CN110038021A - 苯并吡喃类化合物在制备调节脂质代谢产品中的应用及其组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了苯并吡喃类化合物在制备调节脂质代谢产品中的应用及其组合物,所述吡喃类化合物包括矮牵牛素‑3‑O‑β‑D葡萄糖苷和/或锦葵色素‑3‑O‑β‑D葡萄糖苷。为用于制备调节脂质代谢产品提供新的研究方向。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,特别是涉及苯并吡喃类化合物在制备调节脂质代谢产品中的应用及其组合物。
背景技术
脂质代谢是体内重要且复杂的生化反应,指生物体内脂肪,在各种相关酶的帮助下,消化吸收、合成与分解的过程,加工成机体所需要的物质,保证正常生理机能的运作,对于生命活动具有重要意义。脂类是身体储能和供能的重要物质,也是生物膜的重要结构成分。脂质代谢异常引发的疾病为现代社会常见病。
脂质沉积是指除脂肪细胞外的实质细胞中出现脂滴或脂滴明显增多,脂肪变性多见于感染、酗酒、缺氧、中毒、糖尿病、肥胖及营养不良等。脂肪变性主要见于肝、心、肾、骨骼肌等实质器官。
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic htty liver disease,NAFI.D),是一种与胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤,其病理学改变与酒精性肝病(alcoholic liver diseaseALD)相似,但患者无过量饮酒史,疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholicsimple faay liVet,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis,NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌。
临床诊断时,明确NAFLD的诊断需符合以下3项条件:(1)无饮酒史或饮酒折合乙醇量<140g/周(女性<70g/周);(2)除外病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性、自身免疫性肝病等可导致脂肪肝的特定疾病;(3)肝活检组织学改变符合脂肪性肝病的病理学诊断标准。治疗NAFLD的重要的任务是为减少肝脏脂肪沉积并避免因“二次打击”而导致NASH和肝功能失代偿,NASH患者则需阻止肝病进展,减少或防止肝硬化、肝癌及其并发症的发生。目前治疗非酒精性脂肪肝的主要措施为:锻炼、改善饮食结构,控制体重、减少腰围;改善IR,纠正代谢紊乱,可使用胰岛素增敏剂。对于保肝抗炎药物而言,这类药物在NAFLD防治中的作用和地位至今仍有争论,目前并无足够证据推荐NAFLD/NASH患者常规使用这类药物(《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》2010),故当前急需对。
目前,还未见将苯并吡唑类化合物,如矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷和/或锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷用于调节脂质代谢的相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供苯并吡喃类化合物在制备调节脂质代谢产品中的应用及其组合物,将苯并吡喃类化合物如,矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷和/或锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖用于肥胖、非酒精脂肪肝、脂质代谢紊乱相关疾病缓解和治疗,进一步将苯并吡喃类化合物作为组合物的活性成分,获得好的治疗效果,为用于制备调节脂质代谢产品提供新的研究方向。
本发明提供苯并吡喃类化合物在制备调节脂质代谢产品中的应用,所述吡喃类化合物包括矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷和/或锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷,其结构式如下:
本发明提供的应用中,所述产品可以是药物、保健品、实验试剂、或其他调节脂质代谢的产品。当为药物时,所述药物为预防和/或治疗肥胖、脂肪肝、脂质代谢紊乱相关疾病中的一种或多种。
脂质代谢紊乱是指先天性或获得性因素造成的血液及其他组织器官中脂质(脂类)及其代谢产物质和量的异常。
