CN105273918A - 一种可降低黄酒发酵中氨基甲酸乙酯积累的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可降低黄酒发酵中氨基甲酸乙酯积累的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。本发明方法是使用氮代谢物阻遏效应调控因子改造了的基因工程菌进行黄酒，其中酵母工程菌消除了调控因子Gln3p和Gat1p的核定位调控序列并突变了核定位序列上的磷酸化位点。与野生菌株发酵相比，在模拟的黄酒发酵体系中，基因工程菌发酵的黄酒中的尿素和氨基甲酸乙酯的含量分别下降了63％和72％，其中氨基甲酸乙酯含量已经降至55.53μg/L左右，同时主要的营养物质和特征性风味物质的含量差异很小，说明本发明的方法具有应用于黄酒生产的巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种可降低黄酒发酵中氨基甲酸乙酯积累的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯被认为是一种对人有潜在致癌性的物质，并在1974年被国际癌症研究机构(IARC)划为2B级的致癌化合物。此后，研究人员又发现氨基甲酸乙酯也可以直接诱发人的肝癌，进一步促使IARC在2007年将氨基甲酸乙酯的致癌等级由2B级提升到了2A级(与甲醛同级)。而黄酒中的氨基甲酸乙酯，已经成为危害消费者健康和影响其市场竞争力的重要隐患。
在清酒和黄酒中，由酿酒酵母代谢产生的尿素都是氨基甲酸乙酯最主要的前体物质。在发酵过程中，酵母细胞内的尿素主要由精氨酸代谢产生。当发酵培养基中无酵母偏好型氮源(谷氨酰胺、天冬酰胺等)存在时，尿素可以进一步被尿素水解酶降解为二氧化碳和氨。但当酵母偏好型氮源存在时，尿素水解酶的表达会受到强烈的抑制。这种现象由酿酒酵母的氮源阻遏效应(Nitrogencataboliterepression，简称NCR)调控，可以保证酵母细胞能在复杂的生存环境中优先利用最利于其生存的氮源。NCR效应的调控会导致酵母细胞内高浓度尿素的积累。由于尿素对酿酒酵母细胞有毒害作用，因此细胞通过尿素透性酶以主动运输的方式将尿素转运至胞外。在胞外的发酵液中，尿素可以在发酵的过程中自发的和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯。
NCR效应相关的全局性调控因子主要有：四个GATA家族调控因子(Gln3p、Gat1p、Gzf3p和Dal80p)和Ure2p。其中Gln3p和Gat1p是正调控因子，Gzf3p和Dal80p是负调控因子，而Ure2p则是一个可以与Gln3p和Gat1p相结合的阻遏蛋白。在酿酒酵母中，Gln3p和Gat1p能否发挥其功能与它们在胞内的定位密切相关，只有当这两个激活因子被转运至细胞核内时，它们才能激活尿素代谢相关基因的表达。对这两个调控因子胞内定位的调控与它们蛋白序列上的核定位序列和核定位调控序列密切相关。Gln3p和Gat1p的核定位序列和核定位调控序列是酿酒酵母NCR效应重要的调控开关。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种通过改造酿酒酵母氮代谢物阻遏效应调控因子，减少黄酒发酵中氨基甲酸乙酯或尿素积累的方法。
本发明的第一个目的是提供一种可减少黄酒发酵中氨基甲酸乙酯或尿素积累的方法，所述方法是使用酵母基因工程菌进行发酵；所述酵母基因工程菌的氮代谢物阻遏效应相关调控因子Gln3p和Gat1p是进行了改造的。
所述改造是消除了调控因子Gln3p和Gat1p的核定位调控序列并突变了核定位序列上的磷酸化位点。
在本发明的一种实施方式中，所述改造包括将氨基酸序列为SEQIDNO.1的Gln3p的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第347位和第355位的丝氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述改造还包括将氨基酸序列为SEQIDNO.2的Gat1p的位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将改造后的Gln3p和Gat1p基因片段先后连接到表达载体上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主酵母中进行表达。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pY26-GPD-TEF。
在本发明的一种实施方式中，所述pY26-GPD-TEF的核苷酸序列如SEQIDNO.25所示。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主酵母是酿酒酵母。
