CN104001156A

CN104001156A - 真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在治疗肝损伤中的应用

Info

Publication number: CN104001156A
Application number: CN201410213992.6A
Authority: CN
Inventors: 刘殿武; 李曼; 王剑; 员美娜; 刘志鹏; 王佳; 梁晨
Original assignee: Hebei Medical University
Current assignee: Hebei Yihe medical laboratory Co., Ltd
Priority date: 2014-05-20
Filing date: 2014-05-20
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2034-05-20
Also published as: CN104001156B

Abstract

本发明公开了一种真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在治疗肝损伤中的应用。本发明公开了真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备预防和/或治疗肝损伤的产品中的应用。eRF3b片段（eRF3b-36）对Con A诱导的急性肝炎具有良好的预防和治疗效果。另外，在对脂肪肝的治疗研究中,eRF3b片段（eRF3b-36）中剂量组无论从血清学指标还是从肝组织病理都对肝脏起到了很好的保护效果，不仅能够显著降低血清ALT、AST、CHOL、TG、TBIL水平，而且还能减少肝组织游离脂肪的含量。因此，本发明为临床肝病的治疗提供了新的可能的方向和具体措施。

Description

真核肽链释放因子3b片段(eRF3b-36)在治疗肝损伤中的应用

技术领域

本发明涉及一种真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在治疗肝损伤中的应用，属于生物制药领域。

背景技术

肝脏疾病是一类重要的公共卫生问题，很多原因如病毒、化学物质、药物、酒精、遗传因素或自身免疫系统等均可导致肝脏发生病变，长期肝损伤将最终发展为肝衰竭。虽然肝病的发生是由多种不同的病原和复杂的发病机制导致，但最近研究表明免疫系统在大多数病因致病过程中发挥关键作用。静脉注射Con A诱导的急性肝损伤（急性免疫性肝损伤）是一个理想的模拟人类病毒性和自身免疫性肝炎病理生理学的动物模型，用来研究人类T细胞介导的肝脏疾病。Con A所诱导肝炎的特征性表现为：血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平显著升高，同时伴随着T淋巴细胞、自然杀伤T淋巴细胞、库普弗细胞和嗜酸性粒细胞的浸润，以及肝组织出现大量的凋亡和坏死。

在我室早期利用弱阳离子磁珠纯化和基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱分析寻找肝硬化和肝癌潜在的早期血清生物学标志物的过程中，分离得到一个4210Da的多肽，其在慢性肝炎病人血清中表达水平较高，而在肝硬化和肝癌病人血清中表达水平较低，后经鉴定为真核肽链释放因子3b(eRF3b)的一个36个氨基酸片段。

真核肽链释放因子eRF3b片段（eRF3b-36）的分子量为4209.79Da，等电点4.23，氨基酸序列为NH2-Glu-Gln-Ser-Asp-Phe-Cys-Pro-Trp-Tyr-Thr-Gly-

Leu-Pro-Phe-Ile-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asn-Leu-Pro-Asn-Phe-Asn-Arg-Ser-Ile-Asp-Gly-Pro-Ile-Arg-Leu-Pro-Ile-CooH。

在真核生物中，完整的蛋白质合成需要两个释放因子，即eRF1和eRF3。在哺乳动物中，两种不同的基因分别编码eRF3，即GSPT1编码eRF3a，GSPT2编码eRF3b，他们之间有87%基因序列是相同的，仅在N末端有差别。在体外两种蛋白均与eRF1相互作用，并刺激eRF1的分泌活性，这表明两种蛋白在翻译终止过程中均发挥作用，也有研究表明eRF3参与细胞周期的转相和肿瘤形成。目前对于eRF3b主要是在细胞水平上研究其在蛋白表达和细胞周期转相过程中的作用，尚无其在整体动物模型中作用的报道。因此，探索eRF3b对Con A所致肝损伤的作用，并在整体水平上初步研究其作用机制，可以为下一步临床肝炎的治疗提供实验依据。

地塞米松是糖皮质家族中重要的成员，具有抗炎及免疫调节等作用，在临床上广泛用来治疗炎症和自身免疫性疾病。在细胞质中，地塞米松与糖皮质激素受体相互作用，组成配体受体复合物后进入细胞核中，复合物与基因组DNA结合，在转录水平调节抗炎和促炎基因的表达。作为治疗重症肝病的常用药，本研究中将地塞米松作为阳性对照药物使用，以对比观察eRF3b片段对肝损伤的治疗效果及研究结果的可信度。

