CN108888674A - 白花蛇舌草在抗人脑胶质瘤细胞增殖、促凋亡、抗迁移、抗侵袭中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开白花蛇舌草在抗人恶性胶质瘤增殖、促凋亡、抗迁移、抗侵袭方面的应用，具体为白花蛇舌草提取物能够在4～8mg/mL浓度有效降低人恶性胶质瘤U87细胞的增殖活性、促进细胞凋亡。在对细胞活性没有明显影响的1～2mg/mL的低浓度下能显著降低二维实验中细胞迁移和侵袭的能力，0.5mg/mL能够显著降低Transwwell迁移实验中细胞的迁移数量。在1～3mg/mL浓度下，显著抑制三维实验中U87细胞侵袭的能力。本发明提供的白花蛇舌草抗人恶性胶质瘤迁移、侵袭的作用及其及作用机制分析，可能为临床治疗恶性胶质瘤的复发与迁移侵袭及进一步研究白花蛇舌草抗胶质瘤的作用机制提供了新线索和新思路。

Description

白花蛇舌草在抗人脑胶质瘤细胞增殖、促凋亡、抗迁移、抗侵 袭中的应用

技术领域

本发明属于人脑胶质瘤治疗领域相关药物评价及筛选，具体涉及白花蛇舌草抗人恶性脑胶质瘤细胞增殖、促凋亡、抗迁移、抗侵袭方面的应用。

背景技术

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，在脑瘤中占81％。世界卫生组织(WHO)分类系统，将胶质瘤根据恶性程度分为Ⅰ～Ⅳ四个等级。胶质母细胞瘤按照分类，属于恶性级别较高的Ⅲ和Ⅳ级，是最常见的一种恶性胶质瘤，占所有胶质瘤的45％，目前其5年相对存活率仍低于5％，是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一。目前治疗恶性胶质瘤临床上可以采用的治疗方法包括手术切除、放射治疗、化学治疗，除此之外，基因治疗、免疫治疗正在进行临床研究，但总的治疗效果不理想，恶性胶质瘤的疗效及预后无明显改善。其主要原因是，恶性胶质瘤浸润性生长的特性，使手术不易全切，易复发、易扩散侵袭，最后患者均死于肿瘤复发、局部扩散及侵袭。因此寻求有效的治疗措施，尤其是对胶质瘤迁移、侵袭有效的治疗方法是该研究领域亟待解决的焦点问题之一，具有重要的现实意义。

在胶质瘤药物治疗方面，目前，新型口服烷化剂-替莫唑胺是高恶性级别胶质瘤的主要化疗药物，但与其他化疗药物相似依然存在疗效低、易产生耐药性等问题。采用经典的治疗方法：最大安全范围手术切除、联合放疗使用替莫唑胺化疗，患者的中位生存期只能提高6～14.6个月。而胶质瘤患者对常用化疗药物亚硝脲类及替莫唑胺产生耐药的比率达67.2％～76％。因此，寻找高效低毒的新的治疗药物也是临床需要并备受关注的研究课题之一。

白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草的全草。性味：甘、淡，凉。归胃、小肠、大肠经。具有清热解毒，利尿消肿，活血止痛的功能。用于肠痈，疮疖肿毒，湿热黄疸，小便不利及癌肿的治疗；外用治疮疖痈肿，毒蛇咬伤。现代中医临床用白花蛇舌草经过恰配伍可以治疗肺炎、阑尾炎、痢疾、尿道炎、黄疸、胆石症、盆腔炎、附件炎、疮肿热毒以及癌症。我们对白花蛇舌草抗人胶质瘤迁移及侵袭的作用进行了研究，希望为对抗胶质瘤的复发和扩散侵袭提供新的治疗线索。

发明内容

为了解决上述问题，本发明利用MTT实验、活死细胞染色实验、流式细胞术检测细胞凋亡实验、划痕愈伤实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验及三维细胞微流控芯片灌流培养侵袭实验评估不同浓度的中药白花蛇舌草80％乙醇提取物在抗人恶性胶质瘤细胞(U87)增殖、促凋亡方面的应用；以及对人恶性胶质瘤细胞(U87)迁移、侵袭能力的作用。

