CN102127164B - 一种从水稻种子中提取重组人血清白蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从转基因水稻中提取重组人血清白蛋白的方法，包括步骤：1)将含有重组人血清白蛋白的稻米研磨至80-120目，与提取缓冲液按1∶5混合，在55～60℃提取1～3小时，得混合物I；所述提取缓冲液包含10～30mM磷酸盐缓冲液、10～20mM醋酸钠、15～30mM硫酸铵与5～20mM辛酸钠，其pH为6.5～8；2)将混合物I的pH调节至4.0～4.5，室温沉淀3～12小时，得混合物II；3)过滤混合物II，收集滤液，获得含有高浓度重组人血清白蛋白的溶液。所得溶液中重组人血清白蛋白的浓度可以达到650～660μg/ml，比改进前方法的提取量提高了1.15倍并且杂蛋白减少了2.46倍，为下一步人血清白蛋白的纯化提供了基础。

Description

一种从水稻种子中提取重组人血清白蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从水稻种子中高效提取重组人血清白蛋白(rHSA)的方法。
背景技术
人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人体血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右。每升人血含有HSA约40g。HSA除存在于血浆中外，还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。在人的正常生理条件下，HSA具有维持血浆胶体渗透压、营养和促进伤口愈合的作用，而且其作为载体物质，参与诸多疏水性生物分子如激素、生物学活性物质及药物在血液中的运输。因此，HSA是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等。
目前，临床上使用的HSA主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，这种制备途径存在以下缺点：一方面血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求；另一方面血液自身也可能存在风险，例如可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的HSA存在巨大的担忧。因此，寻找其他途径生产人血清白蛋白成为当务之急。
随着现代DNA重组和合成技术的发展，研究人员对重组人血清白蛋白(rHSA)的生产和应用产生了极大的兴趣。迄今为止，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产rHSA，例如利用原核生物如大肠杆菌(Latta，M.etal.，Bio/Technology，5：1309-1314，(1987))、枯草芽孢杆菌(Saunders，C.W.et al，J.Bacteriol.169：2917-2925，(1987))，真核生物如酵母(WO 00/44772，EP0683233A2，US 5612196)、动物细胞培养等生产rHSA。但这些方法因表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。
本发明人的中国专利申请No.200510019084公开了一种利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产rHSA的方法，包括利用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导rHSA进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使rHSA能在水稻种子内大量积累，最终达到较高的表达水平。所得的rHSA的表达水平至少达到水稻种子重量的0.3％以上。该方法具有表达量高、成本低的优势，为蛋白药物的生产开辟了一条新途径。
目前，还没有从转基因水稻中提取rHSA的成熟生产工艺，建立从转基因水稻种子的提取蛋白质的方法和工艺，最大限度地增加目标蛋白的提取效率、降低非目标蛋白的提取率是研究和开发工艺的关键要素。提高rHSA的提取得率是提高生产效率并降低生产成本的最有效途径。本发明建立了从水稻种子中规模化高效提取重组人血清白蛋白的工艺和流程。
发明内容
