CN103446382B

CN103446382B - 中药复方药物组合物的用途

Info

Publication number: CN103446382B
Application number: CN201310314076.7A
Authority: CN
Inventors: 陆华; 叶尚勉; 胡翔; 刘志斌
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2013-07-24
Filing date: 2013-07-24
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2033-07-24
Also published as: CN103446382A

Abstract

本发明公开了含有下述重量配比的原料药在制备早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液中的用途：熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶8-16份。本发明还公开了早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液及诱导方法。本发明诱导液可以诱导早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞分化为类卵细胞，临床应用前景良好。

Description

中药复方药物组合物的用途

技术领域

本发明涉及一种中药复方药物组合物的新用途，具体地，是在制备早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液中的用途。

背景技术

近年来，由于环境污染严重、工作压力加大、饮食习惯改变、生殖系统疾病等因素对正常受孕造成不利影响，不孕症患者数量呈上升势头，发病率约为12.5%～15%，且有逐年增加趋势。因此世界卫生组织（WHO）宣布将不孕症与心血管病、肿瘤并列为当今影响人类生活和健康的三大主要疾病。自1978年全球首例试管婴儿诞生以来，以体外授精-胚胎移植（IVF-ET）为代表的辅助生殖技术（ART）的引入给不孕不育症的成功治疗提供了更大的可能。助孕的相关研究对于解决不孕不育患者的实际问题具有现实的意义。

体外受精（IVF）是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。目前，体外受精包括促排卵、卵泡检测与取卵、精子的优选与处理和体外受精步骤。诱发多个卵泡发育的促排卵是不孕治疗的重要基础，此环节早时使用自然周期排卵，但每一自然周期一般仅有一个卵泡成熟，提供卵子少，导致实施以后步骤困难，且妊娠率低，现已被超排卵技术所取代。超排卵技术是指应用人类促性腺激素促进更多卵泡成熟排卵的一种技术。但由于此过程多个同时发育，雌二醇增加，引起反馈性的黄体生成素（LH）峰出现，导致卵子早熟，质量差，妊娠率低，而且因药物过度使用引起的并发症，如卵巢过度刺激综合征(OHSS)、多胎妊娠、出生缺陷和表遗传学修饰异常等。

补肾中药介入辅助生殖技术，具有调经、助孕、促卵泡发育及排卵、提高卵细胞质量以及提高卵子受精率、促进早期胚胎发育的作用，已得到证实。补肾中药的上述作用与激素、细胞因子等因素有关。目前在辅助生殖技术中与补肾中药联系较为紧密的环节主要是超促排卵和胚胎移植。研究主要以卵细胞质量、体外受精及胚胎发育、子宫内膜容受性为切入点。

左归丸和右归丸出自明代温补名家张景岳的《景岳全书·新方八阵》，为补益肾阴、肾阳的经典方。有研究表明右归丸可以抑制CRL-1825细胞凋亡，并可能与调控Notch1、P16INK4a表达相关。左归丸可以促进胚胎干细胞增殖、维持其不分化状态，阻滞胚胎干细胞凋亡（胡兵,安红梅,史云峰等中国中医基础医学杂志 2007 年第13 卷第5 期 365-367）。也有文献报道左归丸含药血清在间充质干细胞( mesenchymal stem cells，MSCs) 向软骨细胞定向分化过程中可促进MSCs 增殖，并提高Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达（左归丸对间充质干细胞向软骨细胞分化过程中Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达的影响徐凌霄王芳郭敦明等中国中西医结合杂志2011 年12 月第31 卷第12 期 1662-1668）。左归丸水提液在一定浓度范围内可以提高大鼠骨髓间充质干细胞的体外增殖能力（左归丸对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响谭峰，樊巧玲，王明艳等中国实验方剂学杂志第17 卷第13 期 2011 年7 月 145-148）。综上，补肾中药复方左右归丸可以促进胚胎干细胞和间充质干细胞的增殖，并影响间充质肝细胞的胶原、蛋白多糖基因表达，未见关于其影响干细胞分化的报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种中药复方药物组合物的新用途。具体地，是在制备用于诱导早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞分化为类卵细胞中的用途。

早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞，First Trimester-derived Perivascular Cells，简称FTM-PVCs，来源于早孕流产胚胎脐带，具有很强的自我增殖的能力，可诱导分化为多种类型的细胞。

类卵细胞，是指具有卵细胞样结构，表达卵细胞标志物的细胞。

本发明含有下述重量配比的原料药在制备早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液中的用途：熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶8-16份。

