CN113416773A

CN113416773A - 一种用于sglt2荧光定量pcr的检测引物和探针及其试剂盒

Info

Publication number: CN113416773A
Application number: CN202110631007.3A
Authority: CN
Inventors: 邱江; 张家盛; 樊琛语; 郑立新; 王恒; 吴志鹏; 王得中
Original assignee: Guangzhou Huayue Nephrology Regenerative Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Huayue Nephrology Regenerative Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-07
Filing date: 2021-06-07
Publication date: 2021-09-21

Abstract

本发明公开了一种用于SGLT2荧光定量PCR的检测引物和探针及其试剂盒，所述引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示。本发明的荧光定量PCR检测引物和探针灵敏度高、重复性强、特异性好、准确性高、假阳性率低，能够快速、准确地对SGLT2进行定性和定量。不存在非特异性扩增，可以特异的检测肾小管上皮细胞是否表达SGLT2，灵敏度比较高，最低可以检测10pg总RNA；而且本发明中的检测基于一步法，反转录和扩增都在同一管中进行，没有开盖和移液操作，因此可以降低污染的风险。

Description

一种用于SGLT2荧光定量PCR的检测引物和探针及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于SGLT2荧光定量PCR的检测引物和探针及其试剂盒。

背景技术

肾脏是人体最重要的器官，不仅排泄有害物质，还可以重吸收重要的营养物质包括水、氨基酸、盐类和葡萄糖。重吸收功能和有害物质的分泌都通过肾小管上皮细胞实现，肾小球滤过近乎100％的葡萄糖，氨基酸，90％的HCO^3-，70％的Na⁺、Cl^-、H₂O，以及相当大比例的K⁺、Ca²⁺等，这些物质又会被肾小管上皮细胞重吸收，重新进入人体的循环系统。

肾小管在体内大量外源性和内源性代谢产物的转运中起着关键作用。肾小管转运可分为两部分，一部分是异生化合物/代谢物进入细胞，一部分由顶端膜排出，这是通过将不同的特异性转运蛋白通道极性分布到肾小管细胞的顶端膜或基底侧膜来实现的。在人体内，OAT1(SLC22A6)、OAT3(SLC22A8)和OCT2(SLC22A2)是主要的基底侧外排转运蛋白，SGLT,MDR1(P-糖蛋白；ABCB1)、MRP2(ABCC2)、MRP4(ABCC4)和BCRP(ABCG2)是位于顶端膜的重要外排转运蛋白。由此可见，如果单个特异性转运蛋白的表达出现了问题，会引起所对应的异生化合物/代谢物的转运功能障碍，从而导致各种疾病产生。例如HCO3-协同转运蛋白的编码基因突变，就有可能导致2型肾小管性酸中毒。越来越多的研究显示，糖尿病肾病在肾小球出现明显损伤之前已存在肾小管及间质的结构及功能损伤，其临床表现为肾性糖尿、肾小管性蛋白尿及酶尿。因此，急需开发一系列针对肾小管上皮细胞转运体功能的检测手段，用以表征、量化转运体的完整功能；也为各种针对肾小管疾病的治疗，开辟一条便捷的体外诊断的思路。

在人体内，葡萄糖的重吸收在控制体内血糖水平发挥重要作用，每天，最高达180克葡萄糖通过肾小球滤过，在肾小管被重吸收人血液。当葡萄糖超过肾糖阈180mg/dL或葡萄糖滤过负荷超过375mg/min，葡萄糖就会出现在尿液中。钠-葡萄糖共转运蛋白(SGLT)在肾脏葡萄糖重吸收过程中具有重要作用。SGLT2是一种钠-葡萄糖共转运蛋白，约90％的葡萄糖通过近曲小管S1段SGLT2被重吸收，SGLT2介导葡萄糖通过肾小管上皮细胞顶端被动转运。因此，检测肾小管上皮细胞中SGLT2表达水平对开发和评估病患者的肾小管上皮细胞葡萄糖重吸收功能具有重要意义。如果患者中的肾小管上皮细胞细胞膜上的SGLT2缺陷，使肾小管重吸收葡萄糖的能力降低，便有可能导致肾性糖尿。

