CN106520690A - 一种无血清干细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种无血清干细胞培养基。本发明无血清干细胞培养基，包括基础培养基，胰岛素，转铁蛋白，淫羊藿苷，甘氨酰丙氨酸，丙氨酰‑L‑酪氨酸，多聚赖氨酸，维生素E，聚乙烯吡咯烷酮，转化生长因子‑β，还原性谷胱甘肽和碳酸氢钠。本发明无血清干细胞基能够促进细胞生长和增殖，能够明显地促进干细胞的分化，同时培养增殖后的干细胞对细胞退行性模型的保护作用。

Description

一种无血清干细胞培养基
技术领域
本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种无血清干细胞培养基。
背景技术
诸多研究表明干细胞不仅可以自我更新，在条件合适的情况下能分化成其他功能细胞，因此干细胞有望成为治疗人类疑难疾病的有效手段。然而，干细胞在正常成体组织中含量甚微，在体外如何快速扩增与培养干细胞培养是研究干细胞的作用机制及探索其在治疗人类疾病治疗方法的重要技术。
专利申请(CN103243070A)公开了一种干细胞培养基及其应用，所述培养基组分包括有基础培养基、胎牛血清、细胞因子或蛋白多肽、维生素及脂类。其所提供的培养基能够快速扩增干细胞同时又不影响干细胞的潜能，干细胞的扩增速度较常规培养基提高3-5倍，而且能用于培养多种组织的干细胞。
但是在干细胞培养的过程中，血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，其中复杂的蛋白和多重的细胞因子，会导致本身就容易分化的干细胞生出多种完全不同的细胞表型，而产生多种完全不同的细胞分化趋势，也给细胞培养表达产品分离纯化和结果的重复性带来很大的困难。
因此，迫切需要一种成本低、成分明确、简单的的无血清培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、成分明确、简单的无血清干细胞培养基。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种无血清干细胞培养基，主要由以下成分及其浓度组成：基础培养基1L，胰岛素6-15mg/L，转铁蛋白21-35mg/L，淫羊藿苷0.45-0.55μM，甘氨酰丙氨酸365-850mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.85-2.15g/L，多聚赖氨酸0.15-0.75mg/L，维生素E 0.3-0.5mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.03-0.045mg/L，转化生长因子-β10-30μg/L，还原性谷胱甘肽0.025-0.54mg/L和碳酸氢钠0.45-0.65g/L。
进一步，所述无血清干细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F12 1L，胰岛素7.5mg/L，转铁蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨酰丙氨酸765mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.97g/L，多聚赖氨酸0.34mg/L，维生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，转化生长因子-β19μg/L，还原性谷胱甘肽0.43mg/L和碳酸氢钠0.52g/L。
进一步，所述基础培养基为DMEM-L培养基或DMEM/F12培养基。
进一步，所述无血清干细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取相应浓度的胰岛素，转铁蛋白，淫羊藿苷，甘氨酰丙氨酸，丙氨酰-L-酪氨酸，多聚赖氨酸，维生素E，聚乙烯吡咯烷酮，转化生长因子-β，还原性谷胱甘肽，溶于温度为20-30℃超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液I；
(2)向上述溶液I中加入相应浓度的碳酸氢钠，搅拌均匀，加入1LDMEM/F12培养液，搅拌均匀得溶液II；
(3)用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调溶液II的pH至7.2，得溶液III；
(4)将溶液III用0.22μm滤膜正压过滤除菌，即得。
采用本发明的上述无血清干细胞培养基，针对干细胞自身容易生出多种完全不同的细胞表型和多种完全不同的细胞分化趋势的情形，采用上述各功能成分稳定和保持其分化水平；并且可以避免现有技术血清蛋白培养基存在的血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性；并避免血清所带来的外源性污染及血清组分的细胞毒性作用。并且其自身成分相对明确、质量一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化。与现有技术相比，本发明无血清干细胞培养基具有以下优点：
(1)利用本发明培养基能够使细胞生长延滞期缩短，扩增速度快，细胞平顶期时间延长，有利于细胞生长和增殖。
(2)本发明培养基可用于培养多种干细胞，包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞等。
(3)本发明培养能够明显地促进干细胞的分化，同时培养增殖后的干细胞对细胞退行性模型的保护作用。
附图说明
图1：不同细胞培养基中干细胞密度变化；
图2：不同细胞培养基中干细胞分化成RPE细胞的比率；
