CN110616206A

CN110616206A - 一种虎皮鱼PtScd1基因及其应用

Info

Publication number: CN110616206A
Application number: CN201911046381.6A
Authority: CN
Inventors: 刘丽丽; 朱华; 张蓉; 王晓雯
Original assignee: Beijing Aquatic Science Research Institute (national Freshwater Fisheries Engineering Technology Research Center)
Current assignee: Beijing Aquatic Science Research Institute (national Freshwater Fisheries Engineering Technology Research Center)
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2039-10-30
Also published as: CN110616206B

Abstract

本发明公开了一种属于生物化学与分子生物学技术领域的一种虎皮鱼PtScd1基因及其应用。本发明通过RACE克隆和序列拼接获得虎皮鱼PtScd1 cDNA序列，预测ORF序列包含981个核苷酸，编码326个氨基酸；氨基酸序列含有高度保守的脂肪酸去饱和酶结构域，蛋白质三维结构存在双铁离子结合位点，可结合底物ST9和MPG。qPCR技术检测到PtScd1 mRNA在虎皮鱼脑、鳃、肝脏和肌肉组织中表达，其中肝脏表达水平最高；低温诱导虎皮鱼PtScd1 mRNA水平上升，脑组织PtScd1 mRNA相对表达水平与温度具有显著负相关性。筛选出PtScd1为虎皮鱼耐低温基因。

Description

一种虎皮鱼PtScd1基因及其应用

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种虎皮鱼PtScd1基因及其应用。

背景技术

硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)是一种酰基辅酶A，是单不饱和脂肪酸合成途径的限速酶，通过调控脂肪酸代谢过程改变细胞膜流动性，在细胞膜应对低温胁迫的过程中发挥重要作用。SCD广泛存在于单细胞生物、哺乳动物和人类体内，在许多水生动物中也报道了SCD的酶活力和基因表达，包括鲤鱼(Cyprinus carpio)、斑马鱼(Danio rerio)、罗非鱼(Oreochromis mossambicus)草鱼(Ctenopharyngodon idella、团头鲂(Megalobrama amblycephala)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、章鱼(Octopus vulgaris)、大黄鱼(Larimichthys crocea)等。低温驯化过程中遮目鱼(Chanos chanos)肝细胞膜的脂肪酸组成与SCD变化显著，肝细胞微粒体SCD活性与单不饱和脂肪酸含量具有相关性；通过改变饲料配方提高罗非鱼SCD1转录本含量和活性，脂肪酸不饱和指数(16:1/16:0；18:1/18:0)相应变化，能够提高罗非鱼低温耐受能力。SCD可能在鱼类应对低温胁迫的过程中具有重要作用。

虎皮鱼(tiger barb，Sumatra barb)是一种广受水族爱好者欢迎的小型热带观赏鱼，成鱼体长5cm～7cm。体表浅黄或棕黄色，上覆四条垂直的浓黑色条纹，因体表斑斓似虎纹，故称为虎皮鱼，学名四带无须魮，拉丁文名Puntius tetrazona，也称为Puntigrustetrazona。虎皮鱼对温度变化十分敏感，属于狭温热带鱼类，适宜水温为23～28℃。温度降低则体色暗淡、婚姻色减退、摄食力减弱、游动迟缓，导致生病甚至死亡。由于这一生物学特性，虎皮鱼的生产养殖严重受制于季节性气候变化和昼夜温差。在生产养殖过程中，渔场通常依赖地热或煤炭燃烧保持适宜水温；在终端消费市场，观赏鱼爱好者通常使用加热棒保持虎皮鱼水温恒定，造成了极大的能源浪费。鱼类耐低温功能基因挖掘和功能研究将成为未来水产研究的重要方向之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虎皮鱼PtScd1基因及其应用。

