CN103184190A - 一种将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂及培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞定向分化诱导剂及培养基。一种将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂，含有淫羊藿苷、维甲酸、人绒毛膜促性腺激素。一种将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，通过以下方法制备：每1000ml所述诱导培养基中含有：淫羊藿苷0.5～10μmol、维甲酸1～10μmol、人绒毛膜促性腺激素2～8万单位，余量为人间充质干细胞无血清培养基，混匀过滤除菌即可。本发明提供的将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂及培养基，无需细胞转染，故无基因改变及罹患癌症风险；诱导分化效率高；发扬中医中药的特色，可诱导自体脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞，无伦理问题，安全性高。
Description
技术领域
本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞定向分化诱导剂及培养基。
背景技术
睾酮又称睾丸素、睾丸酮或睾甾酮，是一种类固醇荷尔蒙，由男性的睾丸间质细胞(Leydig细胞)或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮，Leydig细胞分泌了男性睾酮总量的95％，睾酮在体内具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。人类睾丸间质细胞功能下降时，睾酮分泌不足，造成年男性性功能障碍、性欲减退、乏力、容易失眠、记忆力下降等。目前，对于人类睾丸间质细胞功能下降，有三种治疗方法：1、传统的雄激素替代疗法：存在一些缺点，如服用不便，患者难以长期坚持规律服用；药物作用时间短；血液中雄激素水平波动大，尤其是对于大多数的青少年病人；肝肾毒性大，被迫中断的病人多等。2、睾丸移植术：能在一定程度上能解决男性无睾症、小睾丸和性功能障碍等疾病，但睾丸是性器官，是能产生精子的器官，产生伦理学问题。3、睾丸间质细胞移植：虽能避免产生精子，基本上不受伦理学的限制，但是来源太少，提取及培养困难，临床应用受限。
随干细胞的研究与发展，人们都把目光转移到了干细胞上。脂肪干细胞作为间充质干细胞的一种，是一种多能前体细胞，在体外可以被诱导向成骨，成软骨，成脂肪细胞分化。它不但来源广泛，容易取材，而且不存在伦理学问题和免疫排斥反应等问题。自体干细胞移植治疗睾丸间质细胞功能下降逐渐被人接受。
但是对于间充质干细胞向睾酮分泌细胞的分化方法目前研究的并不多，主要方法是：1、通过转染技术向细胞内引入固醇生成因子1(SF-1)或肝脏受体类似物1(LRH-1)并辅以RA来诱导MSC分泌睾酮。SF-1在睾酮分泌中起到重要的调控作用，但是SF-1为孤儿核受体家族成员，其调控转录元件位于细胞核中，在调控过程中是以单体的形式结合于DNA上，属于胞内调控元件。2、间充质干细胞与Leydig细胞共培养诱导为睾酮分泌细胞，Leydig细胞在培养过程中可以分泌多种因子及激素，整个诱导过程十分复杂，目前还无法确切得知诱导过程中涉及的信号转导途径。3、MSC注射到大鼠睾丸内，并对大鼠持续灌胃给药，淫羊藿苷可以诱导睾丸内的MSC向Leydig细胞分化，并分泌睾酮。淫羊藿苷是从淫羊藿的干燥茎叶中提取的有效成分，作为一种黄酮类化合物，具有增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还具有补肾壮阳、抗衰老等功效。研究发现雄性小鼠灌胃淫羊藿水煎液可升高血浆睾丸酮的含量，增加睾丸和提肛肌的重量。4、有研究者发现只用RA就可以诱导MSC分泌睾酮和雌二醇，但是文献中的实验组分泌量和对照组没有明显差异。在体内，Leydig细胞在人绒毛促性腺激素(HCG)的脉冲刺激下分泌睾酮，但是对体外培养的Leydig细胞加以刺激时50IU/ml的效果最好。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂，该诱导剂能够将脂肪干细胞定向诱导分化为睾酮分泌细胞。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂，含有淫羊藿苷、维甲酸、人绒毛膜促性腺激素。
本发明的另一个目的是提供一种将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，所述的诱导培养基通过以下方法制备：以人间充质干细胞无血清培养基为基质，每1000ml所述诱导培养基中含有：淫羊藿苷0.5～10μmol、维甲酸l～10μmol、人绒毛膜促性腺激素2～8万单位，余量为人间充质干细胞无血清培养基，混匀过滤除菌即可。
本发明提供的将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂及培养基，具有如下优点：1、无需细胞转染，故无基因改变及罹患癌症风险；2、诱导分化效率高；3、发扬中医中药的特色，可诱导自体脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞，该睾酮分泌细胞移植后无排斥，无伦理问题，安全性高。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。
实施例1一种将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂，含有淫羊藿苷、维甲酸、人绒毛膜促性腺激素。
实施例2本实施例的将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，将下列原料按其各自特性进行溶解，以人间充质干细胞无血清培养基为基质(LONZA，00190632)，使各组分含量如下列定容至1000ml：维甲酸(RA，Sigma，R2625-50MG)2μmol；淫羊藿苷(上海微晶生物，489-32-7，20mg)1μmol；HCG(Sigma，CG5-10VL)5万单位。
实施例3本实施例的将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，将下列原料按其各自特性进行溶解，以人间充质干细胞无血清培养基为基质(LONZA，00190632)，使各组分含量如下列定容至1000ml：淫羊藿苷(上海微晶生物，489-32-7，20mg)10μmol；维甲酸(RA，Sigma，R2625-50MG)8μmol；HCG(Sigma，CG5-10VL)6万单位。
实施例4采用实施例2制备的诱导培养基，对脂肪干细胞进行睾酮分泌细胞诱导分化实验
1、脂肪干细胞制备：
(1)接收脂肪组织，用75％的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁；
(2)分装脂肪组织，每一个T175培养瓶分装脂肪组织为50ml。10ml移液管，去吸头，于脂肪采集瓶先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装。
