CN108277264A - SGLT2 mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物及应用 - Google Patents

SGLT2 mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了SGLT2mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物，以及采用所述特异性引物从外周血白细胞中扩增SGLT2mRNA剪切体，从而实现了从表达量极低的外周血白细胞中特异性检测SGLT2mRNA 8号外显子缺失的方法。所述方法，包括以下步骤：(1)外周血单个核细胞分离收集；(2)总RNA提取及逆转录反应；(3)SGLT2 8号外显子的PCR扩增：(4)取第三轮PCR产物进行电泳鉴定；(5)取第三轮产物进行序列测定；(6)得到SGLT2mRNA 8号外显子剪切的突变检测结果。本发明实现了简单、快速、准确的检测SGLT2mRNA的剪切突变体。

Description

SGLT2 mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物及应用
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种SGLT2 mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物，以及采用所述特异性引物从表达量极低的外周血白细胞中特异性检测SGLT2mRNA 8号外显子缺失的方法。
背景技术
钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)是肾近端小管重吸收葡萄糖的关键，负责重吸收约90％由肾小球滤过的葡萄糖。SGLT2蛋白由SLC5A2基因编码。SLC5A2基因突变导致家族性肾性糖尿，该病诊断主要依据临床表现和实验室检查。标准如下：(1)24h尿葡萄糖＞0.3g.(1.73m2)-1.d-1；(2)葡萄糖代谢正常；(3)无其他肾脏病证据，包括无血尿、蛋白尿、氨基酸尿或磷酸盐尿等，肾功能正常；(4)孕妇除外。其中，24h尿糖<10g/1.73m2定义为轻度糖尿；20g/1.73m2＞24h尿糖≥10g/1.73m2为中度糖尿；24尿糖≥20g/1.73m2为重度糖尿。
SLC5A2基因突变分析是研究家族性肾性糖尿患者基因型与表型关系的必要手段。目前，SLC5A2基因突变主要通过提取病人外周血基因组DNA，采用PCR结合外显子测序的方法寻找突变位点。基于此种技术，近70多个致病性突变位点被发现。然而，由于病人肾脏活体取材限制，且外周血白细胞表达极低，对于某些可能导致外显子剪切的突变，难于实施mRNA水平的剪切验证，从而在很大程度上限制了致病机制的研究。
赵向忠等(Zhao X,Cui L,Lang Y et al.,A recurrent deletion in theSLC5A2 gene including the intron 7 branch site responsible for familial renalglucosuria.Scientific reports 2016,6:33920.)在多个家族性肾性糖尿家系的研究中发现了高频突变位点c.886(-10_-31)del，并采用体外剪切验证体系-迷你基因技术，证实了8号外显子缺失的发生。目前，验证剪切突变公认的体外技术是迷你基因技术；迷你基因技术是通过构建质粒表达载体，通过转染工具细胞进行的验证方法。与体内验证相比，人为构建到特定载体上，不能真实反应在体内的剪切反应，并且不同的工具细胞剪切环境亦不同，因此会造成假阳性或假阴性结果。该技术容易出现假阳性及假阴性，且缺乏体内剪切证据。虽然体内验证是最直接有力的证据；但SGLT2特异性高表达于肾脏，而人肾脏活体取材限制了标本来源。虽然外周血白细胞取材方便，损伤小，适合作为检测标本，但病人外周血白细胞中的SGLT2表达量极低，难以实施mRNA水平的剪切验证。
发明内容
本发明提供了SGLT2mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物，以及采用所述特异性引物从外周血白细胞中扩增SGLT2mRNA剪切体，从而实现了从表达量极低的外周血白细胞中特异性检测SGLT2mRNA 8号外显子缺失的方法。
本发明的技术方案：
SGLT2mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物，包括三对特异性引物，具体为：
引物1序列：5'TTCACCAAGATCTCAGTGGA 3'；
引物2序列：5'CCTGGGGCTCATTCATCT 3'；
引物3序列：5'GGGCATCACCATGATTTACAC3'；
引物4序列：5'TCCTCCCGTTCCTCCTTG3'；
引物5序列：5'ATGGGTTACGCCTTCCACGAG3'；
引物6序列：5'CAGACCGTTGGGCATGAGCT3'。
从外周血白细胞中检测SGLT2mRNA的剪切突变体的方法，包括以下步骤：
(1)外周血单个核细胞分离收集；
(2)总RNA提取及逆转录反应；
(3)SGLT2 8号外显子的PCR扩增：
I.以外周血白细胞cDNA为模板，以权利要求1所述的引物1+引物2为第一套引物，加入2×PCR mix和灭菌水，混合，进行第一轮PCR；
II.以第一轮PCR产物DNA为模板，以权利要求1所述的引物3+引物4为第二套引物，加入加入2×PCR mix和灭菌水，在冰上混合，进行第二轮PCR；
III.以第二轮PCR产物DNA为模板，以权利要求1所述的引物5+引物6为第三套引物，加入加入2×PCR mix和灭菌水，在冰上混合，进行第三轮PCR；
(4)取第三轮PCR产物进行电泳鉴定；
(5)取第三轮产物进行序列测定；
(6)根据步骤(4)电泳条带大小(正常产物489bp，剪切突变产物353bp)和步骤(5)的测序结果，得到SGLT2mRNA 8号外显子剪切的突变检测结果。