其中，所述原料药的重量配比如下：熟地24份、山茱萸9-12份、山药12份、枸杞子9-12份、菟丝子12 份、鹿角胶12份。

其中，所述原料药的重量配比如下：熟地24份、山茱萸12份、山药12份、枸杞子12份、菟丝子12份、鹿角胶12份。

其中，所述的原料药中还含有杜仲1-16份、肉桂1-9份、当归1-16份、制附子1-16份。

优选地，所述原料药中，杜仲为12份、肉桂为6份、当归为9份、制附子为6份。

本发明早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液，它以MEME培养液为基础培养液，添加有40~60 IU/ml青霉素、40~60 mg/ml链霉素和2~20%（v/v）的含药血清；所述含药血清按照如下方法制备：

（1）按照前述配比取原料药，制备成为超细粉，以5.0g/kg的剂量施用于鼠，施用方式为口服给药；

（2）给药30min、60min、90min后，眼底静脉丛取血，分别静置、离心得上清液，混匀，即为含药血清。

所述青霉素的浓度为50 IU/ml、所述链霉素的浓度为50 mg/ml，所述含药血清的浓度为2~5%（v/v）。

步骤（2）中，静置时间为2h，离心转速为3000rpm，离心时间为10min。

本发明诱导早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的方法，包括如下步骤：

a、取早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞；

b、置于前述的诱导液中培养，培养时间不低于3天，即得类卵母细胞。

步骤b中，培养时间为3~31天。

本发明补肾中药复方右归丸及其拆方组份可以促进早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞（FTM-PVCs）分化为类卵细胞，具有重要意义，为试管婴儿领域开拓新思路、新途径。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 含1号药鼠血清诱导人FTM-PVCs表达卵细胞标志物情况。培养第21天：B-1. 5%含1号药鼠血清培养组微弱表达GDF-9；其余组均未表达（A-1. 2%含1号药鼠血清培养组；A-2. 2%含1号药鼠血清+人FF培养组；A-3. 2%空白鼠血清+人FF培养组；A-4. 2%空白鼠血清组； B-2. 5%含1号药鼠血清+人FF培养组；B-3. 5%空白鼠血清+人FF培养组；B-4. 5%空白鼠血清培养组；C-1. 10%含1号药鼠血清培养组；C-2. 10%含1号药鼠血清+人FF培养组；C-3. 10%空白鼠血清+人FF培养组；C-4. 10%空白鼠血清培养组）。培养第31天：A-5. 2%含1号药鼠血清培养组微弱表达GDF-9；B-5. 5%含1号药鼠血清培养组微弱表达GDF-9；B-5. 10%含1号药鼠血清培养组未表达GDF-9；

图2 含2号药鼠血清诱导人FTM-PVCs形态学变化。A. control组；B.阳性对照组Positive control；C.2%2号药组；D.5%2号药组；E. 10%2号药组；F.20%2号药组；

图3 含2号药鼠血清诱导人FTM-PVCs体外分化为类卵细胞的形态学变化。A.E.I.control组无明显变化；B.F.J.空白鼠血清组无明显变化；C.G.K.含2号药鼠血清组出现类卵细胞样形态变化；D.H.L.Positive control组出现类卵细胞样形态变化；

图4 含2号药鼠血清诱导人FTM-PVCs表达卵细胞标志物情况。A: control组无GDF-9表达；B: Positive control组强表达GDF-9；C:2%2号药组表达GDF-9 ；D:5%2号药组表达GDF-9 ；E:2%空白血清组不表达GDF-9 ；F:5%空白血清组不表达GDF-9；

图5 5%含2号药鼠血清组不同时间段人FTM-PVCs产生E2情况；

图6 2%含2号药鼠血清组人FTM-PVCs表达卵细胞和透明带标志物mRNA情况。A．control组、positive组、空白鼠血清组、2%含2号药鼠血清组RT-PCR结果；B. 2%含2号药鼠血清组人FTM-PVCs表达减数分裂标志物和卵细胞标志物mRNA比较；C. 2%含2号药鼠血清组人FTM-PVCs表达透明带标志物情况。

具体实施方式

实施例1 本发明药物的制备

称取原料：熟地24g、山茱萸12g、山药12g、枸杞子12g、菟丝子12g、鹿角胶12g；

制备方法：以上六味，除鹿角胶外，其余熟地黄等六味粉碎成细粉，过筛混匀。取鹿角胶烊化，与上述细粉混匀，烘干密封保存，兑水服用，或每100g粉末加炼蜜 10g与适量的水。实施例2 本发明药物的制备

