CN105296525A - 一种提高酿酒酵母非偏好型氮源利用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高酿酒酵母非偏好型氮源利用的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。本发明方法通过对酵母的氮代谢物阻遏效应相关调控因子Gln3p和Gat1p进行改造，消除调控因子Gln3p和Gat1p的核定位调控序列并突变核定位序列上的磷酸化位点。本发明的酵母，在谷氨酰胺存在的情况下，对尿素、尿囊素和脯氨酸的利用能力大幅提高，不仅可以降低发酵过程中的尿素积累量，还可以提高对培养基中尿囊素和脯氨酸的利用。对这几种氮源利用率的提高会有利于菌体的生长，充分利用原料中的营养成分，节约成本。

Description

一种提高酿酒酵母非偏好型氮源利用的方法

技术领域

本发明涉及一种提高酿酒酵母非偏好型氮源利用的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯被认为是一种对人有潜在致癌性的物质，并在1974年被国际癌症研究机构(IARC)划为2B级的致癌化合物。此后，研究人员又发现氨基甲酸乙酯也可以直接诱发人的肝癌，进一步促使IARC在2007年将氨基甲酸乙酯的致癌等级由2B级提升到了2A级(与甲醛同级)。而黄酒中的氨基甲酸乙酯，已经成为危害消费者健康和影响其市场竞争力的重要隐患。

在清酒和黄酒中，由酿酒酵母代谢产生的尿素都是氨基甲酸乙酯最主要的前体物质。在发酵过程中，酵母细胞内的尿素主要由精氨酸代谢产生。当发酵培养基中无酵母偏好型氮源(谷氨酰胺、天冬酰胺等)存在时，尿素可以进一步被尿素水解酶降解为二氧化碳和氨。但当酵母偏好型氮源存在时，尿素水解酶的表达会受到强烈的抑制。这种现象由酿酒酵母的氮源阻遏效应(Nitrogencataboliterepression，简称NCR)调控，可以保证酵母细胞能在复杂的生存环境中优先利用最利于其生存的氮源。NCR效应的调控会导致酵母细胞内高浓度尿素的积累。由于尿素对酿酒酵母细胞有毒害作用，因此细胞通过尿素透性酶以主动运输的方式将尿素转运至胞外。在胞外的发酵液中，尿素可以在发酵的过程中自发的和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯。

NCR效应相关的全局性调控因子主要有：四个GATA家族调控因子(Gln3p、Gat1p、Gzf3p和Dal80p)和Ure2p。其中Gln3p和Gat1p是正调控因子，Gzf3p和Dal80p是负调控因子，而Ure2p则是一个可以与Gln3p和Gat1p相结合的阻遏蛋白。在酿酒酵母中，Gln3p和Gat1p能否发挥其功能与它们在胞内的定位密切相关，只有当这两个激活因子被转运至细胞核内时，它们才能激活尿素代谢相关基因的表达。对这两个调控因子胞内定位的调控与它们蛋白序列上的核定位序列和核定位调控序列密切相关。Gln3p和Gat1p的核定位序列和核定位调控序列是酿酒酵母NCR效应重要的调控开关。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种通过改造酿酒酵母氮代谢物阻遏效应调控因子，提高酿酒酵母对非偏好型氮源利用的方法。

所述方法是对酵母的氮代谢物阻遏效应相关调控因子Gln3p和Gat1p进行改造。

所述改造是消除调控因子Gln3p和Gat1p的核定位调控序列并突变核定位序列上的磷酸化位点。

所述改造包括将氨基酸序列为SEQIDNO.1的Gln3p的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第347位和第355位的丝氨酸突变为丙氨酸。

所述改造包括将氨基酸序列为SEQIDNO.2的Gat1p的位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝氨酸突变为丙氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是：将改造后的Gln3p和Gat1p的基因片段先后连接到表达载体上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主酵母中进行表达。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pY26-GPD-TEF。

在本发明的一种实施方式中，所述pY26-GPD-TEF的核苷酸序列如SEQIDNO.25所示。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母是酿酒酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：

(1)对Gln3p和Gat1p的核定位调控序列进行消除：将相应截短后的基因连接到表达载体pYX212，得到重组质粒pYX212-Gln3p_1-653和pYX212-Gat1p_1-375；

