CN108504740B - 在非小细胞肺癌中一种特异性高表达的ucr序列、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

在非小细胞肺癌中一种特异性高表达的ucr序列、检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非小细胞肺癌检测中高表达的UCR序列、试剂盒及检测方法。本发明在系统探索非小细胞肺癌的UCR表达谱后，发现与非小细胞肺癌侵袭转移特异性相关的一组UCRs，结果筛选到一条在非小细胞肺癌组织中显著高表达的UCR，即uc.293‑。本发明通过检测非小细胞肺癌特异性相关的超保守基因序列293号，为肿瘤诊断、预后判断及治疗提供帮助。

Description

在非小细胞肺癌中一种特异性高表达的UCR序列、检测试剂盒 及检测方法
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种检测在非小细胞组织中高表达的UCR序列、试剂盒及检测方法。
背景技术
非小细胞肺癌是我国常见的恶性肿瘤，发病率与死亡率位于肿瘤前列。根据临床病理特点分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，大多数患者发现时已处于中晚期，5年生存率只有16％。非小细胞肺癌患者治疗失败的原因主要与能否早期诊断及肺癌细胞侵袭转移和复发密切有关,是非小细胞肺癌治疗失败和患者死亡的主要原因。
uc.293-是超保守基因序列(UCRs)的一员，是一类在生物进化中绝对高度保守的长链非编码RNA(LncRNA)，其基因序列在、小鼠和大鼠等高等生物中保持高度同源性。研究表明转录成RNA的UCRs发挥其特有的生物学功能，即通过调节其他RNA从而调控功能基因的表达，参与肿瘤细胞的生长发育、细胞凋亡、细胞周期及侵袭转移等生物学过程，目前正在成为肿瘤诊治和研究的新热点。截至今日己有较多的UCRs被证实在包括膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌及炎症性肠病等在内的类疾病中存在差异性表达并执行重要的调控功能。但关于非小细胞肺癌中的UCR表达及其相关指标的功能性的研究目前还未见文献报道。
发明内容
鉴于上述技术问题，本发明提供一种非小细胞肺癌检测中高表达的UCR序列、试剂盒及方法。
解决上述技术问题的技术方案是：
为了系统研究与非小细胞肺癌发生与发展密切相关的新的UCRs，由发明提供的20个非小细胞肺癌和配对的15个正常组织标本，取得新鲜标本后冻存与液氮罐中，集齐后采用上海康成生物有限公司的Arraystar Human T-UCR芯片2.0检测筛选出二条在非小细胞肺癌组织中高表达的UCR，其中uc.293-显著高表达。其基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。后期经过共132对非小细胞肺癌与配对正常组织样本qRT-PCR验证发现106对样本中该UCR表达显著上调。该UCR有望成为非小细胞肺癌诊断和预后判断的标志物，同时也为非小细胞肺癌的治疗提供了新的靶点。
本发明的目的是提供一种检测在非小细胞肺癌组织中高表达的uc.293-序列，具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了所述uc.293-序列的检测方法，根据该序列制备用于非小细胞肺癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。即探索其在制备非小细胞肺癌的药物中的应用。
本发明根据所述uc.293-序列设计了3对引物用于检测uc.293-序列。
Pair 1上游引物：SEQ ID NO.2
Pair 1下游引物：SEQ ID NO.3
Pair 2上游引物：SEQ ID NO.4
Pair 2下游引物：SEQ ID NO.5
Pair 3上游引物：SEQ ID NO.6
Pair 3下游引物：SEQ ID NO.7。
本发明根据所述uc.293-序列设计并合成出用于qRT-PCR的检测引物组。所述引物组适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针等进行检测。
优选的用于染料类qRT-PCR检测的引物组分别为：
Pair 2上游引物：SEQ ID NO.4
Pair 2下游引物：SEQ ID NO.5。
本发明提供了一种检测UCR表达水平的染料类qRT-PCR试剂盒，组分如下：特异性上游引物引物序列、特异性下游引物引物序列、DNA模板、荧光染料、qRT-PCR反应液，其中所述的特异性上游引物和下游引物包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
所述qRT-PCR反应液包括buffer缓冲液、Taq酶、Mg2+及dNTP。
