CN104830870A - 一种塔里木马鹿茸c-fos基因及其应用 - Google Patents
一种塔里木马鹿茸c-fos基因及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104830870A CN104830870A CN201510261490.5A CN201510261490A CN104830870A CN 104830870 A CN104830870 A CN 104830870A CN 201510261490 A CN201510261490 A CN 201510261490A CN 104830870 A CN104830870 A CN 104830870A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- sed
- fos gene
- cdna
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种塔里木马鹿茸c-fos基因及其应用，所述c-fos基因的核苷酸序列如SED ID NO：1所示。本发明塔里木马鹿茸c-fos基因还包括在促茸生长中的应用。本发明之塔里木马鹿茸c-fos基因改变了鹿茸依赖自然或药物处理的再生茸生长缓慢现状，实现了鹿茸产品的稳产、高产、质优。实验证明，本发明的SNP基因分型CT可使马鹿茸重13.11±0.90kg。
Description
技术领域
本发明涉及一种马鹿茸基因及其应用，具体涉及一种塔里木马鹿茸c-fos基因及其应用。
背景技术
马鹿又名赤鹿，是体型较大的鹿种之一，据统计全世界有22个马鹿亚种，在我国有天山亚种、塔里木亚种、阿勒泰亚种、东北亚种、甘肃亚种、阿拉善亚种、四川亚种和西藏亚种8个马鹿亚种，主要分布在新疆、青海、甘肃、东北和内蒙古等地区。塔里木马鹿是中国马鹿种群的一个优秀亚种，对塔里木盆地的荒漠区具有独特的适应性，可耐酷热、耐干旱、耐风沙、耐高盐碱，因世代在塔里木盆地繁衍生息而得名。塔里木马鹿是名贵的特种经济动物，以高产茸量且质优而著称，并被国际市场誉为“亚洲之花”。公鹿鹿茸每天增重可达到100g～180g，生长75d～95d就可锯茸，重量一般可在10kg以上。塔里木马鹿每年都进行周期性替代，一般要经过脱盘、生茸、骨化、脱落，再生茸循环过程，每个生长周期可以采两次鹿茸，第一次在生长开始的第二个月末即每年的4月至6月末，短暂的恢复之后，锯后的茸角会再次萌发，可以再生长一个半月到8月中旬再锯第二次。塔里木马鹿养殖业是当地畜牧经济的支柱产业之一，在新疆南部地区为农民增产增收，生活致富起到了及其重要的作用，同时作为一个品质比较优秀的鹿茸，塔里木马鹿茸值得进行大力开发。
目前，人工养殖的鹿主要通过割后再生，提高产茸量，但是收割后的马鹿不用药物处理，虽然马鹿茸能够再生，但产量非常低，即使注射药物，也无法达到头茬茸的生产能力。因此，再生茸比头茬茸生长速度慢，骨化程度大，产量低。迫切需要研究提高再生茸产量的机制，为塔里木马鹿茸大力开发提供线索。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种人工合成得到促茸塔里木马鹿茸c-fos基因及其应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，
本发明之一种塔里木马鹿茸c-fos基因，其核苷酸序列如SED IDNO：1所示。
本发明之一种塔里木马鹿茸c-fos基因的克隆方法，包括以下步骤：
(1)马鹿茸总RNA提取、纯化；
(2)cDNA第一链的合成、纯化：采用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSP1如SED ID NO：2所示，对马鹿茸总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成、纯化；
(3)马鹿茸c-fos基因保守序列的克隆：用牛c-fos基因全长序列(NM001046074.2)设计引物如SED ID NO：3和SED ID NO：4所示，以马鹿茸第一链cDNA为模板进行RT-PCR扩增，PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，用琼脂凝胶回收试剂盒回收、纯化，然后将扩增产物测序，根据测序结果设计全长克隆引物；
(4)5’端序列RACE克隆：采用TdT酶和dCTP对纯化后的第一链cDNA进行末端加上多聚C；接着采用引物GSP2如SED ID NO：5所示和桥连铆钉引物AAP如SED ID NO：6所示对已经加dC尾的第一链cDNA进行PCR第一轮扩增；然后采用引物GSP3如SED ID NO：7所示和桥连通用扩增引物AUAP如SED ID NO：8所示，进行巢式PCR第二轮扩增，将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化；
(5)3’端序列RACE克隆：采用逆转录酶SMARTScribeTM ReverseTranscriptase和引物3’CDS primer A，对总RNA进行逆转录合成cDNA；接着采用引物3’端533-1如SED ID NO：9所示和UPM如SED ID NO：10所示，以逆转录合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增；然后将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，用引物3’端533-2如SED ID NO：11所示和UPM，进行巢式第二轮PCR扩增；PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，PCR产物克隆测序。