(2)对Gln3p和Gat1p的核定位序列上的磷酸化位点进行突变，指的是分别将质粒pYX212-Gln3p_1-653和pYX212-Gat1p_1-375上的GLN3和GAT1基因相应磷酸化位点基因突变，得到重组质粒pYX212-Gln3p_1-653,,S344A,s_347A,S355A和pYX212-Gat1p_1-375,S360A,s_361A；

(3)将Gln3p_1-653,S344A,s_347A,S355A和Gat1p_1-375,S360A,s_361A分别先后亚克隆至载体pY26-GPD-TEF上，获得重组质粒pY26-Gln3p_1-653,,S344A,s_347A,S355A-Gat1p_1-375,S360A,s_361A，并转化酿酒酵母N85单倍体菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述非偏好型氮源包括尿素、尿囊素和脯氨酸、精氨酸和γ-氨基丁酸。

在本发明的一种实施方式中，所述非偏好型氮源是尿素、尿囊素和脯氨酸。

所述的非偏好型氮源利用，指的是基因工程菌株相对于野生菌株，在添加相应的非偏好型氮源的偏好型氮源阻遏培养基中培养，其对非偏好型氮源的利用情况。

本发明的有益之处：本发明对酿酒酵母氮代谢物阻遏效应相关调控因子进行了遗传改造，不仅降低了发酵过程中的尿素积累量，还可以提高对培养基中尿囊素和脯氨酸的利用。对这几种氮源利用率的提高有利于菌体的生长，充分利用原料中的营养成分，节约成本。

附图说明

图1：代谢改造策略对N85单倍体菌株非偏好型氮源代谢的影响(基因工程菌株(●)；对照(■))。

具体实施方式

非偏好型氮源的检测方法参考文献：

(1)KnorstMT,NeubertR,WohlrabW.Analyticalmethodsformeasuringureainpharmaceuticalformulations.JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis15,1627-1632(1997).

(2)KandaJ.Determinationofammoniuminseawaterbasedontheindophenolreactionwitho-phenylphenyl(OPP).WaterResearch29,2746-2750(1995).

(3)CigicIK,VodosekTV,KosmerlT,StrlicM.AminoacidquantificationinthepresenceofsugarsusingHPLCandpre-columnderivatizationwith3-MPA/OPAandFMOC-Cl.ActaChimicaSlovenica55,660-664(2008).

材料与方法

本发明所用菌株为酿酒酵母N85单倍体(Δura3)菌株，该菌株是可商业化购买自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司的生产菌株N85，其他操作均为常规分子生物学操作。

大肠杆菌的培养使用LB培养基，酿酒酵母的活化使用YPD培养基，酿酒酵母尿素利用情况使用使用偏好型氮源阻遏培养基。这些培养基的配方如下。

LB培养基：10g·L^-1蛋白胨，5g·L^-1酵母浸膏，10g·L^-1NaCl，pH7.4。筛选E.coliJM109转化子时，培养基中添加氨苄青霉素100μg·mL^-1；

YPD培养基：20g·L^-1蛋白胨，10g·L^-1酵母浸膏，20g·L^-1葡萄糖；

偏好型氮源阻遏培养基：1.7g·L^-1YNB合成培养基(无氨基酸和硫酸铵)，20g·L^-1葡萄糖，10mmol·L^-1谷氨酰胺，10mmol·L^-1(尿素或其他单一的非偏好型氮源)。培养不同的营养缺陷型基因工程菌株时，需补加菌株生长所必需的氨基酸或尿嘧啶(40mg·L^-1)。

实施例1

Gln3p和Gat1p核定位调控序列缺失截短表达载体的构建：以破壁提取的酿酒酵母CEN.PK2-1C单倍体模式菌株基因组为模板设计引物(正向引物添加SalI限制性内切酶酶切位点；反向引物添加SacI限制性内切酶酶切位点)(见表1)，PCR扩增得到截短的GLN3和GAT1。将扩增得到的基因片段和pYX212质粒分别用SalI和SacI限制性内切酶酶切后，用DNA连接酶连接，得到pYX212-Gln3p_1-653和pYX212-Gat1p_1-375。将所得质粒转化至E.coliJM109菌株中，送至上海生工生物工程有限公司测序。经验证基因序列完全正确的质粒，用于下一步的实验操作。Gln3p和Gat1p完整表达载体的构建(实验对照)：设计引物扩增得到完整的GLN3和GAT1(见表1)。以同样的方法构建得到pYX212-Gln3p和pYX212-Gat1p。