对于荧光染料优选SYBR GreenⅡ，Taq酶优选热启动酶。
本发明还公开了一种非小细胞肺癌中UCR的检测方法，包括样品总RNA的提取、样品cDNA的制备、uc.293-的扩增。具体内容如下：
1)样品总RNA的提取：按照ThermoFisher Scientific公司的TRIZOL⑧试剂(货号15596018)所需试剂及步骤提取非小细胞肺癌组织或肿瘤的总RNA；再用NanoDrop ND 1000微量紫外可见分光光度计定量(NanoDrop Technologies,Wilmington,Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度。
2)样品cDNA的制备：采用TaKaRa试剂盒PrimeScript First Strand cDNAsynthesis(货号6110A)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
反应体系及条件如下：
试剂 使用量
Template RNA/Primer Mixture 2.0μl
Total RNA 1.0μg
RNase Free dH<sub>2</sub>0 Up to 20μl
总体积 20μl
将上述组份混合均匀后37℃15分钟后85℃5秒，即得到cDNA。
3)uc.293-的扩增：使用Takara公司的PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR。以反转录的cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。
反应体系及条件如下：
Figure BDA0001670165370000031
qRT-PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃5s,60℃45s。
通过对阳性样品的检测，发现本发明染料类荧光定量试剂盒检测准确率均在82％-87％以上，连续10次重复实验，实验结果稳定。
本发明还针对uc.293-序列设计并合成其特异性RNA干扰序列：siRNA1(SEQ IDNO.8)、siRNA2(SEQ ID NO.9)，所述干扰序列能显著敲低肿瘤细胞中uc.293-的表达水平(图8)，并且可导致肿瘤细胞的侵袭能力较之前明显减弱(图9)。
本发明的有益效果：
1、为系统探索非小细胞肺癌的UCR表达谱后，发现与非小细胞肺癌发生发展特异性相关的一组UCRs，本发明采用长链非编码RNA-UCR芯片技术筛选到一条在非小细胞肺癌组织中显著高表达的UCRs，比对UCR基因组数据库发现uc.293-位于于类染色体10号染色体反义链102,505,468-102,589,698碱基之间，基因全长约为84230。
2、与配对正常组织相比，该UCRs在非小细胞肺癌组织中显著高表达，并在后期的大样本组织实时qRT-PCR实验中进一步证实uc.293-在非小细胞肺癌组织中的表达，显著高于配对正常组织。
3、本发明涉及的检测uc.293-表达水平的qRT-PCR试剂盒。该qRT-PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
4、本发明重点关注了非小细胞肺癌组织的UCR表达谱，这一类新型的基因调控因子将有望进一步丰富和完善包括非小细胞肺癌在内的肿瘤发病机制的研究，也为发现肿瘤诊断及预后判断的标志物、新的肿瘤治疗靶点带来希望。
附图说明
图1.UCR芯片图示
显示uc.293-在3例非小细胞肺癌组织中表达升高(对照组为3例)，差异表达倍数达到近6倍，浅色代表表达下降，深色代表表达升高；
图1A，结果显示：在3例非小细胞肺癌组织和3例癌旁正常肺组织中，LncRNA和mRNA的表达谱截然不同，绿色代表表达下降，红色代表表达升高(图1)；
图1B，LncRNA(UCRs)芯片结果原始数据显示uc.283、uc.293-在3例非小细胞肺癌组织中表达上调；其中uc.293-差异表达倍数达5.71倍。
图2.特异性引物筛选结果图
针对uc.293-的序列设计的3对特异性引物PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳测试引物的效果。
图3.第一批40例非小细胞肺癌临床样本的uc.293-初步qRT-PCR检测结果(2-△Ct作图)。
图4.第二批80例非小细胞肺癌临床样本的uc.293-再验证qRT-PCR检测结果(2-△Ct作图)。
图5.两批共120例样本uc.293-在癌与癌旁组织差异表达qRT-PCR检测统分析
(2-△△Ct值比较，*p＜0.05，**p＜0.01)。
图6.qRT-PCR检测uc.293-的表达与患者临床分期的相关性分析(2-△△Ct值比较，*p＜0.05，**p＜0.01)。
