CN105510597A - 槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法 - Google Patents

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Abstract

槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法，本发明通过采用高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪肝模型；之后利用光镜、HE染色观察各组大鼠治疗前后组织学的变化；从而检测各组小鼠治疗前后SCD1、LXRα含量和活性的表达。完成槲皮素对非酒精性脂肪性肝病干预作用的评估，了解槲皮素治疗非酒精习惯脂肪性肝病的可能机制。

Description

槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法
技术领域
本发明涉及非酒精性脂肪性肝病的病理及发病机制研究领域，特别涉及槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，其病理学改变与酒精性肝病相似，但患者无过量饮酒史，疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化和肝细胞癌。随着肥胖和代谢综合征在全球的流行，NAFLD的发病率呈逐年增加。在我国NAFLD呈现高发病率和低龄化趋势。NAFLD的发病机制尚不十分明确，目前广泛接受的是Day和James提出的“二次打击”学说，认为肝细胞脂肪积聚和脂肪变性构成“初次打击”进一步在细胞内脂质过氧化和氧化应激、炎性细胞因子等因素作用下形成“二次打击”,诱导了肝脏炎症反应、肝细胞变性坏死和肝纤维化/肝硬化的发生。目前观点认为治疗NAFLD的首要目标是改善IR，次要目标是防止二次打击和肝功能失代偿，减少或防止肝癌、肝硬化及并发症的发生。
脂质在肝脏中的蓄积是NAFLD的特征，也是其发生发展的关键环节。硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)是脂质合成的核心酶，催化单不饱和脂肪酸的合成。Wang等通过建立高脂饮食诱导的NAFLD模型证实，槲皮素能够抑制肝脏脂酸的合成，减轻肝脏脂质蓄积。肝X受体α基因(FXR-α)是细胞内重要的核受体。研究证实FXR-α参与了胆固醇和甘油三酯的合成、吸收、转运、排泄等过程，在胆固醇、甘油三酯代谢中起关键作用。
目前治疗NAFLD尚无特效药物，且现临床使用的大部分药物在治疗的同时还存在一定副作用，疗效也无法肯定。NAFLD患病率在我国逐年升高，亟需找到一种安全、有效、价廉物美的治疗药物。槲皮素(quercetin)是从植物中提取除的一种黄酮类化合物，广泛存在于许多植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在。大量研究证明槲皮素是一种安全性很高的药物，且槲皮素具有抗炎、抗氧化、减少脂质合成、改善胰岛素抵抗等作用，有望成为治疗NAFLD的潜在药物，目前尚无槲皮素对SCD1和FXR-α影响的报道。本研究拟通过高脂喂养建立NAFLD动物模型观察槲皮素对NAFLD的治疗作用；通过动物模型研究SCD1和FXR-α在NAFLD中的作用；在动物模型上观察槲皮素对NAFLD的治疗效果及NAFLD中槲皮素的疗效是否与调节SCD1和FXR-α的表达有关，为槲皮素的进一步临床研究提供理论基础。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法，
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法，通过采用高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪肝模型；之后利用光镜、HE染色观察各组大鼠治疗前后组织学的变化；从而检测各组小鼠治疗前后SCD1、LXRα含量和活性的表达，完成槲皮素对非酒精性脂肪性肝病干预作用的评估，了解槲皮素治疗非酒精习惯脂肪性肝病的可能机制。
进一步的，一、实验材料
⑴实验动物:雄性SD大鼠
⑵饲料配制：普通饲料(由泸州医学院实验动物中心提供)；
高脂饲料：由88％的普通饲料，10％的猪油和2％的胆固醇组成。
二、建立非酒精性肝病动物模型，选取48只SD雄性大鼠，正常喂养一周，随机分为正常对照组(16只)和NAFLD组(40只)，分别给予普通饲料和高脂饮食喂养，8周末处死NAFLD组大鼠8只和正常对照8只,取肝脏进行病理学检查,证实造模成功后,将余下NAFLD大鼠32只分为三组:(1)NAFLD对照组8只,继续饲以高饲料,予以等体积生理盐水灌胃；(2)槲皮素低剂量治疗组8只,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素75mgkg-1·d-1灌胃给药。(3)槲皮素中剂量治疗组8只,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素300mgkg-1·d-1灌胃给药(4)槲皮素高剂量治疗组8只,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素600mgkg-1·d-1灌胃给药。12周末禁食12h后处死所有动物,采集标本，运用生物技术及病理组织检查等进行检测诊断，常规制备血清、肝组织石蜡切片并保留少量肝组织用于RNA的检测。