称取原料：熟地24g、山茱萸9g、山药12g、枸杞子9g、菟丝子12g、鹿角胶12g；

按实施例1方法制备。

实施例3 本发明药物的制备

称取原料：熟地18g、山茱萸9g、山药8g、枸杞子9g、菟丝子8g、鹿角胶8g；按实施例1方法制备。

实施例4 本发明药物的制备

熟地30g、山茱萸12g、山药16g、枸杞子12g、菟丝子16g、鹿角胶16g，按实施例1的方法制备。

实施例5 本发明药物组合物的制备（右归丸）

称取原料：熟地 24g、山药12g、山茱萸9g、枸杞子9g、菟丝子12g、鹿角胶12g、杜仲12g、肉桂6g、当归9g、制附子6g。

制备方法：将熟地蒸烂杵膏，余为细末，烘干密封保存，兑水服用，或加炼蜜为丸，如弹子大。每嚼服二三丸（6～9g），以滚白汤送下。

实施例6 本发明药物组合物的制备

称取原料：熟地30g、山茱萸12g、山药16g、枸杞子12g、菟丝子16g、鹿角胶16g、杜仲1g、肉桂1g、当归1g、制附子1g。

实施例7 本发明药物组合物的制备

称取原料：熟地18g、山茱萸9g、山药8g、枸杞子9g、菟丝子8g、鹿角胶8g、杜仲16g、肉桂9g、当归16g、制附子16g。

上述原料可以用原生药，也可以用原生药的炮制品。

以下是通过药效实验及临床实验证明本发明的有益效果。

名词解释：

FTM-PVCs：First Trimester-derived Perivascular Cells 早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞

FSH：follicle-stimulating hormone 卵泡雌激素

LH：Luteinizing Hormone 黄体生成素

E2：Estradiol雌二醇

FF:Follicular fluid 卵泡液

GDF-9：Growth differentiation facter 9 生长分化因子9

GDF-9B：Growth differentiation facter 9B 生长分化因子9B

SCP1：Synaptonemal Complex Protein 1 联会复合体蛋白质1

SCP2：Synaptonemal Complex Protein 2 联会复合体蛋白质2

SCP3：Synaptonemal Complex Protein 3联会复合体蛋白质3

ZP-1：zona pellucida glycoprotein1透明带糖蛋白1

ZP-2：zona pellucida glycoprotein2透明带糖蛋白2

ZP-3：zona pellucida glycoprotein3透明带糖蛋白3

实验例 1 本发明诱导液诱导 FTM-PVCs 分化为类卵细胞

1 、实验材料

1.1实验仪器

超声波清洗器(Ultrasonic cleaner)：昆山市超声仪器有限公司，KQ5200B；

电子天平(Electronic balance)：瑞士梅特勒-托利多公司，AB 265-5；

纯水机（Ultra-Pure Water Processor）：中国优普公司， UPR-IV-10T；

超纯水系统（Ultra-pure water system）：英国ELGA公司，UHQ2；

CO₂细胞培养箱（CO₂ Cell Culture Incubator）：美国Thermo Scientific公司，3111；

双人单面超净工作台（Double-person Single-face Super-clean Bench）:中国苏州净化公司， SW-CJ-2FD；

全波长紫外光/可见光分光光度计（Full Range Wavelength UV/Vis Spectrophotometer）：美国Beckman coulter公司，型号：DU730；

普通PCR仪（General PCR System）：美国MJ Research公司， PTC-200；

CO₂浓度检测仪（CO₂ Concentration Detector）：德国Labotect公司， InControl 1050；

正置荧光显微镜（Upright Fluorescence Microscope）：德国Leica公司，DM4000B；

倒置显微镜（Inverted Microscope）:德国Leica公司，DMI3000B；

倒置显微镜（Inverted Microscope）:日本Olympus 公司，CK-40；

人工授精（IVF）工作站（IVF Working Station）：丹麦Labogene公司，F-1800；

-80℃超低温冰箱（-80℃ Ultra-low Temperature Freezer）:日本Sanyo公司，MDF-U73C；

-40℃低温冰箱（-40℃ Low Temperature Freezer）:日本Sanyo公司，MDF-U5412；

4℃冰柜（4℃ Refrigerator）:日本Sanyo公司，MPR-1411R；

大型台式冷冻离心机（Large-sized Desktop Centrifuge with Refrigerator）：美国Thermo Scientific公司，Sorvall Biofuge Stratos；

