CN105368772B - 一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞的方法。本发明提供的三维培养基质中以I型胶原水凝胶作为载体，以bFGF和BMP‑2维持牙髓干细胞的稳定性，经6天培养，DPSCs细胞的增殖稳定且保持良好的活力，细胞数目扩大4倍。经免疫细胞化学染色，培养6天后的细胞干性维持良好，且具有较强的增殖能力。并且，本发明采用EGF和bFGF对牙髓干细胞进行原代培养，使原代细胞活性得到提高。

Description

一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞的方法。

背景技术

牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。对牙髓干细胞的研究显示，牙髓干细胞可应用于牙髓再生、牙本质再生、骨骼再生、神经细胞再生、心肌和血管再生等。牙髓干细胞的应用于牙科诊疗，可以促进牙本质再生，从单一牙齿分离获取大量的牙髓干细胞可以应用牙科进行大量的牙齿修复。有数据显示，体外培养的牙髓干细胞，无论是细胞增殖能力还是克隆形成率都要强于骨髓来源的间充质干细胞。

在牙髓干细胞临床应用过程中，目前突出的问题是一次成功的治疗需要一定数量的细胞，这意味着如何在短时间内获得大量有效高活性的细胞以提供给病人使用是一个很关键的问题。因此，体外大量扩增牙髓干细胞的研究越来越受到研究人员和临床医生的重视。

现有的对DPSCs扩增培养方法大多添加胎牛血清，但临床使用含动物源的培养基不仅会引起免疫排斥反应，异源病毒感染，而且采用这种培养基培养的牙髓干细胞，生长比较缓慢，在传代超5次之后其干细胞特性会大大降低。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞的方法。本发明提供的培养基质能够维持DPSCs在传代过程中的稳定性。

本发明提供的三维培养基质，包括I型胶原水凝胶和培养液；培养液中包括基础培养液、bFGF和BMP-2。

在本发明的实施例中，培养液中bFGF和BMP-2的质量比为(8～12)：(8～12)。

在一些实施例中，培养液中bFGF和BMP-2的质量比为1：1。

在本发明的实施例中，培养液中bFGF的浓度为10ng/mL；BMP-2的浓度为10ng/mL；

本发明提供的培养液中添加bFGF和BMP-2因子，其中，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。骨形态发生蛋白-2(BMP-2)是促进骨形成和诱导成骨细胞分化的的信号因子，研究表明，BMP-2在牙髓三维培养中发挥着重要的作用。

在本发明的实施例中，I型胶原水凝胶中I型胶原的浓度为5mg/mL～15mg/mL。

在一些实施例中，I型胶原水凝胶中I型胶原的浓度为5mg/mL。

在本发明的实施例中，I型胶原水凝胶的网孔直径为40μm～70μm。

I型胶原是支持细胞核组织生长的重要外基质蛋白，本发明以I型胶原水凝胶作为载体，使细胞能够在I型胶原水凝胶提供的的三维立体空间结构中与胶原蛋白的充分接触，保证了细胞间信息信号的传递，使得牙髓干细胞更容易在胶原凝胶内的分裂增殖。由于载体创建的细胞生长环境能够最大程度地模拟体内环境，因此细胞的生长更加健康。本发明所采用的I型胶原可为市场购得，也可自行提取获得，其实施皆在本发明的保护范围之内。

本发明所采用的I型胶原水凝胶的制备方法为：将Ⅰ型胶原溶解后-80℃静置3h后，冷冻干燥制得I型胶原水凝胶。

在一些实施例中，冷冻干燥的时间为16h。

I型胶原溶解具体为：将Ⅰ型胶原以乙酸溶液溶解后，于4℃下调节pH值为7.2。

在一些实施例中，乙酸溶液中乙酸的浓度为10mmol/L。

在一些实施例中，调节pH采用1M的NaOH溶液。

以本发明提供的方法制备的I型胶原载体的网孔直径为40μm～70μm，孔隙均匀呈丝状交织，保持良好的三维网络结构。

在本发明的实施例中，基础培养液包括DMEM/F12无血清培养液和血清替代物。

基础培养液中，血清替代物的体积分数为5％。

本发明提供的三维培养基质中，培养液采用无血清培养液，避免了异源病毒感染或免疫排斥反应。且DMEM/F12培养液营养全面，适宜牙髓干细胞的培养。

本发明提供的培养基质中以I型胶原水凝胶作为载体，以bFGF和BMP-2维持牙髓干细胞的稳定性，实验表明，经6天培养，DPSCs细胞的增殖稳定且保持良好的活力，细胞数目扩大4倍。经免疫细胞化学染色，培养6天后的细胞干性维持良好，且具有较强的增殖能力。

