CN105200148B - 一种辅助检测肉乳兼用牛胴体组成性状的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种辅助检测肉乳兼用牛胴体组成性状的方法及试剂盒，可用于种用肉牛早期选择，进行针对乳肉兼用牛胴体性状的遗传标记筛选。只需要采集少量牛血液或组织（尾部亦可），进行基因组DNA提取，使用该分子检测试剂盒检测，测序后可鉴定肉牛样本群体中胴体和肉质性状的SNPs遗传标记，进行单倍型分析后，PSAP基因功能作用区域的6个SNPs位点及其单倍型组合可以作为一种辅助检测肉乳兼用牛胴体性状的有效分子遗传标记。PSAP基因引物片段及SNPs位点单倍型组合Hap2和Hap6能够作为检测和预示乳肉兼用牛胴体组成性状的专用试剂盒。可以作为肉乳兼用牛种质资源创制中优良个体的早期选择和产业化生产中入栏前育肥牛的筛查和生产。
Description
技术领域
本发明提供一种辅助检测肉乳兼用牛胴体组成性状的方法，同时还提供了其专用试剂盒，用于牛PSAP基因作为辅助选择标记的筛查体系和条件，属于检测试剂盒领域。
背景技术
中国西门塔尔牛是我国于20世纪五十年代引进后自主培育的大型肉乳兼用品种，以其独特的生产性能和良好的肉用特点在中国平原、草原、山区等地区被广泛推广，并表现出其作为新的肉乳兼用型牛品种的巨大优势和发展潜力，成为国内饲养最多，范围最广的兼用牛品种，是目前我国肉牛产业化生产中的主导品种。随着人们生活水平的提高，对牛的产肉性能的要求越来越高，对优质高档牛肉的需求也越来越大，因此优质牛肉带来的可观经济效益决定了肉牛育种中肉质性状选择的重要性。胴体性状作为由微效多基因控制的数量性状，由于无法活体测定而且受到传统育种方法的限制，因此从基因水平，利用新分子遗传标记筛查应用对肉乳兼用牛胴体组成性状进行研究成为主要技术手段，实现对优良种牛选育和改良目的。
鞘脂激活蛋白原（prosaposin,PSAP)基因含有15个外显子，编码4个以串联形式排列，处于同一通读框中的4种鞘脂激活蛋白:saposinA、saposinB、saposinC、saposinD。在小鼠、大鼠和人中均存在三种PSAP mRNA的剪接本：不含外显子8、含6bp的外显子8和含9bP完整的外显子8。而牛的机体中仅存在两种PSAP mRNA的剪接本：不含外显子8和含完整外显子8。PSAP基因的选择性剪接具有组织特异性，不同形式的剪接体存在于不同的组织中。PSAP蛋白通过水解酶加工形成四种saposin蛋白，后者主要作用于溶酶体区室，促进鞘脂的分解代谢。另外在神经以及其它质膜上也有分布，细胞质膜上的鞘脂分解产生亲脂性中间体，中间体参与把细胞外信号传入细胞内的调控过程。PSAP蛋白在生命活动中发挥重要功能，因此PSAP基因的遗传标记可能作为肉牛育肥前筛选优良胴体组成性状的分子标记。
发明内容
本发明提供了一种辅助检测肉乳兼用牛胴体组成性状的方法及试剂盒，解决当前对肉牛胴体性状和肉质性状相关的重要分子遗传标记筛查的难题。
本发明所述的一种辅助检测肉乳兼用牛胴体组成性状的方法，解决方案如下：
以中国西门塔尔牛PSAP基因特异性SNP位点设计一对引物，进行严格的PCR反应体系进行样品的PCR扩增和电泳，并根据测序结果筛查出SNPs遗传标记，进行单倍型分析，判定出阳性个体。
本发明所述的一种辅助检测肉乳兼用牛胴体组成性状的的方法，其特征在于中国西门塔尔牛特异性SNPs位点为：
如核苷酸序列如序列表Seq ID NO.1所示，在序列表Seq ID NO.1第132 bp处的SNP位点G>A（rs42143937），第229 bp处的SNP位点C>T (rs381104888)，第341 bp处的C>T(rs385887193)，第380bp处的SNP位点C>T(rs209315330)，第480 bp处的SNP位点C>T(rs432651539)，第486 bp处的SNP位点C>G(rs133441330)。
本发明所述的一种辅助检测肉乳兼用牛胴体组成性状的的方法，其特征在于中国西门塔尔牛PSAP基因的特异性引物为：
正向引物F：5′-TTACTGCGAGGTGTGCGAGTT-3′；
反向引物R：5′-CCTCGGCATCACACGGACT-3′。
本发明还公开了一种牛胴体和肉质性状选择的的分子检测试剂盒，本试剂盒包括上述一对特异性引物和PCR扩增引物及与牛胴体性状高度相关的单倍型判定标准。