具体的，本发明白花蛇舌草在抗人恶性胶质瘤细胞增殖、促凋亡方面的应用中使用的白花蛇舌草采用的是浓度低于8mg/mL的白花蛇舌草80％乙醇提取物。

具体的，本发明所述白花蛇舌草在抗人恶性胶质瘤细胞迁移、侵袭方面的应用中使用的白花蛇舌草采用的是浓度低于4mg/mL的白花蛇舌草80％乙醇提取物。更为优选的情况下，使用浓度为0.5～3mg/mL的白花蛇舌草80％乙醇提取物。

在本发明的具体实施例中，所述白花蛇舌草对人恶性胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的作用的药物浓度通过MTT实验进行筛选，发现在4、6、8mg/mL浓度时，白花蛇舌草对胶质瘤细胞有明显的细胞增殖活性抑制作用，并表现出细胞毒性，在低于4mg/mL的0.5、1、2mg/mL浓度，白花蛇舌草对细胞活性没有明显影响，并同过活死细胞染色实验、流式细胞术检测凋亡实验进行了验证，选择0.5、1、2mg/mL作为二维细胞迁移、侵袭实验的药物刺激浓度，选择1、2、3mg/mL作为三维细胞侵袭实验的药物刺激浓度。

上述技术方案中，为探究白花蛇舌草抗胶质瘤细胞迁移、侵袭的作用机制，采用网络药理学分析方法，通过TCMSP数据库检索、筛选了白花蛇舌草24个潜在活性成分，以及这24个潜在活性成分所对应的83个作用靶点蛋白。利用TCMSP，OMIM，TTD等数据库及软件，检索到72个与人胶质瘤相关联的靶点蛋白。通过Cytoscape软件，构建药物-靶点网络、胶质瘤-靶点网络以及药物-靶点-疾病之间的蛋白相互作用网络图，在此基础上进一步在DAVID平台上使用GO注释分析法对白花蛇舌草作用于胶质瘤的可能的信号通路进行富集分析。结果显示，白花蛇舌草可能通过参与MAPK信号通路、Wnt信号通路及对微管细胞骨架组织的调节抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭。

有益效果

1)本发明提供的白花蛇舌草80％乙醇提取物对人恶性胶质瘤细胞的抗增殖、促凋亡、抗迁移、抗侵袭作用，为临床恶性胶质瘤的治疗以及研发高效低毒的胶质瘤治疗药物提供了新的线索和实验依据。

2)本发明中，建立了一个人恶性胶质瘤细胞微流控芯片三维灌流培养模型，来评估白花蛇舌草提取物对胶质瘤细胞球侵袭作用的影响。三维灌流培养模式，使得体外培养的人恶性胶质瘤细胞更接近于体内微环境，细胞对药物刺激的反应可以更加真实地模拟实际临床用药的效果。

3)本发明中，通过网络药理学挖掘出的白花蛇舌草抗胶质瘤作用的相关机制，为下一步具体的作用机制实验研究提供了思路和线索。

4)本发明采用微流控芯片评价白花蛇舌草提取物对人胶质瘤侵袭作用的抑制效应，具有高通量、操作简单、节省实验时间、生成稳定的药物浓度、可以实时观察药物对细胞的作用、能够长时间持续灌流培养等优点。

附图说明

图1应用MTT法检测不同浓度白花蛇舌草提取物作用人恶性胶质瘤U87细胞24小时对细胞增殖活性的影响；

图2应用活死细胞染色法分析不同浓度白花蛇舌草提取物作用胶质瘤U87细胞24小时对细胞增殖活性的影响；图2A为激光共聚焦显微镜下活死细胞染色的照片，图像放大倍数250×，说明了随着药物浓度的增加，活细胞的数量逐渐减少，4、8mg/ml浓度下存活细胞数明显少于阳性对照替莫唑胺组；图2B为药物浓度-细胞存活率柱状图，说明了在该实验中白花蛇舌草80％乙醇提取物对U87细胞的增殖活性有明显抑制作用，并呈效应-浓度相关性，4、8mg/mL浓度的白花蛇舌草对细胞增殖活性的抑制作用明显优于阳性对照替莫唑胺100μΜ组P＜0.05；