台式冷冻离心机（Desktop Centrifuge with Refrigerator）：美国Thermo Scientific，Legend Micro 17R；

台式离心机（Desktop Centrifuge）：美国Thermo Scientific公司，Micromax；

体视显微镜（Stereo Microscope）: 日本Olympus公司，SZX10；

电泳系统（Electrophoresis System）：美国Bio-Rad公司，MP4；

洗板机（Microplate Washer）：美国Bio-Tek公司，ELx-50；

培养摇床（Culturing shaking incubator）：中国上海智成公司，ZHWY-111B；

大容量液氮罐（Large Volume Liquid Nitrogen Canister）：中国成都金凤公司，YDS-47-127；

大容量液氮罐（Large volume liquid nitrogen canister）：美国MVE公司，XC47/11-10；

高压灭菌锅（Autoclaver）：日本SANYO公司，MLS-3020；

全波长酶标仪（Full Wavelength Microplate Reader）：美国Thermo Scientific公司，Multiskan；

可见/紫外凝胶成像系统（Vis/UV Gel-Imaging System）：美国Bio-Rad公司，XR；

精密pH计（pH Meter）：德国Sartorius公司，PP-15；

恒温烤箱：上海精宏实验设备有限公司，DHG-9053A；

恒温水浴锅：四川成都赛可隆机械设备有限公司，esun-0048；

恒温磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，H01-1A；

0.1-2.5ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

0.5-10ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

10-100ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

20-200ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

100-1000ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

50-5000ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

100-10000ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

30-300ul 8道可调式移液器：eppendorf；

10-100ul 8道可调式移液器：eppendorf。

1.2 实验材料

早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞，即妊娠第一周期脐带组织细胞（Human first trimester umbilical cord cells），购自CReATe脐血库。

无菌生理盐水：四川科伦药业股份有限公司

I型胶原蛋白酶：Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）：Gibco-BRL, MD，USA

MEME培养基（Minimum Essential Medium Eagle）： Alpha Modification，Sigma-Aldrich，M4526

EB培养基（SCM018 Embryoid Body Formation Medium）：millipore，MD, USA

PBS：成都哈里生物

抗生素（Penicillin-Streptomycin）： Gibco-BRL, MD，USA

0.05%胰蛋白酶-0.01%EDTA：Gibco-BRL，MD，USA

低粘附培养板：STEMCELL Technologies, BC, Canada

六孔细胞培养板（6 well cell culture plate）、十二孔细胞培养板（12 well cell culture plate）：Labserv

培养皿（60mm、100mm）：Corning costar

通气盖75cm2、25 cm2培养瓶：Corning costar、NUNC

15ml锥形离心管：Corning costar

50ml锥形离心管：Corning costar

2ml一次性冻存管：Corning costar、NUNC

盖玻片：24×24mm，江苏世泰实验器材有限公司

一次性刻度塑料吸管2ml：Corning costar、Axygen

一次性刻度塑料吸管5ml、10ml、25ml：Corning costar、Axygen

一次性刻度塑料吸管50ml：KIMBLE

八孔、四孔、二孔细胞小室（8 well glass slide，4 well glass slide,2 well glass slide）：Lab-Tek

10ul袋装吸头：Axygen

200ul袋装吸头：Axygen

200ul无菌盒装吸头：Axygen

10ul无菌盒装吸头：Axygen

1000ul袋装吸头：Axygen

1000ul无菌盒装吸头：Axygen

0.5ml离心管：Axygen

1.5ml离心管：Axygen

0.5ml薄壁管[平盖]：Axygen

一抗： rabbit anti-OCT-4(1:200, Abcam)、rabbit anti-Nanog（1:100，Santa Cruz Biotechnology）、mouse anti- Fragilis/IFITM3（1:100，Santa Cruz Biotechnology）、rabbit anti-SCP1(1:200，Cell Signaling Technology)、rabbit anti- VASA（1:100，Santa Cruz Biotechnology）、rabbit anti- DAZL（1:100，Santa Cruz Biotechnology）、rabbit anti- STELLAR（1:200，Abcam）、rabbit anti-SCP3(1:200，Cell Signaling Technology)、rabbit anti-GDF-9（1:100，Abcam）、rabbit anti-GDF-9B（1:200，Santa Cruz Biotechnology）、rabbit anti- ZP1（1:200，Santa Cruz Biotechnology）、rabbit anti- ZP2（1:100，Sigma）、rabbit anti- ZP3（1:200，Santa Cruz Biotechnology）