三、标本采集及处理，
A：血清分离
实验结束后，动物禁食12h，用10％的水合氯醛以0.35ml/l00g体重经腹腔内注射麻醉后开腹，腹主动脉采血，室温静置15min，3000rpm离心15min分离血清，-70℃冰箱冻存，备测血脂、血清转氨酶(ALT,AST,TG,TC)等生化指标。免疫组化检测相关蛋白。
B：组织学标本制备
各组大鼠于肝右叶相同部位取0.5g肝组织置于1.5mlEP管，-70℃冰箱保存，用于RT-PCR的检测；另取肝左叶相同部位1cm×lcm×0.5cm组织，置于4％的多聚甲醛中固定24-48h，自来水冲洗24h，经逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察肝组织病理学改变。
四、观察指标及检测方法：
1、一般情况：大鼠处死前后称重、体长,以及观察大鼠食欲、皮肤、毛发情况，处死大鼠后观察肝脏形态体积、质地弹性等以及称肝脏湿重、计算肝指数(肝湿重/体重×100％)及Lee·s指数(体重1/3/体长×1000)。
2、血清生化测定：将采集的全血用低温离心机迅速分离血浆，采用全自动生化分析仪(OlympusAul000)测定AlT、AST、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及肝组织匀浆脂质水平、血清游离脂肪酸(FFA)水平；葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)；放免法测定血清空腹胰岛素(FINS)水平；并计算胰岛素敏感指数ISI＝ln[1/(F1NS×FBG)]。
五、病理学检查：取石蜡包埋好的肝组织，5um连续切片，常规苏木精-伊红染色，在光镜下评估肝脂肪变性及纤维化程度、计算炎症活动度计分。脂肪肝病理组织学诊断参考中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组“非酒精性肝病诊断标准”
六、免疫组化测SCD1、LXR-α的蛋白水平
七、半定量RT-PCR技术检测肝脏SCD1、LXR-α的表达(采用半定量RT-PCR法，按照Trizol试剂盒说明提取大鼠肝组织总RNA，反转录合成cDNA。)
1.PCR反应引物设计和合成
PCR引物参照有关文献设计
SCD1mRNA引物：
FORWARD5'-CTACACAACCACCACCACCA-3'
REVERSE5'-CAGGGCACCCATCAGATAGT-3'
FXR-αmRNA引物：
FORWARD5’-ACAAGGCTGCCCCGACTAC-3’
REVERSE5’-TTTCTCCTGGTATGAGATAGCAAATC-3’
2.总RNA提取
采用Trizol法提取总RNA
2.1组织匀浆：
(1)[i7]切取并称重100mg-70℃保存的冰冻SD大鼠肝脏组织置于高温高压消毒后研钵内，倒入液氮，迅速研碎；
(2)每100mg均浆组织标本中加入1ml的Trizol，混匀吹打；
(3)将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，颠倒混匀后，室温放置5min[i8]，以彻底分离核蛋白复合体。
2.2分离阶段：每1mlTrizol加入0.2ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15S，充分混匀，在室温放置3min，然后离心12,000rpm，15min，4℃。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总Trizol的60％。
2.3RNA的沉淀：将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入等体积(0.5ml)异丙醇，室温静置10min，然后4℃，12,000rpm，10min离心，可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，即RNA沉淀。
2.4RNA的洗涤：小心去除上清，留取沉淀，加入1ml现配的75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混匀，使沉淀物混悬，4℃，8000rpm，5min离心。
2.5RNA的再溶解：小心去除上清，RNA沉淀物室温风干后，(不完全干燥)，加入25ml的DEPC处理过的无菌去离子水，用枪头反复吹打几次，室温静置10min，55-60℃，测浓度后-20℃保存。
2.6紫外分光光度法检查RNA浓度和纯度：将仪器调零，取2μl储存液加入另一个EP管中，再加入98μl灭菌注射用水，离心混匀，以灭菌注射用水作空白对照。
2.7RNA鉴定，琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。
用氯仿-异丙醇-75％乙醇法常规操作提取RNA，按逆转录试剂盒说明书操作.
