CN113980827B - 一种过表达Eaf3p促进酿酒酵母非偏好氮源利用的方法 - Google Patents

一种过表达Eaf3p促进酿酒酵母非偏好氮源利用的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种过表达Eaf3p促进酿酒酵母非偏好氮源利用的方法，属于微生物遗传和分子生物学技术领域。本发明通过将染色质调控因子Eaf3p基因序列连接到高拷贝质粒上，并转化到酿酒酵母中游离表达，增加了酿酒酵母对多种非偏好氮源的利用率，并减少了菌株发酵过程中的尿素积累，为在工业上大大提高原料中的营养成分的利用率、节约成本，同时减少有害氮代谢物积累提供了一种新的策略。

Description

一种过表达Eaf3p促进酿酒酵母非偏好氮源利用的方法
技术领域
本发明涉及一种过表达Eaf3p促进酿酒酵母非偏好氮源利用的方法，属于微生物遗传和分子生物学技术领域。
背景技术
在传统发酵产品，如黄酒等的生产过程中，由于发酵过程中含氮化合物的不完全代谢，造成大量氮源的浪费和发酵食品中氨基甲酸乙酯等有害物质的积累。氨基甲酸乙酯具有神经毒性和较强的致癌性，被国际癌症研究所(IARC)评为2A类有害物质。尿素是氨基甲酸乙酯的重要前体之一，黄酒中约70％-90％的氨基甲酸乙酯是通过尿素与乙醇自发反应生成。
在酿酒酵母细胞中，氮代谢调控是通过多个复杂的调控系统协同作用实现的，其中NCR效应是调节酿酒酵母氮代谢的重要途径。NCR效应调控因子主要涉及正调控因子(Gln3p、Gat1p)和负调控因子及阻遏蛋白(Gzf3p、Dal80p和Ure2p)，这些调控因子可互作调节胞内约10％基因的表达。偏好性氮源的存在导致Gln3p和Gat1p上游的调控因子被激活，从而磷酸化Gln3p和Gat1p，同时活化阻遏蛋白Ure2p，导致Gln3p和Gat1p被阻滞在细胞核外，无法激活非偏好性氮源利用相关基因的转录，从而抑制非偏好氮源的利用。而负调控因子Dal80p和Ure2p主要通过与激活因子竞争基因启动子区域的5′-GATAA-3′位点来抑制Gln3p和Gat1p的活性，以抑制非偏好氮源的利用，导致发酵过程中非偏好氮源大量浪费和有害氮代谢物质的积累。
先前的一项研究分析了酿酒酵母S288C的核小体排列，发现在不同氮源存在下核小体的整体排列存在差异。与优选的氮源相比，在非优选的氮源存在下酿酒酵母的核小体丰度显着增加。通过核小体排列预测的大多数NCR相关基因被上调。核小体是真核染色质的组分。因此，结果表明染色质重塑可能与酿酒酵母中的氮代谢有关。因此筛选能够调节染色质重塑的染色质调控因子有助于实现对酿酒酵母针对不同氮源的利用率的调控作用。
发明内容
在本发明要解决的问题是通过改造染色质调控因子，增加酿酒酵母非偏好氮源利用的方法。
本发明提供了一株尿素积累量降低的酿酒酵母，所述酿酒酵母过量表达了染色质调控因子Eaf3p。
在一种实施方式中，所述染色质调控因子Eaf3p的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因整合至所述酿酒酵母基因组上；所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
在一种实施方式中，所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因连接到高拷贝表达载体上得到重组质粒，再将重组质粒转化到酿酒酵母细胞中。
在一种实施方式中，所述表达载体是pRS424。
在一种实施方式中，所述酿酒酵母是酿酒酵母S288C-trp1单倍体。
