CN109468390A - Dlk1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DLK1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法，以中国西门塔尔牛DLK1基因的DNA序列为模板，设计一对引物，进行严格的PCR反应体系进行样品的PCR扩增和电泳，通过测序筛查并找到2个SNP位点；群体中筛查DLK1‑478 C/T位点的限制性内切酶为Msp I，该酶限定的切割碱基为CCGG;筛查DLK1‑609 T/G位点的限制性内切酶为Ase I；中国西门塔尔牛群体中携带DLK1‑478 C/T位点T等位基因和TT突变基因型个体具有较高的脂肪覆盖率和较好的大理石花纹；及携带DLK1‑609 T/G位点的G等位基因和GG突变基因型个体具有较高的脂肪覆盖率。本发明DLK1基因两个突变位点可以作为预示中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状遗传标记，用于肉用牛早期标记辅助选择。

Description

DLK1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法
技术领域
本发明公开一种DLK1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法，利用DLK1基因标记检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花性状，属于检测牛肉质性状技术领域。
背景技术
中国西门塔尔牛肉色鲜红、纹理细致、富有弹性、大理石花纹适中、脂肪色泽为白色或带淡黄色、脂肪质地有较高的硬度、体表脂肪覆盖率100%，普通的牛肉很难达到这个标准。从基因角度，利用分子的遗传标记作为对牛肉品质性状研究的主要手段，筛查由微效多基因控制的数量性状，来优化牛群的选育。
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，缩写SNP），是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种，即转换和颠换。SNP技术为当前应用最广泛的遗传标记技术之一，在动物遗传育种研究方面发挥重要作用。
DLK1（dalta like non-canonical Notch ligand 1）基因是一个父源表达的印记基因，是表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）家族中的一员，在细胞膜外含有6个串联的EGF结构域,DLK1蛋白为跨膜糖蛋白。在NCBI网站里查询获得，家牛的DLK1位于21号染色体，有6个外显子。DLK1有可变剪接体，其中牛剪接体有DLK-1-A,DLK-1-C2，DLK-1-E等，牛DLK1 mRNA 至少存在四种可变剪切形式，并且这四种可变剪切都是由第五个外显子部分核苷酸缺失而造成。DLK1在脂肪形成、血细胞的生成、肺脏发育、肾上腺及神经内分泌的分化等过程中有调节作用。除了调节细胞分化（如脂肪形成和成骨）之外，DLK1还是Notch信号传导的负调控因子和细胞干细胞的调节剂。近年来有研究表明，脂肪组织可以分泌多种因子（细胞因子）来参与人体的一些生理活动，如免疫反应和能量代谢平衡等。DLK1作为一个重要的抑制脂肪分化的因子，也逐渐被人们所重视。迄今为止，未有报道表明DLK1基因的遗传标记可作为肉牛育肥前筛选优良肉质性状的辅助选择分子标记。
发明内容
本发明提供了一种DLK1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法，解决了当前对牛脂肪覆盖率和大理石花纹肉质性状相关的重要分子遗传标记筛查的难题。
本发明所述的一种检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的基因，其特征在于：
其基因序列为Seq ID NO.1所示；
序列的第I3-478bp处，478C突变为478T，导致MspI-RFLP多态性；序列的第I3-609bp处，609 T突变为G，导致AseI-RFLP多态性。
本发明所说的一种利用DLK1基因标记检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的方法，其特征在于PCR扩增中国西门塔尔牛DLK1基因遗传标记的引物对如下所示：
DLK1 正向引物 F：5′-TCCACAGTGGAGGCTACTAAG-3′；
DLK1 反向引物 R：5′-CTTGTCTCCTGACTTCCTAAG-3′；
从中国西门塔尔牛血液中提取基因组DNA，以其为模板，用上述引物对进行PCR 扩增，PCR 产物纯化、克隆测序，后测序，获得DLK1 基因及DLK1-478 C/T 和 DLK1-609 T/G的两个单核苷酸碱基突变。经筛查分析，两个的限制性内切酶分别为MspI和AseI，识别的核苷酸酶切位点，MspI为CCGG；Ase1为ATTAAT。利用PCR-RFLP方法可在中国西门塔尔牛群体中进行DLK1基因遗传突变位点检测。
利用 PCR-RFLP 方法对中国西门塔尔牛群体中DLK1 基因2个遗传突变位点进行检测。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认长度为489bp，用限制性内切酶MspI和AseI进行特异性酶切以确认群体中两个遗传标记的基因频率和基因型频率分布。限制性内切酶的酶切体系为15 ul，包括cutsmart buffer 1.5 ul，MspI或AseI酶 0.3 ul，PCR产物 4ul，ddH2O 9.2 ul。于37 ℃条件下酶切2 h。酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认中国西门塔尔牛群体中每个个体所携带的基因型。