进一步的,所述产品为脂质沉积抑制剂。
所述脂质沉积抑制剂是促进脂肪细胞代谢的产品,该产品能够防止脂肪因代谢缓慢而在肝、脑、肾等器官组织中贮积。
进一步的,所述产品为自噬调节剂。
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程,藉此实现细胞本身的代谢需要。自噬在脂质代谢过程中发挥着重要作用。所述自噬调节剂为通过对细胞自噬的调整,从而达到调节脂质代谢的目的产品。
进一步的,所述产品为自噬诱导剂。
所述自噬诱导剂是对脂肪细胞进行诱导,使脂肪细胞自噬活性增强的产品。
进一步的,所述产品为TC抑制剂、TG抑制剂、ALT抑制剂、AST抑制剂中一种或多种。
所述TC、TG、ALT或AST抑制剂,通过促进肝脏脂质细胞的代谢作用,从而使得TC、TG、ALT或AST水平降低的产品。
进一步的,所述非酒精性脂肪肝为非酒精性单纯性脂肪肝或/和非酒精性脂肪性肝炎。
进一步的,所述产品为细胞激动剂,优选为非酒精脂肪肝细胞激动剂。
ROS是细胞体内的氧自由基,过多的ROS会损伤细胞线粒体及其他细胞器,细胞ATP的减少从而可能使细胞无法继续完成正常的脂代谢反应。
所述细胞是能增强另一种细胞活性、促进脂肪细胞代谢反应的产品,如药物制剂,所述非酒精脂肪肝细胞激动剂为使非酒精脂肪肝细胞活性提高,促进脂肪肝细胞细胞代谢反应的产品。
进一步的,所述非酒精性脂肪肝为非酒精性单纯性脂肪肝或/和非酒精性脂肪性肝炎。
本发明在研究苯并吡喃类化合物应用的基础上,提出了一种调节脂质代谢的组合物,该组合物包括苯并吡喃类化合物或其立体异构体、水合物、溶剂化物、药学上可接受的盐或共晶中的一种或多种的组合。
一种调节脂质代谢的一种苯并吡喃类化合物组合物,所述组合物活性成分包括矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷和/或锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷。
本发明所述活性组份,是指在产品中发挥治疗作用的部分。
本发明的有益效果是:区别于现有技术的情况,
1.发明人利用MTT细胞活力实验对非酒精性脂肪肝病模型细胞中TG、TC、ALT和AST含量进行了定性研究。实验结果表明,花色苷及矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷处理HepG2细胞6h时,细胞活力显著增高,花色苷及矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷处理细胞随时间的增加并无细胞毒性。
2.由实验研究可知,矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷能降低高脂细胞的TC、TG、ALT和AST水平。相较对照组与低剂量组,中高剂量的处理组有着极为显著的减少。
3.发明人通过Western blot和Q-PCR实验研究了矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷对自噬的影响,包括Bcl-1、p62、Apg5L、APG7和Fas。Westernblotting结果表明矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷中低剂量对APG5L、APG7、p62和Bcl-1蛋白表达有显著影响。在具体实验结果中显示高剂量组有抑制的趋势。Q-PCR结果表明,矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷能显著降低Bcl-1和Fas的mRNA水平表达,APG5L水平得到上调。
附图说明
图1是本发明黑果枸杞花色苷浓度对HepG2细胞活力的影响图;
图2是本发明花色苷对细胞活性氧的影响图;
图3是矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖处理时间对细胞活力的影响图;
图4是矮牵牛素对NAFLD细胞TC、TG、ALT和AST的影响图;
图5是锦葵色素对细胞TC、TG、ALT和AST的影响图;
图6是矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷对NAFLD细胞模型中自噬蛋白及脂代谢蛋白的表达影响图;
图7是锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖的NAFLD细胞模型中自噬蛋白及脂代谢蛋白的表达影响图;
图8是矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖对细胞相关mRNA表达水平的影响图。
具体实施方式
