KR20080039885A - 식물 세포로부터 생산된 세포 배양 배지의 성분 - Google Patents

식물 세포로부터 생산된 세포 배양 배지의 성분 Download PDF

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케네쓰 제이. 마베리
델리아 알. 베텔
닝 후앙
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Abstract

본 발명은 식물에서 생산된 세포 배양 배지의 성분의 생산 및 이를 함유하는 세포 배양 배지를 포함한다. 소망하는 성분을 인코딩하는 유전자를 포함하는 이종 DNA가 식물 세포, 특히 벼 내로 도입된 후, 이는 소망하는 성분을 생산한다. 요구되는 세포 배양 배지를 형성하기 위해 상기 성분은 상기 식물 세포로부터 분리될 수 있고 기타 성분과 결합될 수 있다.

Description

식물 세포로부터 생산된 세포 배양 배지의 성분{Components of Cell Culture Media Produced from Plant Cells}
본 발명은 식물 세포에서 생산된 재조합 단백질의 생산 및 세포 배양 배지의 성분으로서의 용도에 관한 것이다.
본 출원은 2006년 6월 28일 출원된 미국 가출원 제 60/694,236호의 우선권을 주장한다.
세포 배양 기술은, 적절한 영양분 및 조건이 공급되었을 때, 조직으로부터 분리된 동물 또는 식물 세포의 성장을 가능하게 한다. 영양분 고갈 또는 독성 형성과 같은 몇몇 배양 변수들에 의해 제한될 때까지, 상기 세포는 분열할 수 있고 성장을 계속 할 수 있다(Butler, M. & Jenkins, H., Nutritional aspects of growth of animal cells in culture, J of Biotechnol. (1989) 12: 97-110). 세포 배양 기술은 하기를 포함하는 여러 응용이 가능하다: 세포의 정상적인 생리학 또는 생화학의 조사(Balaban, B. & Urman, B., Embryo culture as a diagnostic tool, Reprod. Biomed. Online (2003) 7(6): 671-82), 다양한 화학 화합물 또는 약물의 특정 세포형에 대한 효과의 시험(Farkas, D. & Tannenbaum, S. R., In vitro methods to study chemically-induced hepatotoxicity: a, literature review, Curr. Drug Metab. (2005) 6(2): 111-25), 인공 조직을 생성에의 다양한 세포형의 순차 또는 병렬 조합의 연구(Wang 등, Cartilage tissue engineering with silk scaffolds and human articular chondrocytes, Biomaterials (2006)), 및 대규모 세포 배양으로부터 귀중한 생물제제(biologics)의 생산(Zeilinger 등, Three-dimensional co-culture of primary human liver cells in bioreactors for in vitro drug studies: effects of the initial cell quality on the long-term maintenance of hepatocyte- specific functions, Altern. Lab Anim. (2002) 30(5): 525-38).
세포 배양 기술은 또한 하기에 사용되어 왔다:
시험관내 수정(Blake 등, Protein supplementation of human IVF culture media, J Assist. Reprod. Genet. (2002) 19(3): 137-43; Bungum 등, Recombinant human albumin as protein source in culture media used for IVF: a prospective randomized study, Reprod. Biomed. Online (2002) 4(3): 233-6),
줄기세포 연구(Conley 등, Derivation, propagation and differentiation of human embryonic stem cells, Int. J Biochem. Cell Biol. (2004) 36(4): 555-67),
백신 생산(Chuang 등, Pharmaceutical strategies utilizing recombinant human serum albumin, Pharm. Res.(2002) 19(5): 569-77; GlaxoSmithKline, Publisher. HAVRIX®(Hepatitis A Vaccine, Inactivated)-Prescribing Information (2005), available at http://us.gsk.com/products/assets/us_havrix.pdf; lnnis 등, Protection against hepatitis A by an inactivated vaccine, JAMA(1994) 271 (17):1328-34;Merck,Publisher. PROQ.UAD®-Measles,Mumps, Rubella, and Varicella (Oka/Merck) Virus Vaccine Live-Prescribing Information(2005), available at http://www.merck.com/product/usa/pi_circulars/p/proquad/proquad_pi.pdf; Litwin, J., The growth of Vera cells in suspension as cell-aggregates in serum-free media, Cytotechnology (1992) 10(2): 169-74),
조직 공학(tissue engineering), 예를 들면 피부(Atala, A., Future perspectives in reconstructive surgery using tissue engineering, Urol. CHn. North Am. (1999) 26(1): 157-65, ix-x; Sher, 등, Targeting perlecan in human keratinocytes reveals novel roles for perlecan in epidermal formation, J Biol. Chem. (2006) 281(8): 5178-87), 기관(organs)(Neronov 등, Integrity of endothelium in cryopreserved human cornea, Cryo Letters (2005) 26(2): 131-6; Han, 등, Interleukin-1 alpha-induced proteolytic activation of metalloproteinase-9 by human skin, Surgery (2005) 138(5): 932-9) 및 유전자 및 세포 치료요법(Chadd, H.E. & Chamow, SM., Therapeutic antibody 발현(expression) technology, Curr. Opin. Biotechnol. (2001) 12(2): 188- 94).
상기 생물제제는 광범위의 세포 생산물을 망라하고 전파를 위해 동물 세포를 필요로 하는 바이러스 또는 특정 단백질을 포함한다. 예를 들면, 모노클로널 항체와 같은 치료적 단백질은 유전공학적으로 생산된 세포를 대규모 배양함에 의해 대 량으로 합성할 수 있다(Dewar 등, Industrial implementation of in vitro production of monoclonal antibodies, liar J (2005) 46(3): 307-13). 그러한 상업적으로 가치있는 생물제제의 수는 지난 십년 동안 급격히 증가하였고 이는 포유동물 세포 배양 기술에 대한 현재의 대폭적 관심을 이끌었다(Mizrahi, A., Biologicals produced from animal cells in culture-an overview, Biotechnol. Adv. (1988) 6(2): 207-20).
세포 배양을 상기 응용 등에 이용하는 주요한 장점은, 클론 세포의 뱃치를 이용하는 것으로부터 얻을 수 있는 결과의 일관성 및 재생성이다. 세포 배양, 특히 대규모의 배양의 필요성은 바이러스 백신의 필요로 명백해졌다. 1940년대 및 1950년대의 폴리오(polio)의 주요 유행은 효과적인 백신의 개발에 대한 많은 노력을 증진하였다. 1949년에는, 폴리오바이러스가 인간 세포의 배양에서 성장시킬수 있다는 것이 밝혀졌고, 이것은 세포 배양을 이용하여 폴리오백신을 대량으로 발달시키는 것에 대한 상당한 관심을 가져왔다(Ligon, B. L., Thomas Huckle Weller MD: Nobel Laureate and research pioneer in poliomyelitis, varicella-zoster virus, cytomegalovirus, rubella, and other infectious diseases, Semin. Pediatr. Infect. Dis. (2002) 13(1): 55-63). 불활성화된 바이러스로부터 생산된 폴리오 백신은 배양된 동물 세포에서의 최초의 상업적 산물들 중의 하나가 되었다(Furesz, J., Developments in the production and quality control of poliovirus vaccines - Historical perspectives, Biologicals (2006)).
세포 배양 배지의 많은 성분들은 동물 원(源)으로부터 얻을 수 있는데, 락토 페린, 트랜스페린 및 혈청 알부민을 포함한다. 이들 성분들은 동물 원으로부터 추출되고, 정제되고, 이어서 다른 무기 성분들과 조합하여 세포 배양 배지를 구성한다(Mizrahi, A. & Lazar, A., Media for cultivation of animal cells: an overview, Cytotechnology (1988) 1 : 199-214). 이런 식으로 생산된 세포 배양 성분들은 바람직하지 않은 특징을 수개 갖는다. 하나는, 정제 기법이 아무리 정확하다 하더라도 외래의 생산물은 상기 성분으로부터 완전히 배제되는 것을 보장할 수가 없다는 것이다. 동물 유래의 성분들은, BSE, HIV 및 헤파티티스 바이러스와 같은 동물 및 인간 기원의 병원체의 오염의 위험을 수반한다(Chamberland 등, Emerging infectious disease issues in blood safety, Emerg. Infect. Dis. (2001) 7(3 Suppl): 552-3; Hepatitis C: A Brief Review, America's Blood Centers (October 1998) vol. 1, issue 3 (Strong, M. ed.), available at http://www.americasblood.org/index.cfm?fuseaction=display.showPage&pagelD=133; Weinberg 등, Legal, financial, and public health consequences of HIV contamination of blood and blood products in the 1980s and 1990s, Ann. Intern. Med. (2002) 136(4): 312-9).
또 하나는, 프리온(prion)과 같은 작은 단백질성 입자가 존재할 수 있으며, 현재의 과학적 증거는 매우 작은 수조차도 질병을 일으킬 수 있다는 것을 시사한다. 최근의 케이스에서, 건강한 대상의 사망이 수혈에 의한 변형 크로이쯔펠트-야콜 병(variant Creutzfeldt-Jakob disease)의 감염일 가능성이 있었다(Llewelyn 등, Possible transmission of variant Creutzfeldt-Jakob disease by blood transfusion, Lancet (2004) 363(9407): 417-21). 이것은 혈액 및 혈액-유래의 생산물의 일관성있는 안전성에 관한 염려를 일으켰다(Bird, S. M., Recipients of blood or blood products "at vCJD risk," BMJ (2004) 328(7432): 118-9). 그러한 안정서 염려 때문에, 규제자들은 백신 생산 및 세포 배양 기법의 다른 응용들에 있어서 동물 성분들을 재조합 단백질로 대체할 것을 권고하였다(Egan, W. M., Bovine-derived products used in the manufacture and formulation of vaccines: current policies and issues for the future (2004), available at http://www.fda.gov/cber/summaries/pda092004we.pdf; European Medicine Agency (EMA), CPMP position statement on Crutzfeldt-Jakob disease and plasma-derived and urine-derived medicinal products (2003), available at http://www.emea.eu.int/pdfs/human/press/pos/287902en.pdf; World Health Organization (WHO), Variant Creutzfeldt-Jakob disease (2002), available at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs180/en/). 또한, 많은 사용자들은 종교적 또는 도덕적 이유로 동물 성분을 함유하는 세포 배양 배지로부터의 제품을 사용하는 것을 망설일 수 있다(Sarkar, S., Use of animal products in vegetarians and others, Anaesthesia (2005) 60(5): 519-20).