(3)洗涤脂肪组织，除去血细胞。向T175培养瓶中加入100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3～5分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。
(4)胶原酶I消化：加入等量新配制的预热(提前半小时于37℃的气浴摇床预热)的胶原酶I溶液(0.1％胶原酶I配制方法：称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml未加任何因子的人间充质干细胞无血清培养基(LONZA，00190632)中，用之前37℃预热)，封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5～10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化60分钟，每隔15分钟剧烈晃动培养瓶5～10秒，直到看起来较为平滑。
(5)分离基质血管组分(SVF)：将消化后的组织用无菌40目滤网分装到50ml的离心管中，室温400g离心10分钟，得到的沉淀即为SVF。
(6)净化沉淀：离心后，SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。注意：在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g，10分钟离心。离心完毕，小心吸去上清液，不能直接倒掉。吸取时移液管头应该置于离心管的上部以便于彻底的出去油。10ml培养基悬浮细胞，然后将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次室温300g，10分钟离心。
(7)细胞种植：离心后加20ml培养基充分混匀。基于组织块法：根据培养瓶的面积进行细胞种植。按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量。即每100ml脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶。进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞。
(8)原代细胞培养：平置培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％。培养基：人间充质干细胞无血清培养基(LONZA，00190632)。
(9)换液：原代培养第24小时，进行全量换液。此后每隔3天全量换液，放置二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养。
(10)原代细胞收获：7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70％～80％时，消化收获。
(11)原代细胞收获：在培养瓶中加入消化酶(消化酶为0.125％Trypsin～0.01％EDTA溶液，使用前室温(20～25℃)放置15～25min，每75cm2加入2ml消化酶溶液)，消化时间为1.5～2.5min，加入培养基2～3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落，移入50ml离心管中，原培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射-液冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，移液管吹打悬浮后，100目无菌滤网过滤，过滤液收集到50ml离心管中，1000rpm，10min离心洗涤。
(12)原代细胞传代：观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数。计数后1000rpm，10min二次离心。去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000～6000个/cm2，即(3.75～4.5)×105个cells/T75，按照4.5×105个cells/T75进行传代。在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息。将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱。条件：37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％。培养至细胞融合达85％～90％。
2、脂肪干细胞的鉴定
(1)取P3代脂肪干细胞，流式检测细胞表面标记，流式结果如表1：
表1脂肪干细胞表面标记物的检测
其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD49d表达大于95％，阴性标记物CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2％，证明为该细胞为脂肪干细胞。
3、脂肪干细胞向睾酮分泌细胞诱导分化：取P3的ADSC以5*105/孔接种于6孔板中，过夜贴壁后换成本发明的诱导培养基诱导14天，每3天换液。同时设置空白对照组。分组如表2所示：
表2诱导分化分组
| 组别 | 诱导条件 |
| 空白对照 | 人间充质干细胞无血清培养基 |
| 实验组一 | 实施例2制备的诱导培养基 |
| 实验组二 | 人间充质干细胞无血清培养基+2μM RA |
| 实验组三 | 人间充质干细胞无血清培养基+1μM淫羊藿苷 |
| 实验组四 | 人间充质干细胞无血清培养基+2μM RA+1μM淫羊藿苷 |
4、仔细观察细胞在诱导过程中的形态变化，在3d，7d，10d，14d时取两个组的培养液，1100r*5min离心，取上清液于-20℃保存，检测其中睾酮含量，并做统计学分析。按照睾酮(TES)ELISA试剂盒(德国DRG：EIA-1559)使用说明规定的操作，检测其中睾酮含量，结果见表3：
表3不同诱导剂的诱导效果比较
从表3的诱导结果可以看出，采用含有本发明诱导剂的培养基诱导效率最高，诱导获得的细胞分泌睾酮最多。加入本发明诱导剂后，7d后ADSC开始缓慢持续分泌睾酮，且分泌量逐渐增加，到第14d时可达到分泌效果量最大。
Claims (3)
1.一种将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂，其特征在于：所述诱导剂含有淫羊藿苷、维甲酸、人绒毛膜促性腺激素。
2.一种将脂肪干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，其特征在于：所述诱导培养基包含权利要求1所述的诱导剂，通过以下方法制备：以人间充质干细胞无血清培养基为基质，每1000ml所述诱导培养基中含有：淫羊藿苷0.5～10μmol、维甲酸1～10μmol、人绒毛膜促性腺激素2～8万单位，余量为人间充质干细胞无血清培养基，混匀过滤除菌即可。
3.根据权利要求2所述的诱导培养基，其特征在于：每1000ml所述诱导培养基中含有：淫羊藿苷1μmol、维甲酸2μmol、人绒毛膜促性腺激素5万单位，余量为人间充质干细胞无血清培养基。
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