本发明还提供所述酿酒酵母的构建方法，是将所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因连接至表达载体pRS424上的TEF启动子后，得到重组质粒pRS424-EAF3，再将重组质粒pRS424-EAF3转化单倍体酿酒酵母S288C-trp1细胞中。
本发明还提供了染色质调控因子Eaf3p在降低酿酒酵母对尿素积累能力和增加酿酒酵母非偏好氮源利用能力中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是在酿酒酵母中过量表达染色质调控因子Eaf3p。
在一种实施方式中，所述氮源包括：天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、缬氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)、苏氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)，铵盐(NH4 +)。
本发明还提供所述酿酒酵母或所述方法在降低发酵食品中的尿素或有害氮代谢物含量方面的应用。
在一种实施方式中，所述有害氮代谢物包括但不限于氨基甲酸乙酯。
有益效果：
本发明对酿酒酵母染色质调控因子Eaf3p进行了过表达，不仅增加了多种非偏好氮源的利用率，还降低了发酵过程中的尿素积累。这对在工业生产中的应用具有重要意义，它不仅大大提高原料中的营养成分的利用率，还减少有害氮代谢物的积累，这不但节约了成本，还提高了发酵食品的安全性。
附图说明
图1：EAF3的过表达对S288C单倍体菌株对21种常用氮源利用的影响。
图2：EAF3的过表达对S288C单倍体菌株尿素积累的影响。
图3：EAF3的过表达对S288C单倍体菌株氮代谢关键基因转录水平的影响。
图4：PHO23的过表达对S288C单倍体菌株对21种常用氮源利用的影响。
图5：PHO23的过表达对S288C单倍体菌株尿素积累的影响。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。配制固体培养基时加入20g/L琼脂粉。用于筛选E.coli JM109转化子时，培养基中添加终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素。
YNB培养基：YNB合成培养基(含硫酸铵)67.4g/L，葡萄糖20g/L，按需要补加色氨酸0.1g/L，并在需要时加入终浓度为100μg/mL的博来霉素。
YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。
氨基酸混合培养基：YNB合成培养基(不含氨基酸和硫酸铵)1.7g/L，葡萄糖20g/L，21种氮源(组分及浓度如表1所示)。
单一氮源培养基：不含氨基酸和硫酸铵的YNB合成培养基1.7g/L，葡萄糖20g/L，分别加入终浓度为1g/L的天冬酰胺、精氨酸或脯氨酸。
模拟黄酒发酵培养基：糯米100g，生曲14g，熟曲4g，水170g，将糯米和水混合后，于105℃蒸煮30min，降温至室温后拌入生曲和熟曲。
表1 21种氮源在培养基中的终浓度
(二)酿酒酵母的构建及感受态制备：
酿酒酵母S288C-trp1的构建：
使用来自pUG66载体上的博来霉素抗性基因ble替换酿酒酵母S288C上的TRP1基因，以缺失TRP1基因，获得色氨酸筛选标记。具体操作为通过PCR扩增TRP1基因的上游500bp与下游500bp基因序列，PCR扩增pUG66载体上的ble序列，通过融合PCR连接将ble序列连接在TRP1的上下游序列之间，得到敲除框。将敲除框转化S288C菌株，通过博来霉素抗性筛选阳性转化子，并测序验证。所用引物序列列于表2.