本发明的目的是提供一种从转基因水稻中高效提取重组人血清白蛋白(rHSA)的方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种从转基因水稻中提取重组人血清白蛋白的方法，包括步骤：
1)将含有重组人血清白蛋白的转基因稻谷去壳、稻米粉碎后获得的转基因米粉与提取缓冲液混合，搅拌提取，得混合物I；
2)调节步骤1)的混合物I的pH至4.0～4.5，室温沉淀3～12小时，得混合物II；
3)过滤步骤2)的混合物II，收集滤液，获得含有高浓度重组人血清白蛋白的溶液。
具体地，步骤1)中，根据重组人血清白蛋白在存在于水稻胚乳细胞的淀粉粒之间，为了去除杂蛋白的提取率，将含有重组人血清白蛋白的转基因稻谷去壳后，糙米粉碎为80～120目的米粉，以提高重组人血清白蛋白的提取效率。
所述提取缓冲液包含20～30mM磷酸盐缓冲液、10～20mM醋酸钠、10～20mM硫酸铵与5～20mM辛酸钠，提取缓冲液的pH为6.5～8。
为了获得最高重组人血清白蛋白的提取率和平衡提取体积与提取效率的关系，米粉与提取缓冲液可以以重量/体积比(kg/l)，米粉重量/提取缓冲液体积)1∶5～1∶10的比率混合，以每分钟60转的速率进行搅拌提取1～3小时。经过实验发现，1∶5～1∶10之间的对总蛋白和重组人血清白蛋白的提取量没有明显影响，从降低成本和减少体积考虑，所述转基因米粉与提取缓冲液优选地以重量/体积比(Kg/L)1∶5混合，提取时间优选为1～1.5小时。
为了能最大效率地从水稻米粉中提取重组人血清白蛋白，根据人血清白蛋白在60℃下具有稳定性的原理，在不使人血清白蛋白变性的前提下，提高提取温度，可以提高总蛋白和重组人血清白蛋白的提取率，因此，本发明中可采用加热处理，从而有效地增加了重组人血清白蛋白的提取率，所述提取温度可以为45～60℃，优选为55～60℃。
由于加热和高pH条件下不仅增加重组人血清白蛋白的提取还增加了杂蛋白的提取，为了消除在上述提取过程中增加杂蛋白，根据人血清白蛋白的等电点，在其等电点的范围内，水稻胚乳储藏蛋白可以得到沉淀的原理，本发明在步骤2)采取了在低pH下沉淀方法，在完成提取后，将提取混合物的pH调节至4.0～4.5，并在室温下放置沉淀至少1小时，能有效地消除了由于加热和高pH值提取产生的杂蛋白质过多的负效应。在一种实施方式中，用醋酸调节pH至4.0～4.5，优选调节至4.5；沉淀时间为1～12小时，优选3～12小时，更优选3小时。
根据水稻米粉的淀粉颗粒与液体的不同，采用了现有的成熟技术设备，将步骤2)沉淀之后的提取混合物经滤布压滤或相当的设备进行固液分离，实现了在规模化过程中有效地分离废物淀粉和蛋白提取物的目的，为本工艺提供了一个简单、快速和廉价的方法，最终获得含有高浓度重组人血清白蛋白的溶液。
在一种实施方式中，所述过滤包括用滤布式板框压滤机压滤，接着用中空纤维膜微滤。所述中空纤维膜为聚醚砜材质、孔径0.20μm～0.45μm的中空纤维膜，优选为孔径0.20μm的聚醚砜材质中空纤维膜。
根据本发明的方法制备的含有重组人血清白蛋白的溶液中，重组人血清白蛋白的浓度达到0.65～0.66mg/ml；总蛋白的初始提取浓度为6.90～7.05mg/ml，通过沉淀步骤后下降至约2.8mg/ml，杂蛋白含量显著降低。
本发明的技术方案具有以下优点：
1、通过不同pH值与不同盐浓度配合，提高了重组人血清白蛋白的提取率。测试数据显示，按照本发明方法所得的提取料液中重组人血清白蛋白的浓度可以达到0.65～0.66mg/ml，用改进前的方法获得的重组人血清白蛋白的浓度仅0.30～0.315mg/ml；根据本发明改进后的方法，相同重量米粉中的重组人血清白蛋白的提取量提高了1.15倍。
2、降低了杂蛋白的提取率。按照本发明方法的初始提取料液中总蛋白浓度为6.90～7.05mg/ml，通过沉淀步骤使总蛋白含量为2.8mg/ml，降低了2.46倍。
3、通过改进微滤步骤加强了除菌效果，消除引入随后纯化步骤中的微生物污染，降低进入生产环节的细菌内毒素的量。
附图说明
图1显示不同温度和提取时间对总蛋白提取的影响。
图2显示不同温度和提取时间对rHSA提取的影响。
图3显示不同温度和提取时间正交组合所得样品的SDS-PAGE图谱。
图4显示不同pH和硫酸铵盐浓度对总蛋白提取的影响。
图5显示不同pH和硫酸铵盐浓度对rHSA提取的影响。
图6显示不同硫酸铵盐浓度和提取液pH值正交组合所得样品的SDS-PAGE图谱。
图7显示不同辛酸钠浓度和沉淀时间对总蛋白提取的影响。
图8显示不同辛酸钠浓度和沉淀时间获得的提取物的SDS-PAGE图谱。
图9显示不同pH和沉淀时间获得的提取物的SDS-PAGE图谱。