图7.uc.293-表达与非小细胞肺癌淋巴结转移的相关性分析(2-△△Ct值比较，*p＜0.05，**p＜0.01)。
图8.qRT-PCR检测siRNA敲降uc.293-的效率。
图9.Transwell实验检测siRNA敲降uc.293-后肿瘤细胞的侵袭能力。
图10.裸鼠荷瘤实验检测siRNA敲降uc.293-后肿瘤细胞的生长能力图(uc.293-敲低组和对照组裸鼠移植瘤生长曲线图和裸鼠移植瘤组织)。
图11.图10对应的实物对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1非小细胞肺癌组织与配对正常组织的UCR芯片差异表达分析
一、材料和方法
1、材料
组织样本来自于20例非小细胞肺癌患者(编号为1-20)的住院病例手术切除样本，其中15对是配对的非小细胞肺癌组织和肿瘤旁正常组织。
2、方法
2. 1肿瘤组织和配对正常组织总RNA的提取
萃取非小细胞肺癌病肿瘤组织和配对正常组织的总RNA按Qiagen公司的RNA提取试剂盒(RNeasy Micro Kit，#74004)说明书步骤操作，该试剂盒内含RNase-Free DNase I(lyophilized)，可有效去除基因组中DNA。再用NanoDrop ND 1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies,Wilmington,Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度。
2. 2对样品RNA进行荧光标记(
Figure BDA0001670165370000051
cRNA扩增标记试剂盒，产品目录号：360060-10)。
2.2. 1反转录合成第一链cDNA
以Total RNA为起始，含有T7启动子序列的T70ligo(dT)Primer为引物，使用CbcScript酶合成第一链cDNA。
2.2. 2合成2nd strand cDNA
用RNase H将杂合链中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段为引物延伸，合成2nd strand cDNA，并纯化双链cDNA。
2.2. 3体外转录合成cRNA
以cDNA为模板，利用T7Enzyme Mix合成cRNA；然后用RNA Clean-up K it(MN)纯化。
2.2. 4随机引物反转录
取5ug cRNA，用CbcScr ipt II酶，Random Prime进行反转录，反转录产物用PCRNucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化。
2.2. 5cDNA用KLENOW酶标记
取上述反转录产物，以Random Primer为引物进行KLENOW酶标记，标记产物用PCRNucleoSp inExtract II Kit(MN)纯化，纯化后抽干。(Cy5-dCTP or Cy 3-dCTP(GEHealthcare)。
2. 3杂交与清洗
标记的DNA溶于杂交液中(2×GEx Hyb Buf f er(HI-RPM),25％甲酰胺)，于45℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS,2×SSC的液体中洗5min，而后在0.2×SSC中室温洗5min。玻片甩干后即可用于扫描。
2. 4芯片扫描
芯片用lncRNA-TUCR Scanner进行扫抽，得到杂交图片。
2. 5芯片图像的采集和数据分析
采用Feature Extraction图像分析软件和GeneSpr ing GX软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号,进行差异基因筛选。
二、结果
关于非小细胞肺癌的TUCR芯片差异基因筛选示图见图1。芯片筛查发现多条表达上调和表达下调的TUCR，其中uc.293-显示出在肿瘤组织中表达显著上调，鉴于其可能在非小细胞肺癌组织中存在特异性表达，本发明通过以下实施例采用大规模样本分批次进行指标的重复验证。
实施例2实时荧光定量qRT-PCR初步验证uc.293-在非小细胞肺癌组织和配对癌旁正常组织中的差异表达
一、实验材料
再选取其他40对(编号为21-60)非小细胞肺癌组织和配对癌旁正常组织，对uc.293-的表达差异进行qRT-PCR第一次实例验证。
二、实验方法和结果
1、引物特异性筛选和鉴定
根据uc.293-基因位点从UCSC Genome Brower数据库提取uc.293-相关的转录本基因序列，并用根据Primer 5引物设计软件对uc.293-设计引物；
(1)设计后的引物用Oligo7评价，得到3对设计的引物序列；
第一对：上游引物SEQ ID NO.2
下游引物SEQ ID NO.3
第二对：上游引物SEQ ID NO.4
