CN104164437A

CN104164437A - 一种获得山羊Dlk1基因新转录剪切体的方法

Info

Publication number: CN104164437A
Application number: CN201310186871.2A
Authority: CN
Inventors: 仲涛; 张红平; 李利; 靳鹏飞; 王林杰
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2014-11-26

Abstract

本发明属于家畜基因工程技术领域，公开了一种获得山羊Dlk1基因新的转录剪切体的方法。首先从南江黄羊肌肉组织中分离出核糖核酸；设计特定的引物组，利用巢式PCR扩展出cDNA片段。经过克隆和测序分析证实了在山羊Dlk1基因转录过程中存在3种剪切形式，包含外显子的部分及全部缺失。这一发现为研究山羊Dlk1基因的表达及功能究奠定了重要基础。

Description

一种获得山羊Dlk1基因新转录剪切体的方法

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种获得山羊Dlk1基因新转录剪切体的方法。

背景技术

Dlk1基因（Delta-like homolog 1）位于Dlk1-Dio3印记域内，参与哺乳动物的脂肪积累及葡萄糖代谢过程。Dlk1基因也被称为脂肪前体因子1（Pref-1），其蛋白为跨膜糖蛋白，包含六个串联重复表皮生长因子样的胞外基序，结构类似Notch信号家族分子，但与Notch家族配体不同的是Dlk1的N端缺乏DSL（Delta：Serrate：Lin12）结构域，因而不能激活Notch信号的受体分子。体外内研究均表明Dlk1基因参与多个组织的分化，抑制脂肪的生成，可能作为Notch信号分子的拮抗物来参与Notch信号通路的调控。人体内缺乏Dlk1表达会导致肥胖；敲除Dlk1的转基因小鼠表现为中度肥胖，同时其体内脂肪含量增加30%，表明Dlk1基因可以抑制脂肪细胞的分化。

目前，研究发现在人、小鼠、牛和猪Dlk1基因中存在多种转录剪切体（A，B，C，C₂，D，D₂和E型），其中A型和B型剪切体编码具有抑制脂肪细胞分化功能的长链可溶蛋白；其它剪接体编码不具抑制功能的短链蛋白。另外，研究还发现Dlk1-C₂过量表达的转基因小鼠也会出现肌肉肥大。在猪多个组织中均有Dlk1-A，Dlk1-B和Dlk1-C₂表达，其中Dlk1-C₂表达量最高，推测在猪肌肉生长和脂肪沉积等方面发挥着重要的作用。目前在山羊上还未见有关Dlk1基因不同转录剪切体的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供山羊Dlk1基因的新转录剪切体、其扩增引物及扩增方法。

本发明所述的山羊Dlk1基因，有三种转录剪切体Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3，其核苷酸序列分别如SED ID NO.1，SED ID NO.2和SED ID NO.3所示。

本发明提供了用于扩增山羊Dlk1基因的两组扩增引物：

正向外引物Dlk1-1F的核苷酸序列如SED ID NO.4所示；

反向外引物Dlk1-1R的核苷酸序列如SED ID NO.5所示；

正向内引物Dlk1-2F的核苷酸序列如SED ID NO.6所示；

反向内引物Dlk1-2R的核苷酸序列如SED ID NO.7所示。

本发明还提供了一种扩增山羊Dlk1基因，包括三种转录剪切体Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3的方法，步骤如下：

步骤1：提取山羊肌肉组织的总RNA；

步骤2：从近缘物种人，小鼠，牛和猪Dlk1基因序列中分析保守序列，以此作为参考来设计所述引物组；

步骤3：以步骤1所得总RNA为模板，以所述的两组引物为引物，通过巢式PCR扩增获得山羊Dlk1基因的片段。

对所得序列用NCBI网站进行blastn在线分析，与Dlk1序列一致性最高的序列都是Dlk1在哺乳动物中的同源序列，可以确定所得序列为山羊Dlk1基因。

利用Clustalx V2.0软件对山羊Dlk1基因（包括三种转录剪切体Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3）的核苷酸序列进行比对分析并使用MEGA5.2软件构建NJ树。

