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GEBIET DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Kontrolle eines gewünschten
zellulären
Prozesses in einer Pflanze durch ein externes Signal. Ferner betrifft
diese Erfindung eine transient oder stabil genetisch veränderte Pflanze
zur Durchführung
des Verfahrens der Erfindung, sowie eine genetisch veränderte Pflanze,
die nach dem Verfahren der Erfindung kontrolliert wurde. Darüberhinaus
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines Produktes
in einer genetisch veränderte
Pflanze, bei dem ein gewünschter
zellulärer
Prozess mit einem verschlüsselten
externen Signal kontrolliert wird. Das Verfahren der Erfindung erlaubt
die selektive Kontrolle über
die Expression eines Transgens in einer transient oder stabil genetisch
veränderten
Pflanze, wobei ein gewünschter
biochemischer Prozess oder eine biochemische Kaskade zu einem gewünschten
Zeitpunkt selektiv eingeschaltet werden kann, wobei der Prozess
oder die Kaskade zuvor nicht aktiv war.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Kontrollierbare Systeme
zur Transgen-Expression in Pflanzen
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Eines der Hauptprobleme der Pflanzen-Biotechnologie
ist das Erreichen einer verlässlichen Kontrolle über die
Transgen-Expression. Eine strikte Kontrolle über die Gen-Expression in Pflanzen
ist wesentlich, wenn ein Produkt der Transgen-Expression wachstumsinhibierend
oder toxisch ist, wie z.B. bioabbaubares Plastik (Nawrath, Poirer & Somerville, 1994,
Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12760-12764; John & Keller, 1996, Proc. Natl. Acad.
Sci., 93, 12768-12773;
US 6 103
956 ;
US 5 650 555 )
oder Proteintoxine (
US 6 140
075 ).
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Bestehende Technologien zur Kontrolle
der Genexpression in Pflanzen beruhen üblicherweise auf gewebsspezifischen
oder induzierbaren Promotoren und praktisch alle leiden an einer
basalen Expressionsaktivität
auch im nichtinduzierten Zustand, d.h. sie sind „leaky". Gewebsspezifische Promotoren (
US05955361 ; WO09828431)
sind ein wirksames Werkzeug, jedoch ist ihre Verwendung auf sehr
spezielle Anwendungsgebiete beschränkt, z.B. für die Herstellung steriler
Pflanzen (WO9839462) oder für die
Genexpression in Samen (WO00068388;
US05608152 ).
Induzierbare Promotoren können nach
den Induktionsbedingungen in zwei Kategorien eingeteilt werden:
solche, die durch abiotische Faktoren (Temperatur, Licht, chemische
Substanzen) und solche, die durch biotische Faktoren wie zum Beispiel Pathogen-
oder Schädlingsbefall
induziert werden. Beispiele für
die erste Kategorie sind hitzeinduzierbare (
US5,187 287 ) und kälteinduzierbare (
US 5 847 102 ) Promotoren, sowie Systeme,
die durch chemische Substanzen wie Kupfer (Mett et al., 1993, Proc. Natl.
Acad. Sci., 90, 4567-4571), Steroidhormone (Aoyama & Chua, 1997, Plant
J., 11, 605-612; McNellis et al., 1998, Plant J., 14, 247-257;
US06063985 ), Ethanol (Caddick
et al., 1997, Nature Biotech., 16, 177-180; WO09321334) oder Tetracyclin
(Weinmann et al., 1994, Plant J., 5, 559-569) induziert werden können. Eine
der letzten Entwicklungen auf dem Gebiet der chemisch induzierbaren
Systeme für
Pflanzen ist ein chimärer
Promotor, der mit dem Glucocorticoid Dexamethason eingeschaltet
und mit Tetracyclin ausgeschaltet werden kann (Bohner et al., 1999,
Plant J., 19, 87-95). Eine Übersicht über das
Gebiet der chemisch induzierbaren Systeme bietet ein Artikel von
Zuo & Chua (2000,
Current Opin. Biotechnol., 11, 146-151). Andere Beispiele für induzierbare
Promotoren sind Promotoren, welche die Expression von PR-Genen (pathogenesis-related
genes) in Pflanzen kontrollieren. Diese Promotoren können durch
Behandlung der Pflanzen mit Salicylsäure induziert werden, eine
wichtige Komponente pflanzlicher Signalwege bei der Pathogenabwehr, oder
mit anderen chemischen Verbindungen wie Benzo-1,2,3-thiadiazol oder
Isonikotinsäure,
die PR-Genexpression
induzieren (
US05942662 ).
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Es gibt Berichte über Systeme zur kontrollierten
Transgen-Expression unter Verwendung viraler RNA/RNA-Polymerase,
die über
virale Infektion bereitgestellt wird (z.B.
US 6 093 554 ;
US 5 919 705 ). In diesen Systemen
enthält
eine rekombinante, pflanzliche DNA-Sequenz Nucleotid-Sequenzen eines viralen
Genoms, die von der viralen RNA/RNA-Polymerase erkannt werden. Die
Effizienz dieser Systeme ist begrenzt wegen der geringen Fähigkeit
viraler Polymerasen, Funktionen in trans bereitzustellen, und wegen
ihrer Unfähigkeit,
andere Prozesse als RNA-Amplifizierung
zu kontrollieren. Ein anderer Weg besteht darin, einen gewünschten
Prozess in einer transgenen Pflanze mit einem genetisch veränderten
Virus auszulösen,
der eine heterologe Nukleinsäure
bereitstellt, die für
einen Schalter für
einen biochemischen Prozess in einer genetisch veränderten Pflanze
kodiert (WO 02068664).
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Die oben beschriebenen Systeme sind
von einigem Interesse als Möglichkeiten,
gewünschte Transgen-Expressionsmuster
zu erhalten, jedoch erlauben sie keine strikte Kontrolle über die
Expression, da die induzierenden Agenzien (z.B. Kupfer) oder deren
Analoge (Brassinosteroide im Fall von Steroid-kontrollierten Systemen)
in Pflanzengeweben in Mengen vorliegen können, die ausreichen, eine Rest-Expression
zu verursachen. Ferner ist die Verwendung von Antibiotika und Steroiden
als chemische Induktoren unerwünscht
oder ökonomisch
für Anwendungen
im großen
Maßstab
nicht durchführbar.
Wenn Promotoren von PR-Genen oder virale RNA/RNA-Polymerasen zur
Kontrolle von Transgenen verwendet werden, sind die Erfordernisse
einer strikten Kontrolle über
die Transgen-Expression ebenso nicht erfüllt, da eine zufällige Pathogen-Infektion
oder Stress Expression herbeiführen
kann. Gewebs- oder organspezifische Promotoren sind auf enge Anwendungsfelder
beschränkt,
da sie die Expression auf ein bestimmtes Organ oder eine bestimmte
Entwicklungsstufe der Pflanze beschränken, es jedoch nicht erlauben,
das Transgen nach Belieben einzuschalten. Rekombinante virale Schalter, wie
in WO02068664 beschrieben, berücksichtigen
all diese Probleme, garantieren jedoch keine strengen Erfordernisse
bezüglich
Umweltsicherheit, da die heterologe Nukleinsäure in dem viralen Vektor rekombinieren
kann.
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Es gibt viel Literatur, inklusive
Patentanmeldungen, die die Gestaltung virusresistenter Pflanzen mittels
Expression vitaler Gene oder mutierter Formen viraler RNA beschreiben
(z.B.
US 5 792 926 ;
US 6 040 496 ). Es besteht
jedoch ein Umweltrisiko bei der Verwendung solcher Pflanzen wegen
der Möglichkeit,
durch Rekombination zwischen dem infizierenden Virus und transgener
viraler RNA oder DNA neue Viren zu bilden (Adair & Kearney, 2000,
Arch. Virol, 145, 1867-1883).
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Hooykaas und Kollegen (2000, Science, 290,
979-982; WO01/89283) beschreiben die Verwendung einer Translationsfusion
der Cre-Rekombinase mit Fragmenten des vir Gens zur Agrobakterium-vermittelten
Translokation in Pflanzenzellen. Cre-vermittelte in planta Rekombination
führte
zu einem selektierbaren Phänotyp.
Die Translokation der Cre Rekombinase stellt die erste Verwendung
eines translozierten Proteins als Schalter dar, um einen gewünschten
Prozess in Pflanzenzellen einzuschalten. Obwohl jedoch die Translokation
nicht notwendigerweise von DNA-Transfer begleitet wird, ermöglicht dieses
Verfahren kein hohe Sicherheit, da der genetisch veränderte phytopathogene
Mikroorganismus (Agrobakterium) eine vollständige kodierende Sequenz des
Porteinschalters Cre-Rekombinase enthält. Ferner kann der gewünschte Prozess
nur in Zellen eingeschaltet werden, die das Schaltprotein erhalten
haben. Wenn große
Zellansammlungen zu behandeln sind, wird das Verhältnis von
Zellen, die das Schaltprotein erhalten, zur Gesamtzahl der Zellen sehr
klein. Die Methode von Hooykaas kann daher nicht auf vollständige Pflanzen
angewandt werden. Ihre Anwendbarkeit ist auf die Gewebe- oder Zellkultur
beschränkt.
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Es ist daher eine Aufgabe dieser
Erfindung, ein Verfahren zum Einschalten eines gewünschten zellulären Prozess
in vollständigen
Pflanzen bereitzustellen. Es ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung,
ein für
die Umwelt sicheres Verfahren zum Einschalten eines gewünschten
zellulären
Prozesses in Pflanzen bereitzustellen, wobei der zelluläre Prozess selektiv
zu einem vorbestimmten Zeitpunkt eingeschaltet werden kann. Es ist
eine andere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Produktion
eines Produktes in einer transgenen Pflanze bereitzustellen, wobei
die Produktion des Produktes selektiv eingeschaltet werden kann,
wenn die Pflanze eine gewünschte
Wachstumsstufe erreicht hat, wobei das Verfahren insofern umweltsicher
ist, als dass genetisches Material, das für den zellulären Prozess
nötig ist,
und genetisches Material, das für
die Kontrollfunktion kodiert, sich nicht zusammen in der Umwelt ausbreiten
können.
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ALLGEMEINE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die obigen Aufgaben werden gelöst durch ein
Verfahren zur Kontrolle einer genetisch veränderten Pflanze, wobei das
Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- (a)
Bereitstellen einer genetisch veränderten Pflanze, wobei Zellen
der genetisch veränderten Pflanze
eine heterologe Nukleinsäure
enthalten und wobei die genetisch veränderte Pflanze inaktiv bezüglich eines
gewünschten
zellulären
Prozesses ist,
- (b) Einschalten des gewünschten
zellulären
Prozesses durch direktes Einführen
eines Polypeptids aus einer zellfreien Zusammensetzung in Zellen,
die die heterologe Nukleinsäure
enthalten,
wobei das Polypeptid und die heterologe Nukleinsäure so aufeinander
abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozesses
einschalten kann.
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Die Erfindung stellt ferner genetisch
veränderte
Pflanzen oder Teile derselben zur Verfügung, die nach dem Verfahren
der Erfindung erhältlich
sind oder erhalten werden. Bevorzugte Teile der Pflanzen sind Blätter und
Samen. Samen sind die bevorzugtesten Teile der Pflanzen.
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Die Erfindung stellt ferner eine
genetisch veränderten
Pflanze zur Verfügung,
die eine heterologe Nukleinsäure
in ihren Zellen enthält,
wobei die Pflanze bezüglich
eines gewünschten
zellulären
Prozesses inaktiv ist, wobei die heterologe Nukleinsäure so vorgesehen
ist, dass der gewünschte
zelluläre
Prozess durch direktes Einführen
eines Polypeptids in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, eingeschaltet
werden kann, wobei das Polypeptid und die heterologe Nukleinsäure so aufeinander
abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess
einschalten kann.
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Die Erfindung stellt außerdem ein
System bereit zur Kontrolle eines gewünschten zellulären Prozesses
in einer genetisch veränderten
Pflanze, umfassend eine Pflanze wie oben definiert und ein Polypeptid
zum Einschalten des gewünschten
zellulären
Prozesses in der genetisch veränderten
Pflanze, wobei die Pflanze und das Polypeptid so aufeinander abgestimmt
sind, dass das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess
einschalten kann.
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Die vorliegende Erfindung erlaubt
das Einschalten eines gewünschten
zellulären
Prozesses in einer Pflanze durch direktes Einführen eines Polypeptids in Zellen,
die die heterologe Nukleinsäure enthalten.
Direktes Einführen
bedeutet, dass das Einführen
nicht die Anwendung von Nukleinsäuren auf
die Pflanze umfasst, die für
das Polypeptid oder für
einen funktionellen Teil des Polypeptids kodieren. Ein Teil des
Polypeptids ist funktionell, wenn er den gewünschten zellulären Prozess
der Erfindung einschalten kann. Durch die direkte Applikation des
Polypeptids auf die Pflanze wird durch diese Erfindung ein sehr
hohes Maß an
biologischer Sicherheit erreicht, da die Pflanze nicht mit genetischem
Material in Kontakt kommt, das den gewünschten zellulären Prozess
einschalten könnte.