下游引物SEQ ID NO.5
第三对：上游引物SEQ ID NO.6
下游引物SEQ ID NO.7。
经普通PCR及琼脂糖凝胶电泳实验验证，筛选用于染料类qRT-PCR检测的引物组如下(图2):
第二对上游引物：SEQ ID NO.4
下游引物：SEQ ID NO.5。
(2)将非小细胞肺癌组织与配对癌旁正常组织按照ThermoFisher Scientific公司的TRIZOL⑧试剂(货号15596018)所需试剂及步骤提取非小细胞肺癌组织或肿瘤的总RNA；再用NanoDrop ND 1000微量紫外可见分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度。
(3)样品cDNA的制备：采用TaKaRa试剂盒PrimeScript First StrandcDNAsynthesis(货号6110A)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
反应体系及条件如下：
试剂 使用量
Template RNA/Primer Mixture 2.0μl
Total RNA 0.5μg
RNase Free dH20 Up to 20μl
总体积 20μl
将上述组份混合均匀后37℃15分钟后85℃5秒，即得到cDNA。
以合成的cDNA为模板，分别针对3对引物设定反应组以及不加cDNA模板的阴性对照组，以除外引物二聚体可能，再按步骤(2)设计的引物进行PCR反应；
(4)电泳检测，选用Marker DL1000(TaKaRa)。根据电泳检测结果选取特定qRT-PCR的引物，其选取标准如下：a.扩增片段大小与预期相同；b.扩增产物只有一个，以明确扩增产物的特异性。结果得出在三对引物中最佳引物对为第二对引物(图2)，上游和下游的特异性引物序列，其序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
2、40例样品总RNA的提取：
采用液氮研磨法，按照ThermoFisher Scientific公司的
Figure BDA0001670165370000082
试剂(货号15596018)所需试剂及步骤提取非小细胞肺癌组织或肿瘤的总RNA。主要操作步骤如下：
(1)样品在离体后迅速冷冻在液氮中，抽提RNA时把组织放入己预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥发干。
(2)组织样品研磨粉末状后，在液氨基本挥发时，每个研钵中加入1.5ml TRIZOL试剂，混合后把含有TRIZOL混合液转移到2ml的离心管中，室温8min。
(3)加200ul的氯仿，用手剧烈摇动30秒，室温8分钟，4℃离心，12000g×5min。
(4)将上清600ul转到新离心管，加入0.5ul异丙醇，室温沉淀8分钟，4℃离心，12000g×5min。
(5)弃上清，用小枪头吸取多余的上清，加1ml75％乙醇清洗RNA，振荡片刻后，12000g×5分钟，小心弃上清。
(6))室温静置5-15min，使RNA沉淀干燥，加入20ul DEPC水溶解。
(7)使用分光光度计RNA浓度后。部分使用或置于液氮中长期保存。
3、取上述40对非小细胞肺癌组织和配对癌旁正常组织的总RNA，采用按照ThermoFisher Scientific公司的
Figure BDA0001670165370000083
试剂(货号15596018)所需试剂及步骤提取非小细胞肺癌组织或肿瘤的总RNA；再用NanoDrop ND 1000微量紫外可见分光光度计定量(NanoDrop Technologies,Wilmington,Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度。
(1)样品cDNA的制备：采用TaKaRa试剂盒PrimeScript First StrandcDNAsynthesis(货号6110A)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
反应体系及条件如下：
Figure BDA0001670165370000081
Figure BDA0001670165370000091
将上述组份混合均匀后37℃15分钟后85℃5秒，即得到cDNA。
(2)uc.293-的扩增：使用Takara公司的PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR。，以反转录的cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。
反应体系及条件如下：
Figure BDA0001670165370000092
qRT-PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃5s,60℃45s。
