KR20030090184A - 인체 락토페린 단백질을 생산하는 딸기 개체의 획득방법및 이에 의해 획득된 딸기 개체 - Google Patents

인체 락토페린 단백질을 생산하는 딸기 개체의 획득방법및 이에 의해 획득된 딸기 개체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역강화단백질인 인체 락토페린을 생산하는 딸기의 제조방법에 관한 것으로서, (A) 인체 락토페린 유전자를 함유하는 식물 형질전환용 벡터를 제작하는 단계, (B) 상기 과정에서 획득된 벡터로 딸기 식물체 절편을 형질전환하는 단계 및 (C) 상기 형질전환된 딸기 식물체 절편을 재분화시키는 단계를 포함하는 인체 락토페린을 생산하는 딸기 식물체의 획득방법을 제공한다.
본 발명에 의해 생산되는 인체 락토페린이 함유된 식물체를 활용하여 딸기의 부가가치를 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 기능성 식품으로의 개발이 가능하게 된다.

Description

인체 락토페린 단백질을 생산하는 딸기 개체의 획득방법 및 이에 의해 획득된 딸기 개체{Method for Acquiring a Strawberry Plant which Produces hLF, and a Strawberry Plant by the Same Method}
본 발명은 면역강화단백질인 인체 락토페린을 생산하는 딸기의 제조방법에 관한 것이다.
딸기는 장미과에 속하는 과채류로서 F.A.O. 통계에 의하면 전세계 딸기 면적은 약 22만 헥타르에서 300만톤이 생산되고 있으며 이중 미국이 2만 헥타르에서 78만톤으로 가장 많으며 우리나라는 전국 25,000여 농가 6,400헥타르에서 년간 15만 4천톤이 생산되어 일본에 이어 세계에서 6번째로 많은 딸기를 생산하고 있고 수박,참외에 이어 3번째로 많이 재배되는 작물로 6,282억원의 농가 소득을 올리고 있는 중요한 작물이다.
딸기의 총 수요량은 2001년에 14만톤에서 2004년에 15만톤으로 점차 증가하고 1인당 소비량도 증가할 것으로 추측되나 재배기술의 발달과 품종갱신에 따른 수량의 증가로 소요면적은 감소할 것으로 예상된다. 또한 경제 성장에 따른 소득향상으로 인하여 소비자 패턴의 변화로 고품질 딸기 생산이 시급히 요구 되고있다.
딸기 재배시 점박이응애, 잿빛 곰팡이병, 흰가루병, 시들음병, 눈마름병, 잎선충 등 병충해 방제를 위해서 농약살포에 의존하고 있으나 향후 저농약 딸기 생산을 위한 기술개발이나 병충해에 강한 딸기 품종의 육성이 요구되고 있다.
현재 딸기 육종가에 의해 딸기의 생산량과 과수의 크기 그리고 품질이 많이 향상되고 있으나 바이러스와 곤충에 대한 저항성, 환경 스트레스에 대한 방어기능의 약화 그리고 제초제의 과다 살포 등 많은 문제가 대두되고 있는 실정이나 딸기의 배수체와 높은 이형접합체등 유전적 특성 때문에 전통육종방법에 의한 우량품종에는 한계가 있다.
전통 육종방법의 단점을 해결하기 위하여 딸기에 대하여 1990년 이래 clonalpropagation을 통한 유전자 도입방법으로 경제적 가치가 있는 품종에 유용한 형질을 안정적으로 유지시킬수 있는 생명공학 기술이 적용되기 시작하였다.
이에 따라 현재 GUS와 같은 reporter 유전자 도입에 의한 형질전환 시스템이 국외 연구 그룹에 의해 확립되어 있으나 형질전환율이 약 6% 정도 매우 낮은 실정이고 아직 유용유전자 도입에 의한 품종개량을 시도한 예는 찾아볼 수 없다.
인체 유래 단백질중 면역 강화 단백질인 락토페린은 모유에 많이 존재하는 철 결합 단백질로 유아의 면역기능 강화에 중요한 요소로 알려져있고 생리적 환경으로부터 미생물이 이용할 수 있는 철을 없애거나 미생물의 세포표면에 결합하여 막투과성을 변화시켜 증식을 억제함으로서 다종의 그람균에서 항균활성과 HIV및 HCMV에서 항바이러스 활성이 보고되고 있다 (Cancer Biotech Weekly, March 1995).