酿酒酵母感受态制备使用Frozen-EZ Yeast Transformation II化转试剂盒，30℃，与10mL YPD培养基培养酿酒酵母菌至中数量级(OD600＝0.8-1.0)。以下步骤室温进行。
1、3500rpm离心细胞5min，吸掉上清液；
2、加入10mL EZ1溶液清洗沉淀，重新离心沉淀细胞，吸掉上清液；
3、加入1mL EZ2溶液重悬沉淀细胞。
表2引物序列
(三)酿酒酵母的转化：
1、取50μL感受态细胞与0.2-1μg DNA(体积少于5μl)混合；加入500μL EZ3溶液，完全混合；
2、30℃孵育45min，孵育过程中用手指轻弹或低俗涡旋2-3次让其混匀；
3、从转化混合液中取50-150μL到适当营养缺陷型平板上。
4、30℃平板孵育3天长出转化子。
(四)氨基酸HPLC测定：样品与4M三氯乙酸一比一混匀，4℃静止4h。色谱条件：AJS-01氨基酸专用分析柱(C18，3μm，4.6×150mm)。柱温：50℃。UV检测器：338nm(一级氨基酸)，262nm(二级氨基酸)。流动相A：称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)9.0g，十水合四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)9.5g，加水2000mL，用36％盐酸(约3mL)调pH至8.2，用0.45μm滤膜过滤。流动相B：取甲醇450mL，乙腈450mL，水100mL，混匀，超声脱气。
尿素HPLC测定：使用岛津高效液相色谱进行测定。HPLC条件：取400μL样品，加入600μL 0.02mol/L的9-羟基占吨醇溶液和100μL 1.5mol/L的盐酸溶液，混匀后避光反应30min。色谱条件：色谱柱为C18柱(4.6×150mm×3μm，Thermo Scientific,CA,USA)；柱温为35℃；流速设定为1mL/min；进样量为10μL；荧光检测器的激发波长和发射波长分别为213nm和308nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.02mol/L的乙酸钠(冰乙酸调pH至7.2)，超声脱气。
(五)实时荧光定量PCR
将菌株细胞活化后转接到YPD培养基中，30℃(200r/min)培养12h。种子液于4℃条件下10000r/min离心5min，收集菌体后立即置于液氮中研磨，并用酵母总RNA提取试剂盒RNeasy Plant Mini Kit提取酵母总RNA。将酵母总RNA用gDNase 42℃处理3min，除去基因组DNA。随后用RNA反转录试剂盒制备cDNA。以所得酵母cDNA为模板，利用LightCycler480Ⅱ系统进行荧光定量PCR。以ACT1基因为内参基因。基因表达变化的计算采用2–ΔΔCT法。RT-qPCR反应采用20μL体系，95℃40s、95℃5s和55℃30s，50个循环。所用引物如表3所示。
表3RT-qPCR引物序列
(六)菌株信息如表4所示。
表4本发明的实施方式中涉及的菌株
实施例1过量表达EAF3的菌株的构建
以pRS424为载体，构建S288C-pRS424-EAF3过表达质粒。用引物EAF3(F)和EAF3(R)从酿酒酵母S288C-trp1上PCR扩增EAF3基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，用引物pRS424(F)和pRS424(R)PCR线性化pRS424载体。然后通过一步克隆法连接基因片段和线性化质粒，转化到JM109菌株中。提取质粒，测序正确后醋酸锂法转化入S288C-trp菌株(该菌株在酿酒酵母S288C的基础上缺失了TRP1基因)中，菌落PCR筛选阳性转化子。
将pRS424空质粒转化入酿酒酵母S288C-trp获得的菌株作为对照菌株。
所有引物及基因序列均列在表5中。
表5引物序列
实施例2：EAF3过量表达对氨基酸利用的影响
将实施例1构建的重组菌株和转化了pRS424空质粒的对照菌株经30℃摇床200rpm培养16h活化(活化后的OD600为1.2)后，分别接种于氨基酸混合培养基中，于30℃温度发酵48h，检测菌株对21种氮源的利用率。检测结果如图1所示，与对照菌株相比，过表达EAF3的重组菌株S288C-pRS424-EAF3对脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、精氨酸(Arg)和甘氨酸(Gly)的利用率分别显著增加388.91％、213.32％、50.20％和20.26％；对亮氨酸(Leu)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)和谷氨酸(Glu)的利用率分别增加了10.87％、9.57％、8.88％和6.01％。
实施例3：EAF3的过量表达对尿素积累的影响
将实施例1构建的重组菌株和对照菌株分别经30℃摇床200rpm培养16h活化(活化后的OD600为1.2)后，分别接种于以天冬酰胺、中性氮源精氨酸或非偏好氮源脯氨酸为唯一氮源的单一氮源培养基中，于30℃温度发酵48h，检测尿素积累量。检测结果如图2所示，在分别以天冬酰胺、精氨酸和尿素为唯一氮源的情况下，与对照菌株相比，S288C-pRS424-EAF3的尿素含量分别降低了79.73％，67.49％和50.04％。这些结果表明，Eaf3p的过表达不但增加了多种非偏好氮源的利用，还降低了尿素的积累。这对在工业生产中的应用具有重要意义，它大大提高原料中的营养成分的利用率，节约了成本，还减少有害氮代谢物氨基甲酸乙酯的积累，增加了发酵食品的安全性。