中华预防医学会2007年公布的肝衰竭治疗指南中，关于肝衰竭的治疗有三种方案：一是内科综合治疗，但目前尚无特效的治疗药物和手段，主要是采用一般支持治疗和针对病因的治疗；二是人工肝支持治疗；三是肝移植治疗。由于人工肝治疗所需费用较高，且存在并发症，而肝移植中要找到合适配型的肝源有十分困难。因此，急需寻找经济、有效且副作用小的急性肝病及肝衰竭的治疗药物和治疗方法。

随着现代人们生活饮食结构的变化，被称为现代“富贵病”的脂肪性肝病（也称脂肪肝）的发病率明显提高，已经成为仅次于病毒性肝炎的第二大高发性肝病，严重威胁着人类健康。脂肪性肝病可由多种诱因引起，病变主要位于肝小叶，是常见的弥漫性肝病之一，以肝细胞内甘油三酯（TG）过量蓄积和弥漫性肝细胞脂肪变性为主要病理特征，可进展为肝纤维化、肝硬化及肝功能衰竭，因此对该病的早期诊断及治疗非常重要。非酒精性脂肪肝的治疗分为非药物治疗和药物治疗，前者仅适用于轻度脂肪肝患者，包括体育锻炼、减轻体重、控制饮食、去除病因等手段。脂肪肝患者血中的胆固醇和甘油三酯水平又往往与膳食中胆固醇和脂肪摄入量密切相关，低热能、低脂、高膳食纤维的平衡膳食可以改善血脂代谢，降低肝脏脂肪的蓄积，并可将肠道中过多的脂肪、毒素等排出体外，从而起到降脂作用；节制饮食可有效降低体重，并能改善肝功能，促进肿大的肝脏回缩及肝内脂肪减少。有效合理的运动，可减少体内脂肪，减轻体重；促进脂肪组织分解，降低血脂，减少内脏脂肪的沉积，从而起到防治脂肪肝的目的。然而，中重度脂肪肝患者无法通过非药物疗法有效清除肝脏脂肪，化学药物治疗主是通过二甲双胍和噻唑烷二酮等胰岛素受体激动剂（胰岛素增敏剂）、奥利司他和西布曲明等减肥药、他汀类和贝特类降血脂药物、维生素E、维生素C等抗氧化剂、肝细胞保护剂和利胆保肝药、细胞因子抑制剂以及CYP抑制剂等药物进行治疗。但是，大多数降脂药物对肝内脂肪消除作用有限，许多降脂药可导致不同程度肝细胞损伤，因此降脂药在脂肪肝治疗中的作用和地位尚有争论。

发明内容

本发明的目的是提供一种真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在治疗肝损伤中的应用，真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）可以显著降低Con A诱导的急性肝损伤中血清ALT、AST水平，抑制肝细胞坏死和/凋亡，可显著提高急性肝损伤小鼠的生存率并延长生存时间，抑制肝损伤中淋巴细胞向肝细胞浸润；在慢性肝损伤中，不仅能够显著降低血清ALT、AST、CHOL、TG、TBIL水平，而且能抑制肝细胞脂肪变性和脂肪含量上升。

本发明提供真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备预防和/或治疗肝损伤的产品中的应用。

上述应用中，所述肝损伤为急性肝损伤或慢性肝损伤；

所述急性肝损伤具体为急性免疫性肝损伤；

所述慢性肝损伤具体为脂肪肝。

真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝损伤时血清中谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶水平上升的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝损伤中肝细胞坏死和/或凋亡的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝损伤中淋巴细胞向肝组织浸润的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的应用中，所述肝损伤为急性肝损伤；

所述急性肝损伤具体为急性免疫性肝损伤。

真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝损伤时血清中谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶和/或血清总胆红素和/或血清总胆固醇和/或血清甘油三酯水平上升的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述肝损伤为慢性肝损伤；

所述慢性肝损伤具体为脂肪肝。

真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝细胞脂肪变性的产品中的应用也属于本发明的保护范围；

或，

真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝组织中游离脂肪的含量上升的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的应用中，所述真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

eRF3b片段（eRF3b-36）对Con A诱导的急性肝炎具有良好的预防和治疗效果，其作用机制可能与抑制肝细胞的凋亡，影响肝细胞周期有关，与地塞米松激素治疗肝炎相比，eRF3b片段（eRF3b-36）治疗在保证治疗效果的前提下，具有长期使用毒副作用小的特点。另外，在脂肪肝的治疗研究中，eRF3b片段（eRF3b-36）中剂量组无论从血清学指标还是从肝组织病理方面都对肝脏起到了很好的保护效果，而且还能减少肝组织游离脂肪的含量。因此，本发明为临床肝病的治疗提供了新的可能的方向和具体措施。