3.逆转录成cDNA
①合成cDNA的引物可结合实际情况从OligodT-AdaptorPrimer，Random9mers或特异性下游引物中任选一种。
按下列组成配制反转录反应液。
②按以下条件进行反转录反应。
4.PCR反应
①按下列组成配制PCR反应液。
②把B-①的反应液加入到A-②的反转录反应结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。
③按以下条件进行PCR反应
5.PCR产物半定量
反应结束后，取PCR反应液(5～10l)进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，须将PCR产物冷冻保存。
6.结果判定
采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。
八、Westernplot测磷酸化的LXR-α
1.蛋白质样品获得：真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。
2.电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3.转移：(半干式转移)
(1)电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。
(2)膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。
(3)转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50％甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
4.免疫反应：
(1)用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
(2)加入包被液，平稳摇动，室温2h。
(3)弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
(4)加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃放置12hr以上。阴性对照，以1％BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
(5)弃一抗和1％BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。
(6)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。
(7)弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。
(8)加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
5.实验结果分析
根据曝光显示的条带的有无、强弱，对照蛋白质分子量标准参照物的迁移距离，可判定目的蛋白质的有无及量的多少。利用“自动灰度扫描仪”扫描条带，计算积分光密度值，以内参照蛋白质条带的积分光密度为校正值，可以进行半定量分析。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种槲皮素对非酒精性脂肪性肝病干预作用的研究方法，实验表明通过制作NAFLD模型大鼠，观察槲皮素对NAFLD大鼠的硬脂酰辅酶A去饱和酶1和肝X受体α基影响。结果显示与空白组比较,模型组大鼠血清ALT、AST和LDL-c、TC、TG升高(P＜0.05,P＜0.01),HDL-c降低(P＜0.01)；SCD-1基因表达降低(P＜0.01)；与模型组比较,槲皮素能使血清ALT、AST降低(P＜0.01),LDL-c、TC、TG降低(P＜0.05,P＜0.01),HDL-c升高(P＜0.01)；肝组织SCD-1基因表达升高(P＜0.01)，下调LXR-a基因表达。提示SCD-1基因表达下降、LXR-a基因表达增强参与了NAFLD的发病机制；槲皮素治疗NAFLD大鼠疗效机制可能与槲皮素有调节NAFLD大鼠脂代谢紊乱和促进调控基因SCD-1表达、抑制LXR-a基因的作用有关。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
试验例：
1.通过高脂喂养建立NAFLD动物模型；
2.通过动物模型观察槲皮素对NAFLD的治疗作用及探究治疗的合适剂量；
3.通过动物模型研究SCD1和FXR-α在NAFLD中的作用；
4.在动物模型上观对槲皮素对NAFLD的治疗效果及NAFLD中槲皮素的疗效是否与调节SCD1和FXR-α的表达有关。
研究方法
一、实验材料
⑴实验动物:雄性SD大鼠
⑵饲料配制：普通饲料(由泸州医学院实验动物中心提供)；
高脂饲料：由88％的普通饲料，10％的猪油和2％的胆固醇组成。
二、建立非酒精性肝病动物模型，选取48只SD雄性大鼠，正常喂养一周，随机分为正常对照组(16只)和NAFLD组(40只)，分别给予普通饲料和高脂饮食喂养，8周末处死NAFLD组大鼠8只和正常对照8只,取肝脏进行病理学检查,证实造模成功后,将余下NAFLD大鼠32只分为三组:(1)NAFLD对照组8只,继续饲以高饲料,予以等体积生理盐水灌胃；(2)槲皮素低剂量治疗组8只,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素75mgkg-1·d-1灌胃给药。(3)槲皮素中剂量治疗组8只,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素300mgkg-1·d-1灌胃给药(4)槲皮素高剂量治疗组8只,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素600mgkg-1·d-1灌胃给药。12周末禁食12h后处死所有动物,采集标本，运用生物技术及病理组织检查等进行检测诊断，常规制备血清、肝组织石蜡切片并保留少量肝组织用于RNA的检测。
三、标本采集及处理，
A：血清分离
实验结束后，动物禁食12h，用10％的水合氯醛以0.35ml/l00g体重经腹腔内注射麻醉后开腹，腹主动脉采血，室温静置15min，3000rpm离心15min分离血清，-70℃冰箱冻存，备测血脂、血清转氨酶(ALT,AST,TG,TC)等生化指标。免疫组化检测相关蛋白。
B：组织学标本制备