本发明的第二个目的是提供了一种酵母基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将改造了的Gln3p和Gat1p基因片段连接到同一表达载体后在转化到宿主酵母中得到的；所述改造包括将氨基酸序列为SEQIDNO.1的Gln3p的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第347位和第355位的丝氨酸突变为丙氨酸，还包括将氨基酸序列为SEQIDNO.2的Gat1p的位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pY26-GPD-TEF。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主是酿酒酵母N85单倍体菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建方法具体是：(1)对Gln3p和Gat1p的核定位调控序列进行消除：将相应截短后的基因连接到表达载体pYX212，得到重组质粒pYX212-Gln3p1-653和pYX212-Gat1p1-375；(2)对Gln3p和Gat1p的核定位序列上的磷酸化位点进行突变：分别将质粒pYX212-Gln3p1-653和pYX212-Gat1p1-375上的GLN3和GAT1基因相应磷酸化位点基因突变，得到重组质粒pYX212-Gln3p1-653,,S344A,s347A,S355A和pYX212-Gat1p1-375,S360A,s361A；(3)将Gln3p1-653,S344A,s347A,S355A和Gat1p1-375,S360A,s361A分别先后亚克隆至载体pY26-GPD-TEF上，获得重组质粒pY26-Gln3p1-653,,S344A,s347A,S355A-Gat1p1-375,S360A,s361A，并转化酿酒酵母N85单倍体菌株。
本发明所述的减少氨基甲酸乙酯的积累，指的是基因工程菌株相对于野生菌株，在黄酒发酵过程中积累氨基甲酸乙酯的情况。
本发明的有益之处：本发明对酿酒酵母氮代谢物阻遏效应相关调控因子进行了遗传改造，使黄酒发酵中氨基甲酸乙酯的含量下降了72％，下降至55.53μg/L左右，远低于了发达国家的限量标准。该方法的效果已经超过了绝大多数减少氨基甲酸乙酯方法的效果，完全可以满足黄酒生产的要求。除此之外，该代谢工程改造方法并未对菌株的发酵特性造成影响，所构建的基因工程菌株有应用于黄酒生产的巨大潜力。
具体实施方式
氨基酸乙酯的检测方法参考文献：LecaJM,PereiraV,PereiraAC,MarquesJC.Rapidandsensitivemethodologyfordeterminationofethylcarbamateinfortifiedwinesusingmicroextractionbypackedsorbentandgaschromatographywithmassspectrometricdetection.AnalyticaChimicaActa811,29-35(2014))；
尿素和氨基酸的检测方法参考文献：
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发酵液中风味物质的检测方法参考文献：
CaoY,XieGF,WuC,LuJA.AstudyoncharacteristicflavorcompoundsintraditionalChinesericewine-GuyueLongshanRiceWine.JIBrewing116,182-189(2010)。
材料与方法
本发明所用菌株为酿酒酵母N85单倍体(Δura3)菌株，该菌株是可商业化购买自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司的生产菌株N85，其他操作均为常规分子生物学操作。
大肠杆菌的培养使用LB培养基，酿酒酵母的活化使用YPD培养基。
LB培养基：10g·L-1蛋白胨，5g·L-1酵母浸膏，10g·L-1NaCl，pH7.4。筛选E.coliJM109转化子时，培养基中添加氨苄青霉素100μg·mL-1；
YPD培养基：20g·L-1蛋白胨，10g·L-1酵母浸膏，20g·L-1葡萄糖；
实施例1
Gln3p和Gat1p核定位调控序列缺失截短表达载体的构建：以破壁提取的酿酒酵母CEN.PK2-1C单倍体模式菌株基因组为模板设计引物(正向引物添加SalI限制性内切酶酶切位点；反向引物添加SacI限制性内切酶酶切位点)(见表1)，PCR扩增得到截短的GLN3和GAT1。将扩增得到的基因片段和pYX212质粒分别用SalI和SacI限制性内切酶酶切后，用DNA连接酶连接，得到pYX212-Gln3p1-653和pYX212-Gat1p1-375。将所得质粒转化至E.coliJM109菌株中，送至上海生工生物工程有限公司测序。经验证基因序列完全正确的质粒，用于下一步的实验操作。Gln3p和Gat1p完整表达载体的构建(实验对照)：设计引物扩增得到完整的GLN3和GAT1(见表1)。以同样的方法构建得到pYX212-Gln3p和pYX212-Gat1p。
表1扩增GLN3和GAT1部分基因的引物
使用MutanBESTkit定点突变试剂盒将Gln3p核定位序列上第344位、第347位和第355位的丝氨酸位点突变为丙氨酸(A)，将Gat1p核定位序列上第360位和第361位的丝氨酸位点突变为丙氨酸(A)。从而分别获得重组质粒pYX212-Gln3p,S344A,s347A,S355A和pYX212-Gat1p,S360A,s361A。所用引用见表2。
表2Gln3p核定位序列上磷酸化位点定点突变引物表