本发明以山羊肌肉组织为材料，利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、巢式聚合酶链式反应（nested-PCR），对山羊Dlk1基因进行了研究，首次从山羊肌肉组织中克隆得到了Dlk1基因三种转录剪切体（Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3），并对其同源性和进化地位进行了分析，对研究山羊Dlk1基因不同转录剪切体在脂类代谢过程发挥的生物学功能具有重要意义。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的山羊Dlk1基因的转录剪切体1序列片段。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的山羊Dlk1基因的转录剪切体2序列片段。

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的山羊Dlk1基因的转录剪切体3序列片段。

图1：山羊Dlk1基因不同转录剪切体PCR产物电泳检测图。

图2：山羊Dlk1基因不同转录剪切的示意图，箭头表示所述引物位置。

图3：近缘哺乳动物Dlk1基因编码区序列的NJ系统进化树。

具体实施方案

以下结合附图，通过实施例对本发明进一步详细说明。

本发明中山羊采自四川省南江黄羊育种场，RNA提取纯化等试剂购自Invitrogen公司，PCR试剂购自宝生物（大连）有限公司（Takara）。

总RNA提取：取100mg山羊肌肉组织在研钵中加液氮研磨，用Trizol法提取总RNA，Trizol试剂购自Invitrogen公司，提取方法根据使用说明书。

山羊Dlk1基因序列的克隆，包括三个转录剪切体Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3：

通过比对已公开的近缘哺乳动物（人、小鼠、牛和猪）的Dlk1基因序列得到保守区，在保守区序列设计两组引物扩增山羊Dlk1基因。

山羊Dlk1基因的克隆：

使用正向外引物Dlk1-1F与反向外引物Dlk1-1R进行第一轮PCR扩增，对扩增产物用正向内引物Dlk1-2F与反向内引物Dlk1-2R进行第二轮PCR扩增，获得山羊Dlk1基因的目的片段；

Dlk1-1F：5' TCCGCAACCAGAAGCCCAG 3'

Dlk1-1R：5' GCGTAGCGTTCACCAGATTTG 3'

Dlk1-2F：5' CTTGCTCCTGCTGGCTTTC 3'

Dlk1-2R：5' GTGGTCATGTCGATCTTCTC 3'

第一轮PCR：

扩增反应体系如下：

第一轮PCR反应条件为：95°C，5min，94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s，35个循环；72°C 10min；4°C保存。

第二轮PCR：

扩增反应体系如下：

第二轮PCR反应条件为：95°C，5min，94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s，35个循环；72°C 10min；4°C保存。

将第二轮PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将三条条带清晰明亮、大小不一的片段进行切胶回收（图1）。胶回收纯化使用天根生化科技（北京）有限公司试剂盒（DP214-02），操作步骤按产品说明书进行。纯化后PCR产物与宝生物公司的pMD-19T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选单克隆扩增培养，经PCR扩增电泳检测后送上海生工公司测序。

将测序结果在NCBI上运用blastn在线比对软件以验证序列的正确性和该方法的可靠性。结果表明该方法获得的山羊Dlk1基因编码区的核苷酸序列（Dlk1-AS1）与人、小鼠、猪和牛该基因的同源性分别为71.0%（NM_003836.5）、57.3%（BC052159.1）、90.3%（BC120429.1）和97.1%（EU564006.1）。另外，扩增所得的三条片段均为山羊Dlk1基因序列，是三种不同转录剪切体Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3（SEQ ID NO：1-3），其中Dlk1-AS1未发现缺失序列；Dlk1-AS2缺失部分第三和第五外显子序列，完全缺失第四外显子序列；Dlk1-AS3缺失第二和第六外显子序列，完全缺失第三、第四和第五外显子序列（图2）。

对已公布的人、小鼠、牛和猪的Dlk1基因编码区序列进行ClustalW比对，然后导入MEGA5.2软件构建Neighbor-Joining（NJ）系统进化树。系统进化树反映出新发现的山羊Dlk1-AS1与已公布山羊Dlk1-C₂首先聚类到一起，然后分别与牛、猪、人和小鼠的Dlk1基因聚类。其中，猪的三种转录剪切体中在编码区差异不大，因次全部聚到一起；而新获得的羊Dlk1-AS2和Dlk1-AS3转录剪切体由于缺失序列较多，与其它序列的遗传距离较远，因此聚在最外支（图3）。

应当说明的是，对本专业内的普通研究人员来说，可以依据上述方法适当改进及修改，但所有的改进和修改都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种获得山羊Dlk1基因新转录剪切体的方法