(6)马鹿茸c-fos基因cDNA全长克隆：利用DNASTAR将所得到的纯化的保守序列、5’端序列、3’端序列进行序列拼接，得到马鹿茸c-fos基因cDNA全长序列。
进一步，对cDNA第一链扩增，5’端序列RACE克隆的PCR第一轮、第二轮扩增，3’端序列RACE克隆的PCR第一轮、第二轮扩增中PCR反应条件均为94℃预变性1min，94℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸2min，35个循环，72℃终延伸7min。
本发明之一种塔里木马鹿茸c-fos基因在促茸生长中的应用，所述c-fos基因含有一个单核苷酸多态点。
进一步，所述单核苷酸多态点的基因型为CG。
本发明之塔里木马鹿茸c-fos基因改变了鹿茸依赖自然或药物处理的再生茸生长缓慢现状，实现了鹿茸产品的稳产、高产、质优。实验证明，本发明的SNP基因分型CT可使马鹿茸重13.11±0.90kg。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
表1-马鹿茸c-fos基因cDNA全长克隆引物
实施例1：塔里木马鹿茸c-fos基因全长克隆
1、马鹿茸总RNA提取、纯化：取3-4岁成年马鹿茸皮组织储存于液氮中。
(1)取0.5-1g组织在液氮中充分碾碎后，加3ml Trizol试剂剧烈震荡以对组织进行裂解；
(2)将上述组织Trizol裂解液转入EP管中，在室温下放置5分钟；
(3)在上述EP管中，按照每1ml Trizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下放置3分钟后，12000g(2-8℃)离心15分钟；
(4)去上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下放置10分钟后，12000g(2-8℃)离心10分钟；
(5)弃上清，按照每1ml Trizol加1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2-8℃)离心5分钟，弃上清；
(6)让沉淀的RNA在室温在自然干燥；
(7)用Rnase-free water溶解RNA沉淀，用琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测其浓度。
2、cDNA第一链的合成、纯化：
(1)采用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSP1对总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成、纯化，使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理。
a加入下列试剂到0.5-ml PCR管中
b将上述混合物在70℃放10min后，立即放冰上，1min。然后依次加入下列试剂离心混匀。
两步实验后最终量为24μl。
c离心混匀，放42℃孵育1min；
d在上述混合物种加入1μl of SUPERSCRIPT II RT，轻柔混匀后放42℃，50min；
e 70℃孵育15min结束反应；
f加入1μl of RNase mix在上述混合物中，离心混匀，然后放37℃环境下30min后，取出放冰上待用。
(2)使用DNA Purification System：GLASSMAX DNA isolation spincartridges对经RNAase处理过的cDNA进行纯化。
A.将连接液提前几小时于室温下放置进行温度平衡；
B.将ddH2O于65℃的水浴锅内进行温浴，按100μL/样品计算；
C.向cDNA第一链反应液中加入120μL的连接液(6M Nal)混匀，反应1～2min；
D.将cDNA/Nal溶液转移到S.N.A.P柱内，13 000r/min离心20s；
E.将得到的液体转移至一新管内，标记好，-20℃保存，吸附柱放回原处；
F.向柱子内加入预冷的400μL的1×Wash Buffer，13 000r/min离心20s，弃去废液并重次；
G.加入400μL预冷的70％的乙醇溶液，13 000r/min离心20s，弃去废液，重复3次；
H.空柱13 000r/min离心1min；
I.将吸附柱置于一个新的离心管内，静置2min左右，散去残留的乙醇，加入40μL预ddH2O，静置4min左右，13 000r/min离心1min，收集已纯化的cDNA，于-80℃保存备用。
(3)使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA进行末端加上多聚C
A依次加入下列试剂，轻轻混匀。
B.94℃反应3min，然后冰浴1min，瞬时离心后置于冰上；
C.加入1μL TdT，轻柔吹吸混匀；
D.37℃反应10min，然后65℃再反应10min，使TdT灭活，瞬时离心后置冰上待用。
3、马鹿茸c-fos基因保守序列的克隆：将c-fos核心序列克隆，根据牛Fos基因全长序列(NM001046074.2)设计引物，
F：5’GGAGGGGCAAGGTAGAACAG3’，
R：5’AAGGAGTCAGCCTCAGGGTA3’；然后将扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测后送宝生物公司测序。根据测序结果设计全长克隆引物，见表1。
4、5’端序列RACE克隆：以马鹿茸第一链cDNA为模板进行RT-PCR扩增。
(1)使用引物GSP-2和试剂盒里面带的桥连铆钉引物AAP对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增，将PCR管置于冰上依次加入下列试剂：
加入1ul Taq DNA polymerase(5units/μl)，混匀后立即放入PCR仪(带有热盖)中。反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，进行34个循环；最后72℃再延伸10min，4℃进行保存。