Stattdessen wird mindestens eine für den gewünschten zellulären Prozess
nötige
Komponente der Pflanze als Polypeptid (ohne dafür kodierendes genetisches Material)
zugeführt.
Ein Hauptvorteil der Erfindung liegt darin, dass genetisches Material,
das für
den gewünschten
zellulären
Prozess nötig
ist, und genetisches Material, das für das Polypeptid kodiert, nicht
zusammen auf Nachkommen der Pflanze übertragen werden können oder
sich auf andere Arten zusammen in der Umwelt ausbreiten können.
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Das Verfahren von Hooykaas (2000,
Science, 290, 979 bis 982; WO0189283) erlaubt das Einschalten eines
gewünschten
zellulären
Prozesses in pflanzlichen Zellen, wobei ein Schaltprotein mit Hilfe
eines pathogenen Bakteriums eingeführt wird. Da dieses Verfahren
auf die Zellkultur (Labormaßstab) beschränkt ist,
bestehen keine Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit
wegen der Verwendung von Agrobakterien, die für das Schaltprotein kodieren.
Die vorliegene Erfindung stellt erstmals ein Verfahren zur Kontrolle
eines gewünschten
zellulären Prozesses
bereit, das in vollständigen
Pflanzen effizient funktioniert und das gleichzeitig umweltsicher
ist, auch wenn es im großen
Maßstab
wie im Gewächshaus
oder auf einem Feld im Freiland durchgeführt wird.
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In Schritt (a) des Verfahrens der
Erfindung wird eine genetisch veränderte Pflanze bereitgestellt. Höhere Pflanzen,
insbesondere höhere
Nutzpflanzen, sind bevorzugt. Die Pflanze ist insofern genetisch
modifiziert, als dass Zellen der Pflanze eine heterologe Nukleinsäure enthalten,
die beim Einschalten des gewünschten
zellulären
Prozesses beteiligt ist. In vielen Fällen wird die heterologe Nukleinsäure für ein zu
exprimierendes Protein kodieren. Die in Schritt (a) bereitgestellte
Pflanze kann eine transgene Pflanze sein, wobei die meisten oder
alle der Zellen der Pflanze die heterologe Nukleinsäure stabil
in das Genom der Zellen integriert enthalten. Die heterologe Nukleinsäure kann
stabil in das Kern-Genom integriert sein oder in das Genom von Organellen, wie
Mitochondrien oder, vorzugsweise, Plastiden. Die Integration der
heterologen Nukleinsäure
in das Plastidengenom ist vorteilhaft hinsichtlich der biologischen
Sicherheit. Der Verfahren der Erfindung wird vorzugsweise mit transgenen
Pflanzen durchgeführt. Alternativ
kann die Pflanze transient modifiziert sein und/oder die heterologe
Nukleinsäure
kann in einem Teil der Zellen, jedoch nicht in anderen Zellen vorhanden
sein. Eine heterologe Nukleinsäure
in einer transient modifizierten Pflanze kann stabil in das Genom des
Teils der Zelle integriert sein, oder sie kann episomal vorhanden
sein. Die Inkorporierung der heterologen Nukleinsäure in einen
Teil der Zellen der Pflanze kann durch transiente Transfektion z.B.
unter Verwendung der viralen Transfektion oder der Agrobakterium-vermittelten
Transformation erreicht werden. In jedem Fall ist die in Schritt
(a) bereitgestellte Pflanze inaktiv hinsichtlich des gewünschten
zellulären
Prozesses bevor Schritt (b) ausgeführt wurde.
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In Schritt (b) des Verfahrens dieser
Erfindung wird das Polypeptid aus einer zellfreien Zusammensetzung
in mindestens einige der Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten,
eingeführt.
Wenn der Organismus transgen ist, kann das Polypeptid prinzipiell
auf irgendeinen Teil oder irgendwelche Zellen der Pflanze appliziert
werden. Wenn nur ein Teil der Zellen der Pflanze die heterologe
Nukleinsäure enthält, wird
das Polypeptid der Pflanze so appliziert, dass das Polypeptid Zellen
erreichen kann, die die heterologe Nukleinsäure enthalten, um den gewünschten
zellulären
Prozess einzuschalten. Wie oben gesagt, wird das Polypeptid direkt
in Zellen der Pflanze aus einer zellfreien Zusammensetzung eingeführt. Das
direkte Einführen
kann ausgeführt
werden durch (i) Partikelbombardierung, (ii) Applikation des Polypeptids
auf mindestens einen Teil der Pflanze oder (iii) durch Injektion
einer das Polypeptid enthaltenden Lösung in Gewebe der Pflanze.
Bei den Methoden (ii) und (iii) ist das Polypeptid üblicherweise
in einer Flüssigkeit
enthalten, vorzugsweise einer wässrigen
zellfreien Zusammensetzung (oder Lösung), die auf Teile der Pflanze
appliziert wird. Eine solche Zusammensetzung kann appliziert werden z.B.
durch Besprühen
der Pflanze mit der Zusammensetzung, die das Polypeptid enthält. Ferner
kann die Zusammensetzung gemäß (iii)
injiziert werden.
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Für
Methoden (ii) und (iii) enthält
das Polypeptid vorzugsweise eine Membran-Translokations-Sequenz (MTS), die
den Eintritt des Polypeptids in Zellen der Pflanze ermöglicht.
Die Membran-Translokations-Sequenz
kann kovalent oder nichtkovalent mit dem Polypeptid verbunden sein. Vorzugsweise
ist sie kovalent mit dem Polypeptid verbunden. Die Membran-Translokations-Sequenz kann ein
Peptid sein, das das Polypeptid mit der Fähigkeit ausstattet, die Plasmamembran
von Zellen der Pflanze zu durchtreten. Viele solcher Membran-Translokations-Sequenzen sind im
Stand der Technik bekannt. Häufig
enthalten sie mehrere basische Aminosäuren, insbesondere Arginine.
Die Größe der Membran-Translokations-Sequenzen
kann in einem weiten Bereich variieren. Typischerweise beträgt sie jedoch
3 bis 100 Aminosäuren,
vorzugsweise 5 bis 60 Aminosäuren.
Polypeptid kann über
Standard-Expressions-Techniken, z.B. in E. coli, produziert werden.
Vorzugsweise wird das Polypeptid nach seiner Expression gereinigt,
vorzugsweise von Nucleinsäuren,
die für
das Polypeptid kodieren. Nukleinsäuren können entfernt oder zerstört werden
durch Hydrolyse, vorzugsweise katalysiert durch ein Enzym wie eine
DNAse oder eine Ribonucleotidase (RNAse). Daneben oder zusätzlich können chromatographische
Techniken verwendet werden, um Nukleinsäuren von dem Polypeptid zu
entfernen. Das Polypeptid kann auf die Pflanze z.B. durch Besprühen der Pflanze
mit einer flüssigen
Zusammensetzung, vorzugsweise einer wässerigen Lösung, die das Polypeptid enthält, appliziert
werden. Vorzugsweise werden Maßnahmen
getroffen, um den Eintritt des Polypeptids in Zellen der Pflanze
zu erleichtern, vorzugsweise Maßnahmen,
die das Durchtreten der pflanzlichen Zellwand und/oder der äußeren Pflanzenschicht
erlauben. Ein Beispiel solcher Maßnahmen ist das leichte Verwunden
von Teilen der Pflanzenoberfläche,
z.B. durch mechanisches Kratzen. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung
von Cellulose-abbauenden Enzymen, um die Pflanzenzellwand zu schwächen oder
zu perforieren.
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Das Einschalten des gewünschten
zellulären Prozesses
(Schritt (b)) setzt das direkte Einführen des Polypeptids aus einer
zellfreien Zusammensetzung in Zellen, die die heterologe Nukleinsäure enthalten,
voraus. Das Polypeptid und die heterologe Nukleinsäure sind
so aufeinander abgestimmt sind, dass das Polypeptid den gewünschten
zellulären Prozess
einschalten kann. Daher wird das Polypeptid hier auch als „Proteinschalter" bezeichnet.
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Bezüglich des gewünschten
zellulären
Prozesses bestehen keine Beschränkungen
und die Erfindung ist von sehr breiter Anwendbarkeit. Der gewünschte zelluläre Prozess
kann die Bildung einer DNA, einer RNA oder eines Proteins von der
heterologen Nukleinsäure
sein oder umfassen. Es gibt viele Möglichkeiten, die Bildung der
DNA, der RNA oder des Proteins zu erreichen. Das Polypeptid kann
z.B. ein Segment enthalten, das eine Bindeaktivität zu der heterologen
Nukleinsäure,
z.B. zu einem Promotor, hat. Das Segment kann dann als Transkriptionsfaktor der
heterologen Nukleinsäure
wirken, was die Bildung der RNA oder des Proteins auslösen kann.
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Vorzugsweise enthält das Polypeptid ein Segment,
das eine enzymatische Aktivität
aufweist, die die Bildung der DNA, der RNA oder des Proteins auslösen kann.
Beispiele solcher Aktivitäten
sind DNA- oder RNA-modifizierende Aktivitäten wie die Aktivität einer
ortsspezifischen Rekombinase, Flippase, Resolvase, Integrase, Polymerase
oder einer Transposase. Die enzymatische Aktivität kann die heterologe Nukleinsäure modifizieren,
was zur Expression des Proteins führt, z.B. durch Rekombination.
In einer Ausführungsform,
bei der das Polypeptid Polymeraseaktivität hat, kann das Segment eine DNA-abhängige RNA-Polymerase
sein, die auf einen Promotor der heterologen Nukleinsäure wirkt.
Der Promotor wird von nativen Polymerasen des multizellulären Organismus
nicht erkannt. Beispiele für
solche Promotor-Polymerase-Systeme
sind bakterielle, virale oder Bakteriophagen-Promotor-Polymerase-Systeme, wie das
T7-Promotor-T7-Polymerase-System.
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Ferner kann das Einschalten des gewünschten
zellulären
Prozesses die Bildung der DNA, der RNA oder des Proteins von der
heterologen Nukleinsäure
umfassen oder die heterologe Nukleinsäure verwenden. Als Beispiel
kann die Bildung eines exprimierbaren Operons von der heterologen
Nukleinsäure
oder von einem RNA-Expressionsprodukt der heterologen Nukleinsäure genannt
werden.
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Die DNA, die RNA oder das Protein
kann befähigt
sein, sich in andere Zellen der Pflanze auszubreiten (z.B ein viraler
DNA- oder RNA-Vektor). Ein wichtiges Beispiel eines solchen zellulären Prozessess
ist die Bildung eines exprimierbaren Amplikons von der heterologen
Nukleinsäure
oder von einem RNA-Expressionsprodukt derselben. Das Amplikon kann
sich in Zellen seiner Aktivierung oder Bildung verstärken (Amplifikationsvektor).
Das Amplikon kann ein exprimierbares Amplikon sein, das ein in dem
gewünschten
zellulären
Prozess zu exprimierendes gewünschtes
Gen enthält.
Ferner kann das Amplikon zur Wanderung von Zelle zu Zelle (cell-to-cell-movement)
oder zur systemischen Wanderung (systemic movement) in der Pflanze
befähigt sein.
Ein Amplikon kann auf einem pflanzlichen DNA- oder RNA-Virus beruhen.
Pflanzenviren wie Tobamoviren sind hierfür bevorzugt. Die Amplifiationseigenschaften
des zur Ausbreitung befähigten
Proteins (siehe unten) und des Amplikons können sich synergistisch verhalten,
was einen extrem starken gewünschten
zellulären
Prozess erlaubt, der sich über beträchtliche
Teile der Pflanze ausbreiten kann (z.B. zu einer extrem starken
Expression eines gewünschten
Proteins von dem Amplikon führen).
Das Engineering von Amplikons auf der Grundlage von Tobamoviren
is bekannt (siehe z.B. Dawson et al., 1989, Virology, 172, 285-293; Yusibov
et al., 1999, Curr.Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94; for review, see "Genetic Engineering
With Plant Viruses",
1992, eds. Wilson and Davies, CRC Press, Inc.).
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In einer Hauptausführungsform
der Erfindung umfasst das Einschalten des zellulären Prozesses die Bildung eines
Proteins von der heterologen Nukleinsäure, wobei das Protein sich
in der Pflanze ausbreiten kann, d.h. es kann eine Zelle, in der
es gebildet wurde, verlassen und in andere Zellen der Pflanze eintreten
(ein solches Protein wird hier auch „Proteinschalter" genannt). In anderen
Zellen kann das Protein einen gewünschten zellulären Prozess einschalten,
insbesondere durch Kontrolle einer zusätzlichen heterologen Nukleinsäure (siehe
unten). Das Verlassen einer Zelle und das Eintreten in andere Zellen
umfast vorzugsweise die Wanderung von Zelle zu Zelle und die systemische
Wanderung in der Pflanze oder einem Teil derselben. Das Protein
(Proteinschalter) enthält
vorzugsweise einen Protein-Teil, der das Verlassen einer Zelle und
Eintritt in andere Zellen ermöglicht.