图10显示不同孔径膜过滤前后料液中rHSA占总蛋白百分比示意图。
具体实施方式
通过以下实施例可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅为说明本发明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】根据本发明改进后的方法从转基因稻米中提取rHSA
参考本发明人的中国专利申请No.200510019084的方法制备含有rHSA的转基因水稻。将稻谷脱壳成半精米，研磨成80～100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1∶5(重量/体积，kg/l)的比例混合，于60℃提取1.5小时。提取缓冲液的成分为：25mM磷酸盐缓冲液、20mM醋酸钠、10mM硫酸铵、10mM辛酸钠，pH 7.5。将上述得到的混合物用醋酸调节pH至4.5，并放置沉淀至少3小时，用滤布式板框压滤机压滤和孔径0.20μm的中空纤维柱过滤，得到澄清的rHSA提取液。rHSA的浓度约为0.66mg/ml。
【实施例2】根据本发明改进前的方法从转基因稻米中提取rHSA
参考本发明人的中国专利申请No.200510019084的方法制备含有rHSA的转基因水稻。将稻谷脱壳成糙米，研磨成80～100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1∶5(重量/体积，kg/l)的比例混合，在常温下提取1小时。提取缓冲液的成分为：20mM醋酸钠和25mM磷酸盐缓冲液体系，pH 6.5。将上述得到的混合物用醋酸调节pH至4.5，并放置沉淀1小时，用滤布式板框压滤机压滤和孔径0.45μm的中空纤维柱过滤，得到rHSA的提取液。rHSA的浓度约为0.314mg/ml。与本发明的提取方法相比，总蛋白的含量只有本发明提取方法的40.5％，重组人血清白蛋白的含量是本发明提取方法的47.7％(图1至图3)。
【实施例3】提取温度和提取时间对rHSA提取的影响
本实施例中采用固定的提取缓冲液，对不同的提取温度(分别为45、50、55、60℃)和提取时间(分别为20、40、60、80min)进行正交组合，得到不同的提取液样品。用BCA法测定每个提取液样品中总蛋白质的浓度，用ELISA法测定提取液中rHSA的浓度。测定结果分别见图1和图2。将各个提取液样品进行SDA-PAGE检测，电泳图谱如图3所示。
从图1和2可以看出，米粉提取液中总蛋白和rHSA的浓度随着提取时间和提取温度的升高而呈现增加的趋势。提取温度大于提取时间对提取效率的影响。在该条件下60℃提取60分钟时，rHSA的提取效率最高。从图3的电泳图谱可以看出，在不同温度和时间条件下，提取的蛋白图谱在大于rHSA分子量的区域存在明显差别，而低于rHSA分子量区域的谱带在不同提取条件下保持一致。
【实施例4】提取缓冲液pH与硫酸铵盐浓度对rHSA提取的影响
本实施例中采用55℃恒温提取60分钟的固定条件。米粉与提取缓冲液的重量/体积比(Kg/L)为1∶5。对不同硫酸铵浓度(分别为0、10、30、50mM)和提取缓冲液pH值(分别为pH 6.5、7、7.5、8)进行正交组合，每个提取条件组合的样品使用BCA法测定提取获得的总蛋白浓度，使用ELISA测定提取液中rHSA的浓度。测定结果分别见图4和图5。对不同硫酸铵盐浓度和提取缓冲液pH值正交组合所得的各样品的SDS-PAGE电泳图谱如图6所示。
从图4和5所示的结果可以看出，米粉提取液中总蛋白和rHSA的浓度随着提取缓冲液pH值和盐浓度的升高而整体呈现增加的趋势，个别数值出现偏离。提取缓冲液pH值对rHSA提取的影响明显大于提取液盐浓度对提取效率的影响。当该条件下提取缓冲液pH7.5，盐浓度10mM时，rHSA提取效率最高。与不同的提取时间和温度相比，不同的pH和盐浓度对提取出的条带差别极小，在较高pH时rHSA主带上方微小条带略多；其他各主要条带一致，如图6所示。
【实施例5】沉淀时间和辛酸钠浓度对rHSA提取的影响
将提取缓冲液中辛酸钠浓度分别设置为10mM、20mM、30mM、40mM，测试随着辛酸钠浓度的提高是否对rHSA的保护效果更好；提取结束后加入硫酸铵并调节pH至4.5，分别在0、1、2、3小时和过夜沉淀后取样测定蛋白浓度。不同沉淀时间和硫酸铵浓度对总蛋白提取的影响如图7所示。不同硫酸铵浓度和沉淀时间获得的提取液样品的SDS-PAGE图谱如图8所示。图7和图8中的提取液是指提取完成之后、调节pH之前的混合物样品。