二抗：山羊抗兔（HRP，碧云天），山羊抗小鼠（HRP，碧云天），蓝色DyLight 抗兔（Santa Cruz Biotechnology）、绿色FITC抗兔（Santa Cruz Biotechnology）

Hoechst 33258:碧云天

多聚甲醛：上海铭睿生物科技有限公司

Txiton X-100：Amresco

H2O2：成都科龙化工试剂厂

HRP-DAB底物显色试剂盒：碧云天

苏木素：碧云天

DMSO分析纯：天津市瑞金特化学药品有限公司

插入式细胞培养皿：millipore，0.4µm

0.22µm滤膜：millipore

注射用高纯度尿促性素（HMG）: Ferring GmbH

雌二醇(E2，Estradiol)：Cayman Chemical Company

叶酸（Folic acid）：Sigma

无水乙醇：成都科龙化工试剂厂

异丙醇：成都科龙化工试剂厂

三氯甲烷：成都科龙化工试剂厂

抗荧光淬灭封片液：碧云天

引物：上海捷瑞生物工程有限公司、英潍捷基（上海）贸易有限公司

Trizol® reagents ：Macherey-Nagel

人雌二醇(E2)酶联免疫试剂盒：San Antonio, TX, USA

矿物油（oil for tissue culture）：In Vitro Fertilization ,Inc,Trumbull

HTF（Quinns’s Advantage Fertilization）:In-Vitro Fertilization ，SAGE

人白蛋白代用品（Quinns’s Advantage TM Sps Serum Protein Substitute）：In-Vitro Fertilization ，SAGE，USA

六孔板共培养小室（6 well millicell Hanging Cell Culture Inserts）：Millipore

5ml、10ml一次性注射器：双鸽

cDNA试剂盒（Revert Aid TMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit）：Fermentas Life Sciences

一步法RT-PCR试剂盒：Fermentas Life Sciences

琼脂糖凝胶：Biowest Agarose

goldview：赛百盛

Trizol® reagents ：Macherey-Nagel

TAE缓冲液：Tris、Na2EDTA.2H2O、冰乙酸

眼科剪、眼科摄、手术剪、无菌棉球、75%酒精等

实施例1和实施例5制备的药物。

2 、实验方法

2. 1 各类含补肾中药鼠血清的制备

SD大鼠，清洁级，6～8周龄，体重220～250g，♀♂兼用，各15只，许可证号：SCXK(川)2004-15；四川省医学科学院实验动物研究所提供。动物饲养于清洁级动物室，温度22±2℃，湿度40～70%，10h/14h明暗交替，每3min自动换气一次，常规全价颗粒饲料喂养，自由饮水，♀♂分开饲养于不锈钢饲养笼内。

依据前期实验结果，在体重均一的情况下随机将30只大鼠分成3组：分别为空白组、1号药组、2号药组，每组10只，雌雄各半。空白组大鼠灌服蒸馏水，1号药组大鼠灌服左右归丸组方共有中药超细粉（实施例1制备的药物，简称1号药，含熟地、山茱萸、山药、枸杞子、菟丝子、鹿角胶）、右归丸组方中药混合超细粉（实施例5制备的药物，简称2号药，含熟地、山药、山茱萸、枸杞子、菟丝子、鹿角胶、杜仲、当归、肉桂、制附子），给药剂量均为5.0g/kg，给药容量为20ml/kg。分别于给药后30 min、60 min、90 min眼底静脉丛取血，血液静置2小时后，3000rpm离心10min，分离各组各不同时间段血清，将每组三个时间段的血清混匀备用。

经预试验比较水浴法、L-L萃取法、固相萃取法、蛋白沉淀法，选取蛋白沉淀法进行血清样品前处理，即取大鼠血清150μl，加入高氯酸-甲醇液（15μl 50%高氯酸+ 5μl甲醇），漩涡振荡2min，然后20000rpm离心10min，取上清液作为供试液做高效液相色谱分析，按分析结果，按成分峰制备含药大鼠血清。所有分离所得血清均用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存待用。