根据对文献进行相关检索,结果表明,脂代谢紊乱和自噬之间存在联系,矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷化具有良好的抗氧化活性和花色苷提取物对脂质代谢具有调节作用。我们首先研究了矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷及黑果枸杞花色苷对细胞活力的影响;同时基于前期用油酸处理得到的高脂HepG2细胞模型,然后我们选择使用LC-MS定性分析矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖的母核,处理高脂HepG2细胞模型6h后检测细胞的总甘油三酯、总胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶;同时借助Western blotting技术在蛋白质水平上检测FAS和自噬相关通路的表达水平;采用荧光定量PCR技术检测与自噬相关的基因mRNA水平的表达。
1.1实验材料、试剂与仪器
1.1.1受试样品的来源
受试样品包括2种花色素类化合物单体(购于Sigma公司):Pt(矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷),Mv(锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷),以及实验室制备花色苷粗提物LRA,矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷化学结构式如下:
1.1.2材料与试剂
本申请中HepG2人肝癌细胞细胞系由中国科学院上海细胞库提供,APG5L、Apg7、p62、Bcl-1、FAS等基因的引物均由上海生工合成。主要试剂的配制
本实验所需MTT溶液以及western blotting相关试剂配制如下:
(1)MTT溶液配制
称取25.0mg MTT粉末,用5mL PBS充分溶解,配制成浓度为5mg/mL,分装后避光,于-20℃保存。
(2)油红O染液的配制
油红O母液的配制:称取0.60g油红O粉末加入到100mL异丙醇中,用磁力搅拌器充分搅拌,震荡均匀,用滤纸过滤,制备成油红O储备液。
油红O工作液的配制:取上述油红O储备液与去离子水按照3:2的比例充分混匀后过滤,配制成油红O工作液,并在2小时内使用。
(3)中性甲醛溶液的配制
量取10mL甲醛(40%),0.40g磷酸二氢钠,0.65g无水磷酸氢二钠,加入90mL去离子水,混合溶解。
(4)电泳缓冲液(5×)
准确称取Tris 7.58g,Glycine 46.90g,SDS 2.50g,加少量的去离子水并不断搅拌使其完全溶解,然后定容至500mL,室温保存即可。
电泳缓冲液(1×):量取20mL的电泳缓冲液(5×)加入480mL的去离子水即配制成1×的电泳液。
(5)转膜液(10×)
准确称取Tris 15.15g,Glycine 72.00g,加少量的去离子水并不断搅拌使其完全溶解,然后用容量瓶定容至500mL,室温保存即可。
转膜液(1×):用量筒量取70mL的转膜液(10×),然后加入140mL甲醇和490mL的去离子水(按转膜液(10×):甲醇:去离子水=1:2:7的比例),即配制成1×转膜液。
(6)TBS(10×)
准确称取Tris 12.12g,NaCl 40.04g,加少量的水至完全溶解,定容至500mL,用pH计测定pH值并用浓盐酸调至pH7.5,室温保存即可。
TBST(1×):以TBS(10×):去离子水:吐温20=1:9:1‰的比例配制1×TBST。
(7)10%过硫酸铵(AP)
准确称取AP 40.00mg,加入400μL的去离子水,翻转摇晃至完全溶解,4℃保存备用。
(8)5%封闭液(BSA)
准确称取BSA或脱脂奶粉1.00g,加入20mL的1xTBST液,翻转摇晃,至完全溶解,4℃保存备用。
(9)5×SDS上样缓冲液
准确称取0.5mol/L Tris-Hcl(pH 6.8)2.5mL,二硫叔糖醇(DTT)0.39g,SDS0.50g,甘油2.5mL,溴酚蓝25.0mg,不断搅拌使其充分混匀,分装于1.5mL的无菌离心管中,4℃保存即可。
a.DNA酶的配制
DNA酶30μl,加RDD40μl,加DEPC水10μl,DW洗液的配制:DW:无水乙醇=9:1
1.2实验方法
1.2.1黑果枸杞花色苷浓度对HepG2细胞增殖活力的影响
取黑果枸杞花色苷加DMEM高糖培养基配制成0,5,10,20,40,80,160,320,640,1280μg/mL处理HepG2细胞6h。具体MTT细胞增殖活力实验步骤如下:
(1)HepG2细胞的复苏与冻存