图3流式细胞术检测不同浓度白花蛇舌草提取物促胶质瘤U87细胞凋亡的作用；图3A为药物刺激后U87细胞凋亡的流式检测结果图，Q2象限为晚期凋亡细胞，Q3象限为早期凋亡细胞，说明了随着白花蛇舌草提取物浓度的增加，Q2+Q3象限内凋亡细胞的数量呈递增趋势；图3B为药物浓度-细胞凋亡率柱状图，说明了在该实验中白花蛇舌草80％乙醇提取物对U87细胞有促凋亡的作用，并呈效应-浓度相关性，4、8mg/mL浓度的白花蛇舌草对细胞的促凋亡作用明显优于阳性对照替莫唑胺100μΜ组P＜0.05；

图4划痕愈伤实验检测白花蛇舌草提取物抑制胶质瘤U87细胞迁移的作用；图4A为不同浓度药物刺激0小时及24小时细胞迁移情况在倒置显微镜下的照片，图像放大倍数50×，说明了1、2mg/mL的白花蛇舌草提取物能明显抑制U87细胞迁移，作用强于阳性对照替莫唑胺100μΜ组；图4B为药物浓度-细胞相对迁移抑制率柱状图，说明了在该实验中1、2mg/mL的白花蛇舌草提取物能明显抑制U87细胞迁移P＜0.05，并呈效应-浓度相关性，作用明显优于阳性对照替莫唑胺100μΜ组P＜0.05；

图5Transwell迁移实验检测白花蛇舌草抗胶质瘤U87细胞迁移的作用；图5A为药物刺激17小时后，Transwell迁移实验U87细胞迁移结果倒置显微镜下照片，图像放大倍数200×，说明了随着白花蛇舌草浓度增加，迁移过Transwell小室底膜的细胞数逐渐减少；图5B为药物浓度-细胞迁移率柱状图，说明了白花蛇舌草能显著抑制U87细胞的迁移作用P＜0.05，并呈效应-浓度相关性；

图6Transwell侵袭实验检测白花蛇舌草抗胶质瘤U87细胞侵袭的作用；图6A为药物刺激17小时后，Transwell侵袭实验U87细胞侵袭结果倒置显微镜下照片，，图像放大倍数200×，说明了随着白花蛇舌草浓度增加，侵袭过Matrigel胶并迁移过Transwell小室底膜的细胞数逐渐减少；图6B为药物浓度-细胞侵袭率柱状图，说明了白花蛇舌草能显著抑制U87细胞的侵袭作用P＜0.05，并呈效应-浓度相关性；

图7三维细胞微流控芯片灌流培养检测白花蛇舌草抗胶质瘤U87细胞侵袭的作用；图7A为药物作用后，三维侵袭实验中U87多细胞球侵袭情况激光共聚焦显微镜多层扫描叠加图，图像放大倍数100×，说明了随着药物浓度的增加，细胞球侵袭的细胞数逐渐减少；图7B为药物浓度-细胞侵袭率柱状图，说明了在微流控灌流培养条件下，白花蛇舌草能显著抑制U87细胞三维多细胞球的侵袭作用P＜0.05，并呈效应-浓度相关性；

图8白花蛇舌草80％乙醇提取物UPLC-Q-TOF-MS阳离子模式色谱分析图；A为保留时间0.6～3min的阳离子模式色谱分析图，图像放大倍数7×，说明了在这段时间分离分析出了26个白花蛇舌草含有的化学成分；B为保留时间0～30min的阳离子模式全色谱分析图，说明了包括图A的26个成分，共分离分析出35个白花蛇舌草含有的化学成分；