本发明的积极效果在于：可用于种用肉牛早期选择，进行针对乳肉兼用牛胴体性状的遗传标记筛选。只需要采集少量牛血液或组织（尾部亦可），进行基因组DNA提取，使用该分子检测试剂盒检测，测序后可鉴定肉牛样本群体中胴体和肉质性状的SNPs遗传标记，进行单倍型分析后，PSAP基因功能作用区域的6个SNPs位点及其单倍型组合可以作为一种辅助检测肉乳兼用牛胴体性状的有效分子遗传标记。PSAP基因引物片段及SNPs位点单倍型组合Hap2和Hap6能够作为检测和预示乳肉兼用牛胴体组成性状的专用试剂盒。可以作为肉乳兼用牛种质资源创制中优良个体的早期选择和产业化生产中入栏前育肥牛的筛查和生产。
附图说明
图1 为中国西门塔尔牛PSAP基因引物对PCR扩增产物电泳图；
图2为本中国西门塔尔牛资源群体测序获得的PSAP基因SNPs 。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
中国西门塔尔牛PSAP基因片段的获得及功能区域多态性检测方法的建立。
1.1 试验材料：380头28月龄中国西门塔尔牛公牛来自内蒙古通辽市宝龙山肉牛育肥场。颈静脉采血，所采血样均为10 mL/头，用ACD抗凝剂抗凝，-20℃冻存。用血液基因组DNA提取试剂盒（天根生化公司）从血样中提取基因组DNA。
1.2 引物设计及PCR扩增：选择中国西门塔尔牛为试验材料，为了尽可能多的检测SNPs位点，选取SNP密度较高的片段，根据选取的牛PSAP基因序列设计以下引物对：
P正向引物F：5′-TTACTGCGAGGTGTGCGAGTT-3′，
P反向引物R：5′-CCTCGGCATCACACGGACT-3′；
用上述引物对在中国西门塔尔牛基因组中进行PCR扩增。PCR扩增反应为50 μL体系，包括：上、下游引物（10 μmol/L）1 μL；Mix（天根）25μL；DNA 模板（50 ng/μL）2 μL；超纯水21μL。PCR 扩增反应程序：94℃变性5 min；94℃变性30 s， 63℃退火30 s，72℃延伸40s，进行30个循环；最后72℃延伸10 min。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后获得目的基因片段，长度为683bp（图1示）。凝胶回收、纯化目的片段进行测序和序列比对分析。PSAP基因共包含6个SNPs位点：I10-65G>A、I10-162C>T、I10-274C>T、I10-313C>T、E11-87C>T、E11-93C>G存在碱基突变。
1.3 中国西门塔尔牛PSAP分子遗传标记分型：根据对目标基因位点测序序列分析，对每个位点的碱基变化做出标识，将其分为野生纯合型，突变纯合型及杂合型。对于SNP1（I10-65G>A）、SNP2（I10-162 C>T）、SNP3（I10-274C>T）、SNP4（I10-313C>T）、SNP6（E11-93C>G）均显示3 种基因型，SNP5（E11-87C>T）显示出两种基因型。
根据SNPs位点的遗传距离和连锁分析，共有16中单倍型组合（Haplotype），在本资源群体中高频率存在的有6种单倍型组合，分别为：hap1：ACCCCC（0.168）、
hap2：ACCTCC（0.122）、hap3：GCCCCC（0.261）、hap4：GCCCGC（0.169）、
hap5：GCCTCC（0.042）、hap6：GTTCCC（0.192）。
实施例2
筛查获得的PSAP基因SNPs遗传标记进行单倍型分型后，与中国西门塔尔牛胴体和肉质性状进行关联分析及应用。
性状测定：研究的胴体性状和肉质性状包括宰前重、胴体重、屠宰率、净骨重、胴体长、背膘厚、眼肌面积、屠宰PH等性状。所有性状的测定根据国家标准GB/T1723821998 执行。
根据实施方法，应用本发明试剂盒对380头中国西门塔尔牛实行检测，共检测出6个SNPs位点，其群体遗传多样性见表一。根据SNPs位点的遗传距离和连锁分析，6种单倍型组合与乳肉兼用牛胴体性状的关联分析结果见表二。在宰前重、胴体重、屠宰率、眼肌面积和净骨重性状方面，肉用牛资源群体中携带Hap2单倍型个体在性状表现方面极显著高于其他五种单倍型携带个体。肉用牛资源群体中携带Hap1单倍型个体的胴体长显著性高于Hap4单倍型携带个体。另外，群体中携带Hap6个体的背膘厚平均水平显著高于Hap2和Hap5单倍型携带个体，同时，Hap6群体的屠宰pH极显著高于Hap4单倍型携带个体，显著性高于Hap1、Hap2单倍型携带个体。综上，结果表明，PSAP基因功能作用区域的6个SNPs位点及其单倍型组合可以作为一种辅助检测肉乳兼用牛胴体性状的有效分子遗传标记。PSAP基因引物片段及SNPs位点单倍型组合Hap2和Hap6能够作为检测和预示乳肉兼用牛胴体组成性状的专用试剂盒。可以作为肉乳兼用牛种质资源创制中优良个体的早期选择和产业化生产中入栏前育肥牛的筛查和生产。