附图说明

图1急性肝损伤预防实验中给予Con A刺激后12h小鼠血清ALT和AST水平的测定结果。

图2急性肝损伤预防实验中给予Con A刺激后12h小鼠肝组织HE染色结果。

图3急性肝损伤预防实验中给予Con A刺激后12h肝细实质胞凋亡测定。

图4急性肝损伤预防实验中各组小鼠注射Con A后72h之内的生存率。

图5急性肝损伤治疗实验中给予Con A刺激后12h小鼠血清ALT和AST水平的测定结果。

图6急性肝损伤治疗实验中给予Con A刺激后12h小鼠肝组织HE染色结果。

图7急性肝损伤治疗实验中各组小鼠注射Con A后72h之内的生存率。

图8脂肪肝各组大鼠的血清ALT检测结果。

图9脂肪肝各组大鼠的血清AST检测结果。

图10脂肪肝各组大鼠的血清TBIL检测结果。

图11脂肪肝各组大鼠的血清CHOL检测结果。

图12脂肪肝各组大鼠的血清TG检测结果。

图13脂肪肝组织的HE染色结果。

图14脂肪肝组织冰冻切片的苏丹染色结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的实验结果采用SPSS13.0进行统计学分析。数据用均数±标准差表示，多组均数的比较，若满足方差分析条件的则进行单因素方差分析，若不满足方差分析则进行秩和检验，均采用SNK法进行组间两两比较。生存率采用Log rank生存分析进行比较。P<0.05差异具有统计学意义。

人eRF3b片段（eRF3b-36）由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，共36个氨基酸，序列如SEQ ID No.1所示，为：

NH2-Glu-Gln-Ser-Asp-Phe-Cys-Pro-Trp-Tyr-Thr-Gly-Leu-Pro-Phe-Ile-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asn-Leu-Pro-Asn-Phe-Asn-Arg-Ser-Ile-Asp-Gly-Pro-Ile-Arg-Leu-Pro-Ile-CooH，浓度为95%，每管2mg分装。

IV型刀豆蛋白A（Con A）购自美国Sigma公司。

地塞米松注射液购自石药集团欧意药业有限公司。

0.9%生理盐水购自石家庄四药有限公司。

小鼠淋巴细胞分离液购自北京索来宝科技有限公司

胰酶购自北京索莱宝科技有限公司。

胎牛血清购自美国Hyclone公司。

FITC标记抗小鼠CD3e抗体、PE标记抗小鼠DX5抗体购自美国BD公司。

Con A注射液：

Con A冻干粉 100mg

无菌生理盐水 5ml

用枪头反复吹打直至Con A冻干粉完全溶解，按照每管1ml分装在1.5ml EP管中，-20℃保存。使用前用无菌生理盐水稀释给药。

实施例1中的eRF3b注射液（人eRF3b片段（eRF3b-36）溶液）：

人eRF3b片段（eRF3b-36）冻干粉 2mg

无菌生理盐水 1ml

用枪头反复吹打直至冻干粉完全溶解，分装为每管100ul，-20℃保存。使用前根据实验需要用无菌生理盐水进行稀释给药。

4%多聚甲醛溶液的配制：

将上述组分在50℃条件下，充分搅拌，直至完全溶解，调pH=7.4，加双蒸水定容至1L。

雄性Balb/c近交系小鼠（6-8周龄）购自河北医科大学实验动物中心。

雄性SD大鼠(180-200g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

PI染液的配制:生理盐水129.6ml、PI10mg、RNase2mg、体积百分含量1.0%Triton X-1000.5ml、枸橼酸钠200mg、加蒸馏水定容至200ml,调pH至7.2～7.6,置4℃冰箱中避光保存备用。