图9白花蛇舌草可能的活性成分-作用靶点网络图；

图10人胶质瘤-相关靶点蛋白网络图；

图11白花蛇舌草-靶点-人胶质瘤蛋白相互作用网络图。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明的实施例中所述浓度梯度微流控芯片，是一种带有浓度梯度生成器并能够培养胶质瘤U87细胞、观察细胞对药物刺激反应的微流控芯片，由上游的浓度梯度生成器、下游的细胞培养小室模块及覆盖细胞培养模块的玻璃片组成。药物浓度梯度刺激和细胞接种培养可以在芯片中进行集成操作，在该系统上可以同时记录不同药物浓度刺激下细胞的反应。

所述微流控芯片上游的浓度梯度生成器，包括两个液体入口和与之连通的数个浓度梯度稀释通道。

所述下游的细胞培养小室模块是一组以阵列排列细胞培养开放小室，上端与上游的浓度梯度稀释通道连通，下游通过连通通道与设置于端部的出口池连通。

所述玻璃片表面旋涂有疏水材料聚二甲基硅氧烷，用于接种细胞，接种细胞的位置与细胞培养开放小室的排列方式及位置相对应；在细胞成球后，将玻璃片上接种的胶质瘤微球阵列反扣于芯片细胞培养模块位置，使每个细胞球恰好位于对应的细胞培养小室中，玻璃片封盖了芯片开发小室二者紧密贴合。

所述微流控芯片上游的浓度梯度生成器，通道宽为10～1000μm，液体存在层流特性；所述浓度梯度稀释通路为蛇形弯道，弯道的剪切力能让进液口的两种流体多次稀释、分离、混合，从而形成连续浓度梯度。

所述下游开放小室(直径5mm、高度2mm)、芯片下游连接通道(高度和宽度为300μm)。

所述微流控芯片细胞培养模块中，4组串联的细胞培养小室与上游的浓度梯度生成器4个终浓度通道分别相连。当白花蛇舌草提取物含药培养基与无药培养基通过两个入口被引入芯片，通过芯片上游的浓度梯度生成器的通路混合、分离、稀释，最终形成四个通路的不同浓度，向与之相连的细胞培养小室内持续渗透，对胶质瘤细胞球进行持续的灌流刺激。

不同浓度的白花蛇舌草提取物对胶质瘤细胞的持续灌流刺激，是通过外接注射泵连续泵入新鲜的含药及无药培养基，芯片放入二氧化碳培养箱中实现连续培养。

经三维微流控芯片灌流培养结束后，细胞球采用波形蛋白抗体免疫荧光及Hoechst33342染色定位法，比较胶质瘤细胞侵袭相关波形蛋白的表达量，计算侵袭细胞数量评价白花蛇舌草对胶质瘤细胞侵袭能力的作用。结果显示，在1mg/mL及2mg/mL浓度灌流培养24小时，白花蛇舌草对胶质瘤细胞的侵袭有明显抑制作用。

实施例1

白花蛇舌草提取物抗胶质瘤细胞增殖活性、促凋亡、抗迁移、抗侵袭的实验研究。

1白花蛇舌草80％乙醇提取物及含药培养基的制备

1)白花蛇舌草80％乙醇提取物的制备

精密称取白花蛇舌草25g，置于1000mL圆底烧瓶中，加入20倍量80％乙醇，加热回流提取两次，第一次提取2小时，第二次提取1小时。合并提取液，旋转蒸发浓缩至干，转移浓缩液至50mL容量瓶，用80％乙醇定容至刻度，即得500mg/mL(药材质量/mL)浓度白花蛇舌草提取物溶液，密封4℃冰箱保存。

2)含药培养基的制备

根据不同实验条件，吸取适量白花蛇舌草提取液，加入DMEM无血清培养基或含有一定浓度胎牛血清的DMEM培养基中，配制成8mg/mL浓度的溶液，4℃冰箱保存，用时以培养基稀释到所需浓度。