从图7和图8的结果可以看出，提取液调节pH至4.5时的冲击造成rHSA大量沉淀，随着沉淀时间的延长，一部分沉淀rHSA重新溶解，过夜沉淀后总蛋白平均浓度是未沉淀时数值的78％，过夜沉淀未出现降解现象；沉淀过程中降解带和杂蛋白也有大量沉淀；20mM辛酸钠保护效果最好，高浓度反而造成沉淀加剧。
【实施例6】沉淀时pH和沉淀时间对沉淀效果的影响
为测定pH和沉淀时间对沉淀效果的影响，将米粉和提取缓冲液(25mM磷酸盐缓冲液，10mM硫酸铵，10mM辛酸钠，pH7.5)以以1∶5的重量/体积比(Kg/L)混合，并在60℃搅拌提取1小时，将所得到的米粉提取液分成六等份，分别调pH为4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0。将调过pH的提取液于摇床上常温振荡，分别在振荡1小时和2小时后取样，所取样品的SDS-PAGE图谱如图9所示。图9中的提取液是指提取完成之后、调节pH之前的混合物样品。
从图9的SDS-PAGE图谱可以看出，随着pH降低，杂蛋白沉淀效果增强，同时伴随着rHSA的损失；沉淀时间的延长对沉淀效果有正向的影响。pH 4.1以下时大分子条带完全沉淀。考虑到工艺系统的要求，优选pH 4.5为沉淀条件，此时目的rHSA的损失最小。
【实施例7】微滤步骤中使用不同孔径的聚醚砜中空纤维膜除菌效果的比较
1、采用不同滤膜微滤对去除稻米细菌的影响
本实施例所用的样品来自中试生产中高表达米粉经改进提取工艺处理而获得的压滤澄清料液。分别使用0.20μm和0.45μm两种孔径的小型中空纤维柱处理样品。收集处理前的料液和处理后的滤过液，用0.1ml原液或者稀释液涂LB平板，考察两种滤膜的除菌效果。实验结果见表1。经0.20μm和0.45μm中空纤维膜过滤处理的提取液，分别测定过滤前后提取液中重组人血清白蛋白和总蛋白的浓度，并计算重组人血清白蛋白占总蛋白的比例，百分比柱状图见图10。
表1
Figure GDA0000048436450000071
从表1的结果可以看出，0.45μm的中空纤维膜可以去除压滤后料液中50％～90％的活体细菌，而0.20μm的中空纤维膜可以100％去除压滤料液中的活体细菌，保证在随后的纯化步骤中不会因为料液途径而引入微生物污染，可以降低进入生产环节的细菌内毒素的量。
从图10的结果看，比较0.2μm和0.45μm过滤后的样品，0.2μm过滤的样品中重组人血清白蛋白损失的程度更小于总蛋白质损失的程度。经0.2μm过滤后的提取液中重组人血清白蛋白的相对浓度得到提高。

Claims (6)

1.一种从转基因水稻中提取重组人血清白蛋白的方法，包括步骤：
1)将含有重组人血清白蛋白的转基因稻谷去壳、稻米粉碎后获得的转基因米粉与提取缓冲液混合，搅拌提取，得混合物I；其中所述转基因米粉的细度为80～120目；所述提取缓冲液包含10～30mM磷酸盐缓冲液、10～20mM醋酸钠、15～30mM硫酸铵和5～20mM辛酸钠，其pH为6.5～8；所述转基因米粉与提取缓冲液是以重量/体积比1∶5～1∶10kg/l混合，提取时间为1～3小时，提取温度为45～60℃；
2)调节步骤1)的混合物I的pH至4.0～4.5，并沉淀1～12小时，得混合物II；
3)过滤步骤2)的混合物II，收集滤液，获得含有高浓度重组人血清白蛋白的溶液；其中所述过滤包括用滤布式板框压滤机压滤，接着用聚醚砜材质的中空纤维膜微滤；所述中空纤维膜为孔径0.20μm～0.45μm的聚醚砜材质中空纤维膜。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤1)中所述提取缓冲液包含25mM磷酸盐缓冲液、20mM醋酸钠、20mM硫酸铵和20mM辛酸钠，其pH为7.5。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤1)中所述转基因米粉与提取缓冲液是以重量/体积比1∶5kg/l混合，提取时间为1～1.5小时，提取温度为55～60℃。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中所述混合物I的pH调节至4.0～4.5，并在室温下沉淀3～12小时。
5.如权利要求4所述的方法，其中步骤2)中所述混合物I的pH调节至4.5，并沉淀3小时。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述聚醚砜材质中空纤维膜为孔径0.20μm的聚醚砜材质中空纤维膜。
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