复方甘草酸苷购自西安利君制药有限责任公司。

降脂通络软胶囊购自神威药业集团有限公司。

橄榄油购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

胆酸钠购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

胆固醇购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

甲基硫氧嘧啶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

高脂饲料：猪油15%，总胆固醇（Tc）2.8%，甲基硫氧嘧啶0.28%，胆酸钠0.7%，普通饲料81.2%，%代表质量百分含量。

普通饲料购自河北医科大学实验动物中心。

实施例2中的eRF3b注射液：

人eRF3b片段（eRF3b-36）冻干粉 5mg

无菌生理盐水 2ml

用枪头反复吹打直至冻干粉完全溶解后，-20℃保存。按照每管500μl分装在1.5mlEP管中，使用前用无菌生理盐水稀释至给药浓度。

实施例1中Con A所诱导的急性肝损伤为急性免疫性肝损伤。

下述实施例中的生理盐水均为无菌生理盐水。

实施例1、人eRF3b片段（eRF3b-36）在治疗急性肝损伤中的应用

一、预防作用实验

（一）实验分组

将56只雄性Balb/c近交系小鼠（6-8周龄）随机分为7组，即正常对照组、ConA模型组、地塞米松阳性对照组、eRF3b-361组、eRF3b-362组、eRF3b-363组和eRF3b-364组，每组8只。

（二）对各组小鼠进行如下处理：

正常对照组：通过尾静脉分别在相应给药时间点给予生理盐水（每次给药体积为每只小鼠0.25ml）。

Con A模型组：通过尾静脉先给予生理盐水（约12.5ml/kg），1小时后用Con A注射液（Con A12mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤。

地塞米松阳性对照组：通过尾静脉先给予地塞米松注射液（地塞米松500μg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml），1小时后用Con A注射液（Con A12mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤。

eRF3b-361组：通过尾静脉先给予eRF3b注射液（eRF3b-3675μg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml），1小时后用Con A注射液（Con A12mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤。

eRF3b-362组：通过尾静脉先给予eRF3b注射液（eRF3b-36150μg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml），1小时后用Con A注射液（Con A12mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤。

eRF3b-363组：通过尾静脉先给予eRF3b注射液（eRF3b-36300μg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml），1小时后用Con A注射液（Con A12mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤。

eRF3b-364组：通过尾静脉先给予eRF3b注射液（eRF3b-36600μg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml），1小时后用Con A注射液（Con A12mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤。

以上七组在Con A注射12小时后处死小鼠，收集血液测定转氨酶，收集肝脏组进行石蜡包埋并做HE染色，分离肝细胞检查细胞周期和凋亡情况，分离肝组织浸润的淋巴细胞检测T细胞、NK细胞及NKT细胞浸润情况。

（三）小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平的测定

血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平是衡量肝功能的指标。

（1）Con A注射12小时后处死小鼠，迅速打开腹腔、胸腔，用注射器在心内抽取小鼠血液；

（2）将获得的血液样本置于1.5ml无菌EP管中（不加抗凝剂），置于37℃温育1小时，后在4℃冰箱中放置0.5小时以上；

（3）将放置后血液3000g,4℃离心15分钟；

（4）小心吸取上层血清至另一无菌EP管中；

（5）将吸取的血清用无菌生理盐水稀释四倍后，采用丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂盒和门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒（均购自北京九强生物技术有限公司）测定小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平。

给予Con A刺激后12h小鼠血清ALT和AST水平的测定结果如图1所示。

图1中，*代表P<0.05，**代表P<0.01，表示与Con A模型组相比；★★代表P<0.01，表示与eRF3b-361组相比。

图1A为给予Con A刺激后12h小鼠血清ALT水平的测定结果。

图1B为给予Con A刺激后12h小鼠血清AST水平的测定结果。

图1表明，eRF3b-361组、eRF3b-362组、eRF3b-363组、eRF3b-364组、地塞米松阳性对照组及正常对照组血清ALT（分别为151±24.07,85.25±45,82.5±20.94，76.25±32.5,52±6.05，46.25±10.44）和AST（分别为198.25±38.09，174.5±46.74，185.75±34.1,178±26.88,173.5±57.65,115.75±11.63）水平均显著低于Con A模型组的ALT和AST水平（407±203.85,528±208.19,P<0.01）。地塞米松阳性对照组血清ALT水平与正常对照组无明显差异（P>0.05）；四个eRF3b剂量组（eRF3b-361组、eRF3b-362组、eRF3b-363组、eRF3b-364组）的血清AST水平与地塞米松阳性对照组均无明显差异（P>0.05）；eRF3b-362组、eRF3b-363组、eRF3b-364组的血清ALT水平显著低于eRF3b-361组（P<0.01），提示ALT的降低与外源性给予人eRF3b片段（eRF3b-36）的量可能存在剂量反应关系。