2人恶性胶质瘤U87细胞培养与传代

人恶性胶质瘤U87细胞用DMEM完全培养基(DMEM高糖培养基、10％胎牛血清、100U/mL青霉素0.1mg/mL链霉素)培养于25cm²培养瓶中，置于5％CO₂，37℃，相对湿度95％的恒温密闭孵箱中培养，当细胞达到80％左右融合度时，弃掉培养基，用2mL PBS清洗2次后，除尽PBS，加入含0.02％EDTA的0.25％胰酶0.8mL，轻轻摇动培养瓶，使消化液遍布所有细胞表面，显微镜下观察细胞质回缩、细胞间隙增大后，立即加入2mL DMEM完全培养基终止消化。用吸管吸取瓶内培养基，按顺序从培养瓶一边到另一边轻柔吹打，并尽量避免出现泡沫，使细胞脱离瓶壁形成细胞悬液。收集细胞悬液于15mL离心管中，800rpm，离心5min，弃上清，计数，将细胞密度调至3×10⁵cell/mL，分别接种到新的培养瓶中，置培养箱中培养。

3MTT实验药物抑制细胞增殖活性作用检测

取对数生长期的细胞，调整细胞密度至8×10⁴/mL，将细胞接种于96孔板，每孔100μL，，置孵箱中孵育过夜，使细胞贴壁，小心吸出每孔培养基，换成不含血清的含药培养基，设0、0.5、1、2、4、6、8mg/mL七个浓度，0mg/mL为空白对照组，以100μΜ替莫唑胺为阳性对照组，每孔100μL，，每个浓度4个复孔，中药提取液在570nm有吸收，每个浓度均设置调零孔，孵箱孵育24h，每孔加入MTT5mg/mL溶液10μL，孵箱孵育4h。取出96孔板，显微镜下观察有紫色结晶生成。将含MTT培养基小心吸净，注意尽量避免吸出结晶，每孔加入150μL DMSO，避光振荡10min，马上用酶标仪检测570nm吸光度值。重复实验三次。计算细胞存活率。图1是应用MTT法检测不同浓度白花蛇舌草提取物作用人恶性胶质瘤U87细胞24小时对细胞增殖活性的影响。

4活死细胞染色实验检测药物抑制细胞活性的作用

1)活死染液的配制

取Calcein-AM储备溶液10μL、PI储备液30μL、Hoechst 33258染液(1mg/mL)20μL，用PBS稀释到10mL避光备用。

2)细胞爬片

将无菌的24孔板专用玻片放入24孔板中，取对数生长期的细胞，消化，计数，调整细胞密度，制备成为1.0×10⁵cell/mL的细胞悬液，每孔中加入1mL，轻轻摇匀，放入孵箱中孵育。待细胞达到50％左右融合度时，加药。

3)药物刺激

弃掉原培养基，加入白花蛇舌草含药培养基，每个样本设0、0.5、1、2、4、8mg/mL六个浓度，0mg/mL为空白对照孔，替莫唑胺100μM为阳性对照孔。孵箱孵育24h。

4)活死染色

取出孔板，吸出弃掉含药培养基，每孔用PBS小心清洗2次，加入配制好的活死细胞染液，孵箱内孵育30min。取出孔板后，吸出弃掉活死细胞染液，每孔加入PBS1mL，轻轻晃动清洗三次，每孔加入适量PBS保存细胞湿润，将玻片小心取出，有细胞一面向下，盖到载玻片上，激光共聚焦显微镜下观察，拍照。用Image J软件统计活死细胞数，计算细胞存活率。图2是应用活死细胞染色法分析不同浓度白花蛇舌草提取物作用胶质瘤U87细胞24小时对细胞增殖活性的影响。