그러므로, 동물 원으로부터 유래되지 않은 또는 생산되지 않은, 그러나 세포 배양의 기능적 가치를 유지하고 있는 세포 배양 배지로 삽입하기 위한 성분들을 생산할 필요가 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, 세포 배양에 사용될 경우, 동물-유래의(animal-derived) 성분을 함유하는 배지의 사용에 비해 동일하거나 개선된 세포의 성장 및 생산성을 가져오는, 식물 세포에서 유래된 성분을 함유하는 배지 보충물(supplements) 및 세포 배양 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예는 세포 배양 배지 성분으로서 식물에서 생산된(plant-produced) 하나 이상의 이종 단백질이 있는 세포 배양 배지를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는, 식물 세포 내에서 하나 이상의 이종 단백질을 생산하는 것 및 식물에서 생산된 상기 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지와 배합시키는 것을 포함하는, 강화된 세포 배양 배지의 생산 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는, 식물 세포 내에서 하나 이상의 이종 단백질을 생산하는 것 및 식물에서 생산된 상기 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지와 배합시키는 것을 포함하는 방법으로 생산된 세포 배양 배지를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는, 하나 이상의 단백질(proteinaceous) 세포 배양 배지 성분을 포함하는 세포 배양 배지에 있어서, 식물에서 생산된 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지 성분으로 포함하는 개선점(improvement)을 갖고, 여기서 상기 이종 단백질은 하기 방법에 의해 생산되는 것을 개시한다:
a) 하기를 포함하는 키메라 유전자(chimeric gene)로 식물 세포를 형질전환하는 단계:
(ⅰ) 종자 저장 단백질(seed storage protein)의 유전자로부터의 프로모터(promoter);
(ⅱ) 종자 저장 단백질의 신호 서열을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로(operably) 연결된, 제 1 DNA 서열; 및
(ⅲ) 상기 이종 단백질을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 2 DNA 서열로서, 여기서 상기 제 1 DNA 서열 및 제 2 DNA 서열은 해독 프레임(translation frame)에서 연결되고 함께 상기 저장 단백질 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합(fusion) 단백질을 인코딩하는 것인, 제 2 DNA 서열; 및
b) 상기 이종 단백질을 함유하는 종자를 생산하는 데 충분한 시간 동안 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재배하는 단계. 상기 구체예는 수확된 종자로부터 상기 이종 단백질을 정제하는 것을 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는, 식물에서 생산된 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지 성분으로 갖는 세포 배양 배지의 생산 방법으로서, 상기 방법은:
a) (ⅰ) 종자 저장 단백질의 유전자로부터의 프로모터;
(ⅱ) 종자 저장 단백질의 신호 서열을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 1 DNA 서열; 및
(ⅲ) 상기 이종 단백질을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 2 DNA 서열로서, 여기서 상기 제 1 DNA 서열 및 제 2 DNA 서열은 해독 프레임에서 연결되고 함께 상기 저장 단백질 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 것인, 제 2 DNA 서열;
을 포함하는 키메라 유전자로 식물 세포를 형질전환하는 단계;
b) 상기 이종 단백질을 함유하는 종자를 생산하는 데 충분한 시간 동안 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재배하는 단계;
c) 상기 종자를 상기 식물로부터 수확하는 단계; 및
d) 상기 이종 단백질을 세포 배양 배지와 배합시키는 단계
를 포함하는 것인, 세포 배양 배지의 생산 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 세포 배양 배지 또는 세포 배양 배지를 위한 첨가물(supplement) 내로 삽입될 수 있는 성분을 생산할 수 있는 재조합(recombinant) 식물 세포를 안출하는 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 세포 배양 배지의 성분을 위해 인코딩하는 DNA 세그먼트를 삽입함으로써 식물 세포를 형질전환하는 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 아미노산, 성장 성분, 및 락토페린(lactoferrin) 및 인간 혈청 알부민을 포함하는 기타 세포 배양 단백질과 같은 세포 배양 배지의 성분을 인코딩하는 DNA 세그먼트를 삽입함으로써 벼 세포를 형질전환하는 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 식물로부터 유래된 성분을 사용한 세포 배양 배지를 포함하며, 더욱 바람직하게는 모든 유기 구성요소는 오로지 비동물 원(source)으로부터 유래된다.
본 발명의 다른 측면은, 세포 배양 배지의 생산 방법을 포함하며, 상기 방법은 재조합 식물 세포로부터 유래된 성분을 세포 배양 배지로 삽입하는 것을 포함하다.
본 발명의 다른 측면은, 세포 배양에서 세포 성장 및 생산성을 향상시키기 위하여 식물-유래된(plant-derived) 성분이 첨가된 배지의 사용을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 하나 이상의 배지 구성요소 및 하나 이상의 세포 배양 배지 성분에 대한 첨가물로서 식물 세포에서 유래된 성분을 포함하는 개선된 세포 배양 배지를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 개선된 세포 배양 배지 내의 배양 세포를 배양함으로써 배양 세포의 고 성장율 및 배양 세포의 고 생산성을 달성하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, a) 식물-기반(plant-based) 프로모터 및 세포 배양 배지 성분을 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터(vector)로 형질전환된 식물 세포를 수득하는 단계, b) 상기 형질전환된 식물 세포를 재배하여 종자를 뿌리는 단계, c) 성숙한 종자를 수확하는 단계, d) 상기 종자로부터 세포 배양 성분을 추출하고 정제하는 단계, 및 e) 세포 배양 배지에 상기 성분을 가하는 단계를 포함하는 개선된 세포 배양 배지의 생산 방법을 포함한다.
도 1은 고유 표피성장인자(epidermal growth factor) 서열("고유 유전자(Native Gene)")과 코돈-최적화된(codon-optimized) 표피 성장 인자 서열("Egfactor")의 비교이며, 성숙한 서열에서 53개의 코돈이 정렬되어 보이고, 27개(51%) 코돈 변경 및 30개(19%)의 뉴클레오티드 변경이 있다.
도 2는 3,877 bp 플라스미드, API303(pGt1-EGF v2.1)의 제한지도(restriction map)인데, 이는 표피성장인자(EGF)를 위한 발현카세트를 보여주고, 벼 Gt1 프로모터, Gt1 신호 펩티드, 코돈 최적화 EGF, 노스 종결자(Nos terminator) 및 암피실린 저항 선발표지(selectable marker)를 함유한다.
도 3은 4,142 bp 플라스미드, API270(pGlb-EGF v2.1)의 제한지도인데, 이는 표피성장인자("EGF")를 위한 발현카세트를 보여주고, Glb 프로모터, Glb 신호 펩티드, 코돈 최적화 EGF, 노스 종결자 및 암피실린 저항 선발표지를 함유한다.
도 4는 유전자 도입 벼 종자의 R1 세대에서 재조합 인간 EGF("rhEGF")의 웨스턴 블럿(Western blot) 분석이다. 레인 1은 형질전환되지 않은 타이페이 309(Taipei 309) 벼 변종(Oryza sativa, Japonica) 대조군의 종자로부터의 추출물을 나타낸다. 레인 2 내지 5는 독립 유전자 도입 벼 사건(event)으로부터 수득된 종자 추출물에서 발현되는 rhEGF를 보여준다. 레인 6은 125 ng이 로딩된, 이스트(yeast)에서 발현된 정제 rhEGF 표준을 보여준다. 레인 7은 넓은 범위의 분자량 표지(molecular weight markers)를 보여준다.
도 5는 고유 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 서열("고유 유전자")와 코돈-최적화 인슐린-유사 성장 인자 I 서열("Insgfact")의 비교인데, 성숙한 서열에서 70개의 코돈이 정렬되어 보이고, 40개(57%) 코돈 변경 및 47개(22%)의 뉴클레오티드 변경이 있다.
도 6은 4,194 bp 플라스미드, API271(pGlb-IGF v2.1)의 제한지도인데, 이는 인슐린-유사 성장 인자 I("IGF")을 위한 발현카세트를 보여주고, Glb 프로모터, Glb 신호 펩티드, 코돈 최적화 IGF, 노스 종결자 및 암피실린 저항 선발표지를 함유한다.
도 7은 3,928 bp 플라스미드, API304(pGt1-IFG v2.1)의 제한지도인데, 이는 인슐린-유사 성장 인자 I("IGF")을 위한 발현카세트를 보여주고, 벼 Gt1 프로모터, Gt1 신호 펩티드, 코돈 최적화 IGF, 노스 종결자 및 암피실린 저항 선발표지를 함유한다.
도 8은 유전자 도입 벼 종자의 R1 세대에서 재조합 인간 IGF-I("rhIGF")의 웨스턴 블럿 분석이다. 레인 1은 형질전환되지 않은 벼 변종 타이페이 309 대조군의 종자로부터의 벼 종자 추출물을 나타낸다. 레인 2 내지 8은 7개의 독립 유전자 도입 벼 사건으로부터 수득된 종자 추출물에서 발현되는 rhIGF를 보여준다. 레인 9는 1 ㎍이 로딩된, 이스트에서 발현된 정제 rhIGF 표준을 보여준다. 레인 10은 넓은 범위의 분자량 표지를 보여준다.
도 9는 고유 장내 트레포일 인자 서열("고유 유전자")과 코돈-최적화 장내 트레포일 인자 서열("트레포일")의 비교인데, 성숙한 서열에서 60개의 코돈이 정렬되어 보이고, 26개(43%)의 코돈 변경 및 28개(15%)의 뉴클레오티드 변경이 있다.
도 10은 4,163 bp 플라스미드, API269(pGlb-ITF-nos)의 제한지도인데, 이는 장내 트레포일 인자("ITF")를 위한 발현카세트를 보여주고, Glb 프로모터, Glb 신호 펩티드, 코돈 최적화 ITF, 노스 종결자 및 암피실린 저항 선발표지를 함유한다.
도 11은 3,889 bp 플라스미드, API307(pGt1-ITF-nos)의 제한지도인데, 이는 장내 트레포일 인자(ITF)를 위한 발현카세트를 보여주고, 벼 Gt1 프로모터, Gt1 신 호 펩티드, 코돈 최적화 ITF, 노스 종결자 및 암피실린 저항 선발표지를 함유한다.
도 12는 유전자 도입 벼 종자의 R1 세대에서 재조합 인간 ITF("rhITF")의 웨스턴 블럿 분석이다. 레인 1은 형질전환되지 않은 타이페이 309 벼 변종 대조군의 종자로부터의 추출물을 나타낸다. 레인 2 및 3은 2개의 독립 유전자 도입 벼 사건으로부터 수득된 종자 추출물에서 발현되는 rhITF를 보여준다. 레인 4는 1 ㎍이 로딩된, 이스트에서 발현된 정제 rhITF 표준을 보여준다. 레인 5는 넓은 범위의 분자량 표지를 보여준다.
도 13은 고유 인간 락토페린 서열("고유 lac")와 코돈-최적화 인간 락토페린 서열("cod opt lac")의 비교인데, 693개의 코돈이 정렬되어 보이고, 413개(59.6%)의 코돈 변경 및 467개(22.5%)의 뉴클레오티드 변경이 있다.
도 14는 5,817 bp 플라스미드, API164(GT1-Lac)의 플라스미드 지도인데, 이는 인간 락토페린을 위한 발현카세트를 보여주고, Gt1 프로모터, Gt1 신호 펩티드, 코돈 최적화 인간 락토페린, 노스 종결자 및 카나마이신 저항 선발표지를 함유한다.
도 15는 재조합 인간 락토페린의 발현에 대한 SDS-PAGE 분석의 결과를 보여준다. 벼 종자 추출물로부터의 총 단백질을 래믈리(Laemli) 샘플 완충액에서 부유시켰는데, 그래디언트 겔(gradient gel)에서 흐르고 쿠마시 블루(Coomassie blue)에 염색되었다. 레인 1은 분자량 표지이다. 레인 3 내지 6은 정제된 인간 유래 락토페린(Sigma Chemical사, 미국)이다. 레인 8 내지 13은 동형(homozygous) 독립 유전자 도입 벼 라인으로부터의 단일 종자 추출물이고 레인 14는 형질전환되지 않 은(non-transformed) 벼 변형 타이페이 309로부터의 종자 추출물이다.
도 16은 R2 내지 R10 세대로부터의 유전자도입 벼 낟알에서의 재조합 인간 락토페린의 안정한 발현이다. 1 g의 현미 분말에서 총 가용성 단백질이 40 ml의 추출 완충액으로 추출되었고 원심분리에 의해 정화되었다. 상기 추출물은 ELISA로 분석되었다. 추출을 3회 반복하였고 표준 편차는 에러 바로 나타냈다.
도 17은 P02768(Swiss-Prot)에서 유래된 고유 단백질 서열에 기초하여, Gt1 신호 펩티드(Gt1 SP) 및 코돈-최적화 인간 혈청 알부민(OPTIMIZED HSA) 서열 사이의 융합의 단백질 서열 및 DNA를 보여준다.
도 18은 5,496 bp 플라스미드, API504(GT1-HSA)의 플라스미드 지도인데, 이는 인간 혈청 알부민을 위한 발현카세트를 보여주고, Gt1 프로모터, Gt1 신호 펩티드, 코돈 최적화 인간 혈청 알부민, 노스 종결자 및 카나마이신 저항 선발표지를 함유한다.
도 19는 12,388 bp 플라스미드, API508(JH/GT1-HSA)의 플라스미드 지도인데, 이는 인간 혈청 알부민을 위한 발현카세트를 보여주고, Gt1 프로모터, Gt1 신호 펩티드, 코돈 최적화 인간 혈청 알부민, 노스 종결자 및 카나마이신 저항 선발표지를 함유한다.