虎皮鱼对低温适应能力差，筛选虎皮鱼耐低温基因，有助于改善虎皮鱼低温耐受能力，提高低温存活率。本发明利用CODEHOP软件设计简并引物，PCR扩增到一段虎皮鱼scd1保守序列，通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)克隆和序列拼接获得虎皮鱼PtScd1 cDNA序列，全长1338bp，ORFfinder预测开放阅读框长度981个核苷酸，编码326个氨基酸。CDD预测PtSCD1氨基酸序列含有高度保守的脂肪酸去饱和酶结构域，Swiss-Model同源建模发现蛋白质三维结构存在两个锌离子结合位点，根据实际分析是双铁离子结合位点。SCD1特异性结合底物硬脂酰辅酶A，并在其脂肪酸delta-9位置引入双键，催化生成单不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸含量升高有助于提高细胞应对低温胁迫的能力；预测PtSCD1有两个配体/底物结合位点，分别和硬脂酰辅酶A(stearoyl-coenzyme A，ST9)、(Z)-十八碳-9-羟基-(2R)-2,3-二氧氮自由基丙酸([(Z)-octadec-9-enyl](2R)-2,3-bis(oxidanyl)propanoate，MPG)结合，但是这两个配体的结合位点序列保守性很差，催化生成不饱和脂肪酸的活力低，是导致虎皮鱼低温应答能力差的原因之一。实时荧光定量PCR技术检测到PtScd1 mRNA在虎皮鱼脑、鳃、肝脏和肌肉组织中表达，表达水平从高到低是肝脏>脑>肌肉>鳃；低温胁迫下虎皮鱼PtScd1 mRNA水平上升，脑组织PtScd1mRNA相对表达水平与温度具有显著负相关性(R²＝-0.97，P<0.01)，脑PtScd1可以作为虎皮鱼响应低温胁迫分子标志物。

本发明的有益效果：本发明筛选出虎皮鱼耐低温基因，该基因的表达蛋白的两个配体的结合位点序列具有高度不保守性，催化生成不饱和脂肪酸的活力低，是虎皮鱼不耐受低温的原因。虎皮鱼脑组织PtScd1基因的mRNA水平与温度具有显著的负相关性，该基因可以作为虎皮鱼应答低温胁迫的分子标志物。本发明的基因的应用有助于改善虎皮鱼低温耐受能力，提高低温存活率。

附图说明

图1为虎皮鱼梯度低温胁迫与取样流程图。

图2为虎皮鱼PtScd1基因ORF序列比对结果图。

图3为CDD保守结构域预测结果图。

图4为PtScd1三维结构模式图。

图5为虎皮鱼PtScd1 mRNA表达水平定量分析图，其中(A)为虎皮鱼脑、鳃、肝脏和肌肉组织PtScd1表达水平定量分析(log(10))图，以脑组织为对照组，所有样品处理温度均为27℃；(B)为低温胁迫下虎皮鱼各组织PtScd1表达水平定量分析图，每个组织中以27℃处理组作为对照组；(C)为脑组织PtScd1 mRNA丰度与温度相关性分析图，R²＝-0.97，P<0.01。图中所有数值表示为平均值±标准差。*表示与同一组织样品对照组(27℃)有显著差异，P<0.01。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例

一、材料

1.虎皮鱼养殖

虎皮鱼在完成驯化后长期养殖，养殖条件为：水温25-27℃，pH 6.5-7.4，kH 6-7，养殖系统具备独立循环过滤和连续曝气装置，每日定时定量投喂商品干饲料2次，喂食10min后吸除饲料残渣。

2.梯度低温胁迫试验

挑选体型大小相近、健康活泼的8月龄虎皮鱼150条(不区分雌雄)，用于梯度低温胁迫试验。将150条虎皮鱼随机分为5个养殖缸，每个养殖缸30L，含有30条虎皮鱼。试验第一天水温保持27℃，次日起每24h降低温度如下：△T1＝4℃/d，△T2＝4℃/d，△T3＝4℃/d，△T4＝2℃/d，其他条件维持不变。各温度梯度维持24h后，每缸随机取3条虎皮鱼(图1)，间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(Sigma-Aldrich，E10521，商品名MS-222)溶液麻醉后，解剖脑、鳃、肝脏和肌肉组织，液氮速冻，-86℃超低温冰箱(Thermo，Forma 88000)保存。实验共3个生物学重复。

二、流程及方法

1.总RNA提取

虎皮鱼脑、鳃、肝脏和肌肉组织从超低温冰箱取出后，立即加入组织总RNA提取试剂RNAiso Plus(TaKaRa，D9108A)，组织匀浆仪(MP，FastPrep-24)进行组织破碎和匀浆，提取总RNA，操作按照试剂说明书进行。Nanodrop2000核酸蛋白浓度检测仪测定总RNA浓度和污染情况，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，-86℃超低温冰箱保存备用。