2.2 含补肾中药鼠血清体外诱导人FTM-PVCs后，细胞免疫组化、免疫荧光和RT-PCR检测测特异性标志物的表达，酶联免疫法检测培养液中的E2浓度。

2.2.1 不同浓度含1号药鼠血清体外诱导人FTM-PVCs分化

将人FTM-PVCs接种于8孔细胞小室，接种密度为2～3×10³cells/cm²，MEME培养液含10%FBS、 50 IU/ml青霉素、50 mg/ml、链霉素。

待细胞贴壁后，用如下表中的培养液培养，每3天更换培养液一次，显微镜下观察每组细胞形态学变化并拍照。以无菌1.5ml一次性塑料离心管收集每个时段的各组细胞培养液，-20℃冰箱内保存待测。各组人FTM-PVCs在不同条件下培养24天、31天后，细胞免疫组化检测卵细胞标志物GDF-9的表达。

组别	培养液（含10%FBS、50 IU/ml青霉素、50 mg/ml链霉素以MEME培养液为基础，添加如下成分）
		空白鼠血清组（2%）	含2%空白鼠血清组
空白鼠血清组（5%）	含5%空白鼠血清组
		空白鼠血清组（10%）	含10%空白鼠血清组
1号药组（2%）	含2%1号药鼠血清
		1号药组（5%）	含5%1号药鼠血清
1号药组（10%）	含10%1号药鼠血清

2.2.2 不同浓度含2号药鼠血清体外诱导人FTM-PVCs分化

根据上述实验结果，调整实验方案：将人FTM-PVCs接种于8孔细胞小室，接种密度为2～3×10³ cells/cm²，MEME培养液含10%FBS、50 IU/ml青霉素、50 mg/ml链霉素。

待细胞贴壁后，用如下表中的培养液培养，每3天更换培养液一次，将每次更换的各组培养液以无菌1.5ml一次性塑料离心管保存于-20℃待测，镜下观察每组细胞形态学变化并拍照。各组人FTM-PVCs在不同条件下培养24天后，免疫荧光法检测卵细胞标志物GDF-9的表达。

组别	培养液（含10%FBS、50 IU/ml青霉素、50 mg/ml链霉素以MEME培养液为基础，添加如下成分）
		阴性对照组control	含20%FBS
阳性对照组positive control	含12.5%卵泡液+FSH、LH+E2+10%FBS
		空白鼠血清组（2%）	含2%空白鼠血清组
2号药组（2%）	含2%2号药鼠血清
		2号药组（5%）	含5%2号药鼠血清
2号药组（10%）	含10%2号药鼠血清
		2号药组（20%）	含20%2号药鼠血清

不同时间段收集的各组细胞培养液以3000×g离心，以酶联免疫试剂盒检测培养液中E2的含量。严格按照酶联免疫试剂盒说明操作，于酶标仪450 nm吸光度，读取OD值，根据标准品的浓度和OD值做出标准曲线，计算得出样品中各检测指标的浓度。

2.2.3 RT-PCR半定量检测2%含2号药鼠血清对人FTM-PVCs表达特异性标志物相关基因的影响

根据上述实验结果，将人FTM-PVCs接种于无菌六孔细胞培养板，接种密度为2-3×10³ cells/cm²，以含10%FBS、50 IU/ml青霉素、50 mg/ml链霉素的MEME培养基培养。

待细胞贴壁后，用如下表中的培养液培养，每3天更换培养液一次。各组人FTM-PVCs在不同条件下培养14天后，提取各组干细胞总RNA。

组别	培养液（含10%FBS、50 IU/ml青霉素、50 mg/ml链霉素以MEME培养液为基础，添加如下成分）
		阴性对照组	含20%FBS
空白鼠血清组（5%）	含5%空白鼠血清组
		2号药组（5%）	含5%2号药鼠血清

卵细胞标志物GDF-9引物和透明带标志物ZP1、ZP2、ZP3引物设计同第一部分，以0.5ug总RNA为模板按cDNA合成试剂盒说明书操作，合成cDNA保存于-20℃待用。以20ul反应体系进行以Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，具体反应条件参照文献：

ZP1\ZP2：95℃ for 5 min, 30 cycles of 95 ℃for 1 min, 61℃for 1 min ，72℃ for 1 min；

ZP3：95℃for 5 min, followed by 30 cycles of 95℃ for 1 min, 55℃for 1 min and 72℃for 1 min；

SCP3：40cycles of 95℃ for 1 min, 55℃ for 1 min and 72℃ for 1 min。

β-action（细胞骨架蛋白）为内部参照物。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶TAE缓冲液电泳分离，凝胶成像系统拍照分析。