HepG2细胞的冻存:待细胞在培养皿中长至80%时,用0.25%的EDTA-胰蛋白酶消化细胞,将消化后的细胞悬浮液吸入离心管中离心,弃去上清液,加入细胞冷冻保存液(DMEM高糖培养基:FBS:DMSO=5:4:1)轻轻吹打均匀,然后将细胞吸入冻存管中,4℃冰箱慢冻10min,再放入-20℃的冰箱中继续冻1h左右,最后将冻存管放入-80℃过夜,第二天将冻存管放入-198℃液氮罐中长期冻存。
Hepg2细胞的复苏:从液氮罐中取出HepG2细胞的冻存管,快速放入37℃水浴中融化,然后将细胞转移到10mL含有10%FBS高糖培养液中,5%CO2、37℃、饱和湿度下培养,每隔两天换一次培养液,待细胞长至80%时传代。
(2)HepG2细胞的培养与传代
HepG2细胞的培养:将HepG2细胞置于含有10%FBS和1%青链霉素的高糖培养液培养基中,5%CO2、37℃、饱和湿度下培养,每隔两天换一次培养液,待细胞长至80%时传代。
HepG2细胞的传代:当细胞融合度达到80%左右时,对细胞进行传代。传代时先吸去培养液,用适量的PBS清洗2次,加入1mL的胰蛋白酶消化液,轻轻晃动培养皿,使胰蛋白酶消化液在培养皿中均匀分布,37℃消化2min左右,至细胞基本脱离培养皿底壁,轻轻振荡培养皿,加入适量DMEM培养液,并反复吹打细胞,使细胞从培养皿底部完全脱落并分散成单个细胞。将细胞悬浮液按照适当比例传至新的培养皿中,然后加入新鲜的DMEM高糖培养液和10%的FBS,然后放入CO2恒温培养箱中培养。
(3)HepG2细胞的计数
血球计数板有H形凹槽,两侧各有一支柱,将盖玻片覆盖其上形成0.1mm的计数池。当实验对细胞要求一定密度时,可将细胞稀释一定倍数,将细胞悬液摇匀,用移液枪吸取少许,从技术板中间平台的下边缘滴入一小滴,让细胞悬浮液充满计数区,此过程不能产生气泡,然后将计数板放在显微镜下,记录4个大方格细胞总数,最后按照以下公式计算细胞个数:
细胞个数=4个格中的细胞总数/4×104×稀释倍数
通过细胞个数确定悬浮液的细胞密度,根据实验需要调整细胞密度。油酸对HepG2细胞增殖活力的影响
将HepG2细胞接种至96孔培养板,每孔1×104个细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养12h至细胞完全汇合,换以用无血清培养基配制的浓度分别为0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4mM的油酸处理细胞0,24,48,72小时,每个浓度设置4个复孔。孵育完成后每孔加入10μL新鲜配制的终浓度为5mg/mL MTT溶液继续培养4h后,吸除培养孔中的液体终止反应,每孔加入100μL DMSO,平板振荡器上充分振摇10min,是结晶充分溶解,在酶标仪上测量A490吸光度。按以下公式计算细胞增殖活力。
细胞增殖活力(%)=(药物组OD/空白组OD)x100%
当细胞增殖活力大于80%时,认为药物对细胞活力影响小,即不呈现毒性作用,并以此作为本研究选取药物最适浓度的标准,并为进一步实验的工作浓度确定最佳范围。
1.2.2黑果枸杞花色苷对HepG2细胞增殖活力氧的影响
荧光显微镜检测HepG2细胞中的活性氧水平
细胞的培养、诱导以及药物处理方式与1.2.1相同,细胞处理方式按照试剂盒操作说明进行,荧光显微镜FITC通道观察荧光强度,并拍照。
1.2.3矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖对细胞脂质沉积的抑制作用
1.细胞的培养、模型的建立及实验步骤按照1.2.1进行操作,细胞培养至汇合度达到70%时,用0.5mM处理24h,建立非酒精性脂肪肝病细胞模型。将花色苷化合物母液稀释至10μM,处理细胞0,6,12,24,48h。MTT细胞增殖活力实验确定最佳给药时间。
2.细胞的培养、模型的建立及实验步骤按照上述步骤进行操作,将花色苷化合物母液稀释至0,0.1,1,10,50,100μM分别处理高脂HepG2细胞。
3.吸除培养液,用PBS轻柔洗涤3次,加入胰酶1min消化细胞,细胞悬液吸入1.5mL无菌EP管内,1000rpm离心10分钟,弃上清,加入适量PBS,冰水浴条件下超声破碎,制备好的匀浆液不离心,待测。
4.细胞甘油三酯(TG)含量检测
按照甘油三酯(TG)试剂盒操作说明测定细胞内甘油三酯含量。BCA蛋白浓度试剂盒测定细胞中蛋白质的含量,以蛋白含量校准细胞中甘油三酯的含量。
5.细胞总胆固醇(TC)含量检测
按照总胆固醇(TC)试剂盒操作说明测定细胞内总胆固醇含量。BCA蛋白浓度试剂盒测定细胞中蛋白质的含量,以蛋白含量校准细胞中总胆固醇的含量。
6.细胞谷丙转氨酶(ALT)含量检测
按照谷丙转氨酶(ALT)试剂盒操作说明测定细胞内谷丙转氨酶含量。
7.细胞谷草转氨酶(AST)含量检测