以上述质粒pYX212-Gln3p1-653,S344A,s347A,S355A和pYX212-Gat1p1-375,S360A,s361A为模板设计引物(正向引物添加BamHI或NotI限制性内切酶酶切位点；反向引物添加HindIII或BglII限制性内切酶酶切位点)(见表3)，PCR分别扩增得到改造后的GLN3和GAT1基因。将扩增得到的基因片段和pY26-GPD-TEF质粒分别用NotI和SacII或BamHI和HindIII限制性内切酶酶切后，用DNA连接酶连接，得到pY26-Gln3p1-653,,S344A,s347A,S355A-Gat1p1-375,S360A,s361A质粒。将所得质粒分别转化至E.coliJM109菌株中，经验证基因序列完全正确的质粒，再转化至酿酒酵母N85单倍体菌株中，构建得到基因工程菌。
表3扩增改造后GLN3和GAT1基因的引物
实施例2：应用
参照浙江古越龙山公司的黄酒生产工艺，在实验室中模拟黄酒的发酵过程。具体步骤如下：取100g大米，在室温中浸渍2-3d；经常压蒸煮后，添加17.4g麦曲(生麦曲13.5g，熟麦曲3.4g)、170g水，并将经活化后的酿酒酵母菌株按10％(v/v)的接种量接种至培养基中；摇瓶加发酵栓于30℃静置发酵；每日称重，当CO2失重小于2g时结束前酵；将摇瓶置于15℃继续静置发酵，15d后结束后酵，取发酵液检测氨基甲酸乙酯、尿素、氨基酸和风味物质含量。
经过25d的黄酒模拟发酵，对发酵所得黄酒中的主要成分以及尿素和EC的含量进行了检测，实验结果如表4所示：
表4N85基因工程菌株与野生菌株化合物黄酒模拟发酵体系成分分析
结果表明，基因工程菌株与野生菌株相比，在模拟的黄酒发酵体系中，尿素和氨基甲酸乙酯的含量分别下降了63％和72％。氨基甲酸乙酯含量已经降至55.53μg/L左右，远远低于了发达国家对酒精饮品中氨基甲酸乙酯的限量标准。Gln3p和Gat1p的代谢改造效果已经超过了绝大多数目前常见的去除氨基甲酸乙酯方法的效果，完全可以满足黄酒生产的要求。除此之外，对黄酒模拟体系主要成分的检测可以发现，基因工程菌株与野生菌株相比，在最主要的营养物质(氨基酸)和古越龙山黄酒特征性风味物质的含量上并没有显著地差异(差异均小于5％)。说明代谢工程的改造并未对菌株的发酵特性造成影响，该方法所构建的基因工程菌株有应用于黄酒生产的巨大潜力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种减少黄酒发酵中氨基甲酸乙酯或尿素积累的方法，其特征在于，所述方法是使用酵母基因工程菌进行发酵；所述酵母基因工程菌的氮代谢物阻遏效应相关调控因子Gln3p和Gat1p是进行了改造的；所述改造是消除了调控因子Gln3p和Gat1p的核定位调控序列并突变了核定位序列上的磷酸化位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造是将氨基酸序列为SEQIDNO.1的Gln3p的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第347位和第355位的丝氨酸突变为丙氨酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造是将氨基酸序列为SEQIDNO.2的Gat1p的位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝氨酸突变为丙氨酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌是将改造后的Gln3p和Gat1p的基因片段先后连接到表达载体上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主酵母中进行表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达载体是pY26-GPD-TEF。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述宿主酵母是酿酒酵母。
7.一种酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将改造了的Gln3p和Gat1p基因片段连接到同一表达载体后在转化到宿主酵母中得到的；所述改造包括将氨基酸序列为SEQIDNO.1的Gln3p的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第347位和第355位的丝氨酸突变为丙氨酸，还包括将氨基酸序列为SEQIDNO.2的Gat1p的位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝氨酸突变为丙氨酸。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述表达载体是pY26-GPD-TEF。
9.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主是酿酒酵母N85单倍体菌株。
10.权利要求7-9任一所述基因工程菌在降低氨基甲酸乙酯或尿素方面的应用。
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