3 、实验结果

3.1 1号药鼠血清诱导人FTM-PVCs的结果

形态学变化和卵细胞标志物GDF-9的表达如表1和图1所示：

表1 形态学变化和卵细胞标志物GDF-9的表达情况

组别	培养时间	形态学	GDF-9表达	对应图片
					空白鼠血清组（2%）	21d	无明显变化	不表达	图1A（2%blank）
空白鼠血清组（5%）	21d	无明显变化	不表达	图1B（5%blank）
					空白鼠血清组（10%）	21d	无明显变化	不表达	图1C（10%blank）
1号药组（2%）	21d	无明显变化	不表达	图1A（2%1#-21d）
					1号药组（2%）	31d	无明显变化	表达	图1A（2%1#-31d）
1号药组（5%）	21d	出现卵细胞样结构	表达	图B（5%1#-21d）
					1号药组（5%）	31d	出现卵细胞样结构	表达	图1B（5%1#-31d）
1号药组（10%）	21d	出现卵细胞样结构	不表达	图1C（10%1#-21d）
					1号药组（10%）	31d	出现卵细胞样结构	不表达	图1C（10%1#-31d）

可以看出，本发明1号药浓度为5%时，可以诱导人FTM-PVCs出现类卵细胞样结构，并表达卵细胞标志物GDF-9，而空白鼠血清组细胞无卵细胞样结构，也不表达卵细胞标志物GDF-9，说明本发明1号鼠血清可以诱导FTM-PVCs分化为类卵细胞；本发明1号药中，鼠血清的浓度为5%时可以很好地诱导FTM-PVCs分化为类卵细胞，浓度过高或者过低时则难以有效诱导。

3.2 2号药鼠血清诱导人FTM-PVCs的结果

3.2.1 成团聚集情况

如图2和表2所示：

表2 成团聚集情况

组别	成团聚集情况	对应图片
			阴性对照组	未成团聚集	图2A
阳性对照组	成团聚集	图2B
			2号药组（2%）	成团聚集	图2C
2号药组（5%）	成团聚集	图2D
			2号药组（10%）	成团聚集	图2E
2号药组（20%）	成团聚集	图2F

可以看出，各组人FTM-PVCs在不同条件下培养5天， 2%、5%、10%、20%含2号药鼠血清组细胞均出现成团聚集，类似于人卵泡液+FSH、LH+E2阳性对照组（图2C、D、E、F，放大倍数10×10），说明2号药鼠血清与阳性对照类似，可以诱导人FTM-PVCs出现卵细胞样结构——成团聚集。

3.2.2 类卵细胞学形态学变化

如图3和表3所示：

表3 成团聚集情况（5d）

组别	培养时间	GDF-9的表达情况	对应图片
				阴性对照组	3d	无明显变化	图3A
阴性对照组	7d	无明显变化	图3E
				阴性对照组	14d	无明显变化	图3I
阳性对照组	3d	出现卵细胞样形态变化	图3D
				阳性对照组	7d	出现卵细胞样形态变化	图3H
阳性对照组	14d	出现卵细胞样形态变化	图3L
				空白鼠血清组（2%）	3d	无明显变化	图3B
空白鼠血清组（2%）	7d	无明显变化	图3F
				空白鼠血清组（2%）	14d	无明显变化	图3J
2号药组（2%）	3d	出现卵细胞样形态变化	图3C
				2号药组（2%）	7d	出现卵细胞样形态变化	图3G
2号药组（2%）	14d	出现卵细胞样形态变化	图3K

可以看出，培养FTM-PVCs时，本发明不同浓度2号药与阳性对照组相同，出现卵细胞样形态变化，而空白鼠血清和阴性对照组则无明显变化。

3.2.3卵细胞标志物GDF-9的表达

如表4和图4所示：

表4 GDF-9的表达情况

组别	GDF-9的表达情况	对应图片
			阴性对照组	不表达	图4A
阳性对照组	表达	图4B
			空白鼠血清组（2%）	不表达	图4E
空白鼠血清组（5%）	不表达	图4F
			2号药组（2%）	表达	图4C
2号药组（5%）	表达	图4D