(2)使用引物GSP-3和试剂盒里面带的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增，将上述PCR产物用TE buffer稀释100倍。将PCR管置于冰上依次加入下列试剂：
加入1ul Taq DNA polymerase(5units/μl)，混匀后立即放入PCR仪(带有热盖)中。反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，进行34个循环；最后72℃再延伸10min，4℃进行保存。
(3)将第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用Takala凝胶试剂盒对目的条带回收纯化。
5、3’端序列RACE克隆：Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit试剂盒获得该基因的3’端序列。
3’533-1 CTTCATGTTCCCAGCATCGTCCAGG
3’533-2 TGGACCTGTCTGGTTCCTTCTATGC
(1)采用逆转录酶SMARTScribeTM Reverse Transcriptase和引物3’CDS primer A：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N-3’(N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C)，对总RNA进行逆转录合成cDNA。
(2)采用引物3’533-1和UPM，以上面合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。
(3)将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，然后用引物3’533-2和UPM进行第二轮PCR扩增。
(4)将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化。
6、马鹿茸c-fos基因cDNA全长克隆：利用DNASTAR将所得到的纯化的保守序列、5’端序列、3’端序列进行序列拼接，得到马鹿茸c-fos基因cDNA全长序列，通过原核表达实验获得完整的转录本
实施例2：SNP在促茸生长中的应用
1、SNP筛查：设计的一对引物，F3’CACCCCTATGGAGTTCCCACT5’，R3’GAGTCAGCCTCAGGGTAGGT5’扩增片段770bp，对6头塔里木马鹿cDNA进行PCR扩增后，凝胶回收、克隆、送上海生物公司测序；测序结果用DNAman软件分析，序列比对结果比对发现在塔里木马鹿第二外显子的748bp位置发现有一突变位点，该位点由胸腺嘧啶T换成胞嘧啶C。将6头塔里木马鹿的cDNA翻译成蛋白，DNAman蛋白比对发现该位点的变化并没有引起氨基酸的变化，该位点属于同义突变。
2、SNP检测：利用单链构象多态性法(PCR-SSCP)进行单核苷酸多态(SNP)检测，结果发现：(1)检测这个多态位点存在三种基因型为CC型、CT型和TT型，这三种基因型频率分辨为0.17、0.73、0.2，等位基因C、T的基因频率分别为，0.54、0.46。(2)分析这个SNP基因型频率与塔里木马鹿产茸量的关联性，结果发现这个多态位点对塔里木马鹿茸重产生的影响显著。其中，Sscp检测马鹿c-fos基因单核苷酸多态与产茸鹿关联分析，见表2、表3。
表2C-FOS基因.C＞T基因型与基因频率
表3塔里木马鹿c-fos基因不同基因型对马鹿茸重的影响
注：同行肩标不相同小写字母表示差异显著(p≤0.05)。
Claims (5)
1.一种塔里木马鹿茸c-fos基因，其特征在于，所述c-fos基因的核苷酸序列如SED ID NO：1所示。
2.一种如权利要求1所述的塔里木马鹿茸c-fos基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)马鹿茸总RNA提取、纯化；
(2)cDNA第一链的合成、纯化：采用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSP1如SED ID NO：2所示，对马鹿茸总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成、纯化；
(3)马鹿茸c-fos基因保守序列的克隆：用牛c-fos基因全长序列(NM001046074.2)设计引物如SED ID NO：3和SED ID NO：4所示，以马鹿茸第一链cDNA为模板进行RT-PCR扩增，PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，用琼脂凝胶回收试剂盒回收、纯化，然后将扩增产物测序，根据测序结果设计全长克隆引物；
(4)5’端序列RACE克隆：采用TdT酶和dCTP对纯化后的第一链cDNA进行末端加上多聚C；接着采用引物GSP2如SED ID NO：5所示和桥连铆钉引物AAP如SED ID NO：6所示对已经加dC尾的第一链cDNA进行PCR第一轮扩增；然后采用引物GSP3如SED ID NO：7所示和桥连通用扩增引物AUAP如SED ID NO：8所示，进行巢式PCR第二轮扩增，将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化；