图3：实施例1培养基中不同干细胞在细胞退行性模型中感光细胞的变化情况。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
原料来源：DMEM(L)液体：美国Hyclone公司；DMEM/F12液体：Hyclone公司；淫羊藿苷，CAS号：489-32-7；多聚赖氨酸，CAS号：25988-63-0。
实施例1一种无血清干细胞培养基
一种无血清干细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F12 1L，胰岛素7.5mg/L，转铁蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨酰丙氨酸765mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.97g/L，多聚赖氨酸0.34mg/L，维生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，转化生长因子-β19μg/L，还原性谷胱甘肽0.43mg/L，碳酸氢钠0.52g/L。
培养基制备方法为：
(1)准确称取相应浓度的胰岛素，转铁蛋白，淫羊藿苷，甘氨酰丙氨酸，丙氨酰-L-酪氨酸，多聚赖氨酸，维生素E，聚乙烯吡咯烷酮，转化生长因子-β，还原性谷胱甘肽，溶于温度为25℃超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液I；
(2)向上述溶液I中加入相应浓度的碳酸氢钠，搅拌均匀，加入1L DMEM/F12培养液，搅拌均匀得溶液II；
(3)用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调溶液II的pH至7.2，得溶液III；
(4)将溶液III用0.22μm滤膜正压过滤除菌，即得。
实施例2一种无血清干细胞培养基
一种无血清干细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM-L 1L，胰岛素6mg/L，转铁蛋白21mg/L，淫羊藿苷0.45μM，甘氨酰丙氨酸365mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.85g/L，多聚赖氨酸0.15mg/L，维生素E 0.3mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.03mg/L，转化生长因子-β10μg/L，还原性谷胱甘肽0.025mg/L，碳酸氢钠0.45g/L。
制备方法与实施例1相似。
实施例3一种无血清干细胞培养基
一种无血清干细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM-L 1L，胰岛素15mg/L，转铁蛋白35mg/L，淫羊藿苷0.55μM，甘氨酰丙氨酸850mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸2.15g/L，多聚赖氨酸0.75mg/L，维生素E 0.5mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.045mg/L，转化生长因子-β30μg/L，还原性谷胱甘肽0.54mg/L，碳酸氢钠0.65g/L。
制备方法与实施例1相似。
对比例1一种无血清干细胞培养基
一种无血清干细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F12 1L，胰岛素7.5mg/L，转铁蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.85μM，甘氨酰丙氨酸765mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.97g/L，多聚赖氨酸0.34mg/L，维生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，转化生长因子-β19μg/L，还原性谷胱甘肽0.43mg/L，碳酸氢钠0.52g/L。
制备方法与实施例1相似。
与对实施例1区别在于，淫羊藿苷的浓度增加至0.85μM。
对比例2一种无血清干细胞培养基
一种无血清干细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F12 1L，胰岛素7.5mg/L，转铁蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨酸320mg/L，丙氨酸445mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.97g/L，多聚赖氨酸0.34mg/L，维生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，转化生长因子-β19μg/L，还原性谷胱甘肽0.43mg/L，碳酸氢钠0.52g/L。
制备方法与实施例1相似。
与对实施例1区别在于，将甘氨酰丙氨酸替换为甘氨酸，丙氨酸。
对比例3一种无血清干细胞培养基
一种无血清干细胞培养基，由以下组分及重量份组成：DMEM/F12 1L，胰岛素7.5mg/L，转铁蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨酰丙氨酸765mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.15g/L，多聚赖氨酸0.34mg/L，维生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，转化生长因子-β19μg/L，还原性谷胱甘肽0.43mg/L，碳酸氢钠0.52g/L。