Der Protein-Teil kann eine Domäne
eines viralen Movement-Proteins oder eines viralen Hüll-Proteins
sein. Weiter kann der Protein-Teil ein pflanzlicher oder tierischer
Transkriptionsfaktor oder eine Domäne eines pflanzlichen oder
tierischen Transkriptionsfaktors sein, der/die zur Wanderung von
Zelle zu Zelle oder zur systemischen Wanderung befähigt ist.
Weiter kann der Protein-Teil ein pflanzlicher oder tierischer peptidischer
intrazellulärer
Messenger (Botenstoff) oder eine Domäne eines pflanzlichen oder
tierischen peptidischen intrazellulären Messengers sein. Darüber hinaus
kann der Protein-Teil ein künstliches
Peptid sein, das die Fähigkeit zur
Wanderung von Zelle zu Zelle oder zur systemischen Wanderung ermöglicht.
Vorzugsweise ist oder umfasst der Protein-Teil ein virales Movement-Protein
oder ein virales Hüll-Protein
oder eine Domäne
eines viralen Movement- oder Hüll-Proteins.
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Wenn das zur Ausbreitung befähigte Protein der
Erfindung in andere Zellen der Pflanze, die die heterologe Nukleinsäure enthalten,
eintritt, kann es vorzugsweise die Expression zusätzlicher
Kopien des Proteins von der heterologen Nukleinsäure einschalten (induzieren).
So erlaubt das Verfahren der Erfindung durch Verwenden dieses Proteins,
das extern mit dem Polypeptid applizierte Schaltsignal in der Pflanze
zu verstärken
und fortzupflanzen. Insbesondere wenn die Anzahl der Zellen, die
anfänglich von
dem Polypeptid erreicht wurden, klein ist, wird das Schaltsignal
effizient zu weiterein Zellen getragen. Es gibt viele Möglichkeiten,
wie das Protein seine eigene Expression von der heterologen Nukleinsäure kontrollieren
kann. Diese Möglichkeiten
entsprechen denjenigen, die für
das Polypeptid in Schritt (b), oben, angewandt werden können.
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Neben der Fähigkeit, seine eigene Expression
zu kontrollieren, weist das Protein der Erfindung die Fähigkeit
auf, einen gewünschten
zellulären
Prozess einzuschalten. Obwohl das Einschalten eines gewünschten
zellulären
Prozesses bevorzugt ist, ist es offensichtlich, dass das Endergebnis
eines eingeschaltenen zellulären
Prozesses auch ein Ausschalten oder ein Unterdrücken eines Prozesses in Zellen der
Pflanze sein kann. Um zum Einschalten des gewünschten zellulären Prozesses
befähigt
zu sein, kann das Protein ein Segment enthalten, das den zellulären Prozess
kontrollieren kann. Das Segment kann eine Binde-Aktivität oder eine
enzymatische Aktivität
aufweisen, die eine Nukleinsäure
(insbesonere die zusätzliche
heterologe Nucleinsäure),
die für
den gewünschten
zellulären
Prozess nötig
ist, kontrolliert. In dem Verfahren der Erfindung kann das Einschalten des
zellulären
Prozesses analog zu dem Kontrollieren der Expression des Proteins
von der heterologen Nukleinsäure
erreicht werden. Zu diesem Zweck kann das Protein ein Segment zur
Kontrolle des zellulären
Prozesses und ein Segment zum Bewirken der Expression des Proteins
aufweisen, wobei die Kontrollmechanismen der beiden Segmente verschieden
sein können.
Vorzugsweise sind die zwei Kontrollmechanismen ähnlich oder identisch, wobei ein
Segment des Proteins zum Einschalten des zellulären Prozesses und zur Kontrolle
der Expression des Proteins ausreichend sein kann. In einer bevorzugten
Ausführungsform
enthält
das Protein also zumindest ein Segment und einen Teil, der dem Protein die
Fähigkeit
verleiht, eine Zelle zu verlassen und in andere Zellen der Pflanze
einzutreten.
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Der gewünschte zelluläre Prozess
kann wie oben gesagt die Gegenwart einer zusätzlichen heterologen Nukleinsäure in Zellen
der Pflanze benötigen,
wo der zelluläre
Prozess kontrolliert werden soll. Die zusätzliche heterologe Nukleinsäure kann
in allen Zellen oder in einem Teil der Zellen der Pflanze vorhanden
sein. Die zusätzliche
heterologe Nukleinsäure
kann stabil in die nucleären
oder die Genome von Organellen der Zellen des Organismus inkorporiert
sein. Was bezüglich
der heterologen Nukleinsäure
der Erfindung gesagt wurde, trifft allgemein auch auf die zusätzliche
Nukleinsäure
zu. Vorzugsweise ist die Pflanze bezüglich der zusätzlichen
heterologen Nukleinsäure
und bezüglich
der heterologen Nukleinsäure
transgen.
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Die zusätzliche heterologe Nukleinsäure wird
z.B. verwendet, wenn die heterologe Nukleinsäure zur Bildung des zur Ausbreitung
befähigten Proteins
verwendet wird. Das sich ausbreitende Protein kann dann einen in
der zusätzlichen
heterologen Nukleinsäure
kodierten gewünschten
zellulären
Prozess einschalten. 8 illustriert
diese Ausführungsform.
Der gewünschte
zelluläre
Prozess, der von der zusätzlichen
heterologen Nukleinsäure
eingeschaltet werden kann, entspricht denjenigen, die im Zusammenhang
mit der heterologen Nukleinsäure
genannt wurden.
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In einer weiteren wichtigen Ausführungsform der
Erfindung generieren das von der heterologen Nukleinsäure exprimierte
Protein und das direkt eingeführte
Polypeptid zusammen eine vorbestimmte Funktion, was zum Einschalten
des gewünschten zellulären Prozesses
nur dann führt,
wenn das Protein und das Polypeptid gemeinsam vorliegen (3). Vorzugsweise generieren
das Protein und das Polypeptid gemeinsam die vorbestimmte Funktion
durch Inteinvermitteltes Trans-Spleißen oder durch Intein-vermittelte
Affinitätsinteraktion.
Die vorbestimmte Funktion kann dann den gewünschten zellulären Prozesses
der Erfindung einschalten. Die vorbestimmte Funktion kann z.B. eine
Bindeaktivität
oder eine enzymatische Aktivität
sein, die auf die zusätzliche
heterologe Nukleinsäure
auf ähnliche
Art wirken kann, wie oben für
das Protein beschrieben. Ein wichtiger Vorteil dieser Ausführungsform
ist, dass die in Schritt (a) bereitgestellte Pflanze, die mit der
heterologne Nukleinsäure
genetisch modifiziert ist, nicht alle zum Einschalten des gewünschten
zellulären Prozesses
nötige
Komponenten enthält.
Daher kann die Pflanze keine genetische Information für einen funktionellen
gewünschten
zellulären
Prozess auf Nachkommen oder auf andere Organismen weitergeben.
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Der gewünschte zelluläre Prozess,
der wie oben beschrieben eingeschaltet wurde, muss jedoch nicht
die gesamte Pflanze betreffen. Stattdessen kann der gewünschte zelluläre Prozess
auf einen Teil der Pflanze beschränkt sein. Vorzugsweise betrifft der
gewünschte
zelluläre
Prozess jedoch wesentliche Teile der Pflanze. Der Teil Pflanze,
wo der zelluläre
Prozess eingeschaltet wird, hängt
u.a. von den Orten der Anwendung des Polypeptids ab. Üblicherweise
wird der gewünschte
zelluläre
Prozess am stärksten
in der Nachbarschaft des Applikationsortes des Polypeptids sein
und mit zunehmendem Abstand von diesem Ort abnehmen. Diese Abnahme
kann üblicherweise
richtungsabhängig
sein und von der Struktur des Gewebes der Pflanze, wo das Polypeptid
appliziert wird, abhängen.
Wenn z.B. ein gewünschter
zellulärer
Prozess in einer Pflanze eingeschaltet werden soll (z.B. es soll
die Expression eines gewünschten
Gens eingeschaltet werden), und das Polypeptid wird auf einen Teil
eines Blattes der Pflanze appliziert, tritt der gewünschte zelluläre Prozess typischerweise
innerhalb des Teils des Blattes und in der Umgebung des Teils des
Blattes auf. Vorzugsweise tritt der gewünschte zelluläre Prozess
im größten Teil
des Blattes auf. Noch bevorzugter tritt der gewünschte zelluläre Prozess
auch im Spross und in anderen Blättern
auf. Am bevorzugtesten tritt der gewünschte zelluläre Prozess
in einem Großteil
der Pflanze auf. Das Ausmaß des
gewünschten
zellulären Prozesses
(z.B. Expression eines gewünschten Gens)
kann innerhalb der Pflanze variieren, z.B. mit dem Zell-Typ oder
dem Gewebe-Typ. Natürlich
ist die Applizierung des Polypeptids normalerweise nicht auf einen
einzigen Punkt auf der Oberfläche
einer Pflanze beschränkt.
Vorzugsweise wird das Polypeptid auf mehrere Teile der Pflanze angewandt
(siehe unten).
-
Der zelluläre Prozess gemäß dieser
Erfindung kann eine gesamte gewünschte
biochemische Kaskade, wie einen mehrstufigen Biosynthese-Weg in
Zellen der Pflanze auslösen.
Der gewünschte
zelluläre
Prozess oder die biochemische Kaskade ist in der Pflanze nicht wirksam
vor der Anwendung des Polypeptids. Der zelluläre Prozess dieser Erfindung ermöglicht eine
Kontrolle über
einen gewünschten zellulären Prozess
oder eine gewünschte
biochemische Kaskade mit einer bisher unerreichbaren technischen
Präzision
und Umweltsicherheit. So sind neue Anwendungen in der Biotechnologie
im allgemeinen, insbesondere in der Pflanzen-Biotechnologie, verfügbar zur Lösung von Problemen, die nach herkömmlichen
Verfahren nicht gelöst
werden können,
darunter die basale Transgen-Expressionsaktivität in einer Pflanze, insbesondere
wenn toxische Substanzen oder biologisch abbaubare Polymere hergestellt
werden. Darüber
hinaus erlaubt die präzise
Kontrolle gemäß dieser
Erfindung eine transgene Pflanze zu einer gewünschten Wachstumsstufe wachsen
zu lassen, bei der die Pflanze z.B. zur Durchführung des gewünschten
biochemischen Prozesses oder der gewünschten Kaskade geeignet ist, ohne
die Pflanze mit einer basalen Expressionsaktivität zu belasten, die das Wachstum
der Pflanze beeinträchtigt.
Wenn die Pflanze zur effizienten Durchführung des gewünschten
zellulären
Prozesses oder der Kaskade geeignet ist, kann der gewünschte Prozess
oder die Kaskade eingeschaltet und mit hoher Effizienz durchgeführt werden.
Dementsprechend erlaubt das Verfahren dieser Erfindung, die Wachstumsphase
und die Produktionsphase eines multizellulären Organismus, insbesondere
einer transgenen Pflanze, voneinander zu entkoppeln. Ferner ist
es möglich,
ein Mehrkomponentensystem für
mehrere gewünschte
zelluläre
Prozesse oder biochemische Kaskaden zu entwerfen, wobei einer oder
mehrere gewünschte
Prozesse oder Kaskaden selektiv eingeschaltet werden können.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
FIGUREN
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1 ist
eine schematische Darstellung eines Verfahrens dieser Erfindung.
-
2 ist
eine schematische Darstellung eines Verfahrens dieser Erfindung,
worin das Polypeptide ein aktives (funktionelles) Protein (AB) ist,
C steht für
eine heterologe DNA und ihre Expressionsprodukte (RNA oder Protein).
RNA wird durch gebundene Ribosomen angedeutet. In der Zelle einer Pflanze
kann das aktive Protein (AB) mit (1) der heterologen Nukleinsäure, (2)
mit einem RNA Expressionsprodukt oder (3) mit einem Protein-Expressionsprodukt
der heterologen Nukleinsäure
interagieren, um einen gewünschten
zellulären
Prozess einzuschalten.
-
3 ist
eine schematische Darstellung eines Verfahrens dieser Erfindung,
worin das Polypeptide ein nichtfunktionelles Protein (AB) ist, das
nach direkter Einführung
in die Pflanzenzelle zu einer aktiven Form A'B' umgewandelt
wird unter dem Einfluss eines Faktors, der von einer heterologen
Nukleinsäure
kodiert wird. D deutet eine zusätzliche
heterologe Nukleinsäure
(oder RNA- oder Proteinexpressionsprodukt derselben) an, auf die
das Protein A'B' abzielt, wobei ein
gewünschter
zellulärer
Prozess eingeschaltet wird. Die Umwandlung zu der aktiven Form A'B' kann z.B. durch eine enzymatische Aktivität eines
Expressionsproduktes von C durch Intein-vermitteltes Trans-Spleißen stattfinden.