5流式细胞术检测药物促细胞凋亡的作用

取对数生长期细胞，消化，计数，取六孔板，加入细胞悬液，使每孔细胞数在5×10⁵个左右，置孵箱孵育，当细胞达到90％融合度时，弃掉原培养基，加入浓度为0、0.5、1、2、4、6、8mg/mL的含药培养基，孵箱孵育24h后，取出孔板，PBS清洗2次，加入胰酶消化，2000rpm，5min离心收集细胞，以冷PBS轻轻吹打清洗2次，2000rpm离心5min，弃上清。用400μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，使细胞密度大约为1×10⁶cell/mL。加入5μL Annexin V-FITC，于4℃轻轻混匀避光孵育15min。加入10μL PI后于4℃轻轻混匀避光孵育5min，用流式细胞仪检测。图3是流式细胞术检测不同浓度白花蛇舌草提取物促胶质瘤U87细胞凋亡的作用。

6划痕愈伤实验检测药物抗细胞迁移的作用

细胞达到80％融合度时，弃去瓶内的培养基，PBS清洗两次，加入无血清DMED饥饿24h，目的是消除胎牛血清对细胞增殖的促进作用。超净台内，在六孔板的底部用记号笔画3条等距离平行线。细胞消化，计数，制备细胞悬液，加入六孔板，使每孔细胞数为5×10⁵个，晃动孔板，使细胞在孔内均匀分布，孵箱孵育过夜，镜下观察细胞融合度达到90％左右，用提前酒精消毒、UV照射30min的尺子和10μL枪头，在孔底中央部位划两条与底部直线垂直的两条线，轻轻晃动六孔板，吸出弃掉原培养基，PBS清洗两次，目的是去掉划线时脱落的细胞。镜下观察，在每个孔底有两条边界清晰的划痕。加入白花蛇舌草0、0.5、1、2mg/mL含药培养基。分别于加药后0小时、24小时在倒置显微镜下观察拍照。根据划线固定位置，每孔取五个视野，用Image J软件测量相应位置0h与24h的迁移面积差，计算细胞迁移率，分析不同药物对胶质瘤细胞迁移的影响。图4是划痕愈伤实验检测白花蛇舌草提取物抑制胶质瘤U87细胞迁移的作用。

7Transwell迁移实验检测药物抗细胞迁移的作用

细胞达到80％融合度时，弃去瓶内的培养基，PBS清洗两次，加入无血清DMEM饥饿24h。消化细胞，计数，以含有0.2％BSA的DMEM培养基制备细胞悬液，使细胞浓度为2×10⁵细胞/mL。将Transwell小室放入24孔板中，取100μL细胞悬液尽量均匀滴加入Transwell小室中，孵箱孵育4h。小心吸出小室内的培养基，注意不要碰到小室底部的细胞，分别向各小室加入浓度为0、0.5、1、2mg/mL的含药培养基100μL，0mg/mL为control组，并设置替莫唑胺100μM为阳性对照孔，每孔下室加入含10％FBS的DMEM600μL，置于培养箱中孵育17h。

取出24孔板，将上室内的培养基吸出弃掉，用PBS清洗小室两次，去净PBS。在上室和下室中分别加入4％多聚甲醛溶液，固定细胞30min。PBS清洗两次，在上室和下室中分别加入0.2％结晶紫溶液，染色30min。取出小室，PBS清洗三次。用棉签仔细擦去小室内膜上的细胞。将小室正放于载玻片上，倒置显微镜高倍镜下观察拍照，计数穿过小室底膜的细胞数。每组与control组比较计算细胞迁移率，衡量药物对细胞迁移的抑制作用。重复实验3次。图5为Transwell迁移实验检测白花蛇舌草抗胶质瘤U87细胞迁移的作用。

8Transwell侵袭实验检测药物抗细胞侵袭的作用

将灭菌的100μL枪头、EP管放入-20℃冰箱中冷冻降温。Matrigel胶置于冰袋上，用冷枪头迅速分装至冷的EP管中，-20℃冻存，避免反复冻融。实验前，将分装好的Matrigel胶放置4℃冰箱中解冻使融。取适量的Matrigel胶，用冷的DMEM无血清培养基按Matrigel：DMEM＝1：3比例稀释。轻轻吹打均匀，尽量避免产生气泡。取稀释好的胶液60μL均匀铺在小室内部底膜上，勿产生气泡，37℃孵箱中放置30min使聚合成胶。小心吸去胶液凝固时析出的水分，加入50μLDMEM培养基，置孵箱中30min水化基底膜，加入细胞悬液之前，吸除培养基。