또한 상기 연구를 바탕으로 락토페린이 도입된 담배 현탁배양세포 추출액이 식물 유해 미생물의 성장을 저해하는 것으로 보고되었다.(Mitra et al. 1995)
항균 특성을 갖는 인체 유래 락토페린 유전자를 발현하는 딸기 개체가 개발된다면 이에 의해 생산되는 딸기의 저장성이 증대되어 제품의 부가가치를 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 인체 유용성분인 락토페린이 함유된 천연의 기능성식품으로 유용할 것이다.
이에 본 발명은 면역강화단백질인 인체 락토페린의 다양한 효과를 활용할 수 있는 식물체를 제조하는데 목적이 있다.
상기 목적에 따라 본 발명에서는 딸기의 잎절편으로부터 고빈도 재분화시스템을 확립한 후 아그로박테리움 매개법에 의해 인체 유래 단백질인 락토페린 유전자를 도입, 발현시키는 딸기의 제조방법을 제공한다.
도 1 은 인체 락토페린(hLF) 유전자를 포함하는 플라스미드 pLSM1의 구조도.
도 2 는 본 발명에 의한 락토페린 유전자로 형질전환된 개체의 재분화과정을 보여주는 사진.
도 3 은 형질전환 세포의 PCR 결과를 도시한 사진.
도 4 는 형질전환 세포의 Northern blot 결과를 도시한 사진.
상기의 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명은, (A) 인체 락토페린 유전자를 함유하는 식물 형질전환용 벡터를 제작하는 단계, (B) 상기 과정에서 획득된 벡터로 딸기 식물체 절편을 형질전환하는 단계 및 (C) 상기 형질전환된 딸기 식물체 절편을 재분화시키는 단계를 포함하는 인체 락토페린을 생산하는 딸기 식물체의 획득방법에 관한 것이다.
본 발명에 사용되는 인체 락토페린 유전자는 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 예를들면, 인체 락토페린 유전자의 알려진 염기서열(Powell and Ogden, Nucleic Acids Research 18, 4013(1990))을 이용하여 공지된 화학적 DNA 합성 방법을 통하여 화학적으로 합성하거나 , 인체 락토페린 유전자를 포함하는 플라스미드, 예를 들어, 플라스미드 pBSK에 락토페린 유전자가 포함된 플라스미스('pBHL-1'이라 명명함; 조용연, Cloning of Human Lactoferrin Gene and Its Polymorphism in Normal and Cancer Cells, 1993년 8월 충남대학교 생물학과 석사과정 논문)로부터적절한 제한 효소로 절단해 냄으로써 얻을 수도 있다.
상기 인체 락토페린 유전자의 서열은 그에 코딩되는 단백질의 특성과 기능을 실질적으로 동일하게 유지하는 한 적절한 변형을 가할 수 있다.
한편, 인체 락토페린 유전자를 포함하는 발현 벡터는 인체 락토페린 유전자를 발현시킬 식물 숙주세포의 종류에 따라 당해 분야에 공지된 백터 중 하나를 선택하여 상기 유전자를 포함하도록 공지된 DNA조작 방법을 적절히 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 인체 락토페린 cDNA를 함유하는 식물 핵형질전환 벡터로 플라스미스 pLSM1(도 1)를 사용한다. 플라스미스 pLSM1는 도에서 볼 수 있듯이, 카나마이신 저항성 유전자(NPTⅡ), CaMV의 35S 프로모터(35S), 인체 락토페린 cDNA 및 다양한 제한효소 절단부위를 가지고 있다.
플라스미스 pLSM1는 1995년 5월 10일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0159 BP호로서 기탁된 형질전환 대장균인E. coliDH-5α 균주로부터 얻는다.
숙주 식물체를 형질전환시키는 방법으로는 종래 알려진 다양한 방법, 예를들면,Agrobacterium매개법, microprojectile(particle) bombardment법, PEG-mediated fusion법, Electroporation법, Microinjection법, Liposome 매개법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
microprojectile(particle) bombardment(Stanford 등, 1992)은 물리적인 힘을 가하여 세포 안으로 핵산을 도입하는 방법이며,Agrobacterium매개법은 외래 유전자가 함유된 플라스미드로 아그로박테리움을 1차로 형질전환시킨 후 형질전환된 아그로박테리움으로 재차 식물체를 형질전환시키는 방법(Pobert, B. H., et al., PlantMolecular Biology Manual A42, 1-9 (1998))이다.