制备方法与实施例1相似。
与对实施例1区别在于，将丙氨酰-L-酪氨酸浓度降低至1.15g/L。
试验例一 对干细胞增殖的加速作用的实验
1、受试培养基：常规培养基组分：DMEM/F12基本培养基，10％胎牛血清(FBS)；实施例1培养基，对比例1-3培养基
2、培养干细胞来源：来源于脂肪组织器官的人体干细胞。
3、体外细胞培养实验：细胞接种密度控制在10-20％之间，接种后加入培养基培养(37℃，5％CO2)。通过MTT法每隔12小时测一次细胞密度。图1为本试验例的实验结果，从图中可以看出，经本发明实施例1的培养基培养的干细胞比对比例1-3的培养基培养表现出更快的扩增速度，并且扩增速度快于常规培养基，在36h时本发明实施例1的培养基培养的干细胞的浓度是常规培养基的2.9倍。
试验例二 对成视网膜上皮细胞的潜能分析影响实验
1、受试培养基：常规培养基组分：DMEM/F12基本培养基，10％胎牛血清(FBS)；实施例1培养基，对比例1-3培养基。
2、培养干细胞来源：分别来源于脂肪、骨髓间及脐带三种组织器官的人体干细胞(ADSC，BMSC，UMBSC)。
3、体外细胞培养实验：为进一步检查干细胞经本发明所描述的培养基扩增后对其分化潜能的影响，我们按文献所描述测定了按文献所描述的方法测定了脂肪、骨髓间以及脐三种组织器官来源的人干细胞(ADSC，BMSC，UMBSC)扩增8代之后视网膜上皮细胞(RPE)的分化实验(Nat Biotechnol.2008Feb；26(2):215-24.)。对RPE细胞标志物染色后统计阳性细胞的数量，结果如图2所示，经本发明描述的培养基培养过的干细胞分化成RPE细胞的比率均在80％左右，高于对比例培养基并高于常规细胞培养基。因此本发明所描述的培养基培养的干细胞能够促进干细胞分化成RPE细胞的潜能。
试验例三 增殖后干细胞对细胞退行性模型的保护作用
1、受试培养基：本发明实施例1培养基
2、培养干细胞来源：分别来源于脂肪、骨髓间及脐带三种组织器官的人体干细胞(ADSC，BMSC，UMBSC)。
3、体外细胞培养实验：为检测干细胞经本发明所描述的培养基扩增后对退行性疾病的治疗作用，我们选用了视网膜感光细胞退行性视网膜疾病小鼠模型(rd1)，将8代扩增后的脂肪、骨髓以及脐三种组织器官来源的人干细胞(ADSC，BMSC或UMBSC)扩增之后植入rd1退行性视网膜之后，组织学检测感光细胞的数量，以确定其对视网膜感光细胞的保护作用。实验结果如图3所示，结果表明，视网膜感光细胞退行性小鼠经干细胞治疗1个月之后，感光细胞的数量由原来不到8％提高到45-57％，干细胞经本发明的培养基培养之后保护减缓组织细胞退化的能力仍然维持。干细胞细胞移植之后rd1小鼠视网膜感光细胞退化明显变慢，因此经本发明所描述的培养基扩增后的干细胞在对退行性视网膜具有保护作用。

Claims (4)

1.一种无血清干细胞培养基，其特征在于，主要由以下成分及其浓度组成：基础培养基1L，胰岛素6-15mg/L，转铁蛋白21-35mg/L，淫羊藿苷0.45-0.55μM，甘氨酰丙氨酸365-850mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.85-2.15g/L，多聚赖氨酸0.15-0.75mg/L，维生素E 0.3-0.5mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.03-0.045mg/L，转化生长因子-β10-30μg/L，还原性谷胱甘肽0.025-0.54mg/L和碳酸氢钠0.45-0.65g/L。
2.根据权利要求1所述无血清干细胞培养基，其特征在于，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F121L，胰岛素7.5mg/L，转铁蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨酰丙氨酸765mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.97g/L，多聚赖氨酸0.34mg/L，维生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，转化生长因子-β19μg/L，还原性谷胱甘肽0.43mg/L和碳酸氢钠0.52g/L。
3.根据权利要求1或2所述无血清干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM-L培养基或DMEM/F12培养基。
4.根据权利要求1-3任一所述无血清干细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)准确称取相应浓度的胰岛素，转铁蛋白，淫羊藿苷，甘氨酰丙氨酸，丙氨酰-L-酪氨酸，多聚赖氨酸，维生素E，聚乙烯吡咯烷酮，转化生长因子-β，还原性谷胱甘肽，溶于温度为20-30℃超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液I；
(2)向上述溶液I中加入相应浓度的碳酸氢钠，搅拌均匀，加入1L DMEM/F12培养液，搅拌均匀得溶液II；
(3)用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调溶液II的pH至7.2，得溶液III；
(4)将溶液III用0.22μm滤膜正压过滤除菌，即得。
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