2.cDNA第一链合成与保守序列克隆

分别以脑、鳃、肝脏和肌肉总RNA为模板，采用1st strand cDNA合成试剂盒(TaKaRa，6110A)合成cDNA第一链。Nanodrop2000核酸蛋白浓度检测仪测定cDNA产物浓度和纯度，-86℃超低温冰箱保存备用。根据GenBank中公布的鱼类scd1基因cDNA保守序列，利用CODEHOP软件设计简并引物SCD-MAFQ-F、SCD-MWGN-R，SCD-VMFQ-F、SCD-NYHH-R(表1)。按照Ex Taq酶(TaKaRa，DRR001A)说明书配制PCR反应体系，按照如下程序进行PCR扩增反应：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环；72℃继续延伸10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳验证，送交擎科新业生物技术公司进行测序。

表1所用引物信息表

3.RACE克隆

根据简并引物PCR扩增获得PtScd1 cDNA部分保守序列，Primer3Web(http://primer3.ut.ee/)在线设计引物SCDGSP1和SCDNGSP1用于5’RACE扩增，设计引物SCDGSP2和SCDNGSP2用于3’RACE扩增。采用SMARTer RACE 5’/3’Kit(Clontech，634858)试剂盒，按照说明书配制反应体系，以肝脏组织cDNA为模板，进行PCR扩增，分别得到PtScd1 cDNA的5’和3’RACE产物。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，凝胶DNA回收试剂盒(TaKaRa，9762)回收目的条带DNA，送交擎科新业生物技术公司进行测序，采用SeqMan软件对测序片段与得到的虎皮鱼scd1 cDNA部分保守序列进行拼接。以肝脏组织cDNA为模板，scdCDS-F和scdCDS-R为引物，进行PCR验证。

4.cDNA序列结构分析与氨基酸序列预测

拼接序列经BLAST在线(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，结果表明该序列与NCBI数据库公布的scd1 mRNA序列具有高度同源性；使用ClustalX2和DNAMAN软件进行序列同源性比对和系统发育进化树构建，NCBI ORFfinder在线(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测开放阅读框(open reading frame，ORF)和可能编码的氨基酸序列。通过BankIt(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/)将PtScd1cDNA序列上传到GenBank数据库。CDD数据库在线(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测氨基酸序列的保守结构域。Swiss-Model在线(https://swissmodel.expasy.org/，ProMod3 Version 2.0.0)进行同源建模，预测其三级结构。

5.实时荧光定量qPCR

根据获得的PtScd1 cDNA序列，Primer3Web(http://primer3.ut.ee/)在线设计引物SCD-qF和SCD-qR用于实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)(表1)。以本研究中获得的脑、鳃、肝脏和肌肉组织cDNA为模板，虎皮鱼gapdh为内参基因(表1)，按照荧光定量PCR试剂盒(天根，FP209)说明书配制20μL反应体系，在ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪器进行qPCR反应，反应程序为：98℃预变性3min；95℃变性5s，60℃退火并延伸(采集信号)30s，40个循环。溶解曲线(melt curve)信号采集程序为：95℃～60℃，2.5℃/s。

6.数据分析与绘图

OriginPro 8.0软件对数据进行统计学分析和绘图，ANOVA单因素方差分析检验显著性水平，Levene检验进行方差同质性分析，LSD和S-N-K方法进行事后多重检验。所有数值表示为平均值±标准差。

三、结果及分析

1.虎皮鱼scd1基因(PtScd1)mRNA序列结构与保守性分析

通过RACE克隆和序列拼接获得一段1338bp的虎皮鱼scd1基因mRNA序列，将其命名为PtScd1，序列在GenBank数据库上传(登录号：MN364671)。Blastn序列比对发现，PtScd1mRNA序列与鲤鱼(Cyprinus carpio)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、矛尾复虾虎鱼(Acanthogobius hasta)和斑马鱼(Danio rerio)scd1 mRNA的序列相似度分别为88.58％、83.84％、83.84％、82.05％、79.98％和79.03％(表2)。

表2虎皮鱼PtScd1 mRNA序列BLAST比对结果

ORFfinder预测PtScd1 ORF位于mRNA序列94～1074位，包含981个核苷酸，编码326个氨基酸。将PtScd1 ORF序列与鲤鱼、团头鲂和斑马鱼scd1mRNA序列进行多序列比对，发现其序列相似度分别为88.52％、83.49％和79.36％，表明PtScd1基因编码序列与鱼类相比具有高度保守性(图2)。

2.PtSCD1蛋白质结构与功能预测

预测Ptscd1 ORF编码326个氨基酸，该氨基酸序列命名为PtSCD1，蛋白质分子量37.62KDa。PtSCD1氨基酸序列33-311位比对到脂肪酸去饱和酶(fatty-acid desaturase)保守结构域(序列号：pfam00487)，长度为248个氨基酸，二进制值(bit score)为63.12，期望值(E-value)为1.96e-11(图3)。

