CN103239477A

CN103239477A - 间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性因子的分离与制备方法

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Publication number: CN103239477A
Application number: CN2012100293107A
Authority: CN
Inventors: 冯长访; 罗军蓉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-02-10
Filing date: 2012-02-10
Publication date: 2013-08-14

Abstract

本发明设计间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性因子的分离与制备方法。通过干细胞培养的上清液和培养的干细胞，将其细胞破碎，提取干细胞中的干细胞活性因子。分离制备的干细胞活性因子在再生医学(包括恶性肿瘤、心脑血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等)和保健品等中具有广阔的应用前景，并将产生重大的社会效益和巨大的经济效益。

Description

间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性因子的分离与制备方法

技术领域

本发明专利设计间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性因子的分离与制备方法。通过间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞培养的上清液和培养的干细胞，将其细胞破碎，提取间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞中的干细胞活性因子。

背景技术

间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞表达、合成和分泌的转录因子、生长因子、细胞因子、调节肽、细胞信号分子、核苷类等生物活性因子，对心脏、肝脏、肾脏和神经系统等的修复与保护作用；并有促进细胞增殖、分化，防止细胞衰老；干细胞可通过其表达、合成和分泌的干细胞活性分子影响靶器官结构、功能状态及其病理状态下的修复，它是实现干细胞治疗改善靶器官功能、抗凋亡、抗癌、抗衰老、抗炎、治疗糖尿病等作用的重要功能物质。

本发明提供了间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞表达、合成和分泌的干细胞活性因子的分离与制备方法。分离制备的干细胞活性因子在再生医学(包括恶性肿瘤、心脑血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等)和保健品等中具有广阔的应用前景，并将产生重大的社会效益和巨大的经济效益。

发明内容

分离制备的间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性物质可分为两类：小分子干细胞活性物质成为干细胞活性转移因子。大分子物质为大分子干细胞活性因子。

(一)分离培养干细胞

1、收获干细胞培养的上清液：分离培养干细胞，用相应的培养基和因子培养细胞，待细胞生长到合适阶段，收获上清液；亦可多次传代，多次收获。

2、收获培养的干细胞：分离培养干细胞，用相应的培养基和因子培养细胞，待细胞生长到合适阶段，收获培养的干细胞。

(二)干细胞活性因子的分离制备

1、裂解细胞、释放干细胞活性因子将收获的干细胞加合适的液体，并调节到合适的pH值，采用机械(超声波、胶体磨等)或物理(如多次冻融等)学方法裂解破坏细胞，使其释放细胞内干细胞活性因子。

干细胞培养上清液不需裂解程序，可直接按下面方法分离提取干细胞活性因子。

2、分离提取干细胞活性因子

可用以下方法：

(1)透析提取小分子干细胞活性因子(相似于干细胞活性转移因子)

将上述干细胞裂解物，经适当处理后，装入透析袋或玻璃纸透析装置内，在一定温度下透析，12-30小时收取透析液。

(2)中空纤维柱分离提取干细胞活性因子

将上述干细胞裂解物，经适当处理后，用适当分子截留孔径(如0.2KD、5KD、10KD、15KD等)的中空纤维柱分离截取干细胞活性因子，按分子量不同，小分子物质为干细胞活性转移因子，大分子物质为大分子干细胞活性因子。

(3)离子交换和层析提取干细胞活性因子

采用离子交换和层析分离提取干细胞活性因子，根据干细胞的分子量或亲和性分步(或特定)收集干细胞活性因子。

3、干细胞活性因子的鉴定

(1)蛋白质浓度的鉴定。

(2)核糖和多核苷酸的浓度鉴定。

(3)蛋白质和核酸类物质的分类鉴定。

(4)干细胞活性因子的生物活性鉴定。

4、可形成的干细胞活性因子制剂

(1)注射用制剂。

(2)口服制剂。

(3)喷雾制剂。

(4)外用制剂。

附图说明

无

具体实施方式

下面通过四个实例描述本发明所涉及的提取干细胞活性因子的方法，但本发明所涉及的范围并不局限于本四个实例。

实施例一：用透析袋或玻璃纸制备干细胞小分子活性因子(类似转移因子)