表1扩增GLN3和GAT1部分基因的引物

使用MutanBESTkit定点突变试剂盒将Gln3p核定位序列上第344位、第347位和第355位的丝氨酸位点突变为丙氨酸(A)，将Gat1p核定位序列上第360位和第361位的丝氨酸位点突变为丙氨酸(A)。从而分别获得重组质粒pYX212-Gln3p_,S344A,s_347A,S355A和pYX212-Gat1p_,S360A,s_361A。所用引用见表2。

表2Gln3p核定位序列上磷酸化位点定点突变引物表

以上述质粒pYX212-Gln3p_1-653,S344A,s_347A,S355A和pYX212-Gat1p_1-375,S360A,s_361A为模板设计引物(正向引物添加BamHI或NotI限制性内切酶酶切位点；反向引物添加HindIII或BglII限制性内切酶酶切位点)(见表3)，PCR分别扩增得到改造后的GLN3和GAT1基因。将扩增得到的基因片段和pY26-GPD-TEF质粒分别用NotI和SacII或BamHI和HindIII限制性内切酶酶切后，用DNA连接酶连接，得到pY26-Gln3p_1-653,,S344A,s_347A,S355A-Gat1p_1-375,S360A,s_361A质粒。将所得质粒分别转化至E.coliJM109菌株中，经验证基因序列完全正确的质粒，再转化至酿酒酵母N85单倍体菌株中，构建得到基因工程菌。

表3扩增改造后GLN3和GAT1基因的引物

实施例2：应用

将基因工程菌N85单倍体菌株(pY26-Gln3p_1-653,,S344A,s_347A,S355A-Gat1p_1-375,S360A,s_361A)和对照菌株，经30℃摇床(200r/min)培养24h活化后，接种至添加相应非偏好型氮源的偏好型氮源阻遏培养基中，在30℃摇床(200r/min)的条件下培养48h，其间每隔8h检测培养基中尿素的利用情况。非偏好型氮源的检测方法参考文献。

对基因工程菌N85单倍体菌株(pY26-Gln3p_1-653,,S344A,s_347A,S355A-Gat1p_1-375,S360A,s_361A)和对照菌株在真实的发酵条件下，非偏好型氮源利用情况进行检测。在添加了非偏好型氮源的偏好型氮源阻遏培养基中，检测48h发酵过程中非偏好型氮源含量的变化情况，如图1所示。

实验结果表明，Gln3p和Gat1p共表达的改造策略可对N85菌株非偏好型氮源的利用产生影响。对针对不同的非偏好型氮源，其影响效果却有很大差异。在谷氨酰胺存在的情况下，改造后的基因工程菌株对尿素、尿囊素和脯氨酸的利用能力大幅提高(如图1所示)；而对精氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的利用率没有发生较大的改变。这种差异可能与这几种氮源代谢的调控方式不同有关。总体来说，利用本发明中效果最好的代谢改造策略所构建的N85基因工程菌株，不仅可以降低发酵过程中的尿素积累量，还可以提高对培养基中尿囊素和脯氨酸的利用。对这几种氮源利用率的提高会有利于菌体的生长，充分利用原料中的营养成分，节约成本。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种提高酵母非偏好型氮源利用的方法，其特征在于，所述方法是对酵母的氮代谢物阻遏效应相关调控因子Gln3p和Gat1p进行改造。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造是消除调控因子Gln3p和Gat1p的核定位调控序列并突变核定位序列上的磷酸化位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述改造包括将氨基酸序列为SEQIDNO.1的Gln3p的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第347位和第355位的丝氨酸突变为丙氨酸。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述改造包括将氨基酸序列为SEQIDNO.2的Gat1p的位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝氨酸突变为丙氨酸。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：将改造后的Gln3p和Gat1p的基因片段先后连接到表达载体上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主酵母中进行表达。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达载体是pY26-GPD-TEF。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母是酿酒酵母。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非偏好型氮源包括尿素、尿囊素和脯氨酸、精氨酸和γ-氨基丁酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述非偏好型氮源是尿素、尿囊素和脯氨酸。