按照谷草转氨酶(AST)试剂盒操作说明测定细胞内谷草转氨酶含量。1.2.4矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖对HepG2细胞自噬的影响
细胞的培养、模型的建立及药物处理方式按照1.2.3进行操作,完成后收集细胞,提取胞浆蛋白,定量后进行蛋白电泳,具体采用如下方法:
细胞汇合度达到70%时,加入0.5mM油酸处理24h,完成后收集细胞,提取胞浆蛋白,定量后进行蛋白电泳,电泳方法如下:
1.细胞总蛋白的提取
细胞培养完成后,取出培养板,弃去孔内培养液,用PBS洗2遍,置于冰浴上,每孔加入100μL蛋白裂解液((RIPA)(用前数分钟向细胞裂解液中1:1000加入PMSF,终浓度1mM)。细胞裂解约10min后,先用细胞刮子刮下细胞,吸到1.5mL离心管中(可用超声破碎仪破碎3-5次),然后4℃,12,000rpm,15-20min离心,取上清转移到新的离心管中进行蛋白定量或-80℃保存。
2.蛋白浓度测定
蛋白含量的测定采用BCA法,操作方法按照试剂盒说明书进行。测完蛋白浓度后,加5x loading buffer与蛋白样品1:4混匀后,100℃水浴10min(缠上封口膜,防止弹开),4℃保存。
3.SDS-PAGE电泳
蛋白电泳具体操作方法按照相关参考文献,由于目的蛋白质分子量除FASN(按下表配制分离胶)以外均在10-80KDa,所以选择分离胶浓度为10%,FASN蛋白分离胶浓度选择6%。
6%SDS-PAGE分离胶制配表
不同浓度的SDS-PAGE分离胶最佳分离范围如下表:
按照下表配好分离胶,
10%SDS-PAGE分离胶制配表
按照按下表配置浓缩胶并上样。完成后需要尽快进行电泳,80v浓缩30min,然后120v进行电泳,直至前沿跑至分离胶下沿时,停止电泳。
5%SDS-PAGE浓缩胶制配表
3.转膜
PVDF膜提前用甲醇浸泡1min,用1x转膜液浸泡10min。取出胶,上下左右裁去多余的胶,从黑板到白板依次是滤纸-胶-膜-滤纸,赶除气泡,夹上夹子,黑对黑,白对白放入转膜槽中。转膜一般采用恒流的方法,根据目的蛋白分子量大小选择转膜电流和转膜时间。
4.封闭
转膜结束后,将PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST室温摇床封闭1小时进行封闭。
5.孵育抗体
一抗用含5%BSA或5%脱脂奶粉的TBST稀释(具体稀释倍数参见抗体说明书),封闭结束后,将PVDF膜与稀释好的一抗于4℃孵育过夜。孵育结束后,用TBST洗膜5次,每次10min。二抗用含5%脱脂奶粉(1:2000)的TBST稀释,一抗孵育完成后,用相应的HRP标记的二抗室温孵育1h,用TBST洗膜5次,每次10min。
6.显影
ECL法检测,将A液与B液1:1混合配制显影液,现用现配,每张膜大约加显影液100-200μL。
1.2.5矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖对HepG2细胞自噬相关基因转录水平的影响
细胞的培养、模型的建立以及药物处理方式与1.2.4相同,处理完成后收集细胞,抽提总RNA,然后进行逆转录合成cDNA,最后利用实时荧光定量PCR法检测矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖对非酒精性脂肪肝病模型下的HepG2细胞自噬相关基因转录水平的变化,可采用如下方法:
(1)Trizol法提取细胞总RNA
1.药物处理完成后,PBS洗2遍,大约每1x107个细胞加入1mL Trizol后用1mL移液枪(无RNA酶)吹打至液体澄清且无细胞团块,转入1.5μL无RNA酶EP管,颠倒混匀10下,室温裂解5分钟。
2.加入0.2mL氯仿,剧烈震荡30sec,室温放置3min。12,000rpm 4℃离心10min。
3.吸取上层水相转移至干净的离心管,加入1/2倍体积的无水乙醇,混匀。
4.将吸附柱放入收集管中,用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入至吸附柱中,静置2min,12,000rpm离心3min,倒掉收集管中废液。
5.将吸附柱放回收集管中,加入500μL RPE Solution,静置2min,10,000rpm离心30sec,倒掉收集管中废液。再重复步骤d一次,并将吸附柱放回收集管中,10,000rpm离心2min。
6.将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中,在吸附膜中央加入30μL DEPC-treatedddH2O,静置5min,12,000rpm离心2min,将所得RNA溶液置于-70℃保存。
(2)RNA检测与定量
1.RNA浓度和纯度的测定