(四)肝组织石蜡包埋及HE染色

（1）Con A注射12小时后处死小鼠，迅速打开腹腔、胸腔；

（2）左心室进针，然后用剪刀剪开右心耳处，用无菌生理盐水缓慢灌流，直至肝脏变为灰白色；

（3）肝组织分离：切取相同位置适当大小的肝组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定24小时以上；

（4）包埋：固定好的肝组织经70%乙醇水溶液30分钟、80%乙醇水溶液30分钟、90%水溶液乙醇30分钟两次、95%乙醇水溶液30分钟两次、100%乙醇水溶液30分钟两次、二甲苯透明30分钟两次、55℃石蜡中30分钟两次、用铜制模具包埋组织块；

（5）切片：将包埋好的组织蜡块切成厚度为5um的组织切片，附于载玻片上，60℃烘烤过夜；

（6）脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中5分钟两次、100%乙醇5分钟两次、95%乙醇水溶液5分钟两次、90%乙醇水溶液5分钟两次、85%乙醇水溶液5分钟两次、75%乙醇水溶液5分钟两次、自来水冲洗、PBS洗两次；

（7）染色：将脱蜡完毕的切片浸于苏木精染色5分钟、自来水冲洗3分钟、1%盐酸酒精30秒、自来水冲洗3分钟、1%氨水30秒、自来水冲洗4分钟、伊红染色1分钟、充分水洗；

（8）脱水、封片：将染色完毕的切片经70%乙醇水溶液5分钟、80%乙醇水溶液5分钟、90%乙醇水溶液5分钟两次、95%乙醇水溶液5分钟两次、100%乙醇水溶液5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片。

上述实验中%均代表体积百分含量。

给予Con A刺激后12h小鼠肝组织石蜡包埋及HE染色结果如图2所示。

图2中，箭头指示的为坏死区。

图2表明，正常对照组小鼠肝组织中肝小叶结构清晰，肝细胞围绕中央静脉和汇管区有序排列；Con A模型组小鼠肝组织中出现大片状坏死区域，可见典型的肝坏死表现（细胞结构破坏、空泡形成、核溶解和嗜酸性粒细胞增多），同时在肝小叶、中央静脉和汇管区周期伴随着广泛的淋巴细胞浸润；eRF3b-361组小鼠肝组织中见少量坏死区域，其余各组中均未见坏死区域。

结合小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平的测定结果，在后续的生存分析和治疗实验中eRF3b均采用150μg/kg为给药剂量进行试验。

（五）流式细胞术测定肝实质细胞凋亡情况

肝实质细胞分离

(1)按照实验设计，在Con A注射12小时后处死小鼠，打开腹腔和胸腔；

(2)左心室进针，用剪刀在右心耳处剪口，用预冷的无菌生理盐水进行心内灌流，冲洗肝脏直至变为灰白色；

(3)分离肝脏，移除结缔组织和胆囊，将肝组织剪成小块状，用眼科镊轻搓过200目钢筛，用生理盐水冲洗获得单细胞悬液；

(4)将单细胞悬液过300目尼龙网，经1000转/分离心4min，去上清。

(5)沉淀用1ml0.5%胰蛋白酶（将0.5g胰酶溶解于100ml Hanks液中）重悬,消化2min后加胎牛血清终止消化，以1000转/分，离心4min。去上清，加5ml生理盐水重悬，沉淀经反复洗2次；

(6)沉淀重悬在生理盐水中并调整细胞浓度至1×10⁶～1×10⁷/ml，制备成单细胞悬液。

肝实质细胞凋亡的测定

（1）取上述单细胞悬液1ml，1000转/分离心4min，去上清，得沉淀。

（2）取1ml配制好的PI染液，重悬沉淀，4℃避光放置30min，染色。

（3）将染色的单细胞悬液加入流式管中，上流式细胞仪测定细胞周期及凋亡情况。

结果如图3所示。图3中，*代表P<0.05,**代表P<0.01，均表示与ConA模型组相比；★★代表P<0.01，表示与eRF3b-361组相比；▲▲代表P<0.01，表示与eRF3b-362组相比；＃＃代表P<0.01，表示与eRF3b-363组相比。