본 발명의 실시예에서는 아그로박테리움 매개법을 적용하였고 또한 딸기를 숙주 식물체로 이용하였다.
전술한 방법에 따라 본 발명자들은 형질전환된 딸기 식물체를 획득하였다.
PCR 분석을 통해 상기 딸기 식물체의 게놈상에 인체 락토페린 유전자가 삽입되어 있으며, northern blotting을 통해 상기 딸기 식물체가 인체 락토페린 mRNA를 전사하고 있음을 확인하였다.
이에 본 발명자들은 본 발명에 의한 인체 락토페린을 생산하는 딸기 식물체의 세포계(Strawberry Cell Line)를 hLF-S로 명명하고 이를 2002년 5월 10일자로 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 기탁하여 기탁번호 제 KCTC 10249 BP호를 부여받았다.
본 발명에 의한 딸기 식물체는 락토페린의 특성이 표현되기 때문에 항균성, 항바이러스성 등의 특성을 가지게 된다.
본 발명에 의한 상기 딸기 식물체가 인체 락토페린 단백질을 생산하므로, 상기 딸기 식물체가 만들어 내는 과일인 딸기에서도 인체 락토페린 단백질이 생산될 수 있음을 추론할 수 있다. 이에 본 발명은 인체 락토페린 단백질을 함유하는 딸기를 제공하는 것이다.
이렇게 인체 락토페린 단백질을 함유하는 딸기는 그 자체로, 또는 적절하게 가공되거나 추출되어 하여 식품, 건강식품 또는 건강보조식품으로 이용되거나, 각종 의약품의 성분으로 활용이 가능할 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다.
하기 실시예에서 락토페린 cDNA를 함유하는 벡터로는 플라스미스 pLSM1를, 숙주 식물체로는 하나의 딸기 품종을 선정하여 실험하였으나, 이들은 본 발명을 실시하기 위한 하나의 예시일 뿐 다양한 락토페린 cDNA 출처 및 다양한 품종의 딸기 식물체에 대하여 본 발명을 실시하는 것이 가능함은 당업자에게 당연할 것이다. 또한 식물체 형질전환 방법으로 하기 실시예에서는 아그로박테리움 매개로 이용하는 방법을 활용하였으나, 현재 알려진 다양한 식물체 형질전환 방법 또는 장차 개발될 식물체 형질전환 방법을 적용할 수 있음도 당업자에게는 당연할 것이다.
실시예 1 : 인체 락토페린 cDNA를 함유하는 식물 형질전환 벡터의 준비
인체 락토페린 cDNA를 함유하는 식물 핵형질전환 벡터로는 플라스미스 pLSM1(도 1)를 사용하였다. 플라스미스 pLSM1는 도에서 볼 수 있듯이, 카나마이신 저항성 유전자(NPTⅡ), CaMV의 35S 프로모터(35S), 인체 락토페린 cDNA 및 다양한 제한효소 절단부위를 가지고 있다. LB 및 RB는 각각 T-DNA의 좌측말단(left border) 및 우측말단(right border)를 나타낸다.
플라스미스 pLSM1는 1995년 5월 10일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0159 BP호로서 기탁된 형질전환 대장균인E. coliDH-5α 균주로부터 얻었다.
기탁번호 KCTC 0159 BP호인E. coliDH-5α 균주는 다음과 같은 과정을 거쳐 제작되었다.
먼저, 사람의 유선조직 cDNA라이브러리(입수처 : Clontech)에서 분리한 인체 락토페린 유전자(GenBankaccesssion No : UO7642)를 pBluescriptⅡ SK벡터(pBSK; 입수처 : Promega) EcoRI부위에 서브클로닝하여 플라스미드 pBHL-1를 제작하였다.(조용연, Cloning of human Lactoferrin Gene and Its polymorphism in Normal and cancer cells, 1993년 8월, 충남대학교생물학과 석사과정 논문)
이어서, 플라스미스 pBHL-1을 제한효소 HindⅢ 및 BamHⅠ으로 절단하여 인체 락토페린(HLf) 유전자를 분리한 다음 HindⅢ및 BglII으로 절단된 식물발현벡터인 pGA748(참고문헌: Pap. Am. Chem Soc., 205(1993))의 CaMV(cauliflower mosaicvirus) 35S 프로모터 하류에 위치한 HindⅢ / BglII 절단부위에 삽입하여, 플라스미스 pLSM1(도 1)을 제작하였다.