表一、PSAP基因6个SNPs位点在中国西门塔尔牛群体（380头）中遗传多样性：
表二、单倍型与中国西门塔尔牛胴体和肉质性状关联分析：
注：同行不同大写字母表示极显著差异，不同小写字母表示显著性差异。
<110> 吉林大学
<120>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 576
<212> DNA
<213> 牛（Bos）
<400> 1
caacccatcc tgacaaactg gagctgaaac tgcagcgagg agtagaatgg tgatgaataa 60
aagggagaga agcagccagt gggtgagagg accgcattca gaccctacga tgctgagtgc 120
accatgacgg ggttcactgt ccttgccctg gtgcccccg ggaagtctga gccggagccc 80
ctgcagggtc cctagctctg tgccctgcag acacacaacg actcgggaga actacctgct 240
gtgagaccag ccagggatgc tccctggtgg ccttcctccc ctccctgtgc tcggtcagga 300
atcctaatta gcagagtcca gccacagggc tctgggctcc accctcttc tgaatcagcc 360
tctcctcccc tacttccact caagtggctt tcccctcgga cgacgatgac aagatcgtcg 420
ggggctacac ctgcgcggag aattctgtcc cttaccaggt gtccctgaat gctggctacc 480
acttctgcgg gggctccctc atcaatgacc agtgggtggt gtccgcggct cactgctacc 540
agtagtaagt gctgggcccc tgatgactaa gcccac 576
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caacccatcc tgacaaac 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>3
gtgggcttag tcatcagg 18
Claims (1)
1.一种检测肉乳兼用牛胴体组成性状的遗传标记，其特征在于：
扩增基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，在序列表SEQ ID NO.1第132 bp处有G>A突变，第229 bp处有C>T突变，第341 bp处有C>T突变，第380bp处有C>T突变，第480 bp处有C>T突变，第486 bp处有C>G突变；
从而利用测序、分型方法对肉乳兼用牛胴体组成性状资源群体中PSAP基因6个SNPs和单倍型组合进行检测；
从肉乳兼用牛血液中提取基因组DNA，根据PSAP基因序列设计引物，得到引物序列：
正向引物F：5′-caacccatcctgacaaac-3′，
反向引物R：5′-CCTCGGCATCACACGGACT-3′；
PCR扩增条件是：50 μL反应体系，包括：10 μmol/L的上、下游引物各1 μL；25 μL PCRMix；50 ng/μL的DNA 模板2 μL；超纯水21 μL；PCR 扩增反应程序为：94℃变性5 min；94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸40 s，进行30个循环；最后72℃延伸10 min；
根据SNPs位点的遗传距离和连锁分析，肉乳兼用牛胴体组成性状资源群体筛查到的6个SNPs共有16种单倍型组合，高频率存在的有6种单倍型组合；分别为，hap1：ACCCCC、hap2：ACCTCC、hap3：GCCCCC、hap4：GCCCGC、hap5：GCCTCC、hap6：GTTCCC；其中单倍型组合Hap2和Hap6作为检测和预示乳肉兼用牛胴体组成性状的遗传标记。
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