图3表明，与ConA模型组（凋亡率30.24±1.29）相比，eRF3b-361组（凋亡率14.73±3.37）、eRF3b-362组（凋亡率10.01±0.87）、eRF3b-363组（凋亡率6.41±0.98）、eRF3b-364组（凋亡率12.86±1.79）及地塞米松阳性对照组（凋亡率8.4±2.01）凋亡肝细胞所占比例显著降低，其中eRF3b-361组、2组及3组，随多肽片段eRF3b-36剂量增大凋亡肝细胞所占比例逐渐降低，且各组间差异均有统计学意义（均P<0.01）；eRF3b-364组凋亡肝细胞所占比例出现升高，与eRF3b-361组无差异（P=0.591），高于2组及3组（均P<0.01）。说明随着多肽片段eRF3b-36剂量增加，凋亡肝细胞所占比例逐渐降低，当剂量达到一定水平后凋亡肝细胞所占比例出现回升，提示存在剂量反应关系。说明人eRF3b片段（eRF3b-36）可抑制Con A所诱导的急性肝损伤模型中肝细胞的凋亡，其抑制作用存在剂量反应关系。

（六）eRF3b多肽片段（eRF3b-36）预防性给药对致死剂量Con A小鼠生存率的影响

将雄性Balb/c近交系小鼠（6-8周龄）随机分为三组，每组10只，分别接受以下处理：

Con A模型组：先给予生理盐水（约12.5ml/kg），1小时后用Con A注射液（ConA25mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导急性肝损伤。

地塞米松阳性对照组：先给予地塞米松注射液（地塞米松500μg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml），1小时后用Con A注射液（Con A25mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导急性肝损伤。

eRF3b-36组：先给予eRF3b注射液（eRF3b-36150μg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml），1小时后用Con A注射液（Con A25mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导急性肝损伤。

观察Con A注射72小时内小鼠的死亡情况，准确记录每只小鼠的给药时间和死亡时间，计算各组小鼠的生存率，结果如图4所示。

图4表明，ConA模型组、地塞米松阳性对照组和eRF3b-36组生存率分别为20%、80%和70%，中位生存时间分别为11小时、72小时和72小时。eRF3b-36和地塞米松阳性对照组小鼠72小时内的生存率均显著高于ConA模型组（P=0.004），生存时间显著延长。

二、治疗作用实验

（一）实验分组及处理方式

将32只雄性Balb/c近交系小鼠（6-8周龄）随机分为四组，每组8只，分别接受以下处理：

正常对照组：分别在相应给药时点给予生理盐水（给药体积为每只小鼠0.25ml）。

Con A模型组：先用Con A注射液（Con A12mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤，0.5小时后给予生理盐水（约12.5ml/kg）进行治疗。

地塞米松阳性对照组：先用Con A注射液（Con A12mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤，0.5小时后给予地塞米松注射液（地塞米松500μg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）进行治疗。

eRF3b-36组：先用Con A注射液（Con A12mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤，0.5小时后给予eRF3b注射液（eRF3b-36150μg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）进行治疗。

（二）小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平的测定如步骤一的（三）。

给予Con A刺激后12h小鼠血清ALT和AST水平的测定结果如图5所示。

图5中，**代表P<0.01，与ConA模型组相比。

图5表明，eRF3b-36组和地塞米松阳性对照组小鼠血清ALT（分别为92.25±38.13,98.5±42.11）及AST（分别为157.5±35.19,150.5±23.12）水平均显著低于Con A模型组（ALT为430.75±144.28,AST为543.25±167.94），P均小于0.01。

（三）肝组织石蜡包埋及HE染色如步骤一的（四）。

给予Con A刺激后12h小鼠肝组织石蜡包埋及HE染色结果如图6所示。

图6中，箭头指示的为坏死区。

图6表明，ConA模型组肝组织切片可见典型的肝坏死结构和大片状坏死区域，eRF3b-36组和地塞米松阳性对照组小鼠肝组织中未见明显肝坏死区域且淋巴细胞浸润减少。

（四）eRF3b片段治疗性给药对致死剂量Con A小鼠生存率的影响

将30只雄性Balb/c近交系小鼠（6-8周龄）随机分为三组，每组10只，分别接受以下处理：

Con A模型组：先用Con A注射液（Con A25mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤，0.5小时后给予0.25ml生理盐水（约12.5ml/kg）。

地塞米松阳性对照组：先用Con A注射液（Con A25mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤，0.5小时后给予地塞米松注射液（地塞米松500ug/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）。

eRF3b-36组：先用Con A注射液（Con A25mg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）刺激小鼠诱导肝损伤，0.5小时后给予eRF3b注射液（eRF3b-36150μg/kg，给药体积为每只小鼠0.25ml）。