根据qRT-PCR的相对运量公式：2-△Ct，分别计算出uc.293-在非小细胞肺癌患者肿瘤组织(T)和配对正常组织(N)中的表达水平，比较结果如图3所示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中uc.293-在配对正常组织中的表达水平主要集中在0.000-0.001之间，而肿瘤组织中的uc.293-的表达量主要集中在0.002-0.150之间，明显高于配对正常组织，以上结果说明该指标在肿瘤组织中普遍高表达。再按照相对表达量T-N>0定义为该指标表达上调；T N<0定义为该指标表达下调。则本次实验结果显示：uc.293-在40例非小细胞肺癌与配对正常组织中上调表达32例，再按照公式：上调表达例数/总检测例数x100％定义该指标的阳性检出率，则该指标的阳性率为80％。
实施例3qRT-PCR进一步验证uc.293-在非小细胞肺癌的肿瘤组织和配对正常组织中的差异表达
1、qRT-PCR试剂盒组成
1.1染料类uc.293-PCR试剂盒组成：
(1)上游引物：SEQ ID NO.4
(2)下游引物：SEQ ID NO.5；
其他试剂参照SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)荧光定量试剂盒(Code No.RR820A)。
2.uc.293-的检测
2.1总RNA的制备
选取另外80对非小细胞肺癌病(编号为61-130)的肿瘤组织和配对正常组织，按照ThermoFisher Scientific公司的
Figure BDA0001670165370000101
试剂(货号15596018)所需试剂及步骤提取总RNA,具体参见说明书。再用NanoDrop ND 1000微量紫外可见分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度。
2.2cDNA合成
采用TaKaRa试剂盒PrimeScript First Strand cDNA synthesis(货号6110A)对上述萃取的总RNA进行逆转录反应。
2.3qRT-PCR检测
qRT-PCR的仪器采用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR system(AppliedBiosystems；Thermo Fisher Scientific,Inc.)；qRT-PCR反应程序如实施例二中荧光染料类qRT-PCR检测uc.293-表达量。
3检测结果
结果显示：选取80对非小细胞肺癌病(编号为61-130)的肿瘤组织与配对正常组织扩大样本量验证，qRT-PCR检测出57对样本中该指标在非小细胞肺癌组织中表达上调，检测阳性率达到71.3％(图4)。以上结果再次证明该指标在肿瘤组织中普遍高表达。我们对上述样本进行重复3次qRT-PCR检验，结果重复性达100％，表明本发明试剂盒的重复性和稳定性较好。
实施例四uc.293-在非小细胞肺癌诊断和预后判断的潜在价值分析
在检测了uc.293-在非小细胞肺癌中高表达的基础上，结合患者的临床病理资料，进一步分析了uc.293-的表达情况与不同病理及临床分期之间的相关性(具体参照American Joint Committee on Cancer criteria标准)，探讨了uc.293-在非小细胞肺癌中与疾病的诊断，包括其表达与临床/病理分期的关系、预后判断、治疗方案的选择等方面所具有的潜在价值。
使用SPSS 16.0software package(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)统计软件对uc.293-的RNA表达与非小细胞肺癌临床病理参数的相关性进行统计学处理，相关数据经过T-test或χ2检验和数据分析，P<0.05认为该指标的差异表达有统计学意义。统计结果表明在130对非小细胞肺癌样本中uc.293-的RNA表达水平显著高于配对正常组织(图5,P<0.01)；uc.293-的表达与淋巴结转移密切相关(图7)：淋巴结转移组显著高于非淋巴结转移组患者(P<0.05)；uc.293-的表达与临床分期高度相关(图6)：III-Ⅳ期非小细胞肺癌患者中uc.293-的表达，显著高于I-II期患者(P<0.05)。
在检测了uc.293-在非小细胞肺癌组织中高表达的基础上，设计干扰RNA(siRNA)序列后，由LifeTechnology公司合成的干扰RNA(siRNA):siRNA1(SEQ ID NO.8)、siRNA2(SEQ ID NO.9)，在非小细胞肺癌细胞株A549中可显著敲降该指标的表达水平(图9)，肿瘤细胞的侵袭能力较之前明显减弱(图9)。在裸鼠体内移植瘤实验中，将含有uc.293--siRNA1的非小细胞肺癌细胞株DOHH2和对照组注射到裸鼠背部皮下荷瘤生长，结果表达敲低uc.293-表达后可抑制移植瘤的生长(图10及图11)。