도 20은 세포 성장에 대한 3가지 형태의 재조합 인간 락토페린의 효과를 보여준다. 상기 3가지 형태의 락토페린은 asis-락토페린, apo-락토페린 및 holo-락토페린이다. Asis-락토페린은 약 50% 철(iron) 포화된 부분-락토페린(partial- lactoferrin)과 동일하다. 기준선은 기초 배지이고 그 나머지는 그래프에 표시된 바와 같이 다양한 농도의 재조합 인간 락토페린이 첨가된 기준선이다. 세포 성장은 티미딘 삽입(thymidine incorporation)으로 측정되었다.
도 21은 세포 성장에 대한 3가지 형태의 재조합 인간 락토페린의 효과를 보여준다. 상기 3가지 형태의 락토페린은 asis-락토페린, apo-락토페린 및 holo-락토페린이다. Asis-락토페린은 약 50% 철 포화된 부분-락토페린과 동일하다. 기준선은 기초 배지와 5% 우태아혈청(fetal calf serum)의 합이고 그 나머지는 최종 농도 1mg/ml에서 표피성장인자, 5% FCS 또는 재조합 인간 락토페린이 첨가된 기준선이다. 세포 성장은 셀의 수/ml로 측정되었다.
도 22는 벼 낟알에서 발현된 재조합 인간 락토페린(LACROMIN™)이 첨가된 세포 배양 배지가 동물 유래 트랜스페린에 비해 하이브리도마(hybridoma) 세포 성장을 촉진하고 하이브리도마 세포 수를 증가시키다는 것을 보여준다. FBS는 우태혈청(fetal bovine serum)이다. AFM6는 Kansas의 KC Bio사에서 유래된 무혈청 세포 배양 배지이다. AFM6-Fe는 철이 없는 무혈청 배지이다.
도 23은 감소된 혈청(1% FBS)을 함유하는 대조군 배지(CM) 내에서 하이브리도마 AE1 세포의 성장에 대한 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA) 및 혈장-유래된(plasma-derived) 인간 혈청 알부민(pHSA)의 영향을 보여준다.
도 24는 무혈청 배지(SMF) 내에서 하이브리도마 AE1 세포의 성장에 대한 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA) 및 혈장-유래된 인간 혈청 알부민(pHSA)의 영향을 보여준다.
다른 기재가 없을 경우, 여기에 사용된 모든 용어는 하기에 주어진 의미 또는 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 상기 용어가 갖는 동일한 의미와 일반적으로 일치하는 의미를 갖는다. 당업자들은 특히 상기 기술의 정의 및 용어에 관하여 "Sambrook 등 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.", "Ausubel FM 등 (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.", 및 "Gelvin and Schilperoot, eds. (1997) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands"에서 학습할 수 있다.
식물 세포로부터 단백질을 생산하기 위한 일반적이고 상세한 기술은 하기 특허 및 출원에서 알 수 있으며, 이들 각각은 여기에 전체가 인용으로 삽입된다: 미국특허출원공개 제2003/0172403 A1호("Plant 전사(transcription) Factors and Enhanced Gene 발현(expression)"); 미국특허 제6,991,824호("발현(expression) of Human Milk Proteins in Transgenic Plants"); 미국특허출원공개 제2003/0221223호("Human Blood Proteins Expressed in Monocot Seeds"); 미국특허출원공개 제2004-0078851호("Production of Human Growth Factors in Monocot Seeds"); 미국특허출원공개 제2004/0063617호("Method of Making an Anti-infective Composition for Treating Oral Infections"); 및 국제출원번호 PCT/US2004/041083("High-level 발현(expression) of Fusion Polypeptides in Plant Seeds Utilizing Seed-Storage Proteins as Fusion Carriers"). 식물 세포로부터 단백질을 생산하기 위한 기타 일반적이고 상세한 기술은, 예를 들어, 하기 인용문헌에서 알 수 있으며, 이들 각각은 여기에 전체가 인용으로 삽입된다: 미국특허 제5,693,507호, 미국특허 제5,932,479호, 미국특허 제6,642,053호, 및 제6,680,426호(각각의 제목은 "Genetic Engineering of Plant Chloroplasts"임); 미국특허출원공개 제2005/0066384호("Site-Targeted Transformation Using Amplification Vectors"); 미국특허출원공개 제2005/0221323호("Amplification Vectors Based on Trans-Splicing"); 미국특허출원공개 제2006/0026718호("Method of Controlling Cellular Processes in Plants"); 및 미국특허출원공개 제2006/0075524호("Method of Controlling A Cellular Process in a Multi-Cellular Organism"); "Marillonnet 등, Systemic Agrobacterium tumefaciens-med'iated transfection of viral replicons for efficient transient 발현(expression) in plants, Nature Biotech. (2005) 23(6): 718-723".
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있으며, 전령 RNA, 합성(synthetic) RNA 및 DNA, cDNA, 및 게놈(genomic) DNA를 포함한다. 상기 DNA는 이중 가닥(double-stranded) 또는 단일 가닥(single-stranded)일 수 있으며, 단일-가닥인 경우는 코딩 가닥(coding strand) 또는 대응-코딩(anti-sense, 상보성) 가닥일 수 있다.
식물 세포에 관한 "안정적으로 형질전환된(stably transformed)"이라는 용어는 상기 식물 세포가 이것의 게놈에 통합된 비정상적(이종(non-native)) 핵산 서열 을 가지며 이것이 2 이상의 세대에 걸쳐 유지되는 것을 의미한다.
"숙주 세포(host cell)"는 벡터(vector)를 함유하고 상기 이종 핵산 서열의 복제 및/또는 전사 및/또는 발현을 지원하는 세포를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 상기 숙주 세포는 식물 세포이다. DNA를 원하는 식물 숙주 세포로 이동시키기 위하여 박테리아 세포, 이스트 세포, 곤충 세포, 양서류 세포 또는 동물 세포를 포함하는 제 2 숙주로서 기타 숙주 세포가 사용될 수 있다.
"식물 세포"는 식물에서 유래된 임의의 세포를 지칭하며, 분화되지 않은 조직(예컨대, 유합조직(callus))뿐만 아니라 식물 종자, 꽃가루, 번식체(propagules), 배(embryos), 진탕 배양(suspension cultures), 분열 부위(meristematic regions), 잎, 뿌리, 발아체(shoots), 배우체(gametophytes), 포자체(sporophytes) 및 소포자(microspores)를 포함한다.
"성숙한 식물(mature plant)"이라는 용어는 완전히 분화된 식물을 지칭한다.
"종자 생성물(seed product)"이라는 용어는, 껍질 제거된(de-hulled) 온전한 종자, 분말(밀링에 의해 껍질이 제거되고 빻아서 분말이 된 종자), 종자 추출물, 바람직하게는 단백질 추출물(여기서 분말의 단백질 단편은 탄수화물 단편에서 분리됨), 맥아(맥아 추출물 또는 맥아 시럽을 포함) 및/또는 유전자 도입된 낟알에서 유래된 정제 단백질 단편과 같은 종자 단편을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
"생물학적 활성(biological activity)"라는 용어는 본 기술의 숙련자에 의해 그 단백질에 전형적으로 있다고 생각되는 임의의 생물학적 활성을 지칭한다.
"단자엽 종자 성분"은 단자엽 종자, 전형적으로는 성숙한 단자엽 종자로부터 추출 가능한 탄수화물, 단백질, 및 지질 성분을 지칭한다.
"종자 성숙(Seed maturation)"은, 신진대사 가능한 잔류물, 예컨대, 당, 올리고당, 녹말, 페놀산, 아미노산, 및 단백질이, 액포타겟팅(vacuole targeting)과 함께 및 없이, 종자(낟알) 내의 다양한 조직, 예컨대, 배젖(endosperm), 종피(testa), 호분층(aleurone layer), 및 스쿠텔라 상피(scutellar epithelium)로 축적되는(deposited) 수정(fertilization)과 함께 시작되고, 낟알 확대(grain enlargement), 낟알 충진(grain filling)에 이르며, 낟알 건조(grain desiccation)로 종료되는 기간을 지칭한다.
"성숙-특이적 단백질 프로모터(Maturation-specific protein promoter)"는 종자 성숙 동안에 실질적으로 상향조정된(up-regulated) 활성을 나타내는 프로모터를 지칭한다.
"성장 인자"라는 용어는, 표피 성장 인자(EGF), KGF-1 및 KGF-2를 포함하는 케라티노사이트 성장 인자(KGF), IGF-I 및 IGF-II를 포함하는 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 장내 트레포일 인자(ITF), TGF-α 및 -β1-3을 포함하는 전환 성장 인자(TGF), 과립구 콜로니-자극 인자(GCSF), NGF-β를 포함하는 신경 성장 인자(NGF), 및 FGF-1-19 및 -12β를 포함하는 섬유아세포 성장 인자(FGF)와, 이들 단백질의 생물학적 활성 단편을 제한 없이, 포함하는, 단백질의 생물학적 활성 단편 또는, 단백질을 지칭한다. 이들의 서열 및 기타 성장 인자는 본 기술의 통상의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
"이종 DNA(Heterologous DNA)"는 다른 원(source)의 식물 세포로 도입된 DNA, 또는 동일한 식물 원을 포함하는 식물 원에서 왔으나, 일반적으로 이종 DNA의 발현을 규제하지(regulate) 않는 프로모터의 제어(control) 하에 있는 DNA를 지칭한다.
"이종 단백질"이란 이종 DNA에 의해 인코딩된 단백질이다. 상기 단백질은 성장 인자(들), 락토페린(lactoferrin), 트랜스페린(transferrin), 알부민(albumin), 인슐린, 및 이들의 단편(fractions), 성장 호르몬 및 이들의 단편, 피브로넥틴(Fibronectin)-(인간)-부착물 인자, 라민(마우스)-부착물 인자, 콜라게나제(collagenase), 혈소판 유래된(platelet derived) 성장 인자, 인간 뇌-유래된 신경영양인자(BDNF), 아교세포-유래된(glial-derived) 신경영양인자(GDNF), 흉선(thymic) 인자, 햅토코린(haptocorin), 락타헤드린(lactahedrin), 락토페록시다제(lactoperoxidase), 알파-페토프로테인(Alpha-fetoprotein), 면역글로빈(immunoglobin), 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
주어진 세포, 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 형질(trait) 또는 표현형(phenotype)에 대하여, 여기에 사용된, "고유의(native)" 또는 "야생형(wild-type)"이라는 용어는 자연에서 전형적으로 발견되는 형태를 지칭한다.
여기에 사용된, "정제(purifying)"라는 용어는 "분리(isolating)"라는 용어와 호환하여 사용될 수 있으며 일반적으로 어떤 성분이 발견되거나 생산된 환경의 기타 성분으로부터의 특정 성분의 임의 분리를 지칭한다. 예를 들어, 단백질이 생산된 식물 세포로부터 재조합 단백질을 정제하는 것은 일반적으로 유전자도입 단백 질-함유 식물 재료가 침전, 원심분리, 여과, 및 크로마토그래피와 같은 분리 기술로 분리되는 것을 의미한다. 임의의 이러한 정제 또는 분리 단계(들)의 결과물은 대상 성분이 농축되는 동안 기타 성분을 여전히 함유할 수 있다.
숙주 세포에 대하여, 여기에 사용된, "형질전환된(transformed)" 또는 "유전자도입된(transgenic)"이라는 용어는 상기 숙주 세포가 고유의 숙주 세포에 없는 비정상 또는 이종 또는 도입된 핵산 서열을 함유하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 본문에서 "안정하게 형질전환된(stably transformed)"은 상기도입된 핵산 서열이 숙주의 2 세대 이상 동안 유지되는 것을 의미하며, 이는 바람직하게는 (필수는 아니지만) 도입된 서열이 숙주 게놈에 통합되기 때문이다.
"세포 배양 배지"는 완전 배지(complete media), 기초 배지(basal media), 또는 세포 배양 배지 성분이 첨가된 기초 배지, 세포 배양 배지 첨가물, 또는 다양한 양의 혈청이 있는 배지 또는 화학적으로 정의된 배지(chemically defined media)를 포함하는 세포 배양 목적을 위한 배지를 지칭한다.