所述步骤(3)第一轮PCR反应条件为：95℃5min；95℃30sec，63℃30sec，72℃1min，3个循环；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，3个循环；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，4个循环；95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，4个循环；95℃30sec，53℃30sec，72℃1min，3个循环；95℃30sec，50℃30sec，72℃1min，3个循环；72℃10min。
步骤(3)第二轮PCR反应条件为：95℃5min；95℃30sec，63℃30sec，72℃1min，2个循环；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，2个循环；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，5个循环；95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，5个循环；95℃30sec，53℃30sec，72℃1min，3个循环；72℃10min。
步骤(3)第三轮PCR反应条件为：95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，5个循环；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，10个循环；95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，8个循环；72℃10min。
步骤(3)第一轮PCR扩增中，2×PCR mix的用量为10μl，cDNA模板的用量为2μl，引物1的用量为2.5mM*1ul，引物2的用量为2.5mM*1ul，灭菌水的用量为6μl。
步骤(3)第二轮PCR扩增中，2×PCR mix的用量为10μl，第一轮PCR产物的用量为2μl，引物1的用量为2.5mM*0.5ul，引物2的用量为2.5mM*0.5ul，灭菌水的用量为7μl。
步骤(3)第三轮PCR扩增中，2×PCR mix的用量为10μl，第二轮PCR产物的用量为0.5μl，引物1的用量为2.5mM*0.5ul，引物2的用量为2.5mM*0.5ul，灭菌水的用量为8.5μl。
步骤(1)所述的外周血单个核细胞分离收集，具体包括以下步骤：
a)抽取个体外周静脉血3ml(肝素或EDTA抗凝)；
b)取一支15ml离心管，加入3ml分离液置于室温22℃复温；
c)将血液样本加于分离液之液面上。室温，500g离心20分钟；
d)离心后，用吸管小心吸出中间层(单个核细胞)至于另一新离心管内；
e)在步骤d中所得离心管中加入10ml 1×PBS洗涤细胞，250g离心10分钟，弃上清；
f)重复步骤e，用吸管以5ml细胞洗涤液重悬所得细胞；
g)细胞沉淀加1ml 1×PBS重悬后，转至无RNA酶的1.5ml EP管中，250g离心10分钟收集细胞沉淀。
步骤(2)所述的总RNA提取及逆转录反应，具体包括以下步骤：
2.1)总RNA提取
a)向步骤(g)所得到的细胞沉淀中，加入1ml Trizol试剂，混匀，反复吹吸几次破裂细胞，置室温5min；
b)加氯仿0.2ml(每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml)，盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟；
c)4℃离心，12000g×15min，离心后，小心吸取上层水相，RNA包含在水相中，移至另一新无RNA酶的EP管中；
d)加0.5ml异丙醇，颠倒混匀数次，室温10min，沉淀RNA；
e)4℃离心，12000g×10min,，RNA沉淀在管底或管壁；
f)弃上清，加入预冷的75％乙醇1ml，震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，7000g×5min。
g)弃上清液，空气干燥5-10min后，沉淀溶于DEPC水中。
2.2)cDNA合成
a)在冰浴条件下，加入下列反应混合物：
b)65℃温育5分钟后立即冰浴冷却,瞬时离心3-5秒。
c)继续加入如下组分：
5x反应缓冲液，2ul
RNA酶抑制剂(40u/ul)0.5ul
PrimeScript II RTase(200U/μl)1ul
d)混匀后30℃、10min，42℃、45min，95℃、5min，灭活反转录酶，反转录反应产物，即外周血白细胞cDNA，-20℃保存备用。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了SGLT2mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物，并采用所述引物实现了从GLT2表达量极低的病人外周血白细胞中，通过提取RNA，经过特殊PCR设计，简单、快速、准确的检测SGLT2mRNA的剪切突变体。
(2)与现有技术相比，本发明所得的检测结果是最直接有力的体内剪切证据，为致病机制的研究打开了一扇新的大门。
(3)本发明采用的检测标的物为外周血白细胞，不但取材方便，而且损伤小，适合作为检测标本，具备极大的便利性和可行性。
附图说明
图1.外周血白细胞RT-PCR电泳结果；
图2.正常人(Ⅱ)RT-PCR产物测序结果；
图3.剪切突变个体(Ⅲ)RT-PCR产物测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：
SGLT2mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物，包括三对特异性引物，具体为：
引物1序列：5'TTCACCAAGATCTCAGTGGA 3'；