取RNA母液1μL和19μL DEPC水,离心混匀,取1μL于24孔酶标板上测定A260和A280和A230,并计算A260/A280,A260/A230,以及DNA浓度3个数值。如果A260/A280比值在1.8~2.0之间,说明RNA纯度好。根据最后的测定浓度计算出1000ng RNA所需的RNA母液体积。然后用稀释的样品进行琼脂糖电泳,检测RNA是否降解或者掺有杂质。
2.琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性
①配制1%琼脂糖凝胶:0.40g琼脂糖加入到40mL 1×TAE电泳缓冲液(或DEPC水中),在微波炉中加热2min,使琼脂糖溶解至完全澄清,冷却至60℃左右,加入2μL 1mg/mL溴化乙锭溶液,充分混匀,将凝胶倒入已经垂直插入梳子的制胶槽,待胶完全凝固后拔出梳子。将提前配制好的1×TAE电泳缓冲液约700mL加入电泳槽,将凝固好的琼脂糖凝胶放置电泳槽等待上样。
②上样:用移液枪将1μL RNA母液和1μL 6×DNA上样缓冲液于200μL无RNA酶EP管中混匀,用移液枪加至上样孔。
③电泳:100V电泳17min左右。
④分析:将电泳完的胶放到紫外成像系统中进行观察,若28S、18S条带清晰,且前者亮度为后者的2倍左右,5S条带弱,表明RNA完整性好。
(3)逆转录
1.以800ng总RNA为模板,总体系20μL,合成cDNA第一链。在冰浴的nuclease-freePCR管中加入以下试剂:
2.轻轻混匀后离心3~5s,反应混合物在65℃温浴5min后,冰浴2min,然后离心3~5s。
3.将试管冰浴,再加入下列试剂:
4.轻轻混匀后离心3~5s
5.在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应,25℃孵育10min,cDNA合成50℃30min,终止反应85℃5min。得到的cDNA产物于-20℃保存。
(4)实时荧光定量PCR
1.根据文献提供的基因序列,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,β-actin、APG5L、Apg7、p62、Bcl-1、FASN的引物序列如下表所示:
实时荧光定量PCR引物序列
实时荧光定量PCR反应体系组成
2.将上述反应液放入荧光定量PCR仪中进行扩增,PCR反应条件如下表所示:
实时荧光定量PCR反应程序
每个循环结束后采集荧光信号,最后绘制熔解曲线以确定反应产物有无引物二聚体及非特异性扩增,当荧光信号强度超过基线时,其域循环数被记录下来,在实时荧光定量PCR中,Ct值被认为与被扩增基因的初始浓度密切相关。
(5)相对定量分析
目的基因的表达采用比较Ct值的方法,用内参基因β-actin来校正差异,变化的倍数量为2-ΔΔCt。计算公式为:变化倍数=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(Ct目标基因-Ct内参基因)药物处理组-(Ct目标基因-Ct内参基因)control。
1.2.6统计分析
使用软件Graphpad Prism 7.0进行统计学分析,两组间均数的比较采用独立样本t检验,多组间均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),实验统计数据以平均值±标准差表示,*表示P<0.05说明具有统计学意义,**表示P<0.01说明其差异具有极显著统计学意义。
1.3结果与分析
1.3.1黑果枸杞花色苷浓度对HepG2细胞增殖活力的影响
我们通过MTT实验观察了黑果枸杞花色苷对HepG2细胞增殖活力的影响,结果如图1所示,当黑果枸杞花色苷浓度0-1280μg/mL处理6h相比对照组均无显著性降低,初步表明黑果枸杞花色苷在该范围浓度无细胞毒性;当花色苷的浓度为160-1280μg/mL,细胞活力同对照组有显著的上升,表明黑果枸杞花色苷处于较高浓度时能有效增加细胞活力并且该范围的浓度可以作为后续实验最佳实验浓度。
1.3.2黑果枸杞花色苷对HepG2细胞活性氧的影响
ROS是细胞体内的氧自由基,过多的ROS会损伤细胞线粒体及其他细胞器,细胞ATP的减少从而可能使细胞无法继续完成正常的脂代谢反应。我们将加药处理后的HepG2细胞进行DCFH-DA染色,荧光显微镜结果如图2所示,LRA处理组与Conrol组对比表明,LRA能明显减少细胞中ROS的产生,其中400-800μg/mL剂量组的效果最佳,1000μg/mL剂量组效果与800μg/mL没有显著的差别。
1.3.3矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖对细胞脂质沉积的抑制作用