플라스미드 pLSM1을 칼슘 클로라이드 방법(Cohen et al P. N. A. S. 69,2110(1972))으로 아그로박테리움AgrobacteriumLBA4404 균주에 주입하여 형질전환시켰다.
실시예 2 : 숙주 식물체의 준비
(1) 전체형성능 있는 숙주 식물체 캘러스의 선별
숙주 식물체로는 상업적으로 중요한 딸기 "여봉" 품종을 선택하여 경단 분열조직 배양법에 의한 virus- free 식물체를 확보하였다. 상기 과정에서 획득된 딸기 식물체의 잎절편으로부터 부정아 형성능이 있는 캘러스를 선별하기 위한 배양 시스템을 구축하였다.
기관발생능 캘러스를 대량 확보하기 위하여 zeatin 3.2 mg/L 와 IBA 0.5mg/L를 첨가한 MS 고체배지(pH 5.8, 이하 모두 동일한 pH)에 상기 확보한 딸기 식물체의 잎절편(5×5mm)을 치상하여 배양하였다. 배양 8주 후 관찰한 결과 기관이 발생한 캘러스를 잎절편으로부터 분리하여 식물체 분화배지(BAP 3.2 mg/L, IBA 0.5 mg/L가 첨가된 MS 고체배지)에 치상하여 16시간 광주기로 배양하여 완벽한 재분화개체를 확인하였고 이를 토양으로 옮겨 온실에서 순화하였다.
실시예 3 : 형질전환
8-10주 후, 전기 실시예 2에서 얻은 재분화 딸기 식물체의 잎절편(5×5mm)을 취하여 형질전환용 재료로 이용하였다.
통상의 아그로박테리움에 의한 형질전환 방법에 따라, 상기 무균식물체의 잎절편과 플라스미드 pLSM1를 가지고 있는 대수기 상태의 아그로박테리움을 배지에 혼합하여 방치하였다.
약 20분 경과 후 멸균된 여과지위에서 상기 잎절편을 말린 다음 zeatin 3.2 mg/L 와 IBA 0.5mg/L를 첨가한 MS 배지에서 3일 동안 배양하였다. 공동배양 후 잎절편을 회수하여 수세한 후 carbenicillin 500mg/L와 카나마이신 20 mg/L가 첨가된 기관발생능 캘러스 유도배지에 옮겨 8주 동안 배양하였다.
배양 8주후 카나마이신에 저항성을 갖는 기관발생능 캘러스를 다시 동일한 항생제 농도가 첨가된 식물체 유도배지 즉 BAP 3.2 mg/L와 IBA 0.5 mg/L를 첨가한 MS 고체배지에서 배양하였다. 카나마이신에 저항성을 갖는 기관발생능 캘러스가 배양 4주 째부터 잎절편 가장자리로부터 형성되기 시작하였으며, 배양 약 13주 째부터 이러한 캘러스로부터 식물체가 유도되기 시작하였다. 다시 6주 경과 후 카나마이신에 저항성을 갖는 형질전환 개체를 MS 기본배지에 옮겨 뿌리 발생을 유도하였으며, 그로부터 4주 후 약 56개체의 형질전환 후보 식물체를 얻었다.
캘러스로부터 형질전환 후보 식물를 얻는 과정의 상황을 도 2에 사진으로 나타내었다. 사진에서 딸기 잎절편 배양으로부터 식물체가 재생된 것을 확인할 수 있다.
실시예 4 : 재분화 딸기 식물체로부터 인체 락토페린 유전자 확인
상기 과정에서 획득한 식물체 세포에 실제 인체 락토페린 유전자가 도입되어 존재하고 있는 지, 이 유전자가 전사되고 있는 지를 확인하였다.