引物2序列：5'CCTGGGGCTCATTCATCT 3'；
引物3序列：5'GGGCATCACCATGATTTACAC3'；
引物4序列：5'TCCTCCCGTTCCTCCTTG3'；
引物5序列：5'ATGGGTTACGCCTTCCACGAG3'；
引物6序列：5'CAGACCGTTGGGCATGAGCT3'。
采用上述引物从外周血白细胞中检测SGLT2mRNA的剪切突变体的方法，包括以下步骤：
(1)外周血单个核细胞分离收集：
a)抽取个体外周静脉血3ml(肝素或EDTA抗凝)；
b)取一支15ml离心管，加入3ml分离液置于室温22℃复温；
c)将血液样本加于分离液之液面上。室温，500g离心20分钟；
d)离心后，用吸管小心吸出中间层(单个核细胞)至于另一新离心管内；
e)在步骤d中所得离心管中加入10ml 1×PBS洗涤细胞，250g离心10分钟，弃上清；
f)重复步骤e，用吸管以5ml细胞洗涤液重悬所得细胞；
g)细胞沉淀加1ml 1×PBS重悬后，转至无RNA酶的1.5ml EP管中，250g离心10分钟收集细胞沉淀。
(2)总RNA提取及逆转录反应：
(2.1)总RNA提取
a)向步骤(g)所得到的细胞沉淀中，加入1ml Trizol试剂，混匀，反复吹吸几次破裂细胞，置室温5min；
b)加氯仿0.2ml(每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml)，盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟；
c)4℃离心，12000g×15min，离心后，小心吸取上层水相，RNA包含在水相中，移至另一新无RNA酶的EP管中；
d)加0.5ml异丙醇，颠倒混匀数次，室温10min，沉淀RNA；
e)4℃离心，12000g×10min,，RNA沉淀在管底或管壁；
f)弃上清，加入预冷的75％乙醇1ml，震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，7000g×5min。
g)弃上清液，空气干燥5-10min后，沉淀溶于DEPC水中。
(2.2)cDNA合成
a)在冰浴条件下，加入下列反应混合物：
b)65℃温育5分钟后立即冰浴冷却,瞬时离心3-5秒。
c)继续加入如下组分：
5x反应缓冲液， 2ul
RNA酶抑制剂(40u/ul) 0.5ul
PrimeScript II RTase(200U/μl) 1ul
d)混匀后30℃、10min，42℃、45min，95℃、5min，灭活反转录酶，反转录反应产物即外周血白细胞cDNA，-20℃保存备用。
(3)SGLT2 8号外显子的PCR扩增
(3.1)巢式PCR第一轮扩增体系
a)在冰上混合下列反应混合物：
b)PCR反应条件如下：
95℃5min；
95℃30sec，63℃30sec，72℃1min，3个循环；
95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，3个循环；
95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，4个循环；
95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，4个循环；
95℃30sec，53℃30sec，72℃1min，3个循环；
95℃30sec，50℃30sec，72℃1min，3个循环；
72℃10min，第一轮反应结束。
(3.2)巢式PCR第二轮扩增体系
a)在冰上混合下列反应混合物：
b)PCR反应条件如下：
95℃5min；
95℃30sec，63℃30sec，72℃1min，2个循环；
95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，2个循环；
95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，5个循环；
95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，5个循环；
95℃30sec，53℃30sec，72℃1min，3个循环；
72℃10min，第二轮反应结束。
(3.3)第三轮PCR扩增体系
a)在冰上混合下列反应混合物：
b)PCR反应条件如下：
95℃5min；
95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，5个循环；
95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，10个循环；
95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，8个循环；
72℃10min，第三轮反应结束。
(4)取第三轮PCR产物进行电泳鉴定；如图1所示。其中，Ⅱ为正常人RT-PCR扩增产物489bp，包含了7，8，9号外显子；Ⅲ为剪切突变个体RT-PCR结果。由图1可知，III中，除正常产物(489bp，含一个正常等位基因)外，出现大量8号外显子剪切缺失的扩增产物(353bp)。
(5)取第三轮产物进行序列测定；如图3所示。剪切突变个体(Ⅲ)RT-PCR产物测序结果(图3)显示，突变情况下，缺失8号外显子，7号和9号外显子连接。正常人(Ⅱ)RT-PCR产物测序结果(图2)显示，正常情况下，7号，8号，9号外显子连接处测序结果。
(6)根据步骤(4)电泳条带大小(正常产物489bp，剪切突变产物353bp)和步骤(5)的测序结果，可以得知，c.886(-10_-31)del导致的8号外显子剪切缺失。说明，采用所述引物，实现了从GLT2表达量极低的病人外周血白细胞中，通过提取RNA，经过特殊PCR设计，简单、快速、准确的检测SGLT2mRNA的剪切突变体。该技术不但填充了现有技术的空白，而且致病机制研究的的一大利器，对于科研工作者及广大患者都具有重要的意义。