我们利用MTT细胞活力实验对矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖处理时间对细胞的影响进行了研究的同时,还对非酒精性脂肪肝病模型细胞中TG、TC、ALT和AST含量进行了定性研究。实验中细胞处理方式与加药方式参照1.2.3细胞的培养、模型的建立及实验步骤处理与1.2.4中完成后收集细胞后具体采用方法处理,其余处理方法如下:
油酸对HepG2细胞脂滴积累的影响
将无菌圆玻片置于24孔板中,加入400μL DMEM,培养箱温育30min。吸走培养基,将细胞以5×104个/mL接种于玻片上,每孔1mL培养液,用枕头按压玻片,排出玻片下面的气泡,置于培养箱中培养,每2天换一次培养液。待细胞完全汇合,加入0.5mM油酸处理24h。处理完成后用镊子取出玻片并PBS洗3次,4%中性甲醛固定30min,PBS洗净后晾干,加入油红O染液于细胞表面静置60min,吸出多余的染料,用70%乙醇洗涤细胞,双蒸水洗涤2-3次,在载玻片上滴一滴PBS,在显微镜下观察、拍照。
图3表明,花色苷LRA及Pt和Mv处理HepG2细胞6h时,细胞活力显著增高,其他几组处理时间并未见显著性差异,表明花色苷及矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷处理细胞随时间的增加并无细胞毒性。
图4和图5表明,矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖能降低高脂细胞的TC、TG、ALT和AST水平。相较对照组与低剂量组,中高剂量的处理组有极为显著的减少。
1.3.4矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖对HepG2细胞自噬的影响
我们通过Western blot和Q-PCR研究了矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷对各种自噬通路介质的影响,包括Bcl-1、p62、Apg5L、APG7和Fas。Westernblotting结果表明矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷中低剂量对APG5L、APG7、p62和Bcl-1蛋白表达有显著影响。结果显示了高剂量组有抑制的趋势。LC3-II/LC3-I的比例较低,p62蛋白表达较高,可能有自噬流的活化。Q-PCR结果表明,矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷能显著降低Bcl-1和Fas的mRNA水平表达,APG5L水平得到上调。低中剂量降低了Apg7和p62的表达,但高剂量组能向上调他们的mRNA水平。当不同组的剂量达到100μM时,都出现了表达水平的抑制下调。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.苯并吡喃类化合物在制备调节脂质代谢产品中的应用,其特征在于,所述苯并吡喃类化合物包括矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷和/或锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品为药物,所述药物包括预防和/或治疗肥胖、脂肪肝、脂质代谢紊乱相关疾病中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品为脂质沉积抑制剂。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品为自噬调节剂。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述产品为自噬诱导剂。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品为TC抑制剂、TG抑制剂、ALT抑制剂、AST抑制剂中一种或多种。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品为ROS抑制剂,优选为非酒精脂肪肝细胞激动剂。
8.根据权利要求1或7所述的应用,其特征在于,所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝,进一步的,所述非酒精性脂肪肝包括非酒精性单纯性脂肪肝或/和非酒精性脂肪性肝炎。
9.一种苯并吡喃类化合物组合物,其特征在于,该组合物包括苯并吡喃类化合物或其立体异构体、水合物、溶剂化物、药学上可接受的盐或共晶中的一种或多种的组合。
10.根据权利要求9所述组合物,所述组合物活性成分包括矮牵牛素-3-O-β-D葡萄糖苷和/或锦葵色素-3-O-β-D葡萄糖苷。
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