观察Con A注射72小时内小鼠的死亡情况，准确记录每只小鼠的给药时间和死亡时间，计算各组小鼠的生存率，结果如图7所示。

图7表明，ConA模型组、地塞米松阳性对照组及eRF3b-36组小鼠的生存率分别为：20%、60%和50%，中位生存时间分别为：13小时、72小时和58小时。eRF3b-36和地塞米松对致死剂量Con A导致的小鼠死亡有明显的治疗效果，显著提高了生存率（P=0.011），延长了生存时间。

实施例2、人eRF3b片段（eRF3b-36）在治疗慢性肝损伤中的应用

复方甘草酸苷，是临床上治疗脂肪肝的一种常用药，它能够保护肝细胞膜，通过抑制磷脂酶A2的活性达到抗炎保护肝细胞膜的作用；同时能够发挥类固醇样作用，具有抗炎、抗变态反应和类固醇样免疫调节等作用。与此同时它还有NK细胞活化作用、胸腺外T淋巴细胞分化增强作用，对慢性肝病肝纤维化及癌变有抑制效果。

另一种阳性药物降脂通络软胶囊，主要成分为中药姜黄，其具有活血化瘀行气止痛作用,根据中华心血管病杂志编辑委员会血脂异常防治对策专题组针对血脂异常防治研究发现证实，其降血脂作用机制可能与促进胆囊对胆固醇排泄和抑制脂肪酸合成有关,对药物性肝损害有一定修复作用。

一、大鼠脂肪肝模型的快速建立

雄性SD大鼠(180-200g)购买后在动物房适应性培养一周，称量大鼠体重，每隔3天按照3ml/kg腹腔注射10%CCl₄（体积百分含量10%的四氯化碳的橄榄油溶液）共4周，同时高脂饲料喂食4周。

二、实验分组及处理方式

正常对照组:雄性SD大鼠(180-200g)购买后在动物房适应性培养一周，正常饲料饲养+生理盐水注射10周（每周3次）。

将步骤一构建的脂肪肝模型大鼠随机分为以下各组并接受以下处理：

eRF3b低剂量组（100μg/kg）：按照大鼠体重尾静脉注射eRF3b（eRF3b-36100μg/kg，给药剂量2ml/kg.次），每周3次，治疗6周；

eRF3b中剂量组（200μg/kg）：按照大鼠体重尾静脉注射eRF3b（eRF3b-36200μg/kg，给药剂量2ml/kg.次），每周3次，治疗6周；

eRF3b高剂量组（400μg/kg）：按照大鼠体重尾静脉注射eRF3b（eRF3b-36400μg/kg，给药剂量2ml/kg.次），每周3次，治疗6周；

西药组（复方甘草酸苷）：复方甘草酸苷稀释液灌胃治疗（复方甘草酸苷用生理盐水稀释至60mg/ml,给药剂量2ml/kg.次），每周三次，治疗6周；

中药组（降脂通络软胶囊）：降脂通络软胶囊稀释液灌胃治疗（降脂通络软胶囊用生理盐水稀释至40mg/ml,给药剂量2ml/kg.次），每周三次，治疗6周；

模型组：通过尾静脉分别在相应给药时间点给予大鼠生理盐水（给药剂量2ml/kg.次）治疗6周。

上述实验中,eRF3b低、中、高剂量组及模型组每组8只，西药组、中药组每组12只，各组给药时间均保持一致。

三、血清学指标检测

末次治疗后将大鼠禁食12h后，剖杀大鼠收集血液，分离血清应用CHEMIX-180全自动生化分析仪（购自日本Sysmex公司）检测肝功能(血清ALT、AST活性，血清总胆红素TBIL水平)、血清甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(CHOL)等指标的变化情况。

各组大鼠的血清ALT检测结果如图8所示。

图8中，正常组为正常对照组，*代表P<0.05,**代表P<0.01，均与模型组相比。

图8表明，eRF3b低剂量组、eRF3b中剂量组、eRF3b高剂量组、西药组、中药组及正常对照组血清ALT水平均显著低于模型组（P<0.05），3个eRF3b剂量组与西药组无明显差异（P>0.05）。

各组大鼠的血清AST检测结果如图9所示。

图9中，正常组为正常对照组，*代表P<0.05,**代表P<0.01，均与模型组相比；▲代表p<0.05,▲▲代表p<0.01，均与西药组比较。

图9表明，eRF3b低剂量组、eRF3b中剂量组及正常对照组血清AST水平均显著低于模型组（P<0.05）；eRF3b高剂量组、西药组、中药组血清AST水平与模型组无明显差异（P>0.05）。eRF3b中剂量组与西药组有明显差异（p<0.01）。