Claims (8)

1.SGLT2mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物，其特征在于：包括三对特异性引物，具体为：
引物1序列：5'TTCACCAAGATCTCAGTGGA 3'；
引物2序列：5'CCTGGGGCTCATTCATCT 3'；
引物3序列：5'GGGCATCACCATGATTTACAC3'；
引物4序列：5'TCCTCCCGTTCCTCCTTG3'；
引物5序列：5'ATGGGTTACGCCTTCCACGAG3'；
引物6序列：5'CAGACCGTTGGGCATGAGCT3'。
2.采用如权利要求1所述引物从外周血白细胞中检测SGLT2mRNA的剪切突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)外周血单个核细胞分离收集；
(2)总RNA提取及逆转录反应，得到外周血白细胞cDNA；
(3)SGLT2 8号外显子的PCR扩增：
I.以外周血白细胞cDNA为模板，以权利要求1所述的引物1+引物2为第一套引物，加入2×PCR mix和灭菌水，混合，进行第一轮PCR；
II.以第一轮PCR产物DNA为模板，以权利要求1所述的引物3+引物4为第二套引物，加入加入2×PCR mix和灭菌水，在冰上混合，进行第二轮PCR；
III.以第二轮PCR产物DNA为模板，以权利要求1所述的引物5+引物6为第三套引物，加入加入2×PCR mix和灭菌水，在冰上混合，进行第三轮PCR；
(4)取第三轮PCR产物进行电泳鉴定；
(5)取第三轮产物进行序列测定；
(6)根据步骤(4)电泳条带大小和步骤(5)的测序结果，得到SGLT2 mRNA8号外显子剪切的突变检测结果。
3.根据权利要求2所述的从外周血白细胞中检测SGLT2mRNA的剪切突变体的方法，其特征在于：步骤(3)第一轮PCR反应条件为：
95℃5min；
95℃30sec，63℃30sec，72℃1min，3个循环；
95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，3个循环；
95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，4个循环；
95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，4个循环；
95℃30sec，53℃30sec，72℃1min，3个循环；
95℃30sec，50℃30sec，72℃1min，3个循环；
72℃10min。
4.根据权利要求2所述的从外周血白细胞中检测SGLT2 mRNA的剪切突变体的方法，其特征在于：步骤(3)第二轮PCR反应条件为：
95℃5min；
95℃30sec，63℃30sec，72℃1min，2个循环；
95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，2个循环；
95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，5个循环；
95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，5个循环；
95℃30sec，53℃30sec，72℃1min，3个循环；
72℃10min。
5.根据权利要求2所述的从外周血白细胞中检测SGLT2 mRNA的剪切突变体的方法，其特征在于：步骤(3)第二轮PCR反应条件为：
95℃5min；
95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，5个循环；
95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，10个循环；
95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，8个循环；
72℃10min。
6.根据权利要求2所述的从外周血白细胞中检测SGLT2 mRNA的剪切突变体的方法，其特征在于：步骤(3)第一轮PCR扩增中，2×PCR mix的用量为10μl，cDNA模板的用量为2μl，引物1的用量为2.5mM*1ul，引物2的用量为2.5mM*1ul，灭菌水的用量为6μl。
7.根据权利要求2所述的从外周血白细胞中检测SGLT2mRNA的剪切突变体的方法，其特征在于：步骤(3)第二轮PCR扩增中，2×PCR mix的用量为10μl，第一轮PCR产物的用量为2μl，引物1的用量为2.5mM*0.5ul，引物2的用量为2.5mM*0.5ul，灭菌水的用量为7μl。
8.根据权利要求2所述的从外周血白细胞中检测SGLT2 mRNA的剪切突变体的方法，其特征在于：步骤(3)第三轮PCR扩增中，2×PCR mix的用量为10μl，第二轮PCR产物的用量为0.5μl，引物1的用量为2.5mM*0.5ul，引物2的用量为2.5mM*0.5ul，灭菌水的用量为8.5μl。
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CN109609605A (zh) * 2019-01-28 2019-04-12 西南大学 Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的检测方法
CN113416773A (zh) * 2021-06-07 2021-09-21 广州华越肾科再生医学科技有限公司 一种用于sglt2荧光定量pcr的检测引物和探针及其试剂盒

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CN104164437A (zh) * 2013-05-20 2014-11-26 四川农业大学 一种获得山羊Dlk1基因新转录剪切体的方法

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