(1) PCR 분석
상기 과정에서 획득된 형질전환 후보 식물체에서 무작위로 선택된 6개체 세포의 genomic DNA 및 pLSM1 plasmid DNA를 대상으로 하였다.
식물세포로부터 Edwardset al,(1991)의 방법으로 genomic DNA를 분리한 후 락토페린 유전자 primer를 이용한 PCR을 수행하였다.
PCR에 사용된 락토페린 primer의 서열은 아래와 같으며, PCR은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분으로 30회 수행하였다.
5′-GGCTCCTGCAAATTTGATGA-3′(서열 1)
5′-TTACTTCCTGAGGAATTCAC-3′(서열 2)
합성된 DNA를 1% agarose gel에 전기영동 한 후 밴드를 확인하였다(도 3). 도 3에서 첫 째 라인은 marker, 둘 째 라인은 pLSM1 plasmid DNA이며, 3~8 번째 라인은 상기 형질전환를 거친 재분화 개체들의 세포를 나타낸다.
조사 결과 무작위로 선택된 6개의 딸기 식물체 개체 모두에서 약 700 bp 크기의 인체 락토페린 유전자를 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명에 의한 상기 형질전환된 딸기 식물체의 genome DNA에는 인체 락토페린 cDNA를 함유하고 있음을 알 수 있다.
(2) Northern blot 분석
상기 형질전환 후보 개체의 락토페린 유전자 발현을 조사하기 위하여 초원심분리기를 이용하여 무작위로 선택된 4 개체에서 잎의 total RNA를 분리하였다.
얻어진 RNA 30㎍ 씩을 65℃에서 변성시켜 formaldehyde가 함유된 1% agarose gel에 전기영동한 후 20X SSC 용액에서 나일론 membrane(Turboblotter, Schleicher ＆ Schuell)에 옮기고 [α-32P] dCTP로 표지된 lactoferrin probe (1.0 kb)를 이용하여 northern blot 을 수행하였다(도 4).
도에서 NC는 형질전환되지 않은 대조군 딸기 개체의 것을, L1~L4는 형질전환된 개체의 것을 나타낸다. 도면으로부터 알 수 있듯이, 형질전환 딸기 식물체에 도입된 인체 락토페린 유전자가 전사수준에서 발현되어 인체 유래 락토페린 단백질을 위한 mRNA를 생산하고 있음이 확인되었다.
본 발명에 의하면 인체 유래 단백질인 락토페린을 딸기 식물체 및 딸기에서 발현시키게 되므로 각종 바이러스나 병원균에 대한 저항성이 증가된 딸기 개체를 얻을 수있으며, 나아가 딸기를 통하여 인체 면격강화 단백질인 락토페린을 용이하게 섭취할 수 있기 때문에 딸기의 상품적 가치를 대폭 향상시킬 수 있게 된다.
나아가 고가인 락토페린을 저렴하게 생산할 수 있게 되어 이를 이용한 다양한 식품, 건강식품, 건강보조식품 등이 개발될 수 있을 것이다.
또한 락토페린을 생산하는 딸기 식물체 또는 그 부산물을 가축 사료로 사용할 경우 가축의 내병성 증가와 동시에 축산비용을 절감시킬 수도 있을 것이다.

Claims (5)

  1. 인체 락토페린 유전자를 함유하는 식물 형질전환용 벡터를 제작하는 단계;
    상기 과정에서 획득된 벡터로 딸기 식물체 절편을 형질전환하는 단계;
    상기 형질전환된 딸기 식물체 절편을 재분화시키는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 락토페린을 생산하는 딸기 식물체의 획득방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 형질전환은Agrobacterium매개법, microprojectile(particle) bombardment법, PEG-mediated fusion법, Electroporation법, Microinjection법 및 Liposome 매개법으로 이루어지는 형질전환 방법 중 어느 하나의 방법으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 인체 락토페린을 생산하는 딸기 식물체의 획득방법.
  3. 제 1 항에 의한 방법에 의해 획득된, 인체 락토페린을 생산하는 딸기 식물체.
  4. 제 3 항에 의한 딸기 식물체에 의해 생산된, 인체 락토페린을 함유하는 딸기.
  5. 제 4 항에 의한 인체 락토페린을 함유하는 딸기를 원료로 하는 식품.
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