实施例4：EAF3的过量表达对尿素积累的影响
将实施例1构建的重组菌株和对照菌株分别以10％(V/V)的接种量接入至模拟黄酒发酵培养基中，摇匀，加上发酵栓，置于恒温培养箱，30℃培养5d后，温度降至15℃，继续培养15d。发酵结束后，4000r/min离心10min，取上清液用于检测发酵体系中尿素的积累情况，结果显示，实施例1构建的重组菌株在黄酒模拟发酵体系中的尿素积累量显著降低，与对照菌株相比，降低40％以上。
实施例5：EAF3的过量表达对氮代谢关键基因转录水平的影响
SPS传感途径(Ssy1p-Ptr3p-Ssy5p)负责感受细胞外氨基酸和激活氨基酸转运蛋白的转录。氨基酸信号被感知后，其代谢相关基因的转录主要受NCR途径的调控。此外，氮代谢相关基因的翻译受GAAC(一般氨基酸控制途径)调控。采用实时荧光定量PCR检测实施例1构建的重组酿酒酵母EAF3的过量表达是否会引起一些关键氮代谢途径的改变。
检测结果表明(图3)，NCR转录激活因子编码基因GAT1和GLN3的转录水平分别上调2.02倍和1.87倍，而NCR阻遏蛋白URE2水平下调0.54倍。GAT1和GLN3的上调可以激活非偏好氮源的利用相关基因的表达。另外，氨基酸转运蛋白GAP1、CAN1、LYP1、HIP1、TAT1、TAT2和PUT4的转录水平均有所上调，这可能是非偏好氮源利用增加的原因。此外，精氨酸酶编码基因CAR1的表达下调0.41倍。尿素主要由精氨酸酶降解精氨酸尿素，精氨酸酶转录水平降低，导致由精氨酸降解减少，这可能是尿素积累减少的原因。
对比例1：PHO23的过量表达对S288C菌株氨基酸利用和尿素积累的影响
过表达与Eaf3p类似的Rpd3L组蛋白托乙酰化酶复合体亚基的染色质调控因子Pho23p。按照实施例1～3相同的策略，过量表达染色质调控因子PHO23基因，并对氮源利用率和尿素积累量进行检测，检测结果表明PHO23的过表达不能增加非偏好氮源的利用(图4)，过表达PHO23的酿酒酵母与原始菌株相比，分别以天冬酰胺、精氨酸或脯氨酸为氮源时，尿素的积累量没有显著变化(图5)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种过表达Eaf3p促进酿酒酵母非偏好氮源利用的方法
<130> BAA211447A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 401
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
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Met Val Asp Leu Glu Gln Glu Phe Ala Leu Gly Gly Arg Cys Leu Ala
1 5 10 15
Phe His Gly Pro Leu Met Tyr Glu Ala Lys Ile Leu Lys Ile Trp Asp
20 25 30
Pro Ser Ser Lys Met Tyr Thr Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Gly Gly
35 40 45
Ser Ser Gln Ala Thr Lys Glu Ile Lys Pro Gln Lys Leu Gly Glu Asp
50 55 60
Glu Ser Ile Pro Glu Glu Ile Ile Asn Gly Lys Cys Phe Phe Ile His
65 70 75 80
Tyr Gln Gly Trp Lys Ser Ser Trp Asp Glu Trp Val Gly Tyr Asp Arg
85 90 95
Ile Arg Ala Tyr Asn Glu Glu Asn Ile Ala Met Lys Lys Arg Leu Ala
100 105 110
Asn Glu Ala Lys Glu Ala Lys Lys Ser Leu Leu Glu Gln Gln Lys Lys
115 120 125
Lys Lys Leu Ser Thr Ser Leu Gly Gly Pro Ser Asn Gly Gly Lys Arg
130 135 140
Lys Gly Asp Ser Arg Ser Asn Ala Ser Ile Ser Lys Ser Thr Ser Gln
145 150 155 160
Ser Phe Leu Thr Ser Ser Val Ser Gly Arg Lys Ser Gly Arg Ser Ser
165 170 175
Ala Asn Ser Leu His Pro Gly Ser Ser Leu Arg Ser Ser Ser Asp Gln
180 185 190
Asn Gly Asn Asp Asp Arg Arg Arg Ser Ser Ser Leu Ser Pro Asn Met
195 200 205
Leu His His Ile Ala Gly Tyr Pro Thr Pro Lys Ile Ser Leu Gln Ile
210 215 220
Pro Ile Lys Leu Lys Ser Val Leu Val Asp Asp Trp Glu Tyr Val Thr
225 230 235 240
Lys Asp Lys Lys Ile Cys Arg Leu Pro Ala Asp Val Thr Val Glu Met
245 250 255