其余步骤与Transwell迁移实验相同。图6为Transwell侵袭实验检测白花蛇舌草抗胶质瘤U87细胞侵袭的作用。

9微流控三维灌流培养检测药物抗胶质瘤细胞侵袭的作用

1)所用微流控装置是由微流控芯片，及涂覆有PDMS膜的刚性玻璃片构成。微流控芯片包括结构单元：细胞培养室阵列、进液池、废液池、微流通道。细胞培养阵列室共用一个废液池。涂覆有PDMS膜的刚性玻璃片，用于细胞接种和对细胞培养室阵列的封合。

应用负性光刻胶SU-8，按照标准的软光刻技术制备阳膜模具，并以此阳模反转出PDMS阴模。在该PDMS阴模相应位置按细胞培养室阵列、进液池、废液池进行打孔，打孔位置形成贯通阴模的通孔结构。用一块洁净的玻璃片，与PDMS阴模含通道的一面不可逆键合，将阴模所有的通道及孔洞的底面封合，形成微流控芯片。该微流控芯片经过高压灭菌，使整体亲水性提高，便于液体流通，并完成消毒过程。

2)胶质瘤细胞的的接种及与微流控芯片的结合。涂覆有PDMS膜的刚性玻璃片经紫外线照射消毒1h。细胞单细胞悬液滴于PDMS膜-刚性玻璃片表面，滴落位置与微流控芯片的细胞培养室对齐。细胞接种密度为1×10⁶个/mL。由于涂覆有PDMS膜的刚性玻璃片的表面疏水性，在其表面形成了液滴阵列。用胶布将玻璃片粘于培养皿盖，培养皿盖小心地倒转，扣于含有PBS的培养皿底，放于培养箱，细胞经沉淀、聚集，三天后形成细胞球。采用胶原水凝胶作为细胞外基质(ECM)培养介质，用PBS和蒸馏水稀释胶原原液，氢氧化钠调节pH值。吸去细胞球周围培养基，将胶原滴于细胞球上。包含有细胞球的胶原体系经培养箱37℃环境，发生交联反应，形成肿瘤细胞的胞外基质环境。

含细胞球阵列的PDMS刚性玻璃片，含细胞面朝下，与微流控芯片的细胞培养室阵列对齐，盖于微流控芯片上，在PDMS-PDMS表面张力作用下，两部分组装在一起，成为一个半密闭的微流控芯片细胞培养体系，将封合的两部分用不锈钢弹簧夹夹紧，增强闭合效果，防止漏液。仅留进液池和废液池为敞开孔，用于液体的引入和外排。

3)微流控装置中胶质瘤细胞的灌流培养。使用移液枪将培养基从进液池加入，排空芯片中的气泡，使液体充满通道及细胞培养室，浸没阵列中所有的细胞样品。采用无菌连接管连接芯片的进液池与装有浓度为0mg/mL及3mg/mL白花蛇舌草提取物含药培养基的微量注射器，该注射器由注射泵控制培养基灌流速度。将芯片部分放入培养箱。

4)免疫荧光染色鉴定胶质瘤细胞的生物学变化。灌流培养结束后，将弹簧夹取下，自微流控芯片及刚性玻璃片封合面的一角逐渐开启，直至这两部分完全分离，回收刚性玻璃片上不同培养条件下的细胞样品。多聚甲醛固定，PBS清洗后加入Triton-100，PBS清洗后加入BSA封闭。分别加入波形蛋白一抗孵育48h。吸弃抗体稀释液，PBS清洗后加入二抗稀释液，避光孵育。吸弃二抗稀释液，PBS清洗后加入核染料Hoechst避光孵育。吸弃核染料，PBS清洗后共聚焦荧光显微镜下观察。每个样本扫描30个层面，统计阳性表达细胞数，加药组通过与空白对照组比较计算细胞侵袭率评价各组细胞的侵袭能力。免疫荧光及定量表征如图7所示。