"세포 배양 배지 성분"은 세포 배양 배지로의 첨가물로 사용되기 위한 임의의 이종 단백질을 지칭한다.
"세포 배양 배지 구성요소"는 세포 배양 배지 성분, 단백질, 펩티드, 호르몬, 탄수화물, 아미노산, 지질, 비타민, 항생물질(antibiotics), 유기염 및 무기염을 포함한다.
"세포 배양 배지 첨가물(supplement)"은 세포 배양 배지에 보충하기 위한, 기타 구성요소가 있거나 없는, 하나 이상의 복합 세포 배양 배지 성분의 조합을 지 칭한다.
배양 중의 세포 대부분은 적절한 배지를 사용하여 37℃ 및 pH 7.4에서 가장 잘 성장한다. 일반적으로, 세포 배양 배지는 pH, 비타민 및 호르몬을 유지하기 위해 탄수화물, 아미노산, 다양한 염, 중탄산염을 함유하고, pH 지시약으로서 페놀레드를 함유한다. 구성될 수 있는 세포 배양 배지의 예는 다음과 같다: Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DME), Ham's Nutrient 용액, MCDB 배지, Minimum Essential 배지 Eagle, RPMI 배지, Ames' 배지, BGJb 배지(Fitton-Jackson Modification), Click's 배지, CMRL-1066 배지, Fischer's 배지, Glascow Minimum Essential 배지(GMEM), Iscove's Modified Dulbecco's 배지(IMDM), L-15 배지(Leibovitz), McCoy's 5A Modified 배지, NCTC 배지, Swim's S-77 배지, Waymouth 배지, 및 William's 배지 E.
종종, 세포 배양 배지는 5 내지 10% 농도의 혈청이 보충된다. 혈청은 세포 성장을 위한 불확정된 필수 물질을 함유하는 복합 혼합물이다. 일반적으로 사용되는 혈청은 우태아혈청(fetal calf serum (FCS))이다. 복합 혼합물의 특성, 항상성의 결여 및 병원균 오염(pathogen contamination)의 잠재적 위험 때문에, 세포 배양 기업 및 취체 기관(regulatory agencies)에서는 세포 배양 배지에 혈청을 보충하는 것에 대한 대안을 찾고 있다.
기초 배지에서는 세포가 잘 자라지 않기 때문에, 기초 배지에는 따라서 다양한 성장 인자, 호르몬, 및 기타 필수 성분이 첨가되어, 혈청-기반(serum-based) 배지와 동일한 세포 성장율을 유지하는 무혈청 배지를 생성한다. 인간 트랜스페린 또 는 소(bovine) 트랜스페린이 철의 원으로서 가해진다. 일반적으로, 무혈청 배지는 인슐린, 혈청 알부민, 트랜스페린, 인슐린-유사 성장 인자 및 표피 성장 인자를 포함한다. 락토페린과 같은 기타 단백질 또한 세포 성장을 촉진할 수 있는 것으로 나타났다. 각각의 성분은 세포 성장에 별개의 기능을 제공한다. 상기 기술에서, 이들 단백질 성분은 동물-유래된 것이다. 동물 원 재료로부터의 잠재적인 병원균 오염에 대한 우려가 증가함에 따라, 세포 배양 기업들은 동물성분이 없는(animal-component-free) 배지를 개발하기 위한 시도를 하고 있다. 식물-기반 가수분해물 또는 미생물 시스템으로 생산된 재조합 단백질의 사용에 의해 몇몇 성공이 이루어졌지만, 식물-기반 가수분해물은 불확정한 성분의 혼합물이고 미생물 원에서의 재조합 단백질은 지나치게 고가여서 통상의 세포 배양에 사용할 수 없다. 세포 배양 산업을 위해 비-동물-유래된(non-animal-derived) 성분의 대안적인 원이 시급하게 요구된다.
다음 절에 기술될 방법에 의해 생산된 세포 배양 배지 성분은 전체적으로 식물-기반이며 NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, 및 MgCl2와 같은 무기 염 및 아미노산, 비타민, 성장 인자, 당, 및 항생물질과 같은 기타 구성요소와 결합되어 여러 가지 다른 세포 배양 배지를 형성한다.
본 발명에 사용되기 위한 발현 벡터(expression vectors)는 결합된 업스트림 및 다운스트림 서열이 있는 키메라(chimeric) 핵산 구조(또는 발현 벡터 또는 카세트)이며, 식물에서의 작용을 위해 디자인되었다.
일반적으로, 본 발명의 실행에 사용되기 위한 발현 벡터는 키메라 유전자를 이루는, 하기의 작동적으로 연결된 요소이다: 식물 단백질을 인코딩하는 유전자로부터 유래된 프로모터로서, 이종 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동적으로 연결된 것. 상기 벡터는, 성숙-특이적 단자엽 식물 저장 단백질의 유전자로부터의 프로모터, 제 1 DNA 서열로서, 상기 프로모터에 작동적으로 연결되고, 결합된 폴리펩티드를, 바람직하게는 단백질 저장체(protein storage body)와 같은 배젖-세포 기관(endosperm-cell organelle)인, 배젖 세포로 타겟팅할 수 있는 (N-터미널 리더 서열 도는 C-터미널 트레일러 서열과 같은) 단자엽 식물 종자-종 신호 서열를 인코딩하는 것, 및 제 2 DNA 서열로서, 상기 제 1 DNA 서열과 해독 프레임(translation frame)에서 연결되고, 세포 배양 배지 성분을 인코딩하는 것을 포함할 수 있다. 상기 신호 서열은 상기 식물 세포 내의 세포 배양 배지 성분으로부터 분리되는(cleaved) 것이 바람직하다.
상기 키메라 유전자는, 이번에는, (i) 벡터가 DNA를 박테리아에서 소망하는 식물 숙주로 이동시키도록 하기 위해 상기 벡터에 필수 특성을 제공하며 플라스미드 또는 바이러스 기원인 상기 키메라 유전자의 업스트림 및/또는 다운스트림 컴퍼니온(companion) 서열; (ⅱ) 선발표지(selectable marker) 서열; 및 (ⅲ) 일반적으로 전사 개시 조절 영역(transcription initiation regulatory region)으로부터 벡터의 말단 반대편에 있는 전사 종료 영역을 가지는 적절한 식물-형질전환 벡터에 일반적으로 위치한다.
본 기술분야에서 수많은 타입의 적절한 발현 벡터, 및 적합한 조절 서열이 다양한 식물 숙주 세포에 대하여 알려져 있다. 상기 프로모터 영역은 종자-성숙 조건 하에서의 유도를 가능하게 하는 방식으로 조절되도록 선택된다. 본 발명의 이러한 구체예의 일 측면에서, 상기 발현 구조는 종자 성숙 중에 특히 상향조정된 활성을 나타내는 프로모터를 포함한다. 본 발명에 사용되기 위한 프로모터는 일반적으로 벼, 보리, 밀, 귀리, 호밀, 옥수수, 기장, 라이밀(triticale), 또는 수수와 같은 곡물에서 유래된다. 이러한 프로모터의 예는 하기 성숙-특이적 단자엽 식물 저장 단백질 중 하나와 관련된 성숙-특이적 프로모터 영역을 포함한다: 벼 글루텔린(glutelins), 오리진(oryzins), 및 프롤라민(prolamines), 보리 홀데인(hordeins), 밀 글리아딘(gliadins) 및 글루텔린, 옥수수 제인(zeins) 및 글루텔린, 귀리 글루텔린, 및 사탕수수 카피린(kafirins), 기장 페니세틴(pennisetins), 및 호밀 시칼린(secalins).
본 발명의 일 구체예는 세포 배양 배지의 성분인 이종 분자의 고-레벨 발현을 포함한다. 이러한 성분은 식물 세포 내에서, 유전자를 인코딩하는 내생(endogenous) 식물 단백질과 작동적으로 연결된 소망하는 성분을 인코딩하는 유전자(들)를 포함하는 키메라 유전자에 의해 발현될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 유전자를 인코딩하는 내생 식물은 벼 성숙 종자 발현 시스템 내에서의 발현을 위한 벼 종자 저장 단백질 유전자이다.
발현된 폴리펩티드는, 하나의 도메인(domain)이 이종 또는 외생(exogenous) 세포 배양 성분이고 다른 것이 내생 식물 단백질인 다중-도메인 폴리펩티드일 수 있다. 하나 이상의 선택 정제 태그(tag) 및/또는 하나 이상의 특정 프로테아 제(protease) 분열 사이트는 단자엽 종자 저장 단백질 운반체로부터의 세포 배양 배지 성분의 최후 릴리스(release)를 위해 제공될 수 있다. 예를 들어, 화학 분열 사이트를 제공하는 전략적(strategic) 메티오닌 또는 트립토판 잔류물은 내생 식물 단백질로부터의 세포 배양 성분의 릴리스를 위한 도메인들 사이의 프레임에서 설계될 수 있다. 이러한 기술은 단백질 부분을 갖거나 단백질, 예컨대 락토페린, 인간 혈청 알부민, 및 인간 성장 인자인 세포 배양 배지 성분을 위해 유용하다.
다른 선택적 프로테아제 분열 사이트는 엔테로키나제(enterokinase(ek)), 인자 Xa(Factor Xa), 트롬빈(thrombin), V8 프로테아제(V8 protease), GENENASE™(서브틸리신 BPN'의 변형), α-라이틱 프로테아제(α-lytic protease) 또는 담배식각(tobacco etch) 바이러스 프로테아제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대안적으로, 융합 단백질의 분열은 브롬화 시아노겐 또는 N-클로로숙신이미드(N-chlorosuccinimide)와 같은 화학적 분열제를 통해 수행될 수 있다.
본 발명은, 숙주 단자엽 식물 종자에서 재조합적으로 생산된 세포 배양 배지 성분을 제공하며 여기서 상기 발현된 세포 배양 배지 성분은 상기 단자엽 종자 내에 총 가용성 단백질의 약 3% 이상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 생산의 목표가 된 상기 세포 배양 배지 성분을 포함하는 총 가용성 단백질의 수율은 재조합적으로 설계된 생산 식물 종자 내에서 발견된 총 가용성 단백질의 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 25%, 및 약 25% 내지 약 30%일 수 있다. 추가적으로, 예를 들어, 생산의 목표가 된 상기 세포 배양 배지 성분을 포함하는 총 가용성 단백질의 수율은 약 3% 이상, 약 5% 이 상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 및 약 25% 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 식물에서 생산된(plant-produced) 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지 성분으로서 포함하는 세포 배양 배지이다. 몇몇 구체예에서, 상기 식물은 단자엽 식물로서, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 기장, 라이밀, 또는 수수, 바람직하게는 벼와 같은 것이다. 상기 이종 단백질은 식물 단백질 또는 비-식물 단백질이며, 바람직하게는 인간으로서, 성장 인자, 락토페린(lactoferrin), 트랜스페린(transferrin), 혈청 알부민(serum albumin), 인슐린, 성장 호르몬, 및 이들의 단편, 피브로넥틴(fibronectin) 부착 인자, 라민(lamin) 부착 인자, 콜라게나제(collagenase), 혈소판 유래된(platelet derived) 성장 인자, 뇌-유래된(brain-derived) 신경영양 인자, 아교세포-유래된(glial-derived) 신경영양 인자, 흉선 인자(thymic factors), 햅토코린(haptocorin), 락타헤드린(lactahedrin), 락토페록시다아제(lactoperoxidase), 알파-페토프로테인(alpha-fetoprotein), 면역글로빈(immunoglobin), 및 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin)으로 이루어진 군에서, 몇몇 구체예에서, 선택될 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 상기 성장 인자는 표피 성장 인자, 케라티노사이트(keratinocyte) 성장 인자, 인슐린-유사(insulin-like) 성장 인자, 장내 트레포일(intestinal trefoil) 인자, 변환(transforming) 성장 인자, 과립구 콜로니-자극(granulocyte colony-stimulating) 인자, 신경(nerve) 성장 인자, 섬유아세포(fibroblast) 성장 인자, 또는 이들의 생물학적 활성 단편이다.