(5)3’端序列RACE克隆：采用逆转录酶SMARTScribeTM ReverseTranscriptase和引物3’CDS primer A，对总RNA进行逆转录合成cDNA；接着采用引物3’端533-1如SED IDNO：9所示和UPM如SED ID NO：10所示，以逆转录合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增；然后将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，用引物3’端533-2如SED ID NO：11所示和UPM，进行巢式第二轮PCR扩增；PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，PCR产物克隆测序。
(6)马鹿茸c-fos基因cDNA全长克隆：利用DNASTAR将所得到的纯化的保守序列、5’端序列、3’端序列进行序列拼接，得到马鹿茸c-fos基因cDNA全长序列。
3.根据权利要求2所述的塔里木马鹿茸c-fos基因的克隆方法，其特征在于，对cDNA第一链扩增，5’端序列RACE克隆的PCR第一轮、第二轮扩增，3’端序列RACE克隆的PCR第一轮、第二轮扩增中PCR反应条件均为94℃预变性1min，94℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸2min，35个循环，72℃终延伸7min。
4.根据权利要求1所述的塔里木马鹿茸c-fos基因在促茸生长中的应用，其特征在于，所述c-fos基因含有一个单核苷酸多态点。
5.根据权利要求4所述的塔里木马鹿茸c-fos基因在促茸生长中的应用，其特征在于，所述单核苷酸多态点的基因型为CT。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510261490.5A CN104830870A (zh) | 2015-05-21 | 2015-05-21 | 一种塔里木马鹿茸c-fos基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510261490.5A CN104830870A (zh) | 2015-05-21 | 2015-05-21 | 一种塔里木马鹿茸c-fos基因及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104830870A true CN104830870A (zh) | 2015-08-12 |
Family
ID=53809070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510261490.5A Pending CN104830870A (zh) | 2015-05-21 | 2015-05-21 | 一种塔里木马鹿茸c-fos基因及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104830870A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107385090A (zh) * | 2017-09-07 | 2017-11-24 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种鉴定鹿茸品种的分子标记、鉴定方法及应用 |
| CN107760678A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-06 | 安徽省农业科学院水产研究所 | 3′‑race接头引物及3′端未知基因序列的扩增方法 |
-
2015
- 2015-05-21 CN CN201510261490.5A patent/CN104830870A/zh active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 李冰冰等: "RACE", 《生化与分子生物学实验指导》 * |
| 李继兴等: "塔里木马鹿c-fos基因克隆及序列分析", 《中国畜牧兽医文摘》 * |
| 武延风: "塔里木马鹿c-fos cDNA克隆、SNP及与茸重的关联分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
| 韩春梅等: "原癌基因c-fos在塔里木马鹿茸组织中表达特性的研究", 《畜牧兽医学报2》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107385090A (zh) * | 2017-09-07 | 2017-11-24 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种鉴定鹿茸品种的分子标记、鉴定方法及应用 |
| CN107385090B (zh) * | 2017-09-07 | 2020-10-02 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种鉴定鹿茸品种的分子标记、鉴定方法及应用 |
| CN107760678A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-06 | 安徽省农业科学院水产研究所 | 3′‑race接头引物及3′端未知基因序列的扩增方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | A novel SNP of the ATP1A1 gene is associated with heat tolerance traits in dairy cows | |
| Ermini et al. | Complete mitochondrial genome sequence of the Tyrolean Iceman | |