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4 ist
ein Schema, das Ausführungsformen
zur Generierung eines aktiven Proteinschalters aus inaktiven Proteinfragmenten
in einer Pflanzenzelle zeigt. A: Generierung eines aktiven Proteinschalters
durch Intein-vermitteltes Trans-Spleißen von Proteinfragmenten.
B: Generierung eines aktiven Proteinschalters durch Affinitätsbinden
von Proteinfragmenten.
-
5 ist
ein Schema, das die Assemblierung eines funktionellen Proteins (AB)
aus nichtfuntionellen Proteinfragmenten A und B durch Intein-vermitteltes
Trans-Spleißen
(5A) oder durch Affinitätsinteraktion
(5B) zeigt. Fragment
A ist das Polypeptid der Erfindung, das in die Zelle importiert wird.
Fragment B wird intern exprimiert von einer heterologen Nukleinsäure.
-
6 ist
ein allgemeines Schema, das das Einschalten eines gewünschten
zellulären
Prozesses über
einen Proteinschalter zeigt, der zum intrazellulären Wandern (trafficking) und
zum Verursachen seiner eigenen Expression in anderen Zellen befähigt ist.
PS steht für Proteinschalter,
TP steht für
Trafficking-Protein, das zum intrazellulären Trafficking (d.h. zum Verlassen
einer Zelle und zum Eindringen in andere Zellen) befähigt ist,
PS:TP steht für
ein PS-TP-Fusionsprotein,
hNA steht für
eine zusätzliche
heterologe Nucleinsäure.
(A)
zeigt eine heterologe Nucleinsäure,
die für
PS:TP kodiert, und eine zusätzliche
heterologe Nukleinsäure
hNA. Es wird kein externes Polypeptid eingeführt, so dass der Proteinschalter
nicht exprimiert wird.
(B) ein externes (zellpermeables) Polypeptid,
das die Expression des Proteinschalters PS:TP veranlasst, wird eingeführt. Der
Proteinschalter kann einen zellulären Prozess kontrollieren,
indem er auf hNA in den Zellen seiner Expression wirkt. Ferner kann
der Proteinschalter die Zelle, die durch das extern eingeführte Polypeptid
betätigt
wurde, verlassen und in andere Zellen eintreten. In den anderen
Zellen kann der Proteinschalter seine eigene Expression induzieren
und außerdem
einen zellulären
Prozess durch Einwirkung auf hNA kontrollieren.
(C) zeigt
eine heterologe Nucleinsäure,
die für
zwei Proteinschalter kodiert: PS1 und PS2. Die Expression von PS1
wird durch ein extern appliziertes Signal (das Polypeptid der Erfindung)
verursacht, was zu PS1:TP führt.
Wie oben kann PS1:TP sich auf andere Zellen ausbreiten und die Expression
von PS2 aktivieren. PS2 kann wiederum einen zellulären Prozess kontrollieren,
indem er auf hNA wirkt.
-
7 zeigt
in (A) das Konstrukt pICHGFPinv, das einen nicht-funktionellen TMV-basierten Provektor
enthält,
und in (B) ein funktionelles Derivat dieses Konstrukts, das bei
der Integrasevermittelten Rekombination entsteht. Die Pfeile unten
zeigen RNAs und subgenomische (sg) RNAs inklusive ihrer Orientierung
an, die von dem in (B) gezeigten Konstrukt gebildet werden können. sgp
steht für
subgenomischer Promotor.
-
8 zeigt
schematisch ein Verfahren gemäß der Erfindung,
bei dem ein zellpermeables Polypeptid (MTS:Rekombinase) Rekombinationsereignisse
in erreichten Zellen auslöst,
was zur Synthese eines Proteinschalters von einer heterologen Nukleinsäure führt, der
zum intrazellulären
Trafficking befähigt
ist (Rekombinase:TP). Der Proteinschalter kann ferner Rekombinationsereignisse
auslösen,
die zur Umordnung eines auf einem Pflanzenvirus beruhenden Provektors
(eine zusätzliche
heterologe Nukleinsäure
gemäß der Erfindung)
führt,
was zur Expression eines gewünschten
Gens (GOI) führt.
MTS:Membran-Translokations-Sequenz;
TP: Protein, das zum intrazellulären
Trafficking befähigt
ist; SM: Selektionsmarker; RS: Rekombinationsstelle, die von einer ortsspezifischen
DNA-Rekombinase/Integrase erkannt wird; ter1 und ter2: Transkriptions-Terminations-Regionen;
PROM: Promotor, der in Pflanzen aktiv ist; RdRp: virale RNA-abhängige RNA-Polymerase;
MP: Movement-Protein; 3'NTR:
3'-nicht-translatierte
Region eines pflanzlichen RNA-Virus. Pfeile zeigen die Orientierung
von kodierenden und regulatorischen Sequenzen an.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die Grundlage dieser Erfindung ist
die Verwendung eines Polypeptids, das zum Verlassen von Zellen und
zum Eintritt in andere Zellen einer Pflanze befähigt ist, was zum Einschalten
eines gewünschten zellulären Prozesses
ohne Zufuhr in Zellen von Nukleinsäuren führt, die für das Polypeptid oder einen funktionellen
Teil kodieren. Vorzugsweise umfasst das Einschalten eines gewünschten
zellulären
Prozesses die Bildung eines Proteins, das seine eigene Expression
veranlassen kann. Das allgemeine Prinzip und schematische Darstellungen
des Verfahrens gemäß der Erfindung
sind in den 1 bis 8 gezeigt.
-
Wahl des Kontrollproteins
für die
Schaltfunktion
-
Es gibt unzählige gewünschte zelluläre Prozesse,
die irreversibel durch das Kontrollprotein der Erfindung (Proteinschalter)
betätigt
werden können. Der
Proteinschalter (in 2 mit
AB bezeichnet) kann z.B. die Expression eines gewünschten
Transgens (in 2 mit
C bezeichnet) auf viele verschiedene Arten kontrollieren. Zum Beispiel
kann er DNA-Rekombination oder -Transkription, RNA-Prozessierung
oder -Translation, posttranslationale Protein-Modifikationen (2) usw. betätigen. Zusätzlich kann
der Proteinschalter von dem Polypeptid nach dessen Verabreichung
in die Pflanzenzelle aktiviert werden und dann als Schalter funktionieren (3). Natürlich hängt die Wahl des Proteinschalters
von der Gestaltung/Wahl des in der Pflanze zu kontrollierenden zellulären Prozesses
ab. Der zelluläre
Prozess kann durch Nucleinsäure-Umordnungen (rearrangement)
oder durch Modifikationen in Zellen, in denen das Protein vorliegt,
oder in Zellen, in die das Protein eingewandert ist, kontrolliert,
insbesondere eingeschaltet, werden. In einem solchen Fall kann der
Proteinschalter ein DNA- oder RNA-modifizierendes Enzym enthalten, wie
eine ortsspezifische Endonuclease, eine Replikase, eine Rekombinase, eine
Methylase, eine Integrase, eine Transposase, eine Polymerase usw.
-
Andere Ausführungsformen dieser Erfindung sind
u.a. das Auslösen
von Reaktionen wie DNA-Restriktion
und/oder DNA-Replikation. Ein Beispiel einer biochemischen Kaskade,
die durch Restriktion ausgelöst
werden kann, ist ein Zweikomponentensystem, bei dem eine einen Replikationsursprung (origin
of replication) enthaltende heterologe Nukleinsäure, die in das Kerngenom integriert
ist, spezifisch herausgeschnitten und in ein automsomal replizierendes
Plasmid umgewandelt wird durch ein selten schneidendes Restriktionsenzym,
das als Proteinschalter dient, was die Kaskade auslöst.
-
Es gibt viele Reaktionen an RNA-Molekülen, die
zum Auslösen
des zellulären
Prozesses der Erfindung verwendet werden können. Dazu gehören unter anderem
Reaktionen wie RNA-Replikation,
reverse Transkription, Editing, Silencing oder die Translation. Es
gibt viel Stand der Technik, der detailliert beschreibt, wie z.B.
eine Rekombinase, Integrase oder Transposase, einen gewünschten
Prozess durch DNA-Exzision, -Inversion oder -Insertion in Zellen, insbesondere
in Pflanzenzellen, auslösen
kann (Zuo, Mollen & Chua,
2001, Nat. Biotech.,19, 157-161; Hoff, Schnorr & Mundy, 2001, Plant Mol. Biol., 45, 41-49;
US 5 225 341 ; WO 9911807;
WO 9925855;
US 5 925 808 ;
US 6 110 736 ; WO 0140492;
WO 0136595). Ortsspezifische Rekombinasen/Integrasen aus Bakteriophagen
und Hefen werden zur Manipulation von DNA in vitro sowie in Pflanzen
und Tieren viel verwendet. Bevorzugte Rekombinasen-Rekombinationsstellen
zur Verwendung in dieser Erfindung sind die folgenden: Cre-Rekombinase-LoxP-Rekombinationsstellen,
FLP-Rekombinase-FRT-Rekombinationsstellen, R-Rekombinase-RS-Rekombinationsstellen,
die C31-Integrase aus Phagen, die attP/attB-Stellen erkennt usw. Transposons
werden viel zur Entschlüsselung
von Gen-Funktionen in Pflanzen verwendet. Bevorzugte Transposon-Systeme
zur Verwendung in dieser Erfindung unter anderem Ac/Ds, En/Spm,
Transposons der "mariner"-Familie usw.
-
Heterologe Transkriptionsfaktoren
und RNA-Polymerasen können
in einem Proteinschalter gemäß der Erfindung
ebenso verwendet werden. Zum Beispiel kann das Einschleusen der
T7-Polymerase in
Zellen einer Pflanze, die ein Transgen unter der Kontrolle des T7-Promotors
trägt,
die Expression eines Transgens induzieren.
-
Die Expression eines pflanzlichen
Transgens (z.B. der zusätzliche
heterologe Nukleinsäure
der Erfindung), das unter der Kontrolle eines Bakteriophagen-Promotors
(z.B. T3, T7, SP6, K11) ist, mit der entsprechenden DNA/RNA-Polymerase,
die in Zellen einer Pflanze eingeführt wird, kann ein wirkungsvoller Ansatz
für die
Entwicklung von Proteinschaltern gemäß dieser Erfindung sein. Ein
anderer nützlicher Ansatz
kann die Verwendung von heterologen oder chimären oder anderen künstlichen
Promotoren sein, die heterologe oder künstlich veränderte Transkriptionsfaktoren
für ihre
Aktivierung benötigen.
Heterologe Transkriptionsfaktoren können auch verwendet werden,
um die Expression eines gewünschten Transgens
unter der Kontrolle des durch den Transkriptionsfaktor erkennbaren
Promotors zu induzieren. Beispiele für solche Transkriptionsfaktoren
sind unter anderem der Metalloresponsive ACE1-Transkriptionsfaktor
aus Hefe, der spezifische Sequenzen im Hefe-MT(Metallothionein)-Promotor
erkennt (Mett et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 4567-4571),
verschiedene chimären
Transkriptionsfaktoren, die eine sequenz-spezifische DNA-Bindungsdomäne und eine
Aktivierungsdomäne
aufweisen, wie einen Transkriptionsfaktor, der eine Fusion aus einem Sechs-Zink-Finger-Protein
2C7 und einer Aktiverungsdomäne
des Herpes simplex-Virus VP16-Transkriptionsfaktors enthält (Ordiz,
Barbas & Beachy, 2002,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99, 13290-13295), ein Transkriptionsfaktor, der
einen 434-Repressor voller Länge
und die C-terminalen 80 Aminosäuren des
VP16-Transkriptionsaktivators
aufweist (Wilde et al., 1994, Plant Mol. Biol., 24, 381-388), ein
Transkriptionsfaktor, der in Steroid-induzierbaren Systemen verwendet
wird (Aoyama & Chua,
1997, Plant J., 11, 605-612; McNellis et al., 1998, Plant J., 14, 247-257;
US 06 063 985 ) oder ein
Tetracyclin-induzierbarem System (Weinmann et al., 1994, Plant J., 5,
559-569). In einigen Fällen
können
bereits bestehende Systeme zur Transgen-Expression verwendet werden.
Alternativ dazu können
heterologe Transkriptionsfaktoren so modifiziert werden, dass kein
aktivierender Ligand-Induktor nötig
ist, um den Transkriptionsfaktor in den aktivierten Zustand zu überführen. Chimäre Transkriptionsfaktoren
sind für
die Verwendung in dieser Erfindung von Vorteil, da sie hochgradig
sequenzspezifische DNA-Bindungsdomänen und hocheffiziente Aktivierungsdomänen vereinigen, was
einen maximalen Effekt nach dem Einschleusen eines solchen Faktors
in die Pflanzenzelle erlaubt.
-
Ein anderer Proteinschalter gemäß dieser Erfindung
kann auf einer posttranslationalen Modifizierung eines oder mehrerer
Expressionsprodukte einer zusätzlichen
heterologen Nukleinsäuren
beruhen, was zur Aktivierung des Expressionsproduktes führen kann.