Swiss-Model同源建模发现，PtSCD1与4ymk.1.A(PDB，2019-08-02)序列同源性高达63.34％，属于单体蛋白，序列相似性为0.5，比对范围氨基酸序列第6～326位，覆盖度95％，序列比对表明其蛋白功能为酰基辅酶A去饱和酶1(Acyl-CoA desaturase 1)。根据其三维结构，预测PtSCD1有两个高度保守的锌离子结合位点，有两个配体结合位点，分别和硬脂酰辅酶A(stearoyl-coenzyme A，ST9)、(Z)-十八碳-9-羟基-(2R)-2,3-二氧氮自由基丙酸([(Z)-octadec-9-enyl](2R)-2,3-bis(oxidanyl)propanoate，MPG)结合，但是这两个配体的结合位点序列保守性很差(图4)。

三维结构模型预测PtScd1有两个锌离子结合位点是由Swiss-model蛋白质模型预测的原理决定的，模型预测过程中，根据氨基酸序列的相似性，参考了人和小鼠SCD1蛋白质晶体结构。尽管在人和小鼠SCD1晶体结构中检测到两个锌离子，但这是蛋白质过表达造成的，天然SCD1与铁离子而非锌离子结合。这是因为：①锌离子通常为四面体配位，而SCD1的离子结合位点为八面体，铁离子正是典型的八面体配位；②亚铁离子和锌离子的离子半径相近；③双铁离子结合位点在delta-9硬脂酰基载体蛋白(ACP)去饱和酶等氧化酶中有广泛研究。SCD1与锌离子的错配结构导致纯化到的SCD1不具有生物活性。最近有研究将小鼠SCD1晶体结构中的锌离子去除，重新加入两个亚铁离子，发现SCD1结构没有发现明显的变化。因此，虎皮鱼PtSCD1的保守组氨酸残基和精氨酸残基，在靠近底物结合口袋的尖角处，形成了双铁离子结合位点(diiron center)，而非锌离子结合位点。

3.PtSCD mRNA组织特异性与温度诱导表达

qPCR分析发现，PtScd1在不同组织(27℃)中的表达水平从高到低是肝脏>脑>肌肉>鳃(图5A)。在梯度低温胁迫(23、19、15、13℃)下，基因表达水平上调。其中在脑组织中PtScd1 mRNA丰度与温度相关性分析发现泊松系数(R²)为-0.97(P<0.01)，表明脑组织中PtScd1 mRNA丰度与温度具有负相关性，随着温度降低，PtScd1 mRNA依赖性上调表达。低温胁迫下鳃和肌肉组织PtScd1 mRNA水平均显著高于对相应照组，肝脏组织13℃处理组PtScd1mRNA水平也显著高于其对照组(P<0.01)。

序列表

<110> 北京市水产科学研究所（国家淡水渔业工程技术研究中心）

<120> 一种虎皮鱼PtScd1基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 326

<212> PRT

<213> 虎皮鱼(Puntius tetrazona)

<400> 1

Met Pro Asp Arg Glu Ile Lys Ser Pro Val Trp Tyr Pro Glu Arg Glu

1 5 10 15

Thr Val Glu Asp Glu Phe Asp His Thr Tyr Lys Glu Lys Glu Gly Pro

20 25 30

Lys Pro Pro Ile Ile Ile Val Trp Arg Asn Val Ile Leu Met Ser Leu

35 40 45

Leu His Val Gly Ala Val Tyr Gly Leu Phe Leu Phe Pro Ser Ala Arg

50 55 60

Ala Leu Thr Trp Val Trp Phe Leu Ala Cys Phe Leu Phe Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gly Ile Thr Ala Gly Val His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Lys