1、细胞分离：从胎儿骨髓、肝、脾、脐带；婴儿脐带；人骨髓、外周血液；人脂肪组织等分离干细胞、间充质干细胞和成体干细胞，用专门配制的或购买的培养基培养细胞干细胞。

2、细胞检定：经流式细胞仪检定细胞表面标志和生物芯片检定其表面标志、生长因子和细胞因子等。

3、细胞和细胞分泌液的收获：

(1)收获细胞分泌液：直接收获细胞培养上清液，然后进行分离纯化。

(2)收获干细胞：将培养一定时间的干细胞，2000转/分，离心10分钟，上清液为细胞分泌液；细胞用注射用水悬浮，调整细胞浓度，用醋酸缓冲液调pH3.5-7.0。

(3)破碎细胞：将悬浮的细胞置于-20℃冷冻，水浴解冻，连续冻容3次，显微镜下观察细胞冻容情况，如还有较多的完整细胞，可增加冻融次数。

(4)收获冻融液：将细胞冻融液4000转/分，离心15分，取上清液(细胞冻融液)用NaOH溶液调pH7.0。

(5)透析：将细胞冻融液装入分子截留量为1万(10KD)～1.5万的透析袋和玻璃纸装置内，对PBS透析8～30小时，温度为4℃左右。中间每3小时将透析袋或玻璃纸装置内的液体物质混匀一次。

取出透析袋或玻璃纸装置，透析袋内和玻璃纸装置内的液体，用于进一步分离大分子干细胞活性因子。

(6)超滤：收集浓缩透析液，将透析液用0.15KD孔径的中空纤维过柱，截留0.2KD以上的小分子干细胞因子，去水并将小分子干细胞因子浓缩。

用注射用生理盐水调小分子干细胞至所需浓度。

(7)必要时冻干。

实施例二：用中空纤维分离获取干细胞活性因子

1、干细胞破碎(冻融)液、透析袋和玻璃纸装置内液体和细胞培养上清液(细胞分泌液)过一定孔径的中空纤维柱。

2、分离获取大分子干细胞因子：

(1)分离截取干细胞因子：用10～15KD孔径的中空纤维，将上述液体物质过柱；截取10～15KD以上的干细胞因子，再过150KD孔径的中空纤维柱，收集15～150KD的干细胞因子。

(2)收集浓缩干细胞因子：将收集的15～150KD的干细胞因子，用0.15KD孔径的中空纤维过柱浓缩去掉水分子。

3、分离截取小分子干细胞因子(类似转移因子)

(1)分离截取浓缩小分子干细胞因子：将10～15KD以下的干细胞因子，用0.15KD孔径的中空纤维过柱，去水并浓缩小分子干细胞因子。

(2)收集小分子干细胞因子：将浓缩去水的小分子干细胞因子用生理盐水调至所需浓度

4、必要时冻干干细胞因子。

实施例三：层析分离(离子层析、疏水层析、亲和层析、凝胶层析等)

本例以凝胶层析分离单分子或多分子物质

1、根据干细胞分子量大小用一定型号的葡聚糖凝胶(Sephndex)柱进行分离纯化。

2、干细胞破碎(冻融)液、透析袋和玻璃纸装置内液体和细胞培养上清液过柱。

3、按分子量大小分布收集流出液。

4、用0.15KD的中空纤维浓缩去水。

5、调制所需浓度。

6、必要时冻干。

实施例四：

分离提取干细胞，可以多种方法联用，如层析(凝胶层析加亲和层析)、中空纤维及透析联用。

提取干细胞因子环境条件的基本要求：

(1)细胞：包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞。

(2)场地：合乎GMP要求的车间。

(3)制品用水及化学药品：注射用水、注射用胜利盐水、化学物质要求分析纯。

干细胞活性因子的鉴定：

(1)蛋白质浓度的鉴定。

(2)核糖和多核苷酸的浓度鉴定。

(3)蛋白质和核酸类物质的分类鉴定。

(4)干细胞活性因子的生物活性鉴定。

Claims

1.用透析袋或玻璃纸提取小分子间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性物质(干细胞活性转移因子)。

2.用中空纤维柱分离截留小分子间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性物质和大分子干细胞活性物质。

3.用层析法分离提取制备间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞内的干细胞活性因子。

4.裂解破坏干细胞，分离提取制备间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性因子。