktiv bezüglich eines gewünschten zellulären Prozesses ist, (c) Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses durch direktes Einführen eines Polypeptids aus einer zellfreien Zusammensetzung in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, wobei das Polypeptid und die heterologe Nukleinsäure so aufeinander abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozesses einschalten kann.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das direkte Einführen von Schritt (b) mittels Partikelbombardierung, Applikation des Polypeptids auf zumindest einen Teil der Pflanze oder mittels Injektion einer Lösung, die das Polypeptid enthält, in Gewebe der Pflanze getan wird.
  3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid eine Membrantranslokationssequenz enthält, die das direkte Einführen des Polypeptids in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, ermöglicht.
  4. Das Verfahren von Anspruch 3, wobei die Membrantranslokationssequenz kovalent mit dem Polypeptid verbunden ist.
  5. Das Verfahren von Anspruch 3, wobei die Membrantranslokationssequenz nichtkovalent mit dem Polypeptid verbunden ist.
  6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses die Bildung einer DNA, einer RNA oder eines Proteins von der heterologen Nukleinsäure umfasst.
  7. Das Verfahren von Anspruch 6, wobei Zellen der Pflanze eine zusätzliche heterologe Nukleinsäure enthalten, die von der DNA, der RNA oder dem Protein kontrolliert wird.
  8. Das Verfahren von Anspruch 6 oder 7, wobei die DNA, die RNA oder das Protein sich auf andere Zellen der Pflanze ausbreiten kann.
  9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der gewünschte zelluläre Prozess die Bildung eines exprimierbaren Operons von der heterologen Nukleinsäure oder von einem RNA-Expressionsprodukt derselben umfasst.
  10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der gewünschte zelluläre Prozess die Bildung eines exprimierbaren Amplikons von der heterologen Nukleinsäure oder von einem RNA-Expressionsprodukt derselben umfasst.
  11. Das Verfahren von Anspruch 10, wobei das exprimierbare Amplikon ein gewünschtes Gen exprimieren kann.
  12. Das Verfahren von Anspruch 10 oder 11, wobei das exprimierbare Amplikon zur Wanderung von Zelle zu Zelle (cell-to-cell movement) oder zur systemischen Wanderung (systemic movement) befähigt ist.
  13. Das Verfahren von Anspruch 8, wobei das Protein einen Proteinteil enthält, der dem Protein die Fähigkeit verleiht, eine Zelle zu verlassen und in andere Zellen der Pflanze einzutreten.
  14. Das Verfahren von Anspruch 13, wobei der Proteinteil aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: ein virales Movement-Protein, ein virales Hüllprotein, ein pflanzlicher oder tierischer Transkriptionsfaktor, ein pflanzlicher oder tierischer peptidischer intrazellulärer Messenger, ein künstliches Peptid, das das Protein mit der Fähigkeit versehen kann.
  15. Das Verfahren von Anspruch 13 oder 14, wobei das Protein die Expression des Proteins in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, kontrollieren kann.
  16. Das Verfahren von Anspruch 15, wobei das Protein die zusätzliche heterologe Nukleinsäure kontrolliert.
  17. Das Verfahren von Anspruch 16, wobei der gewünschte zelluläre Prozess die Bildung einer RNA- oder eines Protein-Expressionsprodukts, eines Operons, oder eines Amplikons von der zusätzlichen heterologen Nukleinsäure umfasst.
  18. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Protein und das Polypeptid zusammen eine vorbestimmte Funktion erzeugen, die den gewünschten zellulären Prozess nur dann einschaltet, wenn das Protein und das Polypeptid gemeinsam vorliegen.
  19. Das Verfahren von Anspruch 18, wobei das Protein und das Polypeptid zusammen die vorbestimmte Funktion durch Intein-vermitteltes Trans-Spleißen oder durch Inteinvermittelte Affinitätsinteraktion generieren.
  20. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess einschalten kann durch (i) eine enzymatische Aktivität oder durch (ii) eine Bindeaffinität zu der heterologen Nukleinsäure oder zu einem Expressionsprodukt der heterologen Nukleinsäure.
  21. Das Verfahren von Anspruch 20, wobei das Polypeptid eine enzymatische Aktivität einer ortsspezifischen Rekombinase, Flippase, Resolvase, Integrase, Transposase, Replicase oder Polymerase aufweist.
  22. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das Polypeptid in Schritt (b) eingeführt wird ohne Einführen einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid oder für einen Teil des Polypeptids kodiert, der den gewünschten zellulären Prozess einschalten kann.
  23. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Pflanze eine transgene Pflanze ist, die die heterologe Nukleinsäure stabil in das Kerngenom integriert enthält.
  24. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Pflanze eine transgene Pflanze ist, die die heterologe Nukleinsäure stabil in das Plastidengenom integriert enthält.
  25. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Pflanze einer höhere Nutzpflanze ist.
  26. Genetisch veränderten Pflanze, die eine heterologe Nukleinsäure in ihren Zellen enthält, wobei die Pflanze bezüglich eines gewünschten zellulären Prozesses inaktiv ist, wobei die heterologe Nukleinsäure so vorgesehen ist, dass der gewünschte zelluläre Prozess durch direktes Einführen eines Polypeptids in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, eingeschaltet werden kann, wobei das Polypeptid und die heterologe Nukleinsäure so aufeinander abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess einschalten kann.
  27. Die genetisch veränderte Pflanze von Anspruch 26, ferner gekennzeichnet wie in einem der Ansprüche 1 bis 25 definiert.
  28. System zur Kontrolle eines gewünschten zellulären Prozesses in einer genetisch veränderten Pflanze, umfassend eine Pflanze wie in einem der Ansprüche 26 oder 27 definiert und ein Polypeptid zum Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses, wobei die Pflanze und das Polypeptid so aufeinander abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess einschalten kann.
  29. Pflanze erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren von einem der Ansprüche 1 bis 25.
  30. Zellfreie Zusammensetzung aus Zellen, die das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 enthält.
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