85 90 95

Ala Ser Leu Pro Leu Arg Ile Phe Leu Ala Leu Ala Asn Ser Met Ala

100 105 110

Phe Gln Asn Asp Ile Tyr Glu Trp Ser Arg Asp His Arg Val His His

115 120 125

Lys Phe Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Gly Arg Gly Phe

130 135 140

Phe Phe Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Asp Val

145 150 155 160

Ile Glu Lys Gly Arg Lys Leu Asp Leu Asp Asp Leu Lys Ala Asp Gln

165 170 175

Val Val Met Phe Gln Arg Arg His Tyr Lys Leu Ser Val Val Val Met

180 185 190

Cys Phe Leu Val Pro Thr Val Val Pro Trp Tyr Met Trp Gly Glu Ser

195 200 205

Leu Trp Val Ala Tyr Phe Val Pro Gly Leu Leu Arg Tyr Ala Thr Val

210 215 220

Leu Asn Ser Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Met Trp Gly Asn

225 230 235 240

Arg Pro Tyr Asp Gly Ser Ile Asn Pro Arg Glu Asn Arg Phe Val Thr

245 250 255

Phe Ser Ala Ile Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Thr Phe Pro

260 265 270

Phe Asp Tyr Ala Thr Ser Glu Phe Gly Cys Lys Leu Asn Leu Thr Thr

275 280 285

Cys Phe Ile Asp Leu Met Cys Phe Leu Gly Leu Ala Thr Glu Pro Lys

290 295 300

Ser Val Ser Lys Glu Ala Val Leu Ala Arg Ala Gln Arg Thr Gly Asp

305 310 315 320

Gly Ser His Arg Thr Gly

325

<210> 2

<211> 1335

<212> DNA

<213> 虎皮鱼(Puntius tetrazona)

<400> 2

gtcgctaatt tgcaaaccac cggcacaagg ccgagtcgag cggcacgcgt tcgcttcatc 60

accgctttac cgaggagctc gatcgtggtc atcatgcccg acagggaaat caaatctccg 120

gtctggtatc cggaacggga gacggtggag gacgagtttg atcacacgta taaagagaaa 180

gaagggccca agccccccat catcatcgtg tggaggaacg tcatcctcat gagtttactg 240

cacgtcggag ccgtgtacgg actcttcctg ttcccgtccg cccgagctct cacgtgggtc 300

tggtttttgg cgtgtttctt gttcagcggt ctgggcatca ccgcaggagt tcaccggctc 360

tggagtcaca gatcatataa agcatcttta cctctccgga tcttcctcgc cttagctaac 420

tccatggcct tccagaacga catctacgaa tggtcgcgcg atcatcgcgt tcaccacaag 480

ttctccgaga cggacgccga cccccacaac gccggtcgag ggttcttctt ctctcacgtc 540

ggctggctgc tggttcgcaa acacccggac gtcatcgaga agggacgcaa gctggacctc 600

gacgacctga aggccgacca agtcgtcatg tttcagagga ggcactacaa gctgtctgtg 660

gtggtgatgt gcttcctggt gccgacggtc gtaccgtggt acatgtgggg cgagtctctg 720

tgggtggcgt atttcgtccc cggcctcctg agatacgcga cggtgctcaa ctccacctgg 780

ctggtcaaca gcgccgcgca catgtggggg aaccggccgt acgacggcag catcaacccc 840

cgcgagaaca gattcgtcac cttcagcgct ataggtgagg gcttccataa ctaccaccac 900

acgttcccct tcgactacgc caccagcgag ttcggctgca agctcaacct gaccacctgc 960

ttcattgacc tcatgtgttt cctgggtctg gccacagagc ccaagagcgt gtccaaagag 1020

gcagtgcttg ctcgagctca gcgcaccgga gacggcagcc accggaccgg ctaacggcgc 1080

tctcaaccaa ccgctaaacc cgacaacagg aggacggacg atcggcggcg aggagtgtca 1140

gatgactaat gcttatgttt gttttttttc tctcgccccc ccggctaacc ccggacgctt 1200

taataagggg aaccggcctg gttgtgtaac gcttattccg aatttctttc cggcttcctc 1260

ctctccacag cagctggaga ctaagctctt gtcgctgaag tggcggtttg ctccatgcag 1320

gaactaaacg gggtg 1335

Claims

1.一种虎皮鱼PtScd1蛋白，其特征在于，具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：

1)自序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基序列；

2)将自序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有耐低温的蛋白质。

2.根据权利要求1所述虎皮鱼PtScd1蛋白，其特征在于，所述虎皮鱼PtScd1蛋白的基因序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的虎皮鱼PtScd1蛋白，其特征在于，所述蛋白的两个配体的结合位点序列具有高度不保守性，催化生成不饱和脂肪酸的活力低，是虎皮鱼不耐受低温的原因。

4.根据权利要求2所述虎皮鱼PtScd1蛋白，其特征在于，所述虎皮鱼脑组织PtScd1基因的mRNA水平与温度具有显著的负相关性，该基因可以作为虎皮鱼应答低温胁迫的分子标志物。

5.权利要求1所述虎皮鱼PtScd1蛋白在虎皮鱼耐低温性中的应用。