该基因标记的核苷酸序列为Seq ID NO.1所示序列的第I3-478bp处，478C突变为478T，导致MspI-RFLP多态性；序列的第I3-609bp处，609 T突变为G，导致AseI-RFLP多态性。
本发明的积极效果在于：公开了DLK1基因的遗传标记可作为肉牛育肥前筛选优良肉质性状的辅助选择分子标记用途；并提供了一对引物及2个SNP位点分别是I3-478 C/T和I3-609 T/G作为预示中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状遗传标记，用于肉用牛早期标记辅助选择。
附图说明
图1为中国西门塔尔牛DLK1基因引物对PCR扩增产物电泳图；
图2为本中国西门塔尔牛资源群体测序获得的DLK1基因SNPs；
图3为单个中国西门塔尔牛DLK1基因引物对PCR扩增产物电泳图；
图4为PCR扩增产物MspI酶切电泳图，AseI酶切电泳图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
中国西门塔尔牛DLK1基因片段的获得及功能区域多态性检测方法的建立：
1.1 试验材料：237头28月龄中国西门塔尔牛公牛来自内蒙古通辽市宝龙山肉牛育肥场。颈静脉采血，所采血样均为10 mL/头，用ACD抗凝剂抗凝，-20℃冻存。用血液基因组DNA提取试剂盒从血样中提取基因组DNA；
1.2 引物设计及PCR扩增：选择中国西门塔尔牛为试验材料，为了尽可能多的检测SNPs位点，选取SNP密度较高的片段，根据选取的牛DLK1基因序列设计以下引物对：
正向引物F：5′-TCCACAGTGGAGGCTACTAAG-3′；
反向引物R：5′-CTTGTCTCCTGACTTCCTAAG-3′；
用上述引物对在中国西门塔尔牛基因组中进行PCR扩增；
PCR扩增反应为25 μL体系，包括：上、下游引物各0.5μL；Green Mix 12.5μL；DNA 模板2 μL；ddH2O 9.5μL；
PCR 扩增反应程序：94℃变性5 min；94℃变性30 s， 59℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行35个循环；最后72℃延伸10 min；
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认长度为489bp（图1示）；
PCR扩增产物进行测序和序列比对分析(图2示)；
DLK1基因共包含2个SNPs位点：DLK1-478 C/T、DLK1-609 T/G存在碱基突变。
1.3 对单个样品进行扩增：利用 PCR-RFLP 方法对中国西门塔尔牛群体中DLK1基因2个遗传突变位点进行检测。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认长度为489bp（图3示），用限制性内切酶MspI和AseI进行特异性酶切以确认群体中两个遗传标记的基因频率和基因型频率分布；限制性内切酶的酶切体系为15ul，包括cutsmart buffer 1.5ul，MspI或AseI酶 0.3ul，PCR产物 4ul，ddH2O 9.2ul。于37℃条件下酶切2h。酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认中国西门塔尔牛群体中每个个体所携带的基因型（图4示）；
1.4 中国西门塔尔牛DLK1分子遗传标记分型：根据对目标基因位点单酶切产物电泳图分析，对每个位点的碱基变化做出标识，将其分为野生纯合型，突变纯合型及杂合型；对于DLK1-478 C/T、DLK1-609 T/G均显示3 种基因型。
实施例2
筛查获得的DLK1基因SNPs遗传标记进行基因型频率和基因频率计算。
中国西门塔尔牛群体中DLK1-478 C/T位点C等位基因频率为0.865，CC为优势基因型；DLK1-609 T/G位点T等位基因频率为0.846，TT为优势基因型。
表1.DLK1基因2个SNPs位点在中国西门塔尔牛群体中遗传多样性
SNP定位 群体样本 等位基因频率 基因型频率
I3-478 C>T 237 C (0.865) T (0.135) CC (0.738) CT(0.253) TT (0.008)
I3-609 T>G 217 T(0.846) G (0.154) TT (0.719) TG (0.234) GG (0.028)
实施例3
DLK1分子遗传标记与中国西门塔尔牛肉质和胴体性状进行关联分析：
性状测定：研究的肉质和胴体性状包括毛重、胴体重、皮重、肾脏脂肪、肾脏脂肪、屠宰pH、排酸pH、胴体长、后腿围、后腿长、腰部肉厚、背膘厚、脂肪覆盖率、大理石花纹、眼肌面积、脂肪颜色等性状。所有性状的测定根据国家标准GB/T1723821998 执行；
为确定DLK1基因DLK1-478 C/T和DLK1-609 T/G突变位点与中国西门塔尔牛肉质和胴体性状的相关性，采用实施例1所建立的PCR-RFLP方法进行多态性分析，采用SPSS 13.0的AVOVA方法分析这两个SNPs不同基因型对中国西门塔尔杂交牛肉质和胴体性状的影响，各基因间的多重比较采用Duncan法；
牛DLK1基因内含子DLK1-478 C/T和DLK1-609 T/G多态位点各基因型与肉质和胴体性状的平均值和标准差如表2和表3所示。DLK1-478 C/T主要与中国西门塔尔牛的脂肪覆盖率和大理石花纹性状显著相关关系，即CC基因型与CT基因型有极显著相关关系（p<0.01），CC基因型与TT基因型有显著相关关系（p<0.05）；
DLK1-609 T/G主要与部分中国西门塔尔牛的肉质和胴体性状显著相关关系；在脂肪覆盖率肉质性状中，TG基因型与TT基因型和GG基因型都有极显著相关关系（p<0.01）；在眼肌面积肉质性状中，TT基因型与TG基因型有显著相关关系（p<0.05）；在背膘厚肉质性状中，TG基因型与GG基因型有显著相关关系（p<0.05）；
结果表明，牛DLK1基因DLK1-478 C/T和DLK1-609 T/G突变位点导致这批中国西门塔尔牛牛群中部分与脂代谢相关性状的显著差异；中国西门塔尔牛群体中携带DLK1-478 C/T位点T等位基因和TT突变基因型个体具有较高的脂肪覆盖率和较好的大理石花纹；及携带DLK1-609 T/G位点的G等位基因和GG突变基因型个体具有较高的脂肪覆盖率；