Es gibt viele mögliche
Implementierungen solcher Proteinschalter, die z.B. durch Kontrolle der
Polypeptidfaltung, der Oligomerbildung, dem Entfernen von Zielsignalen,
der Überführung eines
Proenzyms in ein Enzym, durch Blockierung der enzymatischen Aktivität usw. funktionieren.
Zum Beispiel kann das Einschleusen einer ortsspezifischen Protease
in Zellen eines multizellulären
Organismus einen gewünschten
zellulären
Prozess auslösen,
wenn ein genetisch veränderter
Wirt spezifisch ein Proenzym spaltet, wobei es in ein aktiviertes
Enzym überführt wird,
wenn ein Produkt in ein spezielles zelluläres Kompartiment geleitet wird,
wegen der Fähigkeit
des Wirts, ein Zielmotif zu spalten oder zu modifizieren, oder wenn
ein Produkt infolge des Entfernens einer spezifischen Bindesequenz
mobilisiert wird. Die Spaltung eines translationalen Fusionsproteins
kann mit Hilfe einer Peptidsequenz erreicht werden, die von einer
viralen ortsspezifischen Protease erkannt wird, oder mittels eines
katalytischen Peptids (Dolja et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89, 10208-10212; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173;
US 5 162 601 ;
US 5 766 885 ;
US 5 491 076 ). Andere Beispiele für ortsspezifische
Proteasen für
diese Erfindung sind Enterokinasen aus Säugern, z.B. die leichte Kette
der menschlichen Enterokinase, die die Sequenz DDDK-1 erkennt (Kitamoto
et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 7588-7592) und spezifisch
Lys-Ile-Bindungen spaltet; virale Proteasen, wie Hc-Pro (Carrington JC & Herndon KL, 1992,
Virology, 187, 308-315), die die Proteolyse zwischen dem Gly-Gly-Dipeptid
katalysiert, jedoch 4 Aminosäuren für die Erkennung
der Spaltstelle benötigt;
ortsspezifische Proteasen des Semliki Forest Virus (Vasiljeva et
al., 2001, J. Biol.
-
Chem., 276, 30786-30793); und Proteasen, die
beim Prozessieren von Polyubiquitin beteiligt sind, Ubiquitin-Carboxy-terminale
Hydrolasen (Osava et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 283,
627-633).
-
Direktes Einführen des
Polypeptids (Proteinschalters) in Zellen einer Pflanze
-
a) Mikroprojektilbombardierung
(particle bombardment)
-
Verschiedene Methoden können für das direkte
Einschleusen (direct delivery) des Polypeptids in Zellen der Pflanze
verwendet werden. Unter den einfachsten Methoden ist das direkte
Einschleusen mit Hilfe einer mechanischen Interaktion mit dem Pflanzengewebe.
Zum Beispiel kann die Mikroprojektilbombardierung mit mit dem Polypeptid
beschichteten Partikeln das Polypeptid in eine Pflanzenzelle einschleusen.
Das Protokoll kann denen für
das Einschleusen von DNA bei der Transformation von Pflanzen (
US 05 100 792 );
EP 00 444 882 ;
EP 00 434 616 ) ähneln. Dabei
werden die Partikel anstelle von DNA mit dem Polypeptid beschichtet.
Es gibt eine Beschreibung eines biolistischen Verfahrens, bei dem
die Partikel nach einem ausreichend schonenden Verfahren zur Bewahrung
der Aktivität
des Polypeptids beschichtet werden (Sandford, Smith & Russell, 1993,
Methods in Enzymol., 217, 483-509). Im Prinzip können auch andere Transformationsmethoden
für Pflanzen
verwendet werden, z.B. die Mikroinjektion (WO 09209696; WO 09400583;
EP 175 966 ) oder das Liposomen-vermittelte
Einschleusen (für eine Übersicht
siehe: Fraley & Papahadiopoulos, 1982,
Curr. Top Microbiol. Immunol., 96, 171-191).
-
b) Verwendung von Membran-Translokations-Aminosäuresequenzen
-
Das gewünschte Polypeptid kann extern
auf Zielzellen der Pflanze appliziert werden, indem eine kovalente
Fusion oder eine nicht-kovalente Interaktion mit einer Membran-Translokations-Sequenz verwendet
wird. Viele Beispiele für
Membran-Translokations-Sequenzen (MTS), ob natürlich oder synthetisch, sind
im Stand der Technik bekannt. Sie werden als Fusionen mit peptidischen
Arzneistoffen und therapeutischen Proteinen viel verwendet, um deren Membrangängigkeit
zu erhöhen.
Ein MTS kann eine einfache Aminosäure-Wiederholung sein, z.B.
ein kationisches Peptid, das 11 Arginine RRRRRRRRRRR enthält (Matsushita
et al., 2001, J. Neurosci., 21, 6000-6007). Ein anderes kationisches MTS
ist ein Transportan aus 27 Aminosäuren (GWTLNSAGYL LGKINLKALA
ALAKKIL) (Pooga et al., 1998, FASEB J., 12, 67-77). Es ist sehr wahrscheinlich, dass
solche Peptide für
die Penetration der Zelle die Asymmetrie der zellulären Plasmamembran
ausnutzen: Die Lipid-Einzelschicht, die dem Cytoplasma zugewandt
ist, enthält
anionische Phospholipide (Buckland & Wilton, 2000, Biochim. Biophys.
Acta/Mol. Cell. Biol. of Lipids, 1483, 199-216). Verschiedene Proteine enthalten
Untereinheiten, die ihre aktive Translokation über die Plasmamembran in Zellen
ermöglichen.
Hierzu gehört
die basische Domäne
von HIV-1 Tat49-57(RKKRRQRRR) (Wender et al.,
2000, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 97, 13003-13008), Antennapedia43-58 (RQIKIWFQNRRMKWKK) (Derossi et al,
1994, J. Biol. Chem., 269, 10444-10450), die MTS des Kaposi-Fibroblasten-Wachstumsfaktors
(AAVALLPAVL LALLAP) (Lin et al., 1995, J. Biol. Chem., 170, 14255-14258);
die VP22-MTS (Bennet, Dulby & Guy,
2002, Nat. Biotechnol., 20, 20; Lai et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA, 97, 11297-302); Homeodomänen
aus Drosophila melanogaster Fushi-Tarazu und Engrailed Proteinen
(Han et al , 2000, Mol. Cells, 10, 728-732). Es wurde gezeigt, dass
all diese positiv geladenen MTS von sich aus und als Fusionen mit
anderen Proteinen, wie GFP, den Eintritt in Zellen (Zhao et al., 2001,
J. Immunol. Methods, 254, 137-145; Han et al., 2000, Mol. Cells,
10, 728-732), Cre-Rekombinase (Peitz et al., 2002, Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 4489-4494) energieunabhängig ermöglichen. Jedoch ist die Fusion
nicht notwendigennreise für
den Proteintransport in die Zelle nötig. Es wurde ein Peptid-Träger Pep-1
aus 21 Resten entworfen (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV), welcher über nicht-kovalente
hydrophobe Interaktionen mit verschiedenen Arten von Proteinen,
wie GFP, b-Gal, oder spezifischen Antikörpern voller Länge Komplexe
bilden kann. Diese Komplexe können
effizient in Zellmembranen eindringen (Morris et al., 2001, Nature
Biotechnol., 19, 1173-1176).
Diese Liste von MTS könnte fortgesetzt
werden. Ganz allgemein kann jedes synthetische oder natürliche Arginin-reiche
Peptid zur Durchführung
dieser Erfindung verwendet werden (Futaki et al., 2001, J. Biol.
Chem., 276, 5836-5840).
-
Da kein wesentlicher struktureller
Unterschied zwischen pflanzlichen und tierischen Zellmembranen besteht,
der die allgemeine Architektur und physiko-chemischen Eigenschaften
beeinflusst, können
diese Fusionen von MTS mit einem gewünschten Polypeptid auch für das Eindringen
in Pflanzenzellen verwendet werden. Im Unterschied zu tierischen
Zellen besitzen pflanzliche Zellen eine stabile Zellwand (Varner & Linn, 1989, Cell,
56, 231-239; Minorsky, 2002, Plant Physiol., 128, 345-53). Dies Hindernis
kann mit Hilfe einfacher Techniken überwunden werden. Zum Beispiel
kann die Injektion eines (z.B. rohen) Protein-Extrakts, das ein
MTS enthaltendes Polypeptid enthält,
in den pflanzlichen Apoplasten die Translokation des Polypeptids
in die Pflanzenzellen erleichtern. Ein anderer Ansatz zur Überwindung
der Zellwand und zum Erreichen der Zellmembran von Pflanzenzellen
kann die Anwendung von zellulytischen Enzymen sein, von denen viele
kommerziell erhältlich
sind. Wenn sie zu einer das Polypeptid enthaltenden Zusammensetzung
gegeben werden, entfernen oder schwächen diese Enzym die Zellwand,
aber lassen jedoch die Zellmembran intakt und für die Penetration des Polypeptids
mit der MTS exponiert. Solche Cellulose abbauenden Enzyme aus Bakterien
und Schimmelpilzen sind kommerziell erhältlich im industriellen Maßstab und werden
viel verwendet (z.B. "Onozuka" R-10, Enzympräparat aus
Trichoderma harzianum usw.) in der Zellkultur pflanzlicher Zellen
zur Herstellung von pflanzlichen Protoplasten (Sidorov & Gleba, 1979, Tsitologia,
21, 441-446; Gleba & Gleba,
1978, Tsitol. Genet., 12, 458-469; Ghosh et al., 1994, J. Biotechnol.,
32, 1-10; Boyer, Zaccomer & Haenni,
1993, J. Gen. Virol., 74, 1911-1917; Hilbricht, Salamini und Bartels,
2002, Plant J., 31, 293-303). Cellulose abbauende Enzyme können auch
für Anwendungen dieser
Erfindung in großem
Maßstab
eingesetzt werden. Eine Mischung von Cellulose abbauenden Enzymen
mit einem Zell-permeablen Polypeptid kann über genetisch modifizierte
Pflanzen oder deren Teile gesprüht
werden. Cellulasen können
Zellmembranen für
Zellmembran-permeable Polypeptide zugänglich machen. Nach der Translokation
in die Zelle kann das Polypeptid den gewünschten zellulären Prozess und
die Expression des Kontrollproteins in der Pflanze auslösen.
-
Zusätzlich zu den obigen Delivery-Methoden für das Polypeptid
wird vorzugsweise eine wirksame Ausbreitung des Proteinschalters
in der Pflanze für Amplifizierungszwecke
angewandt. Um ferner die Gesamtmethode sicher zu machen, ist eine
strikte Kontrolle über
die heterologe Nukleinsäure
nötig.
-
Um diese Probleme zu lösen, wird
hier vorgeschlagen, ein "split
genes"-Ansatz zur
Kontrolle der Segregation eines für den Proteinschalter kodierenden
Transgens zu verwenden. In dieser Ausführungsform wird ein aktiver
Proteinschalter entweder durch Intein-vermitteltes Protein-Trans-Spleißen (4-A und 5-A) oder durch Affinitäts-Interaktion
(4-B und 5-B) aufgebaut. In diesem
Fall wird der Proteinschalter nicht von einer kontinuierlichen DNA-Sequenz
kodiert, und seine Verwendung kann viel besser kontrolliert werden.
Besonders wichtig ist, dass diese Ausführungsform eine außergewöhnliche
biologische Sicherheit aufweist.
-
Intein-vermitteltes Trans-Spleißen von
Protein unter Wiederherstellung ihrer Aktivität ist aus dem Stand der Technik
bekannt und in vielen Publikationen beschrieben. Die Affinitäts-Interaktion
und/oder das Trans-Spleißen
von Proteinen kann mit Hilfe von veränderten Inteinen (4-A) erreicht werden. Inteine
wurden ursprünglich
als Protein-Sequenzen identifiziert, die in-frame in Proteinvorläufern eingefügt sind
und bei der Proteinreifung herausgeschnitten werden (Perler et al.,
1994, Nucleic Acids Res., 22, 1125-1127; Perler, F.B., 1998, Cell,
92, 1-4). Alle Informationen und katalytischen Gruppen, die zum Selbst-Spleißen nötig sind,
liegen in dem Intein und zwei flankierende Aminosäuren. Der
chemische Mechanismus des Proteinspleißens wird im Detail von Perler
und Kollegen (1997, Curr. Opin. Chem. Biol., 1, 292-299) und von
Shao & Kent (1997,
Chem. Biol., 4, 187-194) beschrieben. Inteine bestehen üblicherweise
aus N- und C-terminalen Spleißregionen
und einem zentralen Homing-Endonucleasen-Bereich oder einer kleinen
Linkerregion. Über
100 Inteine aus Kern- und Organell-Genomen verschiedener Orgasnismen,
darunter Eukaryoten, Archaebakterien und Eubakterien sind bekannt (http://www.neb.com/neb/inteins.html).