몇몇 구체예에서, 상기 세포 배양 배지는 감소된 혈청 배지 또는 무혈청 배 지이다. 다른 구체예에서, 상기 세포 배양 배지는 완전 배지, 기초 배지, 또는 세포 배양 배지 성분이 첨가된 기초 배지로서 개시된다.
본 발명의 다른 구체예는 세포 배양 배지의 생산 방법으로서, 식물 세포에서 하나 이상의 이종 단백질을 생산하는 것 및 식물에서 생산된 상기 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지와 배합시키는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 식물 세포에서 하나 이상의 이종 단백질을 생산하는 것 및 식물에서 생산된 상기 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지와 배합시키는 것을 포함하는 방법으로 생산된 세포 배양 배지이다.
본 발명의 다른 구체예는 하나 이상의 단백질(proteinaceous) 세포 배양 배지 성분을 갖는 세포 배양 배지에 있어서, 식물에서 생산된 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지 성분으로 포함하는 개선점을 갖고, 여기서 상기 이종 단백질은 하기 단계를 포함한다:
a) 하기를 포함하는 키메라 유전자로 식물 세포를 형질전환하는 단계:
(ⅰ) 종자 저장 단백질의 유전자로부터의 프로모터;
(ⅱ) 종자 저장 단백질의 신호 서열을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 1 DNA 서열; 및
(ⅲ) 상기 이종 단백질을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 2 DNA 서열로서, 여기서 상기 제 1 DNA 서열 및 제 2 DNA 서열은 해독 프레임에서 연결되고 함께 상기 저장 단백질 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 것인, 제 2 DNA 서열; 및
b) 상기 이종 단백질을 함유하는 종자를 생산하는 데 충분한 시간 동안 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재배하는 단계. 몇몇 구체예에서, 상기 이종 단백질은 수확된 종자로부터 정제된다. 몇몇 구체예에서, 상기 이종 단백질은 상기 수확된 종자 내에서 총 가용성 단백질의 적어도 약 3.0%를 구성한다.
본 발명의 다른 구체예는 식물에서 생산된 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지 성분으로 갖는 세포 배양 배지의 생산 방법으로서, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) (ⅰ) 종자 저장 단백질의 유전자로부터의 프로모터;
(ⅱ) 종자 저장 단백질의 신호 서열을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 1 DNA 서열; 및
(ⅲ) 상기 이종 단백질을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 2 DNA 서열로서, 여기서 상기 제 1 DNA 서열 및 제 2 DNA 서열은 해독 프레임에서 연결되고 함께 상기 저장 단백질 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 것인, 제 2 DNA 서열;
을 포함하는 키메라 유전자로써 식물 세포를 형질전환하는 단계;
b) 상기 이종 단백질을 함유하는 종자를 생산하는 데 충분한 시간 동안 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재배하는 단계;
c) 상기 종자를 상기 식물로부터 수확하는 단계; 및
d) 상기 이종 단백질을 세포 배양 배지와 배합시키는 단계.
본 발명의 다른 구체예는 소망하는 세포 배양 배지 성분을 발현할 수 있는 단자엽 종자, 바람직하게는 벼 낟알의 생산 방법으로서, 하기를 포함한다:
a) 하기를 포함하는 키메라 유전자로써 단자엽 식물 세포를 형질전환하는 단계:
(i) 단자엽 종자 저장 단백질의 유전자로부터의 프로모터;
(ii) 단자엽 종자 저장 단백질을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 1 DNA 서열; 및
(iii) 세포 배양 배지 성분을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 2 DNA 서열로서, 여기서 상기 제 1 DNA 서열 및 제 2 DNA 서열은 해독 프레임에서 연결되고 함께 상기 저장 단백질 및 상기 세포 배양 배지 성분을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 것인, 제 2 DNA 서열;
b) 상기 세포 배양 배지 성분을 함유하는 종자를 생산하는 데 충분한 시간 동안 상기 형질전환된 단자엽 식물 세포로부터 단자엽 식물을 재배하는 단계;
c) 상기 단자엽 식물로부터 종자를 수확하는 단계.
본 발명의 다른 구체예는 단자엽 종자 저장 단백질을 융합 단백질 운반체로써 사용하는 방법으로서, 상기 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 키메라 유전자를 포함한다:
(i) 단자엽 종자 저장 단백질의 유전자로부터의 프로모터;
(ii) 단자엽 종자 저장 단백질을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 1 DNA 서열; 및
(iii) 세포 배양 배지 성분을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 결합된, 제 2 DNA 서열;
여기서 상기 제 1 DNA 서열 및 제 2 DNA 서열은 해독 프레임에서 연결되고 함께 상기 저장 단백질 및 상기 세포 배양 배지 성분을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다.
상기 단자엽 종자 저장 단백질은 상기 융합 단백질 내의 세포 배양 배지 성분의 N-터미널 또는 C-터미널 쪽(side)에 있을 수 있다. 상기 단자엽 종자 저장 단백질은 상기 세포 배양 배지 성분의 N-터미널 쪽에 존재하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 기장, 라이밀, 또는 수수를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 단자엽 식물은 벼이다.
모든 간행물, 특허 및 특허출원은, 각각 개별적인 간행물, 특허 및 특허출원이 그 전체로서 인용에 의해 삽입되기 위하여 명확하고 개별적으로 나타난 경우와 동일한 정도로, 여기에 명백히 그 전체가 인용으로 삽입된다.
하기에 실시예가 설명되나 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1 : 재조합 인간 성장 인자의 발현
일반적으로, 하기에 추가로 기술된 바와 같이, 발현 벡터는 표준 분자생물학적 기술을 사용하여 구성된다. 상기 벡터는 벼 조직-특이적 프로모터의 제어 하에 특정한 성장 인자에 대한 이종 단백질 코딩 서열을 포함한다.
상기 프로모터의 뉴클레오티드 서열 및 벼 글루텔린-1(Gt1) 유전자의 신호 펩티드의 뉴클레오티드 서열을 공개된 Gt1 유전자 서열에 기초하여 복제했다. 상기 프로모터의 뉴클레오티드 서열 및 벼 글로불린-1(GIb) 유전자의 신호 펩티드의 뉴클레오티드 서열을 공개된 GIb 유전자 서열에 기초하여 복제했다.
A. 인간 EGF 발현 벡터의 발생
인간 EGF 유전자를 도 1에 나타난 바와 같이 코돈 최적화했고, Operon Technologies사(CA, USA)에서 합성했다(SEQ ID NO: 1). 벼 종자 내에서 EGF의 발현을 위해, 상기 코돈 최적화 유전자를 pAPI303에서 벼 배젖 종 글루텔린(Gt1) 프로모터, Gt1 신호 펩티드 및 노스 종결자에 작동적으로 연결시켰고(도 2), pAPI270에서 벼 배젖 종 글로불린(GIb) 프로모터, GIb 신호 펩티드 및 노스 종결자에 작동 적으로 연결시켰다(도 3). 도 4에 나타나고 여기에 예시된 바와 같이, EGF를 발현하는 유전자 도입 식물이 발생되었고, 식물에서 발생된(plant-generated) 재조합 EGF가 검출됐다.
B. 인간 IGF -I 발현 벡터의 발생
IGF-I 유전자를 도 5에 나타난 바와 같이 코돈 최적화하고, Operon Technologies사(CA, USA)에서 합성했다(SEQ ID NO: 3). 벼 종자 내에서 IGF-I의 발현을 위해, 상기 코돈 최적화 유전자를 pAPI304에서 벼 배젖 종 글루텔린(Gt1) 프로모터, Gt1 신호 펩티드 및 노스 종결자에 작동적으로 연결시켰고(도 7), pAPI271에서 벼 배젖 종 글로불린(GIb) 프로모터, GIb 신호 펩티드 및 노스 종결자에 작동 가능하게 결합시켰다(도 6). 도 8에 나타나고 여기에 예시된 바와 같이, IGF-I를 발현하는 유전자 도입 식물이 발생되었고, 식물에서 발생된 재조합 IGF-I가 검출됐다.
C. 인간 ITF 의 발생
ITF 유전자를 도 9에 나타난 바와 같이 코돈 최적화하고, Operon Technologies사(CA, USA)에서 합성했다(SEQ ID NO: 5). 벼 종자 내에서 ITF의 발현을 위해, 상기 코돈 최적화 유전자를 pAPI307에서 벼 배젖 종 글루텔린(Gt1) 프로모터, Gt1 신호 펩티드 및 노스 종결자에 작동적으로 연결시켰고(도 11), pAPI269에서 벼 배젖 종 글로불린(GIb) 프로모터, GIb 신호 펩티드 및 노스 종결자에 작동 적으로 연결시켰다(도 10). 도 12에 나타나고 여기에 예시된 바와 같이, ITF를 발현하는 유전자 도입 식물이 발생되었고, 식물에서 발생된 재조합 ITF가 검출됐다.
D. 모든 성장 인자에 대한 웨스턴 블럿 분석
형질전환되지 않은(벼 변종 Taipei 309) 벼 종자 및 유전자도입 벼 종자(EGF, IGF-I 또는 ITF 중 하나를 발현하는 각각의 유전자도입 식물로부터 ~10 풀 링된(pooled) R1 종자) 모두를 pH 7.4, 인산염 완충된 염수(PBS) 내의 1 ml의 0.35 M NaCl에서, 얼음-냉각 막자사발 및 막자를 사용하여 빻았다. 상기 만들어진 추출물을 14,000 rpm, 40℃에서 10분간 원심분리했다. 맑아진 상청액(supernatant)을 수집하고 약 20 ㎍의 이 가용성 단백질 추출물을 샘플 로딩 완충액(sample loading buffer)에서 다시 부유시키고(re-suspended), 미리-캐스팅한(pre-cast) 10-20% 폴리아크릴아미드 트리신(tricine) 겔(Novex) 상에 놓고 SDS-PAGE를 실시했다. 정기이동 후에, 상기 겔을 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오스 막에 블로팅했다(blotted). 상기 막을 pH 7.4 PBS 내에 5% 무지방(non-fat) 분말 우유와 함께 2 시간 동안 블로킹한 후 각각 10분 동안 PBS로 3회 세척했다. EGF(Sigma), IGF-I(Sigma) 또는 ITF(GI Company)에 대하여 생산된 일차 래빗 다클론성 항체(primary rabbit polyclonal antibody)를 PBS 내의 1:2000 희석액에서 사용했다. BCIP/NBT 기판 시스템(Sigma)에 연결된 고트 안티-래빗 항체(goat anti-rabbit antibody)를 사용하여 밴드를 전개했다. 결과는 도 4, 8 및 12에 각각 나타난다.
실시예 2: 재조합 인간 락토페린의 발현
A. 유전자도입 벼 내의 인간 락토페린 발현을 위한 발현 벡터
인간 유선 락토페린의 완전한 뉴클레오티드 서열을 Operon Technologies사(CA, USA)에서 코돈 최적화하고 합성했다. 최적의 발현 레벨을 얻기 위해 벼 종자 단백질의 해독에 가장 자주 사용되는 코돈으로 인간 밀크 락토페린 유전자(유전자은행 기탁 번호: HSU07642)를 재합성했다(도 13). 변경된 코돈 수가 총 서열의 22.46%였지만, 아미노산 조성은 고유 인간 락토페린과 동일하게 남는다. 코돈-최적화 유전자를 함유하는 플라스미드를 Lac-ger라고 부른다. Lac-ger를 Smal/Xhol로 절단시키고 락토페린 유전자를 함유하는 단편을, Nael로 부분적으로 절단되고 Xhol로 완전히 절단된 pAPI141 내로 복제했다. 벼 종자 내의 hLF의 발현을 위해, 코돈-최적화 유전자를 벼 배젖-특이적 글루텔린(Gt1) 프로모터 및 노스 종결자로 작동적으로 연결했다. 결과적인 플라스미드를 pAPI164에 나타냈다(도 14).