本发明筛查的DLK1基因两个突变位点可以作为预示中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状遗传标记，用于肉用牛早期标记辅助选择。
表2. DLK1-478 C/T与中国西门塔尔牛肉质和胴体性状关联分析
注：同行不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)，不同小写字母表示显著性差异(p<0.05)。大理石花纹的分数范围从1到9；脂肪颜色的分数范围从1到7；N表示牛的个数，Mean表示均值，SD，standard deviation，表示标准差。
表3.DLK1-609 T/G与中国西门塔尔牛和肉质和胴体性状关联分析
注：同行不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)，不同小写字母表示显著性差异(p<0.05)。大理石花纹的分数范围从1到9；脂肪颜色的分数范围从1到7。N表示牛的个数，Mean表示均值，SD，standard deviation，表示标准差。
序列表
<110> 吉林大学
<120> DLK1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 489
<212> DNA
<213> 中国西门塔尔牛(Bos Taurus,bovine,Chinesesimmental)
<400> 1
tccacaggtg aggctactaa ggatgctgca gcacacacgc aaacacacgt ggagagggtg 60
ctgggtgctg agcgctgggg ccagcggcta ccgggtcagg accactggga cagggctggg 120
ggctgtgctg gacgaggcca ggtgtagggg ctggggggtg gcaggtcggg aaaggctgag 180
aagtagctca agtgcagatt ggtgttatct gttgatttca ttaatttatg ccatctttgc 240
cctccattac cctgagaagt ggacagttgg ctgtcgctgc agtttcaggc tgcaaaatgt 300
tcaaccgagc ccattcttgt ttggcaaaac ctgccctgaa gcccaggcag accagggtcc 360
ttgagaaaat tcccctggca gtgtaggcag ctgccatacg ccagcgtctg caaagtttcc 420
caggagggaa actgaggctc agggaagcaa ctgggtctgc tcatgactct taggaagtca 480
ggagaacag 489
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 正向引物(人工序列)
<400> 2
tccacaggtg aggctactaa g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 反向引物(人工序列)
<400> 3
ctgttctcct gacttcctaa g 21

Claims (4)

1. 一种检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的基因，其特征在于：该基因序列为Seq ID NO.1所示；
序列的第I3-478bp处，478C突变为478T，导致MspI-RFLP多态性；
序列的第I3-609bp处，609 T突变为G，导致AseI-RFLP多态性。
2.一种利用DLK1基因标记检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的方法，其特征在于PCR扩增中国西门塔尔牛DLK1基因遗传标记的引物对如下所示：
正向引物 F：5′-TCCACAGTGGAGGCTACTAAG-3′；
反向引物 R：5′-CTTGTCTCCTGACTTCCTAAG-3′。
3.如权利要求2所述一种利用DLK1基因标记检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的方法，包括以下步骤：
以中国西门塔尔牛血液中提取基因组DNA为模板，用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增，PCR 产物纯化、克隆测序，获得如权利要求1所述的DLK1基因和DLK1-478 C/T 和DLK1-609 T/G的两个单核苷酸碱基突变；
获得两个的限制性内切酶分别为MspI和AseI，识别的核苷酸酶切位点，MspI为CCGG；Ase1为ATTAAT；
利用PCR-RFLP方法在中国西门塔尔牛群体中进行DLK1基因遗传突变位点检测。
4.如权利要求3所述的一种利用DLK1基因标记检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的方法，其特征在于：
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认长度为489 bp，用限制性内切酶MspI和AseI进行特异性酶切以确认群体中两个遗传标记的基因频率和基因型频率分布；
限制性内切酶的酶切体系为15 ul，包括cutsmart buffer 1.5 ul，MspI或AseI酶 0.3ul，PCR产物 4 ul，ddH2O 9.2 ul；于37 ℃条件下酶切2 h；
酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认中国西门塔尔牛群体中每个个体所携带的基因型。
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