总之，在非小细胞肺癌组织中显著高表达并具有调控肿瘤细胞生长和转移能力的指标，有望成为参与辅助非小细胞肺癌诊断、治疗及预后评估相关的生物标志物，具有十分重要的临床应用价值。随着后期进一步逐步阐明uc.293-在非小细胞肺癌中调控肿瘤细胞生长和转移功能的作用机制，uc.293-不仅能成为诊断及预后判断相关的生物标志物，更有望成为新的非小细胞肺癌治疗靶点以改善、提高临床非小细胞肺癌治疗效果。
序列表
<110> 扬州大学附属医院
<120> 在非小细胞肺癌中一种特异性高表达的UCR序列、检测试剂盒及检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 243
<212> DNA
<213> Human ultraconserved region 293-
<400> 3
cggagagagg tggctggcga ggtaatggca ttttgctctc tttaaacttt aatctttcct 60
attaattccc tgcaactgga gaatgtgtga gagttaatgt tccgtgaacg tgtttcgcac 120
tcggcagtct cttcgagcta attaccttca ggtgctaaat ggagggaaat tgcaatccat 180
ttggatgtga aaaaatttcg ccttcccgtc ccctgtgaga catccttttt cctgagtgct 240
gca 243
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 3
ctggcgaggt aatggcattt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 3
ctcacacatt ctccagttgc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 4
ggcgaggtaa tggcattttg ct 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 5
cgaagagact gccgagtgcg aa 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 6
gcaactggag aatgtgtgag 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 8
ccatttagca cctgaaggt 19
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列( )
<400> 8
cuggagaaug ugugagaguu aa 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列( )
<400> 9
uugcaaucca uuuggaugug aa 22

Claims (4)

1.一种检测UCR表达水平的特异性引物在制备检测非小细胞肺癌辅助诊断或疗效预测试剂盒中的应用，其特征在于，
UCR核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
所述特异性引物包括3对，分别为：
Pair 1 上游引物 ：SEQ ID NO. 2
Pair 1 下游引物 ：SEQ ID NO. 3
Pair 2 上游引物 ：SEQ ID NO. 4
Pair 2 下游引物 ：SEQ ID NO. 5
Pair 3 上游引物 ：SEQ ID NO. 6
Pair 3 下游引物 ：SEQ ID NO. 7。
2.根据权利要求1所述的一种检测UCR表达水平的特异性引物在制备检测非小细胞肺癌辅助诊断或疗效预测试剂盒中的应用，其特征在于，所述特异性引物为序列表SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求1所述的一种检测UCR表达水平的特异性引物在制备检测非小细胞肺癌辅助诊断或疗效预测试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA模板、荧光染料、qRT-PCR反应液，所述qRT-PCR反应液包括buffer缓冲液、Taq酶、Mg2+及dNTP。
4.根据权利要求3所述的一种检测UCR表达水平的特异性引物在制备检测非小细胞肺癌辅助诊断或疗效预测试剂盒中的应用，其特征在于，所述荧光染料为SYBR GreenⅡ，Taq酶为热启动酶。
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