B. 생산 시스템
벼 변종 Taipei 309(Oryza sativa, Japonica)를 재조합 인간 락토페린(rhLF)을 위한 생산 시스템으로 선발하고, 플라스미드 pAPI164가 있는 배발생 벼 캘리(embryogenic rice calli)의 입자충격주입법(particle bombardment)에 의해, 선발표지로서 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hygromycin phosphotransferase) 유전자를 함유하는 짝 표지 플라스미드(companion marker plasmid)를 사용하여 유전자도입 벼 사건을 발생시켰다. 이 절차에 의해 완전히 전개된, 수정한 벼 식물을 수득했다.
C. 벼 낟알에서 재조합 인간 락토페린의 고 레벨 단백질 발현
재조합 인간 락토페린의 발현이 종자 성숙-특이적 프로모터 Gt1의 조절 하에서 있었다. 재조합 인간 락토페린의 고 레벨 발현은 독립적인 유전자도입 벼 사건을 스크린한 도 15에서 명백하다. 성숙한 벼 종자 추출물로부터의 총 가용성 단백질을 Laemli 겔 상에 흘리고 상기 단백질을 볼 수 있도록 쿠마시 블루로 물들였다. 물든 겔로 나타나는 것처럼 모든 유전자도입 라인에서 ~80kD 재조합 락토페린 단백 질을 얻었다. 재조합 인간 락토페린의 발현 레벨은 종자 중량의 0.5%에 상응한다. 재조합 인간 락토페린의 안정적인 발현이 10 세대에 대하여 모니터링되었다. 발현 레벨은 현미 종자 중량의 약 0.5%에서 유지됐다(도 16).
실시예 3: 벼 낟알 내에서 재조합 인간 혈청 알부민의 발현
다양한 데이터베이스로부터 인간 혈청 알부민(HSA)의 단백질 서열을 비교했다. 벼 낟알 내에서 인간 혈청 알부민의 적합한 발현을 위한 유전자 코돈-최적화를 위한 기준으로서 기탁 번호 P02768(Swiss-Prot)로 표현되는 컨센서스(consensus) 서열을 사용했다(도 17). Blue Heron(Seattle, WA)에 이해 유전자 합성을 수행했고 상기 합성 단편을 pUC 기반 벡터에 삽입하여 pUC-HSA를 만들어냈다. 정확한 DNA 및 단백질 서열을 확인한 후, pUC-HSA를 Mlyl 및 Xhol로 절단했다. 코돈-최적화 HSA 유전자를 함유하는 상기 단편을, Nael 및 Xhol로 미리 절단된, pAPI405에 삽입했다. 플라스미드 API405는 Gt1 프로모터, Gt1 신호 서열 및 노스 종결자를 포함하는 pAPI141의 유도체였다.
Mlyl/Xhol 단편을 pAPI405에 삽입하여 pAPI504를 만들었다(도 18). 그리고 나서 플라스미드 API504를 Hindlll 및 EcoRI로 분열시켰다. 전체 발현 카세트, Gt1 프로모터, Gt1 신호 서열, 코돈-최적화 HSA 유전자 및 노스 종결자를 함유하는 상기 Hindlll/EcoRI 단편을 pAPI508(도 19)을 만든 동일한 효소로 미리 절단된(predigested) pJH2600으로 복제했다. 플라스미드 JH2600은 E 콜리(E coli)와 아그로박테리아(Agrobacterium) 사이의 셔틀벡터였다. DNA 서열을 확인한 후, 벼 형 질전환을 위해 pAPI508을 아그로박테리아 AGL-1로 이동시켰다. 상기 기술된 절차에 따라 충격-기반(bombardment-based) 형질전환을 통해서도 플라스미드 API504가 사용되었다. 형질전환이 되면, 유전자도입 식물이 발생되고, 유전자도입 R0 식물이 성장하여 성숙하여 R1 종자를 맺게 하는 온실로 이들을 옮긴다.
벼 종자에서 HSA의 발현을 모니터링하기 위해, 10 mL의 추출 완충액(50 mM Tris-HCl pH 8.0. 150 mM NaCl)을 사용하여 각각의 R0 식물에서 10개의 R1 종자를 추출하였다. 상청액을 모아서 벼 추출물로부터의 발현 레벨을 ELISA(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)로 모니터링하였다. 결과는 벼 유전자도입 종자에서의 HSA 발현 레벨이 브라운플라워(brown flour) 중량의 0.01 내지 0.85% 범위(0.1 내지 8.5 g/kg 플라워)인 것으로 나타났다. 가장 높은 발현 레벨을 보인 8개의 사건 결과를 하기 표(표 1)에 나타낸다.
표 1. 상위 8개 사건에서 재조합 HSA 발현 레벨
라인 번호 발현 레벨 (g/kg 플라워)
508-3 5.5
508-17 8.0
508-71 8.7
508-73 4.0
508-77 8.5
508-83 8.5
508-101 3.0
508-113 4.0
실시예 4: 세포 배양 배지 성분으로서 재조합 인간 락토페린의 정제
재조합 인간 락토페린이 첨가된 세포 배양 배지를 생산하기 위해, 재조합 인 간 락토페린을 벼 분말로부터 정제했다. 고 레벨의 rhLF를 발현하는 유전자도입 벼 라인(164-12)을 선발했다. 여기서 LF164라고 명명한 이 라인을 1년에 2 세대씩 식재하였는데, 여름에 야외 식재 및 겨울에 온실 식재를 번갈아 했다. 단백질 정제를 위해, rhLF를 발현하는 벼의 껍질을 제거하고(Rice Mill, PS-160, Rimac, FL), 그 후에 해머 밀(8WA, Schutte-Buffalo, NY)을 사용하여 분말로 빻았다(평균 입자 크기 100 메쉬).
50 L 탱크에서 1시간 동안 2 kg의 벼 분말 및 20L의 추출 완충액(0.02 M 인산나트륨 pH 6.5 and 0.3 M sodium chloride)을 혼합하여 유전자도입 분말로부터의 단백질 추출을 수행했다. 혼합 기간의 말미에, 부유물을 밤새 가라앉히거나 3750 rpm에서 원심분리시킬 수 있다. 모든 경우에, M-05 및 M-70 셀룰로오스/펄라이트(perlite)-기반 필터(Ertel Alsop, NY)를 사용하여, 플레이트 및 프레임 여과 프레스(Ertel Alsop, 8S, NY)를 통해 상기 상청액을 여과한다.
추가 정제를 위해 rhLF 및 기타 벼 분말 가용성 단백질을 함유하는 여과액을 이온교환 컬럼 위에 로딩했다. SP-Sepharose 고속 흐름(Amersham Pharmacia Biotech, NJ)과 함께 인덱스 200/500 프로세스 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech, NJ)을 사용했다. 생산자의 지시에 따라 상기 레진베드(resin bed)의 패킹, 세척 및 테스트를 수행했다(HETP 테스트). 여과액을 선속도 175 cm/h에서 상기 레진에 로딩하고, A280이 기준선으로 돌아올 때까지 0.3 M NaCl을 함유한 0.02 M 인산나트륨 완충액으로 세정했다. 0.8 M NaCl을 함유한 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)을 사용하여 재조합 hLF를 용출하였다(eluted). 세정 및 용출은 각각 200 cm/h 및 150 cm/h에서 수행되었다.
용출된 hLF의 농축 및 탈염(한외여과(ultrafiltration))을 위해 1 ft2 50 kDa 폴리에테르술폰(Pall Biopharmaceutical, MA) 막을 구비한 Centramate 모듈(Pall Biopharmaceutical, MA)을 사용했다. 교차 유속(cross flow rate) 약 1.5 L/min 및 평균 막간 압력차 10 psig에서 여과를 수행했다. 용출된 rhLF를 최종 부피 0.25 L까지 농축 및 탈염한 후 감압 동결건조하였다. 보통, 1 kg의 유전자도입 벼 분말로부터 약 3g의 정제된 재조합 인간 락토페린이 회수된다.
벼 분말에서 정제된 재조합 인간 락토페린은 철로 약 50% 포화된다(부분-락토페린). 상기 50% 포화된 재조합 인간 락토페린을 철 함량 상향 처리(iron up taking treatment)로 >90% 철 포화되게 하여, holo-락토페린을 만들고, 결합된 철을 제거하는 산 처리로 <10% 철 포화되게 하여 apo-락토페린을 만든다. 상기 정제된 락토페린들(holo-, partial- 및 apo-)은 세포 배양 배지 성분으로서 사용되었다.
실시예 5: 세포 성장을 촉진하는, 재조합 인간 락토페린 첨가된 세포 배양 배지
재조합 인간 락토페린에 다양한 농도의 최소 필수 배지(MEM)를 첨가했다. 이로써 락토페린의 성장 인자 효과를 테스트할 수 있다. 인간 복제 암 세포 라인, HT-29을 10% 우태아혈청(FCS)을 함유하는 MEM 기본 배지에서 유지시켰다. 이어서, 무혈청 조건(우태아혈청을 첨가하지 않은 MEM) 하에서 락토페린 샘플을 테스트했다. DNA 합성에 들어가는 세포의 백분율을 평가하기 위하여, 락토페린 샘플을 첨가한 후 24시간 동안 [3H]-티미딘 (2 μCi/well)을 포함시켰으며 추가 24시간 동안 세포를 남겨뒀다. 각각의 조건에 대해, 락토페린 용액의 자극성(stimulatory) 또는 억제성(inhibitory) 효과를 별도 6개 웰(well)에서 중복하여 측정했다.
0.2% 트리판 블루(trypan blue)를 배제하는 능력으로 측정되는, 세포 생존력(Cell viability)은 90% 보다 높았다. 증식 분석(Proliferation assay)은 전형적인 '종 모양' 투여 반응 곡선을 나타낸다(도 20). 3가지 형태의 락토페린 모두에 대해, 결과는 락토페린 첨가에 대한 이러한 반응을 보였고 락토페린의 최대 활성은 1 mg/ml의 최종 농도에서였음을 보였다. 게다가, 상기 3 가지 형태에서, holo-락토페린이 가장 큰 증식 활성을 보였다(도 20).
세포 생존력을 평가하기 위해, 5% 우태아혈청(FCS)가 첨가된 MEM 내 웰당 5 x 105개 세포로 24개의 웰 플레이트에 HT-29를 식재했다; 이 결과는 24시간 후에 웰당 >95%의 부착 세포수로 판단하였다(트립신화 및 Neubauer 혈구계산기를 사용하여 직접 셈하는 것에 의해 평가함). 이때, 추가 48시간 동안, 동일하게 식재된 웰에서 배지를 5% FCS만 있는 MEM을 함유한 것 또는 5% FCS + EGF가 있는 MEM을 함유한 것, 또는 추가로 5% FCS 또는 1 mg/ml 농도에서 다양한 형태의 락토페린(즉, apo-, partial- 또는 holo-)을 함유한 것으로 교체했다. 이 기간의 말미에, 세포 수를 평가했다. 이때 상청액에 있는 임의의 세포가 총 세포 수에 포함되는지 확인하기 위 하여, 상청액을 모아서, 13,000 rpm(12,000 g)에서 5분 동안 원심분리하고 트립신화 후의 세포에 더했다. 결과는 벼로부터 유래된 재조합 인간 락토페린이 세포 성장을 촉진하는 것으로 나타났다. holo-락토페린이 첨가된 웰에 있는 세포는 락토페린이 없는 웰의 경우보다 2배 많았다(도 21). 티미딘 삽입 실험 및 세포수 실험 양쪽 모두 빠른 세포 성장을 위한 세포 배양 배지에의 성분으로서 벼로부터의 재조합 인간 락토페린을 첨가할 수 있음을 나타낸다(도 20 및 21).