实施例2

UPLC-Q-TOF-MS色谱分析白花蛇舌草抗胶质瘤可能的活性成分。

色谱分析采用的是安捷伦1290超高压液相色谱仪-G6530B Q-TOF质谱分析仪。自动进样系统设置于标准注射模式，进样量为0.5μL。高效液相分析柱为安捷伦Eclipse PlusC18(4.6×150mm，3.5μm)，运行温度为40℃。梯度洗脱的流动相条件为：0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)；3-30分钟B 20％-99％，30-35分钟B 99％-20％；流动相流速为0.350mL/min。质谱分析为阳离子模式，脱溶剂气温为350℃，脱溶剂气流速度10L/min，锥孔气温400℃，锥孔气流速度12L/min，毛细管电压4000V，喷嘴电压500V，碎裂电压120V。图8为白花蛇舌草80％乙醇提取物UPLC-Q-TOF-MS阳离子模式色谱分析图。

表1.质谱分析结果

实施例3

网络药理学分析白花蛇舌草抗胶质瘤迁移、侵袭可能的作用机制。

1)白花蛇舌草潜在活性成分及其作用靶点的分析。基于化学、药理学及分子生物学数据分析基础上的系统网络药理学的方法分析白花蛇舌草抗人恶性胶质瘤潜在的作用机制。通过TCMSP数据库检索，白花蛇舌草已经被发现的成分及其药理学、药代动力学参数都被收集起来，通过两个关键参数：口服利用度(OB≥30％)和药物相似度(DL≥0.18％)进行筛选，24个成分被保留下来进行下一步的分析。其中几个具有明显生物活性的成分，一直被作为中药重要的活性成分指标的，OB、DL两个参数值没有达到筛选标准，也被保留下来。通过TCMSP数据挖掘，找到了这24个潜在活性成分所对应的83个作用靶点蛋白，使用Cytoscape绘制的白花蛇舌草潜在活性成分及其作用靶点网络图见图9。

表2.网络药理学活性成分筛选结果

2)人胶质瘤相关靶点分析。利用TCMSP，OMIM，TTD等数据库及软件进行分析，发现了72个与人胶质瘤相关联的靶点蛋白。使用Cytoscape绘制的人胶质瘤疾病-靶点网络图见图10。

3)药物-作用靶点-疾病之间的蛋白相互作用及白花蛇舌草抗胶质瘤迁移、侵袭相关信号通路分析。通过Cytoscape软件，将药物-靶点-疾病之间的蛋白相互作用网络图构建出来，见图11。在蛋白相互作用网络中通过用degree、betweeness和closeness三个参数进行筛选，有69个大的节点被保留下来，进一步在DAVID平台上使用GO注释分析法对白花蛇舌草作用于胶质瘤的可能的信号通路进行富集分析。结果显示，白花蛇舌草抑制人胶质瘤细胞迁移和侵袭的作用机制可能与MAPK信号通路、Wnt信号通路及对微管细胞骨架组织的调节有关。

对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (4)

1.白花蛇舌草在抗人脑胶质瘤细胞增殖、促凋亡方面的应用，其特征在于：所述应用中使用的白花蛇舌草是浓度低于8mg/mL的白花蛇舌草80％乙醇提取物。

2.白花蛇舌草在抗人恶性胶质瘤细胞迁移、抗侵袭方面的应用。

3.根据权利要求2所述的白花蛇舌草在抗人恶性胶质瘤细胞迁移、抗侵袭方面的应用，其特征在于：所述应用中使用的白花蛇舌草是浓度低于4mg/mL的白花蛇舌草80％乙醇提取物。

4.根据权利要求3所述的白花蛇舌草在抗人恶性胶质瘤细胞迁移、抗侵袭方面的应用，其特征在于：所述应用中使用的白花蛇舌草是浓度为0.5～3mg/mL的白花蛇舌草80％乙醇提取物。