本发明提供的三维培养基在牙髓干细胞传代培养中的应用。

本发明还提供了一种牙髓干细胞的培养方法，包括：将原代培养的牙髓干细胞以本发明提供的三维培养基质传代培养。

在本发明的实施例中，传代培养具体为将牙髓干细胞接种于I型胶原水凝胶后，置于培养液中培养；培养液中包括基础培养液、bFGF和BMP-2。

在本发明的实施例中，接种的密度为1×10⁸个/mL。

在本发明的实施例中，传代培养的条件为5％CO₂、37℃、湿度95％。

在本发明的实施例中，传代培养的时间为7d。

在本发明的实施例中，原代培养具体为：将牙髓组织经I型胶原酶消化后以原代培养液培养至细胞80％～90％汇合；所述原代培养液中包括基础培养液、bFGF和EGF。

在本发明的实施例中，I型胶原酶的质量分数为0.1％～0.25％。

在本发明的实施例中，经I型胶原酶消化后，细胞经70μm细胞筛过滤。

现有技术中，对牙髓干细胞的原代培养采用含有胎牛血清的液体培养基。然而，含有胎牛血清的培养液不仅易引起免疫反应且提高病毒感染的风险，其培养原代细胞的效果也不佳，所得细胞的数量较低。

在本发明的实施例中，原代培养液中bFGF和EGF的质量比为(8～12)：(8～12)。

在本发明的实施例中，原代培养液中bFGF和EGF的质量比1:1。

在本发明的实施例中，原代培养液中bFGF的浓度为10ng/mL；EGF的浓度为10ng/mL。

在本发明的实施例中，原代培养的条件为5％CO₂、37℃、湿度95％。

在本发明的实施例中，原代培养每3天换液一次。

在本发明的实施例中，当原代培养的细胞80％～90％回合后，以胰蛋白酶消化后，传代培养。

本发明提供的提供一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞的方法。本发明提供的三维培养基质中以I型胶原水凝胶作为载体，以bFGF和BMP-2维持牙髓干细胞的稳定性，经6天培养，DPSCs细胞的增殖稳定且保持良好的活力，细胞数目扩大4倍。经免疫细胞化学染色，培养6天后的细胞干性维持良好，且具有较强的增殖能力。并且，本发明采用EGF和bFGF对牙髓干细胞进行原代培养，使原代细胞活性得到提高。

附图说明

图1示浓度为5mg/mL的I型胶原水凝胶电镜观察效果(100×)；

图2示实施例3培养细胞的免疫细胞化学染色检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，I型胶原购自sigma，其为鼠尾胶原蛋白I型。

血清替代物购自HELIOS。

本发明提供的I型胶原蛋白水凝胶的制备方法为：

步骤1：以10mmol/L乙酸溶液溶解I型胶原蛋白(浓度为5mg/mL～15mg/mL)后，于4℃下用1mol/L NaOH溶液调节pH值至7.2；

步骤2：瞬时离心脱泡后以100μL/孔的体积接种到预先冷却的96孔板内，-80℃静置3h后冻干16h。

制得的浓度为5mg/mL I型胶原水凝胶经电镜观察如图1所示。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

将牙髓组织剪碎，放置50ml离心管中，加入10倍体积的3g/L I型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37℃、200rpm消化10～20min左右，加入等体积的DMEM终止液终止消化，反复吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，1000rpm离心5min。丢弃上清，用30ml PBS清洗沉淀1次，1000rpm离心5min。沉淀用无血清培养基重悬，以0.5×10⁴个/cm²～1×10⁴个/cm²接种至六孔板中，每孔加入2mlDMEM/F12培养基(含有100ul血清替代物)，再加入表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两者终浓度为10ng/ml)，混匀细胞悬液，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，3-7d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至80％-90％汇合时(约经过12d)，0.125％胰蛋白酶消化细胞，作为传代细胞。

对比例1

将牙髓组织剪碎，放置50ml离心管中，加入10倍体积的3g/L I型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37℃、200rpm消化10～20min左右，加入等体积的DMEM培养液终止消化，反复吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，1000rpm离心5min。丢弃上清，用30ml PBS清洗沉淀1次，1000rpm离心5min。沉淀用无血清培养基重悬，以0.5×10⁴个/cm²～1×10⁴个/cm²接种至六孔板中，每孔加入2ml含有20％FBS的DMEM培养基，混匀细胞悬液，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，3-7d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至80％-90％汇合时(约经过12d)。

实施例2

采用CCK-8法检测实施例1和对比例1制得的牙髓干细胞细胞增殖活力，CCK-8法检测时每孔加10μL CCK-8(终质量浓度约为0.5g/L)于5％CO2，37℃培养3h，用酶标仪测定450nm，参考波长为630nm的吸光度值(A)。具体操作方法按照说明书进行，并在荧光显微镜下观察细胞吸光值，从而判断出牙髓干细胞的生长活力。结果表明，实施例1制得的牙髓干细胞的吸光值为0.26，而对比例1制得的牙髓干细胞的吸光值为0.22，结果表明，实施例1制得的牙髓干细胞的活性显著优于对比例1。