当前已技术公开的肾小管上皮细胞转运体检测方法，其普遍缺陷是检测费用高昂、检测过程过长、敏感度低、准确率不高等等。为了改善以上缺点，我们需要开发更为方便快捷、价格低廉、准确灵敏的检测手段，鉴于葡萄糖转运体在近端小管中的重要作用，本发明专注于葡萄糖转运体功能的检测试剂盒。专利CN201810318410.9公开了一种使用巢式PCR检测外周血白细胞中SGLT2 mRNA表达量的方法，需要经过三轮PCR才能对产物进行琼脂糖凝胶电泳测定，涉及多对引物，不仅过程复杂降低检测效率，而且需要频繁的移液操作，容易产生污染，使结果准确性降低。专利201611024059.X通过免疫印迹实验检测以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选细胞模型中SGLT2蛋白质表达量，但该方法步骤很多，检测时间长，操作繁琐，不能快速检测SGLT2表达量，不适合大规模高通量实验。因此急需一种更加简便、快速、准确、灵敏的检测方法。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种引物。

本发明的第二个目的在于提供一种探针。

本发明的第三个目的在于提供一种检测试剂。

本发明的第四个目的在于提供一种试剂盒。

本发明的第五个目的在于提供一种检测SGLT2的方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种引物，包括用于扩增SGLT2的上游引物和下游引物。

在本发明的一些优选实施方式中，所述上游引物和下游引物的序列为：

上游引物：TCCCTTTTCCTGTACATC(SEQ ID NO.1)；

下游引物：GTCACCGTGTAAATCATG(SEQ ID NO.2)。

本发明的第二个方面，提供一种探针，所述探针靶向SGLT2。

在本发明的一些优选实施方式中，所述探针的序列优选为：

探针：TCACCAAGATCTCAGTGGACA(SEQ ID NO.3)。

本发明的第三个方面，提供一种检测试剂，包括本发明第一方面所述引物和/或本发明第二方面所述探针。

本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，包括本发明第三个方面所述检测试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包含逆转录试剂与荧光定量PCR试剂、用于扩增内参基因的引物及探针。

在本发明的一些实施方式中，所述内参引物为GAPDH、β-actin、β-tubulin。

在本发明的一些优选实施方式中，所述内参引物为GAPDH。

在本发明的一些优选实施方式中，所述内参引物用于扩增内参基因的引物及探针序列为：

上游引物：GCTTGTCATCAATGGAAATC(SEQ ID NO.4)；

下游引物：CAGAGATGATGACCCTTTTG(SEQ ID NO.5)；

探针：ATCACCATCTTCCAGGAGCGAG(SEQ ID NO.6)。

本发明还提供本发明第一方面所述引物或第二方面所述探针或第三方面所述检测试剂或第四方面所述试剂盒在检测SGLT2中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种检测SGLT2的方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1：提取待测样品总RNA；

S2：使用本发明第一方面所述引物或第二方面所述探针或第三方面所述检测试剂或第四方面所述试剂盒对待测样品进行实时荧光定量PCR构建荧光PCR反应体系进行扩增反应；

S3：收集待测样品荧光信号，对待测样品进行检测。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光PCR反应体系为：包括模板RNA 5μL，引物探针混合液3.5μL，PCR酶混合液15μL，MasterMix 26.5μL。

在本发明的一些实施方式中，所述扩增反应的条件为：50℃30min；95℃3min；95℃15s，60℃30s，45个循环。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种基于Taqman探针一步法定量检测SGLT2的荧光定量PCR检测引物、探针、检测材料、检测试剂盒及其检测方法，试剂盒含有检测特SGLT2以及内参基因GAPDH的上下游引物及探针，该试剂盒用于检测肾小管上皮细胞葡萄糖转运体(SGLT2)，具有灵敏度高、重复性强、特异性好、准确性高、假阳性率低的特点，能够快速、准确地对SGLT2进行定性和定量。