各组大鼠于肝右叶相同部位取0.5g肝组织置于1.5mlEP管，-70℃冰箱保存，用于RT-PCR的检测；另取肝左叶相同部位1cm×lcm×0.5cm组织，置于4％的多聚甲醛中固定24-48h，自来水冲洗24h，经逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察肝组织病理学改变。
四、观察指标及检测方法：
1、一般情况：大鼠处死前后称重、体长,以及观察大鼠食欲、皮肤、毛发情况，处死大鼠后观察肝脏形态体积、质地弹性等以及称肝脏湿重、计算肝指数(肝湿重/体重×100％)及Lee·s指数(体重1/3/体长×1000)。
2、血清生化测定：将采集的全血用低温离心机迅速分离血浆，采用全自动生化分析仪(OlympusAul000)测定AlT、AST、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及肝组织匀浆脂质水平、血清游离脂肪酸(FFA)水平；葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)；放免法测定血清空腹胰岛素(FINS)水平；并计算胰岛素敏感指数ISI＝ln[1/(F1NS×FBG)]。
五、病理学检查：取石蜡包埋好的肝组织，5um连续切片，常规苏木精-伊红染色，在光镜下评估肝脂肪变性及纤维化程度、计算炎症活动度计分。脂肪肝病理组织学诊断参考中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组“非酒精性肝病诊断标准”
六、免疫组化测SCD1、LXR-α的蛋白水平
七、半定量RT-PCR技术检测肝脏SCD1、LXR-α的表达(采用半定量RT-PCR法，按照Trizol试剂盒说明提取大鼠肝组织总RNA，反转录合成cDNA。)
1.PCR反应引物设计和合成
PCR引物参照有关文献设计
SCD1mRNA引物：
FORWARD5'-CTACACAACCACCACCACCA-3'
REVERSE5'-CAGGGCACCCATCAGATAGT-3'
FXR-αmRNA引物：
FORWARD5’-ACAAGGCTGCCCCGACTAC-3’
REVERSE5’-TTTCTCCTGGTATGAGATAGCAAATC-3’
2.总RNA提取
采用Trizol法提取总RNA
2.1组织匀浆：
(1)[i7]切取并称重100mg-70℃保存的冰冻SD大鼠肝脏组织置于高温高压消毒后研钵内，倒入液氮，迅速研碎；
(2)每100mg均浆组织标本中加入1ml的Trizol，混匀吹打；
(3)将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，颠倒混匀后，室温放置5min[i8]，以彻底分离核蛋白复合体。
2.2分离阶段：每1mlTrizol加入0.2ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15S，充分混匀，在室温放置3min，然后离心12,000rpm，15min，4℃。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总Trizol的60％。
2.3RNA的沉淀：将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入等体积(0.5ml)异丙醇，室温静置10min，然后4℃，12,000rpm，10min离心，可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，即RNA沉淀。
2.4RNA的洗涤：小心去除上清，留取沉淀，加入1ml现配的75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混匀，使沉淀物混悬，4℃，8000rpm，5min离心。
2.5RNA的再溶解：小心去除上清，RNA沉淀物室温风干后，(不完全干燥)，加入25ml的DEPC处理过的无菌去离子水，用枪头反复吹打几次，室温静置10min，55-60℃，测浓度后-20℃保存。
2.6紫外分光光度法检查RNA浓度和纯度：将仪器调零，取2μl储存液加入另一个EP管中，再加入98μl灭菌注射用水，离心混匀，以灭菌注射用水作空白对照。
2.7RNA鉴定，琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。
用氯仿-异丙醇-75％乙醇法常规操作提取RNA，按逆转录试剂盒说明书操作.
3.逆转录成cDNA
①合成cDNA的引物可结合实际情况从OligodT-AdaptorPrimer，Random9mers或特异性下游引物中任选一种。
按下列组成配制反转录反应液。
②按以下条件进行反转录反应。
4.PCR反应
①按下列组成配制PCR反应液。
②把B-①的反应液加入到A-②的反转录反应结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。
③按以下条件进行PCR反应
5.PCR产物半定量
反应结束后，取PCR反应液(5～10l)进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，须将PCR产物冷冻保存。
6.结果判定
采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。
八、Westernplot测磷酸化的LXR-α
1.蛋白质样品获得：真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。
2.电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3.转移：(半干式转移)
(1)电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。
(2)膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。
(3)转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50％甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
4.免疫反应：
(1)用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
(2)加入包被液，平稳摇动，室温2h。
(3)弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