Es wurde gezeigt, dass Inteine zum Trans-Spleißen befähigt sind. Das Entfernen des
Homing-Endonucleasen-Bereichs hat keinen Effekt auf das Selbst-Spleißen des
Inteins. Dies ermöglichte
unter anderem die Entwicklung von Trans-Spleiß-Systemen, bei denen die N-terminalen und
C-terminalen Fragmente des Inteins als getrennte Fragmente koexprimiert
werden und, wenn sie mit Exteinen verbunden sind (Protein-Fragmente,
die mit Hilfe eines Inteins verbunden werden können), in vivo zum Trans-Spleißen befähigt sind
(Shingledecker et al., 1998, Gene, 207, 187-195). Ebenso wurde mit den
N- und C-terminalen Segmenten des RecA-Inteins aus Mykobakterium
tuberculosis gezeigt, dass Protein-Trans-Spleißen in vitro stattfinden kann
(Mills et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3543-3548).
Dieses Phänomen
wurde auch am DnaE-Protein aus Synechocystis Sp.-Stamm PCC6803 gefunden
(Wu et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9226-9231). Dieses
Protein wird von zwei Genen kodiert, die auf entgegengesetzten DNA-Strängen mehr
als 700 Kb.p. entfernt liegen. Es wurde gezeigt, dass die von diesen
Genen kodierten Intein-Sequenzen ein gespaltenes Mini-Intein darstellen
und in Esherichia coli Trans-Spleißing-Aktivität haben.
Ein Intein aus derselben Quelle (DnaE-Intein aus Synechocystis sp.-Stamm
PCC6803) wurde zur Herstellung funktioneller Herbizidresistenz über Acetolactat-Synthase
II aus zwei nicht verknüpften Fragmenten
(Sun et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol., 67, 1025-29) und von
5-Enolpyruvylschikimat-3-Phosphat-Synthase
(EPSPS) (Chen et al., 2001, Gene, 263, 39-48) in E. coli verwendet.
-
Das Trans-Spleißen von Proteinfragmenten (darunter
die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen Exteinen) ist nicht
notwendigerweise nötig,
um eine ursprüngliche
Protein-Funktion wiederherzustellen. In vielen Fällen reicht eine Affinitäts-Interaktion zwischen
Protein-Teilen ohne Bildung einer Peptidbindung aus, um eine Protein-Funktion
wiederherzustellen (4-B).
Dieser Ansatz ist am erfolgreichsten (wie im Fall des Intein-vermittelten
Trans-Spleißens)
mit Proteinen, die zwei oder mehr funktionelle Domänen aufweisen.
In einem solchen Fall können die
Domänen
voneinander getrennt werden, indem die kodierende Sequenz gespalten
und auf zwei Transkriptionsvektoren verteilt wird, und durch Protein-vermittelte
Affinitäts-Interaktion
zusammengebracht werden. Protein-Domänen können ohne Verwendung von Intein-Teilen interagieren.
Es gibt ein Beispiel der Rekonstitution der Aktivität der IS10-Transposase,
die aus zwei strukturellen Domänen
besteht, die durch einen Proteolyse-sensitiven Linker verbunden
sind (Kwon, Chalmers & Kleckner, 1995,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8234-8238). Jede der Domänen ist
für sich
alleine unfähig,
die Funktion der Transposase auszuüben. Wenn sie gemeinsam verwendet
werden, können
sie jedoch Transpositionen ausführen,
auch wenn sie nicht durch einen Linker verbunden sind. Es gibt viele
weitere Beispiele der funktionellen Protein-Rekonstitution aus isolierten
Fragmenten ohne Peptid-Bindungsbildung. Der effiziente Aufbau einer
funktionellen Insulin-Rezeptor-Bindestelle wurde durch einfaches Mischen
nichtfunktioneller Fragmente erreicht (Kristensen et al., 2002,
J. Biol. Chem., 277, 18340-18345). Die Rekonstitution aktiver Proteine durch
einfaches Mischen zweier inaktiver Peptid-Fragmente wurde für die Leucin-Dehydrogenase (Oikawa
et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 280, 1177-1182), das
Ca2+-Binde-Protein Calbindin D28k (Berggard
et al., 2000, Protein Sci., 9, 2094-2108; Berggard et al., 2001,
Biochemistry, 40, 1257-1264), der Entwicklungsregulator COP1 (development
regulator) aus Arabidopsis (Stacey et al., 2000, Plant Physiol.,
124, 979-990), Diopamin-D-Rezeptor
(Scarselli et al., 2000, Eur. J. Pharmacol., 397, 291-296), Mikroplasminogen
(De Los Santos, Wang & Reich,
1997, Ciba Found. Symp., 212, 76-83) und viele andere gezeigt.
-
Affinitäts-Interaktionen können entwickelt werden,
indem natürlich
vorkommende Protein-Interaktionsdomänen verwendet
werden, oder indem solche Domänen
mit Hilfe des two-hybrid-Systems (Fields & Son, 1989, Nature,
340, 245-246; Chien et al., 1991, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 88,
9578-9582; Yeast Protocol Handbook, Clontech Laboratories, Inc.,
2000) oder des Phage-Display-Systems identifiziert werden. Zum Beispiel
kann Phage-Display dazu benutzt werden, ein 5- bis 12-mer Oligopeptid
mit hoher Affinität
zu einem gewünschten
Protein-Fragment zu
selektieren. Mehrere solcher Systeme sind jetzt kommerziell erhältlich.
Phage-Display ist
eine Selektionstechnik bei der ein kurzes variables 5- bis 12-mer
Oligopeptid in ein Hüll-Protein
eines Bakteriophagen inseriert werden kann. Die für das variable Oligopeptid
kodierende Sequenz wird in das entsprechende Gen des Hüll-Proteins
des Bakteriophagen inkorporiert. Üblicherweise hat eine 7-mer
Phage-Display-Bibliothek mindestens 109 unabhängige Klone, die verschiedene
Kombinationen von 7-mer Aminosäuren
in verschiedenen Oligopeptiden tragen. Phage-Display wurde dazu
benutzt, Affinitätskomplexe
zwischen Bakteriophagen und einem gewünschten Protein zu schaffen,
was die schnelle Identifizierung von Peptid-Liganden für ein gegebenes
Zielprotein mittels einer in-vitro-Selektionsmethode erlaubt, die "panning" genannt wird (Parmley, Smith,
1988, Gene, 73, 305-318; Cortese et al., 1995, Curr. Opin. Biotechnol.,
6, 73-80). Der Phagen-Protein-Komplex aus der Panning- Prozedur kann dissoziiert
werden, und ein Phage mit Affinität zu einem Zielprotein kann
amplifiziert werden. Üblicherweise
werden diese Panning-Zyklen dazu benötigt, Bakteriophagen mit hoher
Affinität
zu bekommen. Nach drei Runden können
individuelle Klone durch Sequenzieren der variablen Region in der
genomischen DNA charakterisiert werden. Dieses System kann gut für die Identifizierung
kurzer interagierender Oligopeptide angewandt werden, die dann als
Affinitäts-Tags verwendet
werden können,
um Protein-Fragmente zusammen zu bringen.
-
Ein anderer Ansatz verwendet natürlich vorkommende
interagierende Domänen,
wie Leucinreiche Wiederholungen (Kobe & Deisenhofer, 1994, Trends Biochem.
Sci., 19, 415-421; Kobe & Kajava, 2001,
Curr. Opin. Struct. Biol., 11, 725-732), Zink-Finger (Grossley,
Merika & Orkin,
1995, Mol. Cell. Biol., 15, 2448-2456), Ankyrin-Wiederholungen (Thompson,
Brown & McKnight,
1991, Science, 253, 762-768), Chromo-Domänen (Paro & Hogness, 1991, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88, 263-267; Singh et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19,
789-793) und vielen anderen, die in Protein-Protein-Interaktionen involviert
sind. Jedoch sollte die Möglichkeit
in Betracht gezogen werden, bei dem Protein-Protein-Interaktionen
nicht nur die durch Engineering erhaltenen Protein-Fragmente mit
den Fusionen zu verwenden, sondern auch endogene Proteine.
-
Die Verwendung von Protein-Protein-Interaktionen
zum Einschalten eines gewünschten
zellulären
Prozesses wie die Genexpression hat unter anderem die folgenden
Vorteile: Erstens kann das System hochgradig spezifisch gestaltet
werden, da die gewünschte
Funktion das Ergebnis einer hochspezifischen Protein-Protein- oder
Protein-Nukleinsäure-Interaktion
ist, die im nichtinduzierten Zustand auf null ist und keine nichtspezifische
basale Expression im nichtinduzierten Zustand (leakiness) aufweist. Dies
ist bei Systemen des Standes der Technik wie auf kleinen Molekülen beruhenden
Schaltern anders, da diese inhärent
weniger spezifisch sind und immer ein gewisses Maß ein Leakiness
zeigen. Zweitens kann ein Proteinschalter oder ein Fragment desselben
direkt in eine Zelle eingeführt
werden ohne einen Nukleinsäurevektor,
der für
das Protein kodiert, was eine genaue Dosierung des Proteins erlaubt.
Dies macht das direkte Einschleusen des Proteinschalters in Zellen
vergleichbar mit der Verwendung kleiner Moleküle zum Auslösen eines benötigten Prozesses in
den Zellen. Drittens ist das System inhärent umweltsicherer als Systeme
des Standes der Technik, die die volle genetische Information für das gewünschte Protein
enthalten (entweder in Form einer linearen Nukleinsäure oder
Fragmenten derselben), da der fragliche Organismus nicht die gesamte
genetische Information enthält,
die für
die Expression eines funktionellen Proteins benötigt wird. Gemäß des zentralen
Dogmas der Molekularbiologie können
biologische Systeme Proteine nicht rückwärts zu Nukleinsäuren translatieren.
Daher ist das Rückwärts-Engineering
der genetischen Information, die für die Expression eines funktionellen
Merkmals in einem lebenden Organismus ausreichend ist, nicht möglich. Viertens
stellt das System ein spezifisches Schloss dar, das verwendet werden
kann, um die nichtauthorisierte Verwendung des Systems zu verhindern.
Die Verwendung eines Proteinschalters als Komponente eines rohen
Proteinextrakts aus Organismen, die das Protein oder das Proteinfragment
exprimieren, macht es praktisch sehr schwierig, die aktive Komponente des
Extrakts zu identifizieren.
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Ausbreitung des Proteinschalters
in einer Pflanze zum Auslösen
eines gewünschten
zellulären
Prozesses
-
Im folgenden wird ein Ansatz beschrieben, um
das Problem der geringen Anzahl der Zellen einer Pflanze, die mit
dem extern-applizierten Polypeptid erreicht werden können, zu
lösen:
Das Polypeptid kann zur Bildung eines intrazellulären Proteinschalter-Moleküls führen, das
zur Wanderung von Zelle zu Zelle oder zur systemischen Wanderung
befähigt
ist. Ferner kann das Polypeptid zur Bildung eines auf einem Virus
basierenden Vektors (Amplicons) führen, der ein gewünschtes
Gen oder ein Teil desselben exprimiert und zur Wanderung von Zelle
zu Zelle (cell-to-cell-movement) oder zur systemischen Wanderung
(systemic movement) in der Pflanze befähigt ist. In diesen Ausführungsformen
kann die Bewegung entweder eines viralen Vektors oder von Proteinschalter-Molekülen oder
beidem zur Ausbreitung eines zellulären Prozesses und/oder einer
biochemischen Kaskade über
beträchtliche
Teile der Pflanze und sogar in der gesamten genetisch modifizierten Pflanze
führen.
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In Beispiel 1 der Erfindung enthält der Proteinschalter
eine PhiC31 Integrase, um einen Vorläufer-Vektor eines viralen Vektors
in einen viralen Vektor umzuwandeln. Der virale Vektor ist zur Amplifizierung,
zur Wanderung von Zelle zu Zelle und zur systemischen Wanderung
befähigt.
Die Integrase-vermittelte Rekombination zwischen attP und attB-Stellen
von pICHGFPinv (
7-A)
führt zur
Inversion eines DNA-Fragments, das von den Stellen flankiert wird,
und zur Bildung eines viralen Vektors, der amplifiziert werden kann
und ein gewünschtes
Gen (GFP) exprimieren kann (
7-B).
Dies wird dadurch erreicht, dass virale Komponenten (3'NTR – 3'-nicht-translatierte
Region; CP – Hüll-Protein),
die für
die Vektor-Amplifizierung und den systemischen Transport nötig sind,
bezüglich
eines in dem fraglichen multizellulären Organismus aktiven Promotors in
Sense-Orientierung gebracht werden, z.B. der Actin-2-Promotor. Dies führt zusammen
mit anderen Komponenten des viralen Vektors (RdRp und CP) zur Bildung
einer cDNA, die infolge der durch den Actin-2-Promotor betriebenen
Transkription einen viralen RNA-Vektor bildet, der zur Amplifizierung,
zur Wanderung von Zelle zu Zelle und zur systemischen Wanderung
befähigt
ist. Wahlweise kann der Vektor weiter modifiziert werden, indem
das CP-Gen (Hüll-Protein)
entfernt wird. Ein Vektor, dem das CP-Gen fehlt, ist noch immer
zur Wanderung von Zelle zu Zelle befähigt. Die Konstruktion von
Expressionssystemen auf der Basis von pflanzlichen Viren für die Expression
von nicht-viralen Genen in Pflanzen wurde in mehreren Publikationen
beschrieben (Dawson et al., 1989, Virology, 172, 285-293; Brisson
et al., 1986, Methods in Enzymology, 118, 659; MacFarlane & Popovich, 2000,
Virology, 267, 29-35; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173;
Voinnet et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14147-14152)
und Übersichtsartikel
(Porta & Lomonossoff,
1996, Mol. Biotechnol., 5, 209-221; Yusibov et al., 1999, Curr.
Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94) und kann leicht von Fachleuten
ausgeführt werden.
Expressionssysteme auf der Basis viraler Vektoren erlauben eine
deutlich höhere
Ausbeute des Produktes eines Transgens, verglichen mit pflanzlichen
nucleären
Transgenen. Zum Beispiel kann das Maß an Transgen-kodiertem Protein
5 bis 10% des zellulären
Gesamt-Proteins der Pflanze erreichen, wenn es von einem viralen
Vektor exprimiert wird (Kumagai et al., 2000, Gene, 245, 169-174; Shivprasad
et al., 1999, Virology, 255, 312-323). RNA-Viren sind am besten
geeignet, da sie ein höheres
Expressionslevel ermöglichen
verglichen mit DNA-Viren. Es gibt mehrere veröffentlichte Patente, die virale
Vektoren beschreiben, die für
die systemische Expression transgenen Materials in Pflanzen geeignet
sind (
US 5 316 931 ;
US 5 589 367 ;
US 5 866 785 ). Im allgemeinen können diese
Vektoren ein Fremd-Gen als Translationsfusion mit einem viralen Protein
exprimieren (
US 5 491 076 ;
US 5 977 438 ), von einem
zusätzlichen
subgenomischen Promotor (
US 5
466 788 ;
US 5 670 353 ;
US 5 866 785 ) oder von polycistronischer
viraler RNA unter Verwendung eines IRES- (internal ribosome entry
site)-Elements zur unabhängigen
Protein-Translation (
DE 100
495 87 ). Der erste Ansatz, die Translationsfusion eines rekombinanten
Proteins mit einem viralen Struktur-Protein ergibt eine gute Ausbeute
eines rekombinanten Protein-Produkts (Hamamoto et al., 1993, Biotechnology,
11, 930-932; Gopinath et al. 2000, Virology, 267, 159-173;
JP 6169789 ;
US 5 977 438 ). Der Nutzen dieser Methode
ist jedoch begrenzt, da das rekombinante Protein nicht leicht von
dem viralen abgetrennt werden kann. Eine Alternative zu dieser Methode
verwendet eine Translationsfusion über eine Peptidsequenz, die
von einer viralen ortsspezifischen Protease oder über ein
katalytisches Peptid erkannt wird (Dolja et al., 1992, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89, 10208-10212; Gopinath et al., 2000, Virology, 267,
159-173;
US 5 162 601 ;
US 5 766 885 ;
US 5 491 076 ). Expressionsprozesse
unter Verwendung viraler Vektoren auf der Basis von heterologen
subgenomischen Promotoren erlauben das bislang größte Ausmaß an Protein-Produktion
(
US 5 316 931 ). Der größte Nachteil
viraler Vektoren und vieler anderer Vektoren ist ihre beschränkte Kapazität bezüglich der Größe der DNA,
die amplifiziert werden soll. Normalerweise nehmen stabile Konstrukte
Inserts von nicht mehr als 1 kb auf. In einigen Gebieten der funktionellen
Genom-Analyse von Pflanzen mag das keine sehr ernste Beschränkung sein,
da G. della-Cioppa et
al. (WO 993651) die Verwendung TMV-basierter viraler Vektoren zur
Expression von pflanzlichen cDNA-Bibliotheken beschrieb, mit dem
Ziel, endogene Gene herunter zu regulieren (Silencing). Zwei-Komponenten-Amplifikationssysteme,
die Hilfsviren verwenden (helper viruses), ermöglichen eine etwas bessere
Kapazität
(
US 5 889 191 ). Andere
Systeme, die auf Expressions-Kassetten beruhen, die stabil in das
pflanzliche Genom integriert werden, enthalten den starken 35S-Promotor,
der die Expression von Amplicons, die auf viralen Vektoren beruhen,
antreibt. Diese Systeme werden gewöhnlich von posttranskriptionalem
Gene-Silencing (PTGS) betroffen (Angel) & Baulcombe, 1997, EMBO J., 16, 3675-3684).
Die Verwendung von PTGS-Suppressoren
ist nötig,
um das Silencing zu bewältigen
(WO 0138512). Das Kreuzen von Pflanzen, die das vom Silencing betroffene
Amplicon tragen, mit Pflanzen, die die Quelle des PTGS-Suppressors
tragen, ist nötig,
um mit einem solchen System die Produktion eines gewünschten
Proteins im großen
Maßstab
zu erreichen (Mallon et al., 2002, Nature Biotechnol., 20, 622-625).
Es ist offensichtlich, dass ein solches System keine flexible und
strikte Kontrolle der Transgen-Expression erlaubt und auf die Herstellung
von Proteinen beschränkt
ist, die nicht mit dem Wachstum der Pflanze und deren Entwicklung
interferieren.
-
Unsere Erfindung erlaubt es, die
Beschränkungen
der oben beschriebenen viralen Vektor-Systeme, insbesondere ihre beschränkte Kapazität für die Größe des zu
exprimierenden Gens und den Mangel an Flexibilität bezüglich der Kontrolle der Expression
zu überwinden.
In unserer Erfindung ist der virale Vorläufer-Vektor (Provektor) vorzugsweise
in jeder Zelle der transgenen Pflanze vorhanden. Im Fall der Expression
großer
Gene (über
1 kb) ist die Wanderung des Proteinschalters bevorzugt im Vergleich
zur Wanderung eines viralen Vektors. Virale Vektoren können in
Zellen effizient amplifizieren, und die Größe des Inserts eines viralen
Vektors beeinflusst vor allem die Fähigkeit zur Wanderung von Zelle
zu Zelle und die systemische Wanderung. Daher löst das Einschleusen eines beweglichen
Proteinschalters in viele oder sogar in alle Zellen der Wirtspflanze
das oben genannte Problem, sofern der Proteinschalter einen viralen
Vektor aktivieren kann. Um ferner ein System mit einer effizienten
Schaltfunktion bereitzustellen, die die Amplifikation eines solchen Vektors
in den meisten, wenn nicht in allen Zellen der Wirtspflanze, anschalten
kann, werden in dieser Erfindung Proteinschalter verwendet, die
zur Wanderung von Zelle zu Zelle und zur systemischen Wanderung
befähigt
sind.
-
Zu diesem Zweck kann der Proteinschalter einen
Protein-Teil enthalten, der den Proteinschalter zur Bewegung von
Zelle zu Zelle und zur systemischen Wanderung befähigt. Beispiele
für solche
Protein-Teile, die interzellulär
wandern können,
sind im Stand der Technik bekannt. Es gibt Hinweise, dass pflanzliche
Transkriptionsfaktoren, bei der Abwehr beteiligte Proteine und virale
Proteine durch Plamodesmata wandern können (für eine Übersicht siehe: Jackson & Hake, 1997, Curr.
Opin. Genet. Dev., 7, 495-500; Ding, B., 1998, Plant Mol. Biol.,
38, 279-310; Jorgensen RA., 2000, Sci STKE, 58, PE2; Golz & Hudson, 2002,
Plant Cell, 14, S277-S288). Es wurde gezeigt, dass eine Fusion des
3a-Movement-Proteins des Gurken-Mosaik-Virus mit GFP über Plasmodesmata
in Nachbarzellen wandern kann (Itaya et al., 2002, Plant Cell, 14,
2071-2083). Diese
Fusion zeigte auch die Bewegung durch das Phloem vom transgenen
Wurzelstock in einen nicht-transgenen Pfropf. Das Movement-Protein
des Tabak-Mosaik-Virus (TMV), P30, wandert zwischen Zellen durch
Plasmodesmata und erleichtert durch Beeinflussung der Größe der Plasmodesmata
die Bewegung vieler anderer großer
Makromoleküle,
die sonst nicht wandern (Citovsky et al., 1999, Phil. Trans. R.
Soc. London B Biol. Sci., 354, 637-643; Ding, Itaya & Woo, 1999, Int.
Rev. Cytol., 190, 251-316). Die P30:GFP-Fusion zeigte Wanderung zwischen
den Zellen unabhängig
von den physiologischen Bedingungen, während die ungezielte GFP-Diffusion
durch Plasmodesmata stark vom physiologischen Zustand der Pflanzenzellen
abhängt (Crawford & Zambryski, 2001,
Plant Physiol., 125, 1802-1812). Die Fusion von GFP mit dem Transkriptionsfaktor
knotted 1 zeigt ebenso die Fähigkeit
zum interzellulären
Trafficking. Das GFP:KN1-Fusionsprotein zeigte Wanderung von den
internen Geweben des Blattes zur Epidermis, zwischen Epidermis-Zellen
und in das apikale Meristem des Sprosses der Tabakpflanze (Kim et
al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 4103-4108). Plasmodesmata
spielen eine wichtige Rolle bei dieser Wanderung und ihr physiologischer
Zustand und Struktur sind für
die Effizienz dieses Trafficking wichtig. Zum Beispiel erlauben
einfache Plasmodesmata das nicht-spezifische Trafficking von Proteinen
in sich entwickelnden Tabakblättern,
während
verzweigte dies nicht erlauben (Oparka et al., 1999, Cell, 98, 5-8).
Das Ermöglichen der
Wanderung von Makromolekülen
inklusive Proteinen scheint eine normale Funktion der Plasmodesmata
zu sein, was von Pflanzenviren für
ihre Ausbreitung von Zelle zu Zelle ausgenutzt worden ist (Fujiwara
et al., 1993, Plant Cell, 5, 1783-1794). Es ist allgemein akzeptiert,
dass Plasmodesmata und das Phloem eine wichtige Rolle beim Transport
und beim Einschleusen von Informations-Makromolekülen (Proteine
und Nucleinsäuren)
spielen (Ruiz-Medrano et
al., 2001, Curr. Opin. Plant Biol., 4, 202-209). Saft-Proteine des
Phloems aus Cucurbita maxima und Ricinum communis haben die Fähigkeit
zur Wanderung von Zelle zu Zelle durch Plasmodesmata (Balachandran
et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 14150-14155).
-
8 zeigt
schematisch Möglichkeiten
zum Erreichen der interzellulären
Wanderung des erfindungsgemäßen Proteinschalters.
Ein extern verabreichter Proteinschalter (z.B. das Polypeptid) und
der in einer Zelle synthetisierte Proteinschalter können Fusionen
derselben oder verschiedener Protein-Segmente mit Translokations-
oder Trafficking-Signalen sein. In unserem Beispiel (8) wird das gleiche Protein-Segment,
z.B. eine Rekombinase, entweder mit einem Membran-Translokationssignal
(MTS) für Zellmembran-Permeabilität verbunden,
oder mit einem Protein-Teil (TP), der die interzelluläre Wanderung
(Trafficking) ermöglicht.
Es ist sehr wahrscheinlich, dass für kleine Proteine (wie GFP
und kleinere) eine Fusion mit TP nicht nötig ist, da sie zur effizienten
Bewegung von Zelle zu Zelle durch einfache Diffusion fähig sein
können.
Für größere Proteinschalter ist
eine Fusion mit einem TP oder einem aktiven Fragment desselben jedoch
vorteilhaft. Unter allen Proteinen, die beim interzellulären Trafficking
beteiligt sind, sind virale Proteine am besten untersucht. Daher
sind sie die bevorzugtesten Kandidaten zur Verwendung in einem Proteinschalter.
Wie in 8 gezeigt, kann
ein extern verabreichtes Polypeptid (MTS:Rekombinase) die Expression
eines Transgens, das für
einen Proteinschalter mit derselben enzymatischen Aktivität (Rekombinase:TP)
kodiert, auslösen,
der dann zum Verlassen einer Zelle und zum Eintritt in andere Zellen
(interzelluläres
Trafficking) befähigt
ist. Der zum Trafficking befähigte
Proteinschalter betätigt
die Expression des Proteinschalters in allen betroffenen Zellen,
was eine Kettenreaktion darstellt. Die Verfügbarkeit des Proteinschalters in
der Zelle ist die Voraussetzung für die Expression eines gewünschten
Gens (gene of interest – GOI)
in Zellen durch DNA-Umordnung, was die Bildung eines auf einem viralen
Vaktor basierenden Amplicons verursacht. Die Größe des gewünschten Gens, das von einem
solchen Amplicon exprimiert wird, ist kein limitierender Faktor
für die
Effizienz der GOI-Expression,
da Amplicon-Stabilität
und Bewegung von Zelle zu Zelle in diesem System nicht nötig sind:
Der virale Provektor kann in jeder der Zellen der Pflanze vorliegen,
und die Ausbreitung des Proteinschalters kann die Expression des
gewünschten
Gens in jeder dieser Zellen auslösen.