本发明中的荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板与探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，故不存在非特异性扩增，从而可以特异的检测肾小管上皮细胞是否表达SGLT2。由于反转录得到的cDNA全部用来扩增，因此灵敏度比较高，最低可以检测10pg总RNA；而且本发明中的一步法检测是反转录和扩增都在同一管中进行，没有开盖和移液操作，因此可以降低污染的风险，而且相比于两步法，可以节省工作量，提高工作效率，有利于提高检测通量，提高检测效率，辅助评价生物人工肾装置的葡萄糖重吸收能力。

附图说明

图1为实施例3中的荧光定量PCR检测扩增曲线。

图2为实施例3中琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图3为实施例4中的荧光定量PCR检测扩增曲线。

图4为实施例4中的标准曲线。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1引物探针序列设计

本实施例根据NCBI上的SGLT2和GAPDH(内参基因)基因序列，据此设计特异性引物和Taqman探针，设计特点如下：1.通过跨内含子设计引物，最大程度避免了基因组的干扰；2.引物和探针都和全转录组、全基因组进行细致对比，有效避免非特异性结合；3.引物和探针结构都进行了小心的设计，避免互相之间干扰；4.引物尽量覆盖目标基因的各种转录本，以达到最佳检测效果。

本实施例是葡萄糖转运体表达量检测，是基于Taqman探针法的荧光定量PCR检测手段，包括检测SGLT2基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示；检测GAPDH内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6所示，具体见表1。

表1引物和探针序列

实施例2检测SGLT2试剂盒的制备

本实施例制备一种试剂盒，试剂盒中配置好上下游引物和探针混合液、PCR酶混合液和MasterMix。其中上下游引物浓度为5μM，探针浓度为10μM；酶混合液中逆转录酶浓度为2000U/μL，RNase抑制剂浓度为650U/μL。MasterMix包含浓度为100mM的KCl，浓度为6mM的MgCl₂，浓度为80mM、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为0.6mM的dNTPs，浓度为0.06U/μL的热启动Taq DNA酶，以及0.2M的PCR增强剂。PCR反应体系为50μL，包括模板RNA 5μL，上下游引物和探针混合液3.5μL，PCR酶混合液15μL，MasterMix 26.5μL。

实施例3特异性检测

本实施例对实施例2中的试剂盒进行特异性检测。其中荧光定量PCR反应条件见表2。

表2荧光定量PCR反应条件

具体检测步骤：

(1)提取肾小管上皮细胞RNA

使用试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，9767)提取肾小管上皮细胞RNA，实验步骤如下：

1.倒出培养基，1×PBS清洗一次，洗去培养基；

2.加入600μL buffer BL，均匀裂解细胞；

3.将细胞裂解液转移至1.5ml离心管，移液器反复吹打，直至无明显沉淀；

4.室温裂解2min；

5.加入等体积的70％乙醇，吹打混匀；

6.立即将混合液(含RNA沉淀)转入RNA spin Column(含2ml collection tip)；

7.12000rpm离心1min，弃滤液；把RNA spin Column放回2ml collection tube；

8.向RNA spin Column加入500μL buffer RWA，12000rpm离心30s，弃滤液；

9.向RNA spin Column加入600μL buffer RWB，12000rpm离心30s，弃滤液；该步骤重复一次；

10.将RNA spin Column重新放入2ml collection tube，12000rpm离心2min，弃滤液；

11.将RNA spin Column放1.5ml RNase free collection tube上，在膜中央加入50～200μL DEPC水；

12.室温静置5min；12000rpm离心2min，洗脱RNA；

13.RNA样品放-80℃保存。

(2)荧光定量PCR检测

1.配置反应体系：PCR反应体系为50μL，在PCR管中加入模板RNA 5μL，上下游引物和探针混合液3.5μL，PCR酶混合液15μL，MasterMix 26.5μL；

2.设定反应条件：50℃30min；95℃3min；95℃15s，60℃30s，45个循环，采集荧光；

3.上PCR仪检测；PCR结果如图1所示。

(3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小

1.实验步骤如下

1.1.在三角锥瓶中加入50ml 1×TAE，加入1g琼脂糖粉；

1.2.拧松瓶盖，放微波炉中加热溶解琼脂糖。当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解；

1.3.使溶液冷却至60℃左右，在此时加入5μL 10000×StarStain Red Plus溶液，使其在凝胶中终浓度为1×，充分混匀；

1.4.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。在室温下使胶凝固(大约30min～1h)，然后放置于电泳槽中进行电泳；