<130> 2013

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 861

<212> DNA

<213> Capra hircus

<400> 1

cttgctcctg ctggctttcg gccgcagtgc ccatggagct gaatgcttcc cggcctgcca 60

ccctgaaaat ggattctgcg acgatgacag tgtgtgcagg tgccagcctg gctggcaggg 120

tcccctgtgt gaccagtgtg tgacctttcc cggctgtgtg aacggcgtct gcgtggaacc 180

ctggcagtgc atctgcaagg acggctggga cggacacctc tgtgacctag acatccgggc 240

ttgcacctcg accccctgtg ccaacaacgg cacctgcctg gacctcgatg acggccagta 300

cgagtgctcc tgtgtccccg ggttctcggg aaaggattgc caggaaatgg acgggccctg 360

cgtggtgaat ggctcgccct gccagcacgg aggcagctgc gtggacgatg agggccgggc 420

cccccacgcc gtctgcctgt gcccccctgg cttctcgggc aacttctgcg agatcatgac 480

caacagctgc atccccaacc cgtgcgagaa ccagggcatc tgcaccgaca tcgggggtga 540

cttccgctgc cgctgccccg ccggcttcat ggataagacc tgcagccgcc cggtgagcac 600

ctgcaccagc gagccgtgcc tcaacggcgg cacctgcctg cagcactccc aggccatctg 660

cttcaccatc ctgggcgtgc tcaccagcct ggtggtcctg ggcaccgtgg gcatcgtctt 720

cctcaacaag tgcgaggcct gggtgtccaa cctgcgctac aaccacgtgc tgcgcaagaa 780

gaagaatctg ctgctgcgct acaacagcgg ggaggagctg gccgtcaaca tcgtcttccc 840

cgagaagatc gacatgacca c 861

<210> 2

<211> 395

<212> DNA

<213> Capra hircus

<400> 2

cttgctcctg ctggctttcg gccgcagtgc ccatggagct gaatgcttcc cggcctgcca 60

ccctgaaaat ggattctgcg acgatgacag tgtgtgcagg tgccagcctg gacctgcagc 120

cgcccggtga gcacctgcac cagcgagccg tgcctcaacg gcggcacctg cctgcagcac 180

tcccaggcca tctgcttcac catcctgggc gtgctcacca gcctggtggt cctgggcacc 240

gtgggcatcg tcttcctcaa caagtgcgag gcctgggtgt ccaacctgcg ctacaaccac 300

gtgctgcgca agaagaagaa tctgctgctg cgctacaaca gcggggagga gctggccgtc 360

aacatcgtct tccccgagaa gatcgacatg accac 395

<210> 3

<211> 183

<212> DNA

<213> Capra hircus

<400> 3

cttgctcctg ctggctttcg gccgcagtgc ccatggagct gaatgcttcc cggcctgcca 60

ccctgaaaat ggattctgct acaaccacgt gctgcgcaag aagaagaatc tgctgctgcg 120

ctacaacagc ggggaggagc tggccgtcaa catcgtcttc cccgagaaga tcgacatgac 180

cac 183

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tccgcaacca gaagcccag 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgtagcgtt caccagattt g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttgctcctg ctggctttc 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtggtcatgt cgatcttctc 20

Claims

1.作为山羊Dlk1基因新的转录剪切体，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述。

2.根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于：其中SEQ ID NO：1片段未发现缺失序列；SEQ ID NO：2片段缺失从第三外显子第13个核苷酸到第五外显子第205个核苷酸序列，包括部分第三和第五外显子序列，完整第四外显子序列；SEQ ID NO：3片段缺失从第三外显子第43个核苷酸到第五外显子第103个核苷酸序列，包括部分第二和第六外显子序列，完整第三、第四和第五外显子序列。

3.检测权利要求1所述遗传标记的正、反向引物组的DNA序列如下所示：

Dlk1-1F：5' TCCGCAACCAGAAGCCCAG 3'

Dlk1-1R：5' GCGTAGCGTTCACCAGATTTG 3'

Dlk1-2F：5' CTTGCTCCTGCTGGCTTTC 3'

Dlk1-2R：5' GTGGTCATGTCGATCTTCTC 3'。

4.制备如权利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步骤：

利用NCBI数据库信息，比对人、小鼠、牛和猪Dlk1基因得到保守区，在保守区设计引物扩增山羊Dlk1基因，提取山羊肌肉组织RNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列。