(4)加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃放置12hr以上。阴性对照，以1％BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
(5)弃一抗和1％BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。
(6)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。
(7)弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。
(8)加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
5.实验结果分析
根据曝光显示的条带的有无、强弱，对照蛋白质分子量标准参照物的迁移距离，可判定目的蛋白质的有无及量的多少。利用“自动灰度扫描仪”扫描条带，计算积分光密度值，以内参照蛋白质条带的积分光密度为校正值，可以进行半定量分析。
通过制作NAFLD模型大鼠，观察槲皮素对NAFLD大鼠的硬脂酰辅酶A去饱和酶1和肝X受体α基影响。结果显示与空白组比较,模型组大鼠血清ALT、AST和LDL-c、TC、TG升高(P＜0.05,P＜0.01),HDL-c降低(P＜0.01)；SCD-1基因表达降低(P＜0.01)；与模型组比较,槲皮素能使血清ALT、AST降低(P＜0.01),LDL-c、TC、TG降低(P＜0.05,P＜0.01),HDL-c升高(P＜0.01)；肝组织SCD-1基因表达升高(P＜0.01)，下调LXR-a基因表达。提示SCD-1基因表达下降、LXR-a基因表达增强参与了NAFLD的发病机制；槲皮素治疗NAFLD大鼠疗效机制可能与槲皮素有调节NAFLD大鼠脂代谢紊乱和促进调控基因SCD-1表达、抑制LXR-a基因的作用有关。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法，其特征在于，通过采用高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪肝模型；之后利用光镜、HE染色观察各组大鼠治疗前后组织学的变化；从而检测各组小鼠治疗前后SCD1、LXRα含量和活性的表达，完成槲皮素对非酒精性脂肪性肝病干预作用的评估。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
步骤一、实验材料准备：
⑴实验动物:雄性SD大鼠
⑵饲料配制：普通饲料；高脂饲料：由88％的普通饲料，10％
的猪油和2％的胆固醇组成；
步骤二、建立非酒精性肝病动物模型，选取48只SD雄性大鼠，正常喂养一周，随机分为正常对照组和NAFLD组，分别给予普通饲料和高脂饮食喂养，8周末处死NAFLD组大鼠8只和正常对照8只,取肝脏进行病理学检查,证实造模成功后,将余下NAFLD大鼠32只分为三组:(1)NAFLD对照组,继续饲以高饲料,予以等体积生理盐水灌胃；(2)槲皮素低剂量治疗组,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素75mgkg-1·d-1灌胃给药；(3)槲皮素中剂量治疗组,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素300mgkg-1·d-1灌胃给药(4)槲皮素高剂量治疗组,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素600mgkg-1·d-1灌胃给药；12周末禁食12h后处死所有动物,采集标本，运用生物技术及病理组织检查等进行检测诊断，常规制备血清、肝组织石蜡切片并保留少量肝组织用于RNA的检测；
步骤三、标本采集及处理，
A：血清分离
实验结束后，动物禁食12h，用10％的水合氯醛以0.35ml/l00g体重经腹腔内注射麻醉后开腹，腹主动脉采血，室温静置15min，3000rpm离心15min分离血清，-70℃冰箱冻存，备测血脂、血清转氨酶(ALT,AST,TG,TC)等生化指标；免疫组化检测相关蛋白；
B：组织学标本制备
各组大鼠于肝右叶相同部位取0.5g肝组织置于1.5mlEP管，-70℃冰箱保存，用于RT-PCR的检测；另取肝左叶相同部位1cm×lcm×0.5cm组织，置于4％的多聚甲醛中固定24-48h，自来水冲洗24h，经逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察肝组织病理学改变；
步骤四、观察指标及检测方法：
1、一般情况：大鼠处死前后称重、体长,以及观察大鼠食欲、皮肤、毛发情况，处死大鼠后观察肝脏形态体积、质地弹性等以及称肝脏湿重、计算肝指数及Lee·s指数；
2、血清生化测定：将采集的全血用低温离心机迅速分离血浆，采用全自动生化分析仪测定AlT、AST、甘油三酯、总胆固醇以及肝组织匀浆脂质水平、血清游离脂肪酸水平；葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖；放免法测定血清空腹胰岛素水平；并计算胰岛素敏感指数ISI＝ln[1/(F1NS×FBG)]；
步骤五、病理学检查：取石蜡包埋好的肝组织，5um连续切片，常规苏木精-伊红染色，在光镜下评估肝脂肪变性及纤维化程度、计算炎症活动度计分，脂肪肝病理组织学诊断参考中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组“非酒精性肝病诊断标准”
步骤六、免疫组化测SCD1、LXR-α的蛋白水平；
步骤七、半定量RT-PCR技术检测肝脏SCD1、LXR-α的表达；
步骤八、Westernplot测磷酸化的LXR-α。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，上述方法显示与空白组比较,模型组大鼠血清ALT、AST和LDL-c、TC、TG升高,HDL-c降低；SCD-1基因表达降低；与模型组比较,槲皮素能使血清ALT、AST降低,LDL-c、TC、TG降低,HDL-c升高；肝组织SCD-1基因表达升高，下调LXR-a基因表达。提示SCD-1基因表达下降、LXR-a基因表达增强参与了NAFLD的发病机制；槲皮素治疗NAFLD大鼠疗效机制可能与槲皮素有调节NAFLD大鼠脂代谢紊乱和促进调控基因SCD-1表达、抑制LXR-a基因的作用有关。
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