Vorzugsweise trägt
jedoch die Ausbreitung des Amplicons zur Effizienz der GOI-Expression
bei.
-
Das ultimative Ziel des Proteinschalter-Systems
dieser Erfindung ist eine operative Kontrolle eines gewünschten
zellulären
Prozesses oder einer biochemischen Kaskade in einem pflanzlichen
Produktionssystem. Eine biochemische Kaskade ist eine Kette biochemischer
Reaktionen in einem Produktionssystem eines Wirts, die schlussendlich
ein spezifisches Produkt, Wirkung oder Merkmal ergibt. Die hier
beschriebenen Ansätze
bieten ein effizientes Produktionskontrollverfahren und sind vielfältig einsetzbar
und leakage-sicher. Das oben beschriebene Zwei-Komponenten-Verfahren
ist im wesentlichen ein Schlüssel-Schloss-System,
womit ein Unternehmen effizient den Zugang zur Produktion kontrollieren
kann, indem sie die Proteinschalter-Komponente verkauft.
-
Bevorzugte Pflanzen zur Verwendung
in dieser Erfindung sind u.a. alle Pflanzenarten, vor allem jedoch
Pflanzenarten, die in der Landwirtschaft oder im Gartenbau wichtig
sind. Übliche
Nutzpflanzen zur Verwendung in dieser Erfindung sind u.a. Alfalfa, Gerste,
Bohnen, Raps, Futtererbsen, Baumwolle, Mais, Klee, Lotus, Linsen,
Lupinen, Hirse, Hafer, Erbsen, Erdnüsse, Reis, Roggen, Süßklee, Sonnenblumen,
süße Erbsen,
Sojabohnen, Sorghum triticale, Yams-Bohnen, Seidenbohnen, Wicken, Weizen,
Wisteria und Nusspflanzen.
-
Bevorzugte Pflanzenarten für die Durchführung dieser
Erfindung sind u.a. solche, die zu den Gramineae, Kompositeae, Solanaceae
und Rosaceae gehören.
Weitere Pflanzenarten für
diese Erfindung sind solche der folgenden Gattungen: Arabidopsis,
Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa,
Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis,
Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis,
Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea,
Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus,
Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens,
Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera,
Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum,
Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa,
Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum,
Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum,
Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia,
Vigna, Vitis, Zea, und Olyreae, Pharoideae und viele andere.
-
In dieser Erfindung sind Pflanzenarten,
die nicht in die Nahrungskette eingehen, besonders bevorzugt für die Erzeugung
pharmazeutischer oder technischer Proteine. Unter diesen sind Nikotiana-Arten
besonders bevorzugt, da diese Arten leicht zu transformieren und
zu kultivieren sind und es gut entwickelte Expressionsvektoren (insbesondere
virale Vektoren) gibt.
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Bevorzugte multizelluläre Organismen nicht-pflanzlicher
Herkunft zur Verwendung in dieser Erfindung sind Zellkulturen von
Säugern,
Insekten sowie nicht-menschliche transgene Organismen.
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Gewünschte Gene, deren Fragmente
oder deren künstliche
Derivate, die mit dieser Erfindung exprimiert und isoliert werden
können,
sind unter anderem: Stärke-modifizierende
Enzyme (Stärke-Synthase,
Stärke-phosphorylierendes
Enzym, debranching enzyme, Stärke- verzweigendes Enzym,
Stärke-verzweigendes
Enzym II, granule bound Stärke-Synthase),
Sucrosephosphat-Synthase, Sucrose-Phosphorylase, Polygalacturonase,
Polyfructan-Sucrase, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, Cyclodextrin-Glycosyltransferase,
Fructosy-Transferase, Glycogen-Synthase, Pectin-Esterase, Aprotinin, Avidin,
Bacterielle Levansucrase, E.coli glgA Protein, MAPK4 und Orthologe,
Stickstoff-Assimilierungs/Methabolismus-Enzyme, Glutamin-Synthase, pflanzliches
Osmotin, 2S Albumin, Thaumatin, ortspezifische Recombinasen/Integrasen
(FLP, Cre, Recombinase, Int, SSVI Integrase R, Integrase phiC31,
oder ein aktives Fragment oder Variante derselben), Isopentenyl-Transferase,
Sca M5 (Sojabohnen-Calmodulin), Coleopteran-artige Toxine oder ein
insektizidaktives Fragment, Fusionsproteine des Ubiquitin-konjugierenden
Enzyms (E2), Enzyme die Lipide, Aminosäuren, Zucker, Nukleinsäuren und
Polysaccharide metabolisieren, Superoxide-Dismutase, inaktives Proenzym
einer Protease, pflanzliche Proteintoxine, Merkmale die in faserproduzierenden
Pflanzen Fasern verändern,
gegen Coleoptera-aktives Toxin von Bacillus thuringiensis (Bt2 Toxin,
Insektizides Kristallprotein (ICP), CryIC Toxin, Delta-Endotoxin, Polyopeptidtoxin,
Protoxin etc.), insektenspezifisches Toxin AaIT, Cellulose-abbauende
Enzyme, E1 Cellulase von Acidothermus celluloticus, Lignin-modifizierende
Enzyme, Cinnamoylalkohol-Dehydrogenase,
Trehalose-6-phosphat-Synthase, Enzyme des Cytokinin metabolic pathway,
HMG-CoA Reductase, Thaumatin, E. coli anorganische Pyrophosphatase, Samenlagerungsprotein
(seed storage protein), Erwinia herbicola Lycopen-Synthase, ACC
Oxidase, pTOM36 kodiertes Protein, Phytase, Ketohydrolase, Acetoacetyl-CoA-Reductase,
PHB (Polyhydroxybutanoate)- Synthase, Acyl-carrier-protein, Napin,
EA9, Phytoen-Synthase aus nichthöheren
Pflanzen, pTOM5-kodiertes Protein, ETR (Ethylen-Rezeptor), plastidäre Pyruvat-Phosphat-Dikinase,
Nematoden-induzierbares Transmembranporenprotein, merkmalsfördernde
photosynthetische oder plastidäre
Funktion der Pflanzenzelle, Stilben-Synthase, Enzyme, die Phenole hydroxylieren
können,
Catechol-Dioxygenase, Catechol-2,3-Dioxygenase, Chloromuconat-Cycloisomerase,
Anthranilat-Synthase, Brassica AGL15 Protein, Fructose-1,6-Biphosphatase
(FBPase), AMV RNA3, PVY Replicase, PLRV Replikase, Potyvirus-Hüllprotein,
CMV-Hüllprotein, TMV-Hüllprotein,
Luteovirus Replicase, MDMV messenger RNA, mutierte geminivirale
Replicase, Umbellularia californica C12:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase,
pflanzliche C10 or C12:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, C14:0
bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase (luxD), pflanzlicher Synthasefaktor
A, pflanzlicher Synthasefaktor B, 6-Desaturase, ein Protein mit
einer enzymatischen Aktivität
in der peroxysomalen b-Oxidation von Fettsäuren in Pflanzenzellen, Acyl-CoA-Oxidase,
3-Ketoacyl-CoA-Thiolase,
Lipase, Acetyl-CoA-Carboxylase aus Mais, 5-Enolpyruvylschikimat-3-Phosphat- Synthase (EPSP),
Phosphinothricin-Acetyl-Transferase (BAR, PAT), CP4 Protein, ACC-Deaminase, Proteine
mit posttranslationaen Spaltstellen, DHPS Gen, das Sulfonamid-Resistenz
verleiht, bakterielle Nitrilase, 2,4-D Monooxygenase, Acetolactat-Synthase
oder Acetohydroxysäure-Synthase (ALS,
AHAS), Polygalacturonase, Taq Polymerase, viele andere Enzyme aus
Bakterien oder Phagen, darunter Restriktionsendonucleasen, Methylasen, DNA- und RNA-Ligasen,
DNA-und RNA-Polymerasen, Reverse Transcriptase, Nucleasen (Dnasen
und Rnasen), Phospatasen, Transferasen, usw.
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Die Erfindung kann auch für die Zwecke
der molekularen Landwirtschaft (molecular farming) und zur Reinigung
von kommerziell wertvollen und pharmazeutisch wichtigen Proteinen
verwendet werden, darunter industrielle Enzyme (Cellulasen, Lipasen, Proteasen,
Phytase, etc.) Jedes humane oder tierische Protein kann nach der
Erfindung exprimiert und gereinigt werden. Beispiele für solche
gewünschten Proteine
sind u.a. Immunantwort-Proteine (monoklonale Antikörper, Einzelketten-Antikörper, T-Zell-Rezeptoren
usw.), Antigene (darunter solche aus pathogenen Mikroorganismen),
Kolonie-Stimulationsfaktoren, Relaxine, Polypeptid-Hormone (darunter
Somatotropin HGH und Proinsulin), Cytokine und deren Rezeptoren,
Interferone, Wachstumsfaktoren und Koagulationsfaktoren, enzymatisch
aktive lysosomale Enzyme, fibrinolytische Polypeptide, Blutgerinnungsfaktoren,
Trypsinogen, a1-Antitrypsin (AAT), humanes Serumalbumin, Glucocerebrosidase,
natives Cholera-Toxin B, sowie funktionskonservative Proteine, wie
Fusionsproteine, mutierte Varianten und synthetische Derivate all
dieser Proteine.
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BEISPIEL 1
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Verwendung einer von einem Proteinschalter ausgelösten ortsspezifischen
DNA-Rekombination, um
einen Amplifikationsvektor aus Provektor-Teilen zusammenzufügen, die
stabil in das Pflanzen-Genom integriert wurden Ein Binärvektor
pICHGFPinv (
7), der
T-DNA mit zwei Provektor-Teilen trägt, wurde nach Standardmethode
der Molekularbiologie (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning:
a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York) hergestellt.
Provektor-Elemente und Prinzipien ihrer Herstellung und Funktion
sind im Detail in den Patentanmeldungen PCT/EP 02/03476 und in
DE 101 21 283 beschrieben.
Der Vektor enthält
einen Transformationsmarker (NPTII-Gen), das 5'-Ende von TMV hinter dem Pflanzenpromotor
des Arabidopsis-Actin2-Gens (An et al., 1996, Plant J., 10, 107-121)
und enthält
eine RNA-abhängige
RNA Polymerase (RdRp) und das Movement-Protein (MP) gefolgt von
einem subgenomischen Promotor. Der Vektor enthält ferner das 3'-Ende des Provektors,
der das gewünschte
Gen (GFP), das virale Hüll-Protein (CP),
das die systemische Wanderung ermöglicht, und die 3'-nicht-translatierte
Region des viralen Vektors (3' NTR)
enthält.
Der 3'-Provektor
zusammen mit 2 Transkriptions-Terminationssignalen
wird von Rekombinationsstellen flankiert, die von der Phagen-Integrase
PhiC31 erkannt werden (Thomason, Calendar & Ow, 2001, Mol. Genet. Genomics,
265, 1031-1038).
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Transgene Nicotiana benthamiana Pflanzen, die
die T-DNA von pICHGFPinv enthält,
wurden durch Agrobakterium-vermittelte Transformation von Blattscheiben
erhalten, wie von Horsch et al. (1985, Science, 227, 129-131) beschrieben.
Blattscheiben wurden 30 Minuten mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101,
der mit dem gewünschten
Konstrukt transformiert war, inkubiert. Nach dreitägiger Inkubation im
Medium (MS-Medium 0,1 mg/l NAA, 1 mg/l BAP) ohne Selektionsmittel,
wurden Transformanten auf demselben MS-Medium, das mit 100 mg/l
Kanamycin versetzt war, selektioniert. Um das Wachstum des Agrobacteriums
zu reduzieren, wurde das Medium ferner mit 300 mg/l Carbenicilin
und 300 mg/l Cefotaxim versetzt. Regeneranten wurden auf Selektionsmedium
(MS-Medium) ohne Hormone, jedoch mit derselben Konzentration der
Selektionsmittel inkubiert, um die Wurzelbildung zu induzieren.
Die Anwesenheit des Transgens in segregierenden T2-Populationen
wurde durch PCR-Analyse bestätigt.
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Die Exposition der Blätter transgener
Pflanzen mit zellpermeabler Integrase bewirkt die ortsspezifische
Rekombination zwischen attP und attB Stellen. Diese Rekombination
führt zum Umdrehen
des 3'-Provektors,
was zur Bildung einer vollständigen cDNA
eines viralen Amplikons unter der Kontrolle des Actin2 Promoters
führt (7B). Das TMV-basierte RNA-Amplicon,
das GFP exprimiert, ist zur Wanderung von Zelle zu Zelle und zur
systemischen Wanderung befähigt.
Die GFP-Expression in N. benthamiana-Pflanzen kann visuell leicht
detektiert werden unter Verwendung einer UV-Lampe oder durch Betrachten
von Pflanzengewebe unter einem LEICA-Stereo-Fluoreszenz-Mikroskop
(Anregung bei 450-490 nm, Emission bei 500-550 nm). Das in unseren
Experimenten verwendete sGFP kann mit blauem und mit UV-Licht angeregt
werden.