可以看出，培养FTM-PVCs时，本发明不同浓度2号药与阳性对照组相同，表达卵细胞标志物GDF-9，而空白鼠血清和阴性对照组则不表达。

3.2.4 雌二醇分泌情况

如图5所示：在培养不同时间段，5%含2号药鼠血清组人FTM-PVCs产生的E2明显高于空白鼠血清组，说明本发明2号药鼠血清诱导人FTM-PVCs后产生雌二醇，促进其向卵细胞分化。

3.2.5 透明带标志物mRNA表达情况

如图6和表5所示：

表5 透明带标志物mRNA的表达情况

组别	CP3	ZP-1mRNA	ZP-2mRNA	ZP-3mRNA
					阴性对照组	1（图5A-SCP3-C、图5B-CON）	1（图5A-ZP1-C、图5C- ZP1- CON）	1（图5A-ZP2-C、图5C- ZP2- CON）	1（图5A-ZP3-C、图5C- ZP3- CON）
空白鼠血清组（5%）	1.11（图5A-SCP3-NS、图5B-NS）	0.95（图5A-ZP1-NS、图5C- ZP1- NS）	0.7（图5A-ZP2-NS、图5C- ZP2- NS）	1.11（5图A-ZP3-NS、图5C- ZP3- NS）
					2号药组（5%）	1.49*（图5A-SCP3-MS、图5B-MS）	1.62*（图5A-ZP1-MS、图5C- ZP1-MS）	1.28*（图5A-ZP2-NS、图5C- ZP2- NS）	1.28*（图5A-ZP3-NS、图5C- ZP3- NS）
阳性对照组	*（图5A-SCP3-POS、图5B- POS）	*（图5A-ZP1-POS、图5C- ZP1- POS）	*（图5A-ZP2-POS、图5C-ZP2- POS）	*（图5A-ZP3-POS、图5C- ZP3- POS）

与阴性对照组相比，*表示p<0.05。

可以看出，对照组和空白血清组中，细胞的CP3、ZP-1、ZP-2、ZP-3 mRNA表达水平低，本发明2号药鼠血清和阳性对照组的表达水平高；本发明2号药鼠血清诱导人FTM-PVCs 14天后SCP3、ZP-1、ZP-2、ZP-3 mRNA的表达水平显著高于对照组和空白鼠血清组，分别为control组的1.64倍、1.62倍、1.28 和1.28倍，分别为空白鼠血清组的1.49、1.80、1.81、1.15倍，说明本发明2号药鼠血清诱导人FTM-PVCs产生透明带糖蛋白，促进其向卵细胞分化。

综上，用本发明1号药和2号药诱导培养人FTM-PVCs，细胞均出现了类卵细胞样结构，同时表达卵细胞标志物GDF-9，说明本发明诱导液可以诱导FTM-PVCs分化为类卵细胞；其中，1号药诱导21天出现类卵细胞样结构，而2号药诱导3天即出现类卵细胞样结构，说明2号药的诱导效果更优。

本发明药物可以诱导FTM-PVCs分化为类卵细胞，可以为体外受精技术提供原材料，克服超排卵技术的缺陷，应用前景非常优良。

Claims

1.下述重量配比的原料药在制备早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液中的用途：熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶8-16份。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述原料药的重量配比如下：熟地24份、山茱萸9-12份、山药12份、枸杞子9-12份、菟丝子12份、鹿角胶12份。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述原料药的重量配比如下：熟地24份、山茱萸12份、山药12份、枸杞子12份、菟丝子12份、鹿角胶12份。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的用途，其特征在于：所述的原料药中还含有杜仲1-16份、肉桂1-9份、当归1-16份、制附子1-16份。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述原料药中，杜仲为12份、肉桂为6份、当归为9份、制附子为6份。

6.一种诱导早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

a、取早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞；

b、置于诱导液中培养，培养时间不低于3天，即得类卵母细胞；

步骤b所述诱导液以MEME培养液为基础培养液，添加有40～60IU/ml青霉素、40～60mg/ml链霉素和2～20％(v/v)的含药血清；所述含药血清按照如下方法制备：

(1)按照权利要求1～5任意一项所述配比取原料药，制备成为超细粉，以5.0g/kg的剂量施用于鼠，施用方式为口服给药；

(2)给药30min、60min、90min后，眼底静脉丛取血，分别静置、离心得上清液，混匀，即为含药血清。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述青霉素的浓度为50IU/ml、所述链霉素的浓度为50mg/ml，所述含药血清的浓度为2～5％(v/v)。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，静置的时间为2h，离心转速为3000rpm，离心时间为10min。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤b中，培养时间为3～31天。