실시예 6: 하이브리도마 세포 성장을 촉진하는, 재조합 인간 락토페린이 첨가된 세포 배양 배지
하이브리도마 세포 배양을 위하여 재조합 인간 holo-락토페린을 5 내지 250 mg/ml 범위의 다양한 농도에서 무혈청 배지에 첨가했다. 상기 재조합 인간 락토페린은 철-포화되므로, holo-락토페린은 세포 성장을 위해 철을 제공할 수 있다. 5% 우태혈청(FBS)를 함유하는 DMEM 기초 배지에서 하이브리도마 세포 라인 AE1(ATCC)을 유지시켰다. 우태혈청의 첨가가 없는 무혈청 조건(AFM6, KC Bio, Kansas) 하에서 락토페린을 테스트했다. 다양한 경로에 걸쳐 5% FBS부터 무혈청 배지까지 상기 세포를 계대 배양했다. 각각의 이차배양에서, 총 세포 수 및 생존력에 대하여 상기 세포를 분석했다. 재조합 인간 락토페린이 동물 소스에서 유래된 트랜스페린을 대페할 수 있음을 보이기 위하여, 대조군으로서 AFM6 배지에 동일 농도의 트랜스페린을 첨가했다. 결과는, 하이브리도마 세포 성장을 위한 세포 배양 배지에서 재조합 인간 holo-락토페린이 동물-유래된 트랜스페린을 대체하여 사용될 수 있는 것으로 나타났다.
Holo-락토페린이 세포 성장을 촉진시키는 능력을 평가하기 위하여, 5% FBS를 함유하는 배지로부터 무혈청 배지까지 T25 고정 플라스크에서 AE1 세포를 계대 배양하였다. 산업에 흔히 사용되는 동물 유래된 트랜스페린, 또는 재조합 인간 holo-락토페린(LACROMIN™) 중 하나를 상기 무혈청 배지 첨가했다. 이는 재조합 인간 holo-락토페린 및 동물 유래된 트랜스페린 사이의 직접 비교를 가능하게 한다. ml당 5 x 105 세포의 식재밀도(seeding densities)로 3회씩 각각의 단백질 시험을 수행했다. 계대 배양을 위해, 원심분리에 의해 세포를 모은 후, 트랜스페린 또는 재조합 인간 holo-락토페린(LACROMIN™)의 농도가 동일한 새로운 배지에 식재했다. 세포 수 및 생존력에 대하여, 계대 배양에 따라, 1일차 및 3일차에 각각의 플라스크를 분석했다. 평균 세포 수는 도 22에서 2회에 걸쳐 제공된다. 보이는 것과 같이, 재조합 인간 holo-락토페린을 사용할 때의 세포 생존력 및 세포수는 락토페린이 없는 경우보다 훨씬 높았고 동물 유래된 트랜스페린의 경우와 동등했는데, 이는 식물-유래된 재조합 인간 holo-락토페린이 하이브리도마 세포 성장을 촉진할 수 있고 동물 유래된 트랜스페린을 대체할 수 있음을 의미한다.
다른 하이브리도마 세포 라인, L243으로 동일한 분석을 수행했다. 표 2에서 볼 수 있는 것과 같이, LACROMIN™(rhLF)은 인간 트랜스페린(TF) 만큼 세포 성장을 촉진할 수 있다. L243 역시 IgG 생산 세포 라인이다. IgG 생산를 위해 샘플을 취했다. LACROMIN™을 포함하는 배지에서, 트랜스페린을 함유하는 배지에서보다 더 많 은 IgG가 생산되었다.
표 2. 하이브리도마 성장 및 단자엽 항체 생산에 대한 인간 트랜스페린(TF) 및 재조합 인간 락토페린(rhLF)의 효과
TF/rhLF 세포 수 (x 106) IgG 레벨 (㎍/ml)
처리 (㎍/ml) 평균 표준편차 평균 표준편차
대조군 0 0.39 0.18 15.78 5.63
TF 5 0.70 0.25 34.10 8.44
rhLF 5 0.63 0.10 43.58 8.24
TF 25 0.78 0.24 31.93 7.10
rhLF 25 0.81 0.20 36.10 7.54
TF 100 0.86 0.33 28.58 5.82
rhLF 100 0.78 0.26 29.73 4.28
5% FBS 0 0.98 0.12 23.88 5.50
실시예 7: 재조합 인간 혈청 알부민의 정제 및 특성 평가
벼 낟알로부터 rHSA를 정제하기 위해, rHSA를 발현하는 벼 낟알의 껍질을 벗기고, 가루로 빻고 rHSA 추출 완충액(아세트산 나트륨, pH 4.9)과 30분간 혼합했다. 여과에 의한 정화 후에, 약 150 cm/hr의 속도로 음이온 교환 컬럼(Q-Sepharose; GE Healthcare)에 여과액을 로딩했다. 한번 로딩되면, 어떤 미결합 단백질을 제거하기 위해 평형 완충액으로 상기 레진을 세정했다. 용출된 rHSA는 SDS-PAGE로 분석했을 때 약 90% 순수하다. 그 후에 SDS-PAGE 겔의 스캐닝 분석에 기반하여, 순도를 90%에서 약 98%까지 증가시키기 위해 Blue-Sepharose(GE Healthcare)를 사용할 수 있다. 그리고 나서, 저온 건조 전에 한외여과법에 의해 상기 rHSA를 농축 및 탈염시킨다.
정제된 rHSA를 pHSA(Plasma-derived HSA)와 비교하기 위해 일련의 생화학적 및 생물리학적 특성평가를 실시했다(표 3). 이들 시험은 벼에서 발현된 rHSA가 pHSA와 동등하다는 것을 나타낸다.
표 3. pHSA와 비교한 rHSA의 특성
특성 pHSA rHSA
N-터미널 서열 DAHKSE DAHKSE
글리코실화(glycosylation) None None
SDS-PAGE/웨스턴 ~66 kDa ~66 kDa
분자량 (MALDI) 66.9~68.1 kDa 66.8~67.9 kDa
등전위 초점 pl 5.3 pl 5.3
리간드 결합 Yes Yes
터미널 안정성 중간점 65 ℃ 중간점 65 ℃
에스테라제 활성 Yes Yes
프로테아제 민감성 각각 동일 각각 동일
실시예 8: 감소된 -혈청 배지에서의 하이브리도마 세포 성장을 촉진하는, 재조합 인간 혈청 알부민이 첨가된 세포 배양 배지
혈장 유래된 인간 혈청 알부민(pHSA)과 유사한, 세포 성장을 자극하기 위한 벼로부터의 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)의 효율응 시험했다. 공통 배지(CM)로서 10 ㎍/ml 인슐린, 5.5 ㎍/ml 트랜스페린, 6.7 ng/ml 이인산나트륨(sodium selenite), 0.20 mg/ml 에탄올아민 및 2 mM Glutamax(Gibco)를 첨가한 기초 배지 DMEM을 사용했다. CM + 10% 우태혈청(FBS) 내의, 하이브리도마 AE1 스톡(stocks)을 4개의 계통(lineages)으로 나눴다: 1) 양성 대조군(positive control)으로서 CM +10% FBS, 2) 음성 대조군으로서 HSA 없는 CM, 3) 실험구로서 CM + 100 mg/L rHSA, 및 4) 비교구로서 CM +10.0mg/L 혈장-유래된 HSA(pHSA). 그리고 나서, 50% 감소된 FBS를 함유하는 배지로 1 x 105 세포/ml를 순차적으로 통과시킴으로써 각각의 계통을 1% FBS에 순차적으로 적응시켰다. 1% FBS에서, 감소된-혈청(1% FBS) 조건 하에서의 성장에 완전히 적응하도록, 각각의 계통을 10회 이어서 통과시켰다. 도 23은 CM +1% FBS 하에서의 10번째 통과 중에 4개의 계통의 세포 성장 곡선을 보여준다. 어떠한 HSA도 없는 CM에서의 경우보다 CM rHSA에서 AE1 하이브리도마 세포가 훨씬 빠르게 성장하고 고밀도에 도달했음을 발견했다(도 23). 또한, rHSA 첨가된 배지에서 성장한 세포가 혈장 유래된 HSA가 있는 배지에서 성장한 세포와 동등하거나 더 잘 자랐음을 발견했다. 이 결과는 감소된-혈청 배지에서의 하이브리도마 세포 성장을 향상시킴에 있어서 벼로부터의 rHSA가 pHSA와 기능적으로 동등하다는 점을 나타낸다.
실시예 9: 무혈청 배지에서 하이브리도마 세포 성장을 촉진하는, 재조합 인간 혈청 알부민이 첨가된 세포 배양 배지
세포 성장을 부양하기 위해 식물 유래된 재조합 인간 혈청 알부민이 동물로부터 유래된 알부민과 동등하게 기능한다는 점을 증명하기 위해, 첨가된 무혈청 배지(SFM)에서의 AE1 하이브리도마 세포의 성장을 테스트했다. 재조합 인간 혈청 알부민 또는 혈장 유래된 인간 혈청 알부민을 각각 유사한 농도(100 mg/L)로 첨가하여 SFM을 생산했다. 음성 대조군으로서 알부민 첨가가 없는 SFM을 생산했다. 이러한 접근은 세포 성장을 촉진함에 있어서 식물 유래된 재조합 인간 혈청 알부 민(CELLASTIM™)과 혈장 유래된 인간 혈청 알부민 사이의 직접 비교를 가능하게 한다. SFM은 10 ㎍/ml 인슐린, 5.5 ㎍/ml 트랜스페린, 6.7 ng/ml 이인산나트륨, 0.20 mg/ml 에탄올아민 및 2 mM Glutamax(Gibco)가 첨가된 DMEM/F12 기초 배지로 되어 있다. 무혈청 성장 조건에 도달하기 위해, 연속 적응 절차에 의해 AE1 하이브리도마 세포(ATCC # HB-72)를 먼저 FBS 없는 SFM에 적응시켰다. 간단하게, 재조합 인간 혈청 알부민 또는 혈장 유래된 인간 혈청 알부민이 첨가되거나 HSA가 첨가되지 않은 SFM/10% FBS에서 성장한 AE1을, 이전의 배양으로부터 50% 감소된 혈청이 있는 SFM 내로 1 x 105 세포/ml로 성공적으로 계대 배양하였다. SFM/0.25% FBS 배양은 FBS 없는 SFM 낼 직접 계대 배양되었다. SFM에서 진행된 6개의 성공적인 계대 배양은 세포를 FBS 없는 각각의 SFM에 완전히 적응시켰다.
100 mg/L 재조합 인간 혈청 알부민 또는 100 mg/L 혈장 유래된 인간 혈청 알부민을 함유하거나 HSA를 함유하지 않는 SFM에서 6회의 통과 동안 성장한 AE1 하이브리도마 세포를 1 x 105 세포/ml로 6-웰 플레이트에서 계대 배양되었다. 상기 배양의 성장 역학을 시험하기 위하여 생존 가능한 세포의 수 및 생존력 백분율을 매일 평가했다. 정확한 생존 세포수 셈 및 분석을 보증하기 위해 계대 배양을 2회 실시했다. 도 24는 AE1 하이브리도마 세포가 더 빨리 성장했고 생존 가능한 세포의 최대수가 식물 유래된 재조합 인간 혈청 알부민으로 보충된 배지에서 더 높았으며 혈장 유래된 인간 혈청 알부민의 경우와 동등했음을 보여준다. 따라서, 이 실시예는, 식물 유래된 재조합 인간 혈청 알부민이 무혈청 배지 내에서 세포 성장을 촉진시킬 수 있고 조직 배양을 위한 동물 유래된 알부민을 대체할 수 있음을 보여준다.