Val Leu Asn Lys Tyr Glu His Glu Val Ser Gln Glu Leu Glu Ser Pro
260 265 270
Gly Ser Gln Ser Gln Leu Ser Glu Tyr Cys Ala Gly Leu Lys Leu Tyr
275 280 285
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Val Pro Ile Arg Ile Tyr Gly Ala Ile His Leu Leu Arg Leu Ile Ser
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Val Leu Pro Glu Leu Ile Ser Ser Thr Thr Met Asp Leu Gln Ser Cys
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Gln Leu Leu Ile Lys Gln Thr Glu Asp Phe Leu Val Trp Leu Leu Met
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His Val Asp Glu Tyr Phe Asn Asp Lys Asp Pro Asn Arg Ser Asp Asp
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<213> Saccharomyces cerevisiae
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tacgaacatg aagtgagtca agaattggaa tcgccagggt cccagtcaca gttgagcgaa 840
tactgtgccg gtctcaagtt gtattttgac aagtgcctgg gtaatatgct tttatatagg 900
ttggaacggc tgcaatatga cgaacttctg aaaaaatcat cgaaggatca aaagccacta 960
gtaccaatta gaatttatgg ggctatccat ctgttaaggt tgataagtgt tttaccagag 1020
ctgatctcgt ctactacaat ggatctacaa agctgtcagc ttttaatcaa acaaaccgaa 1080
gacttcttgg tttggttgtt gatgcatgtg gacgaatact tcaatgacaa ggatccaaat 1140
agaagtgacg atgctctgta tgtaaatacg tctagccaat acgaaggagt ggctttaggt 1200
atgtga 1206

Claims (9)

1.一株尿素积累量降低的酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母过量表达了染色质调控因子Eaf3p；所述染色质调控因子Eaf3p的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因整合至所述酿酒酵母基因组上。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因连接到高拷贝表达载体上得到重组质粒，再将重组质粒转化到酿酒酵母细胞中。
4.根据权利要求3所述的酿酒酵母，其特征在于，所述表达载体是pRS424。
5.染色质调控因子Eaf3p在降低酿酒酵母对尿素积累能力和/或增加酿酒酵母非偏好氮源利用能力中的应用，其特征在于，所述染色质调控因子Eaf3p的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是在酿酒酵母中过量表达染色质调控因子Eaf3p。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，是将编码染色质调控因子Eaf3p的基因整合至所述酿酒酵母基因组上，或将所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因连接到高拷贝表达载体上得到重组质粒，再将重组质粒转化到酿酒酵母细胞中。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述氮源包括：天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、酪氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、甘氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或铵盐中的一种或多种。
9.权利要求1~4任一所述的酿酒酵母在生产低尿素含量的发酵食品中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2008035727A (ja) * 2006-08-02 2008-02-21 Toyota Motor Corp 出芽酵母の乳酸耐性又は生産性を向上させる多重遺伝子破壊の組み合わせ
CN105296525A (zh) * 2015-11-20 2016-02-03 江南大学 一种提高酿酒酵母非偏好型氮源利用的方法

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