| Mariotti et al. | Accumulation of Y-specific satellite DNAs during the evolution of Rumex acetosa sex chromosomes | |
| Matsubara et al. | Sex chromosome evolution in snakes inferred from divergence patterns of two gametologous genes and chromosome distribution of sex chromosome-linked repetitive sequences | |
| El-Magd et al. | Polymorphisms of the IGF1 gene and their association with growth traits, serum concentration and expression rate of IGF1 and IGF1R in buffalo | |
| CN103937785B (zh) | 西瓜雌性系基因ClWIP1与染色体易位及连锁标记 | |
| CN104830870A (zh) | 一种塔里木马鹿茸c-fos基因及其应用 | |
| CN110643716A (zh) | 一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用 | |
| Rahim et al. | PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA cytochrome b gene among Haruan (Channa striatus) in Malaysia | |
| CN104805089A (zh) | 一种塔里木马鹿茸c-myc基因及其应用 | |
| Erdoğan et al. | Associations of SNPs in GHR gene with growth and milk yield of Anatolian buffaloes | |
| Hauser et al. | Microsatellite screening in Pacific halibut (Hippoglossus stenolepis) and a preliminary examination of population structure based on observed DNA variation | |
| CN111394473B (zh) | 一种鸡“鹿角”冠相关的分子标记及其分型方法和应用 | |
| CN108841969B (zh) | 一种检测黄牛msrb3基因插入/缺失标记的方法 | |
| Gaudry | Molecular phylogenetics of the rhinoceros clade and evolution of UCP1 transcriptional regulatory elements across the mammalian phylogeny | |
| Bhattacharya et al. | Identification of haplotypes in promoter of prolactin gene and their effect on egg production and quality traits in layer chicken | |
| Zhu et al. | Cloning and sequence analysis of the coding sequence of β-actin cDNA from the Chinese alligator and suitable internal reference primers from the β-actin gene | |
| Silva et al. | Polymorphisms in the DGAT1 gene in buffaloes (Bubalus bubalis) in the Amazon. | |
| Jeran et al. | Genetic diversity of 15 STR loci in a population of Montenegro | |
| Kholodova et al. | Molecular genetic diversity of musk deer Moschus moschiferus L., 1758 (Ruminantia, Artiodactyla) from the northern subspecies group | |
| AU2004257309B2 (en) | Improving production characteristics of cattle | |
| CN110592190B (zh) | 利用pcr-rflp检测绵羊dazl基因单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| CN104164437A (zh) | 一种获得山羊Dlk1基因新转录剪切体的方法 | |
| Zhang et al. | Identification of novel isoforms of dairy goat EEF1D and their mRNA expression characterization | |
| Rivera et al. | Characterization of the full length mRNA coding for Lucina pectinata HbIII revealed an alternative polyadenylation site |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150812 |