이제 본 발명이 완전히 기술되었으며, 첨부된 청구항의 의도 또는 범위에서 벗어나지 않고 많은 변형 및 개선이 이루어질 수 있음은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

Claims (19)

  1. 식물에서 생산된(plant-produced) 하나 이상의 이종(heterologous) 단백질을 세포 배양 배지 성분으로서 포함하는, 세포 배양 배지.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물인 것인, 세포 배양 배지.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 기장, 라이밀(triticale), 또는 수수인 것인, 세포 배양 배지.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼인 것인, 세포 배양 배지.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 식물인 것인, 세포 배양 배지.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 이종 단백질은 식물 단백질인 것인, 세포 배양 배지.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 이종 단백질은 비식물(non-plant) 단백질인 것인, 세포 배양 배지.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 비식물 단백질은 동물 단백질인 것인, 세포 배양 배지.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 비식물 단백질은 인간 단백질인 것인, 세포 배양 배지.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 성장 인자(growth factors), 락토페린(lactoferrin), 트랜스페린(transferrin), 혈청 알부민(serum albumin), 인슐린, 성장 호르몬, 및 이들의 단편(fractions), 피브로넥틴(fibronectin) 부착 인자, 라민(lamin) 부착 인자, 콜라게나제(collagenase), 혈소판 유래된(platelet derived) 성장 인자, 뇌-유래된(brain-derived) 신경영양 인자, 아교세포-유래된(glial-derived) 신경영양 인자, 흉선 인자(thymic factors), 햅토코린(haptocorin), 락타헤드린(lactahedrin), 락토페록시다아제(lactoperoxidase), 알파-페토프로테인(alpha-fetoprotein), 면역글로빈(immunoglobin), 및 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 세포 배양 배지.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 성장 인자는 표피(epidermal) 성장 인자, 케라티노사이트(keratinocyte) 성장 인자, 인슐린-유사(insulin-like) 성장 인자, 장내 트레포일(intestinal trefoil) 인자, 전환(transforming) 성장 인자, 과립구 콜로니-자극(granulocyte colony-stimulating) 인자, 신경(nerve) 성장 인자, 섬유아세 포(fibroblast) 성장 인자, 또는 이들의 생물학적 활성 단편(fragments)인 것인, 세포 배양 배지.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 감소된 혈청(reduced serum) 배지, 무혈청(serum-free) 배지, 또는 화학적으로 정의된 배지(chemically defined medium)인 것인, 세포 배양 배지.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 완전 배지(complete media), 기초 배지(basal media), 또는 세포 배양 배지 성분이 보충된 기초 배지인 것인, 세포 배양 배지.
  14. 식물 세포 내에서 하나 이상의 이종 단백질을 생산하는 단계 및 식물에서 생산된 상기 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지와 배합시키는 단계를 포함하는, 강화된 세포 배양 배지의 생산 방법.
  15. 식물 세포 내에서 하나 이상의 이종 단백질을 생산하는 단계 및 식물에서 생산된 상기 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지와 배합시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 세포 배양 배지.
  16. 하나 이상의 단백질(proteinaceous) 세포 배양 배지 성분을 포함하는 세포 배양 배지에 있어서, 식물에서 생산된 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지 성분으로 포함하는 개선점을 갖고, 여기서 상기 이종 단백질은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 것인, 세포 배양 배지:
    a) 하기를 포함하는 키메라 유전자(chimeric gene)로 식물 세포를 형질전환하는 단계:
    (ⅰ) 종자 저장 단백질(seed storage protein)의 유전자로부터의 프로모터(promoter);
    (ⅱ) 종자 저장 단백질의 신호 서열을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된(operably linked), 제 1 DNA 서열; 및
    (ⅲ) 상기 이종 단백질을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로(operably) 연결된 제 2 DNA 서열로서, 여기서 상기 제 1 및 제 2 DNA 서열은 해독 프레임(translation frame)에서 연결되어서 함께 상기 저장 단백질 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질(fusion protein)을 인코딩하는 것인, 제 2 DNA 서열; 및
    b) 상기 이종 단백질을 함유하는 종자를 생산하는 데 충분한 시간 동안 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재배하는 단계.
  17. 청구항 17에 있어서, 수확된 종자로부터 상기 이종 단백질을 정제하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 이종 단백질이 상기 수확된 종자 내의 총 가용성 단백질의 약 3.0% 이상을 구성하는 것인, 방법.
  19. 식물에서 생산된 하나 이상의 이종 단백질을 세포 배양 배지 성분으로 갖는 세포 배양 배지의 생산 방법으로서, 상기 방법은:
    a) (ⅰ) 종자 저장 단백질의 유전자로부터의 프로모터;
    (ⅱ) 종자 저장 단백질의 신호 서열을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 1 DNA 서열; 및
    (ⅲ) 상기 이종 단백질을 인코딩하는, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 제 2 DNA 서열로서, 여기서 상기 제 1 DNA 서열 및 제 2 DNA 서열은 해독 프레임에서 결합되어 함께 상기 저장 단백질 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 것인, 제 2 DNA 서열;
    를 포함하는 키메라 유전자로 식물 세포를 형질전환하는 단계;
    b) 상기 이종 단백질을 함유하는 종자를 생산하는 데 충분한 시간 동안 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재배하는 단계;
    c) 상기 종자를 상기 식물로부터 수확하는 단계; 및
    d) 상기 이종 단백질을 세포 배양 배지와 배합시키는 단계
    를 포함하는 것인, 세포 배양 배지의 생산 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016021955A1 (ko) * 2014-08-08 2016-02-11 (주)세포바이오 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 및 식물성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 세포 보존용 조성물

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7304208B2 (en) * 2000-05-02 2007-12-04 Ventria Bioscience Expression of human serum albumin (HSA) in monocot seeds
IT1394596B1 (it) * 2008-09-30 2012-07-05 Fond Parco Tecnologico Padano Produzione di ngf in pianta.
US8482664B2 (en) 2008-10-16 2013-07-09 Magna Electronics Inc. Compact camera and cable system for vehicular applications
US20120315697A1 (en) * 2009-02-20 2012-12-13 Ventria Bioscience Cell Culture Media Containing Combinations of Proteins
US8609416B2 (en) * 2009-12-18 2013-12-17 Ventria Bioscience Methods and compositions comprising heat shock proteins
US20130157356A1 (en) * 2010-01-25 2013-06-20 Ventria Bioscience Methods & compositions for improving protein production
CN102127164B (zh) * 2010-12-20 2013-01-30 武汉禾元生物科技有限公司 一种从水稻种子中提取重组人血清白蛋白的方法
US10250004B2 (en) 2015-11-05 2019-04-02 Magna Electronics Inc. Method of forming a connector for an electrical cable for electrically connecting to a camera of a vehicle
US10560613B2 (en) 2015-11-05 2020-02-11 Magna Electronics Inc. Vehicle camera with modular construction
US10230875B2 (en) 2016-04-14 2019-03-12 Magna Electronics Inc. Camera for vehicle vision system
US10351072B2 (en) 2015-11-05 2019-07-16 Magna Electronics Inc. Vehicle camera with modular construction
US10142532B2 (en) 2016-04-08 2018-11-27 Magna Electronics Inc. Camera for vehicle vision system
US10237456B2 (en) 2016-08-22 2019-03-19 Magna Electronics Inc. Vehicle camera assembly process
US11457554B2 (en) 2019-10-29 2022-10-04 Kyndryl, Inc. Multi-dimension artificial intelligence agriculture advisor
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
CA3191387A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US6680426B2 (en) 1991-01-07 2004-01-20 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5932479A (en) 1988-09-26 1999-08-03 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US7091401B2 (en) * 1991-02-22 2006-08-15 Sembiosys Genetics Inc. Expression of epidermal growth factor in plant seeds
EP0891419A4 (en) * 1996-03-12 2000-03-01 Life Technologies Inc NUTRIENT ADDITIVE FOR HEMATOPOETIC CELL CULTURES
EP0947581A4 (en) * 1996-08-08 2004-07-28 Mitsubishi Pharma Corp CULTURAL MEDIUM AND ITS USE.
AU5734998A (en) * 1997-01-10 1998-08-03 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
CA2280894A1 (en) * 1997-02-13 1998-08-20 Applied Phytologics, Inc. Production of mature proteins in plants
FR2762850B1 (fr) * 1997-05-02 2000-02-11 Biocem Lactoferrines recombinantes, leurs procedes de production par les plantes ainsi que leurs utilisations
EP1097211B1 (en) * 1998-07-10 2007-04-18 Calgene LLC Expression of eukaryotic peptides in plant plastids
US6406909B1 (en) * 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
IT1299565B1 (it) * 1998-07-17 2000-03-16 Plantechno S R L Polinucleotide sintetico codificante per la lattoferrina umana, vettori, cellule e piante transgeniche che lo contengono.
WO2001020974A1 (en) * 1999-09-22 2001-03-29 The Penn State Research Foundation Quantitative transient protein expression in plant tissue culture
EP2080803B1 (en) * 2000-03-01 2011-05-25 Auburn University Plastid transformation vectors for expressing proinsulin fused to the cholera toxin B-subunit in plants
US20030172403A1 (en) 2000-05-02 2003-09-11 Ning Huang Plant transcription factors and enhanced gene expression
US7304208B2 (en) * 2000-05-02 2007-12-04 Ventria Bioscience Expression of human serum albumin (HSA) in monocot seeds
US7138150B2 (en) 2000-05-02 2006-11-21 Ventria Bioscience Method of making an anti-infective composition for treating oral infections
US7417178B2 (en) * 2000-05-02 2008-08-26 Ventria Bioscience Expression of human milk proteins in transgenic plants
US6991824B2 (en) 2000-05-02 2006-01-31 Ventria Bioscience Expression of human milk proteins in transgenic plants
US20040078851A1 (en) 2000-05-02 2004-04-22 Ning Huang Production of human growth factors in monocot seeds
DE10114209A1 (de) * 2001-03-23 2002-12-05 Icon Genetics Ag Ortsgerichtete Transformation durch Verwendung von Amplifikationsvektoren
US7118914B2 (en) * 2002-04-23 2006-10-10 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Method for producing human lactoferrin in plant cell culture
US8003381B2 (en) 2002-04-30 2011-08-23 Icon Genetics Gmbh Amplification vectors based on trans-splicing
JP2004093257A (ja) 2002-08-30 2004-03-25 Oki Electric Ind Co Ltd 光センサユニット
DE10254165A1 (de) 2002-11-20 2004-06-03 Icon Genetics Ag Verfahren zur Kontrolle eines zellulären Prozesses in einem multizellulären Organismus
DE10254166A1 (de) 2002-11-20 2004-06-03 Icon Genetics Ag Verfahren zur Kontrolle eines zellulären Prozesses in Pflanzen
CA2410702A1 (en) * 2002-11-26 2004-05-26 Illimar Altosaar Production of human granulocyte macrophage-colony stimulating factor (gm-csf) in the seeds of transgenic rice plants
US20040268431A1 (en) * 2003-06-30 2004-12-30 The Chinese University Of Hong Kong Transgenic plant products comprising human granulocyte colony-stimulating factor and method for preparing the same
US20070067862A1 (en) * 2003-07-03 2007-03-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chloroplast transgenic approach to express and purify human serum albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation
US20080010697A1 (en) * 2003-12-23 2008-01-10 Daichang Yang Methods of Expressing Heterologous Protein in Plant Seeds Using Monocot Non Seed-Storage Protein Promoters
US20070078851A1 (en) * 2005-10-05 2007-04-05 Grell Mathew L System and method for filtering search query results
KR100828704B1 (ko) * 2006-01-24 2008-05-09 삼성엔지니어링 주식회사 열 사이펀 반응기 및 이를 구비한 수소 발생기
WO2007123489A1 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 Agency For Science, Technology And Research Method for recombinant protein production in cho cells
EP2118270A2 (en) * 2007-01-08 2009-11-18 Millipore Corporation Cell culture methods for producing recombinant proteins in the presence of reduced levels of one or more contaminants
US9321828B2 (en) * 2010-05-07 2016-04-26 Ventria Bioscience Inc. Non-glycosylated transferrin expressed in monocots

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016021955A1 (ko) * 2014-08-08 2016-02-11 (주)세포바이오 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 및 식물성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 세포 보존용 조성물
CN107072188A (zh) * 2014-08-08 2017-08-18 Cefo有限公司 一种用于细胞保存的包含作为活性成分的植物源重组人血清白蛋白和植物肽的组合物
US11345887B2 (en) 2014-08-08 2022-05-31 Cefo Co., Ltd Composition for preserving cells, containing, as active ingredients, plant-derived recombinant human serum albumin and plant peptides

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