1.5.上样：取10μL样品与2μL 6×上样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中；

1.6.电泳：加样结束后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在120V，电泳40min；

1.7.紫外下拍照并观察。

2.检测结果

本试剂盒设计的SGLT2和GAPDH基因PCR产物长度分别为137bp和170bp，如图2电泳结果所示，目的条带(扩增产物)大小与设计的长度一致，并且没有其他非特异性条带，说明探针和引物特异性较强，只扩增目的基因。

实施例4灵敏度检测

1.根据实施例3中的步骤(1)提取RNA；

2.配置6个梯度的模板(1/10^-1/10^-2/10^-3/10^-4/10^-5μg)：从1μg/20μl RNA模板中取0.1μg/2μl作为PCR模板，另取0.1μg/2μl，加入18μl RNase-free水，配置成10^-1μg/20μlcDNA模板，以同样方法配置10^-2/10^-3/10^-4/10^-5μg的模板；

3.荧光定量PCR检测：

配置反应体系：PCR反应体系为50μL，在PCR管中加入模板RNA 5μL，上下游引物和探针混合液3.5μL，PCR酶混合液15μL，MasterMix 26.5μL；

设定反应条件：50℃30min；95℃3min；95℃15s，60℃30s，40个循环，采集荧光；

4.上PCR仪检测。实验结果如图3和表3所示。

表3不同浓度样本的Ct值

样本(μg)	Ct(SGLT2)
		10<sup>-1</sup>	18.9
10<sup>-2</sup>	22.09
		10<sup>-3</sup>	26.1
10<sup>-4</sup>	29.52
		10<sup>-5</sup>	33.56
10<sup>-6</sup>	36.2

可以看出10pg RNA即可获得较好的扩增效果，该试剂盒最低可以从10pg RNA标本中检测SGLT2的表达。并且通过SGLT2表达量的线性回归分析(图4)可证明数据有效，SGLT2表达量与RNA模板量成线性关系。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州华越肾科再生医学科技有限公司

<120> 一种用于SGLT2荧光定量PCR的检测引物和探针及其试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcccttttcc tgtacatc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtcaccgtgt aaatcatg 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcaccaagat ctcagtggac a 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcttgtcatc aatggaaatc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagagatgat gacccttttg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcaccatct tccaggagcg ag 22

Claims

1.一种引物，包括用于扩增SGLT2的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的序列优选为：

上游引物：TCCCTTTTCCTGTACATC(SEQ ID NO.1)；

下游引物：GTCACCGTGTAAATCATG(SEQ ID NO.2)。

2.一种探针，所述探针靶向SGLT2，所述探针的序列优选为：

探针：TCACCAAGATCTCAGTGGACA(SEQ ID NO.3)。

3.一种检测试剂，包括权利要求1所述的引物和/或权利要求2所述探针。

4.一种试剂盒，包括权利要求3所述的检测试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含逆转录试剂与荧光定量PCR试剂、用于扩增内参基因的引物及探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为GAPDH，所述用于扩增内参基因的引物及探针序列优选为：

上游引物：GCTTGTCATCAATGGAAATC(SEQ ID NO.4)；

下游引物：CAGAGATGATGACCCTTTTG(SEQ ID NO.5)；

探针：ATCACCATCTTCCAGGAGCGAG(SEQ ID NO.6)。

7.权利要求1所述引物或权利要求2所述探针或权利要求3所述检测试剂或权利要求4～6任一项所述试剂盒在检测SGLT2中的应用。

8.一种检测SGLT2的方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1：提取待测样品总RNA；

S2：使用权利要求1所述引物或权利要求2所述探针或权利要求3所述检测试剂或权利要求4～6任一项所述试剂盒对待测样品进行实时荧光定量PCR构建荧光PCR反应体系进行扩增反应；

S3：收集待测样品荧光信号，对待测样品进行检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR反应体系为：RNA 5μL，引物探针混合液3.5μL，PCR酶混合液15μL，MasterMix 26.5μL。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述扩增反应的条件为：50℃30min；95℃3min；95℃15s，60℃30s，45个循环。