各组大鼠的血清TBIL检测结果如图10所示。

图10中，正常组为正常对照组，*代表P<0.05,**代表P<0.01，均与模型组相比。

图10表明，eRF3b低剂量组、eRF3b中剂量组、eRF3b高剂量组血清TBIL水平均显著低于模型组（P<0.01）；3个eRF3b剂量组的血清TBIL水平与西药组无明显差异（P>0.05）。

各组大鼠的血清CHOL检测结果如图11所示。

图11中，正常组为正常对照组，*代表P<0.05,**代表P<0.01，均与模型组相比。

图11表明，eRF3b中剂量组血清CHOL水平显著低于模型组（P<0.01）;eRF3b低剂量组、eRF3b高剂量组、西药组、中药组及正常对照组血清CHOL水平与模型组无明显差异（P>0.05）。

各组大鼠的血清TG检测结果如图12所示。

图12中，正常组为正常对照组，*代表P<0.05,**代表P<0.01，均与模型组相比。

图12表明，eRF3b低剂量组、eRF3b中剂量组、eRF3b高剂量组、西药组、中药组、正常对照组血清TG水平均显著低于模型组（P<0.01）。

四、病理学检测

末次治疗后将大鼠禁食12h后，剖杀大鼠，各组大鼠于肝左叶同一部位取一小块肝组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片，进行HE染色。

将各组小鼠的组织在光镜下观察，评估肝脏的脂肪变性程度:

0级(肝细胞无脂肪变性);

1级(＜25%肝细胞脂肪变性);

2级(25%～50%肝细胞脂肪变性);

3级(50%～75%肝细胞脂肪变性);

4级(＞75%肝细胞脂肪变性)。

HE染色结果如图13所示，图13中，正常组为正常对照组。

图13表明，正常对照组大鼠肝组织中肝小叶结构清晰，肝细胞围绕中央静脉和汇管区有序排列，形成肝索，脂肪变性程度0级；模型组大鼠肝组织中出现大片脂肪空泡，＞75%肝细胞脂肪变，脂肪变性程度4级；eRF3b低剂量组、eRF3b高剂量组、中药组：50%～75%肝细胞脂肪变，脂肪变性程度3级；eRF3b中剂量组、西药组：25%～50%肝细胞脂肪变性,脂肪变性程度2级。

五、肝组织冰冻切片及苏丹染色

（一）取各组大鼠肝左叶外侧下段同一部位的一小块肝组织，未固定的肝组织体积为24×24×2mm。

（二）取出组织支承器，放平摆好肝组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。

（三）将冰冻好的肝组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

（四）调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10mm间。

（五）调好防卷板,制作冰冻切片，准确地调好防卷板，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。

（六）应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。切片后进行苏丹染色。

结果如图14所示，图14中，正常组为正常对照组。

图14表明，正常组肝组织内游离脂肪含量较少；模型组肝组织汇管区有大量游离脂肪；eRF3b低剂量组、eRF3b高剂量组有较多游离脂肪组织，但相对于模型组已经有所减少；eRF3b中剂量组、西药组、中药组游离脂肪含量相对于模型组下降十分明显。

以上结果表明，eRF3b中剂量组无论从血清学指标还是从肝组织病理结果看对肝脏起到了很好的保护效果，不仅能够显著降低血清ALT、AST、CHOL、TG、TBIL水平，而且还能减少肝组织游离脂肪的含量。

Claims

1.真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备预防和/或治疗肝损伤的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝损伤为急性肝损伤或慢性肝损伤；

所述急性肝损伤具体为急性免疫性肝损伤；

所述慢性肝损伤具体为脂肪肝。

3.真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝损伤时血清中谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶水平上升的产品中的应用。

4.真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝损伤中肝细胞坏死和/或凋亡的产品中的应用。

5.真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝损伤中淋巴细胞向肝组织浸润的产品中的应用。

6.根据权利要求3-5任一所述的应用，其特征在于：所述肝损伤为急性肝损伤；

所述急性肝损伤具体为急性免疫性肝损伤。

7.真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝损伤时血清中谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶和/或血清总胆红素和/或血清总胆固醇和/或血清甘油三酯水平上升的产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肝损伤为慢性肝损伤；

所述慢性肝损伤具体为脂肪肝。

9.真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝细胞脂肪变性的产品中的应用；

或，

真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）在制备抑制肝组织中游离脂肪的含量上升的产品中的应用。

10.根据权利要求1-9任一所述的应用，其特征在于：所述真核肽链释放因子3b片段（eRF3b-36）的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。