实施例3～5

将实施例1制得的牙髓干细胞用DMEM/F12无血清培养基重悬，用70μm细胞筛过滤细胞，以1000-1500rpm离心5min，收集细胞沉淀，并用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为以1×10⁸个/ml的密度接种于本发明制备的水凝胶材料(I型胶原的浓度为5mg/mL～15mg/mL)上，加入含有bFGF和BMP-2的DMEM/F12培养基(含有200ul血清替代物)(配方如表1)，37℃，CO₂培养箱中培养7天。

表1实施例3～5

	凝胶中I型胶原	无血清培养基	bFGF	BMP-2
					实施例3	5mg/mL	DMEM/F12+5％血清替代物	10ng/mL	10ng/mL
实施例4	10mg/mL	DMEM/F12+5％血清替代物	8ng/mL	12ng/mL
					实施例5	15mg/mL	DMEM/F12+5％血清替代物	12ng/mL	8ng/mL

对比例2

将实施例1制得的牙髓干细胞用DMEM/F12无血清培养基重悬，用70μm细胞筛过滤细胞，以1000-1500rpm离心5min，收集细胞沉淀，并用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁸个/ml，接种于含有10ng/mLbFGF和10ng/mL BMP-2的DMEM/F12无血清培养基中，37℃，CO₂培养箱中培养7天。

对比例3

将实施例1制得的牙髓干细胞用DMEM/F12无血清培养基重悬，用70μm细胞筛过滤细胞，以1000-1500rpm离心5min，收集细胞沉淀，并用无血清培养基重悬细胞，采用细胞团块状三维培养，细胞密度为2×10⁵个/mL，在球形细胞团中添加10ng/mL BMP-2的DMEM/F12无血清培养基，每周换液2次，持续培养7d。

实施例5

将实施例3～5、对比例2～3培养后的牙髓干细胞，每2天取样，采用CCK-8法检测细胞活力，CCK-8法检测时每孔加10μL CCK-8(终质量浓度约为0.5g/L)于5％CO2，37℃培养3h，用酶标仪测定450nm，参考波长为630nm的吸光度值(A)。具体操作方法按照说明书进行，并在荧光显微镜下观察细胞的吸光值，根据吸光值的大小判断牙髓干细胞的生长活力。结果如表2：

表2 CCK-8法检测牙髓干细胞的吸光值

	2d	4d	6d
				实施例3	0.45	0.66	0.94
实施例4	0.42	0.6	0.85
				实施例5	0.43	0.62	0.87
对比例2	0.34	0.55	0.73
				对比例3	0.32	0.53	0.70

结果显示，与对比例相比，实施例3～5的细胞具有更好的细胞活力。

实施例6

Stro-1蛋白作为牙髓干细胞的标志物，广泛用于牙髓干细胞的鉴定。

采用对Stro-1蛋白细胞进行免疫细胞化学染色鉴定的步骤如下。牙髓干细胞在I型胶原凝胶中培养7d后，加入4％多聚甲醛固定30-60min；分别加anti-Vimention的单克隆(1∶200)抗体及anti-STRO-1单克隆抗体(1：200)，4℃孵育过夜；吸出一抗，加入罗丹明及FITC交联的二抗室温避光孵育1h，甘油封片后，在激光共聚焦显微镜下观察。

其中，对实施例3培养后细胞的检测结果如图2，结果显示，牙髓干细胞在胶原凝胶内仍然保持着干细胞的基本特性且具有较强的增殖能力。细胞与胶原蛋白的充分接触，保证了细胞间信息信号的传递，使得牙髓干细胞更容易在胶原凝胶内的分裂增殖。对实施例4和实施例5的检测结果于此相似。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种三维培养基质，其特征在于，由I型胶原水凝胶和培养液组成；

所述培养液由DMEM/F12无血清培养液、血清替代物、bFGF和BMP-2组成；

所述培养液中bFGF和BMP-2的质量比为(8～12)：(8～12)；

所述I型胶原水凝胶中I型胶原的浓度为5mg/mL～15mg/mL。

2.权利要求1所述的三维培养基在牙髓干细胞传代培养中的应用。

3.一种牙髓干细胞的培养方法，其特征在于，将原代培养的牙髓干细胞以权利要求1所述的三维培养基质传代培养。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述传代培养具体为将牙髓干细胞接种于I型胶原水凝胶后，置于培养液中培养；

所述培养液由DMEM/F12无血清培养液、血清替代物、bFGF和BMP-2组成；

所述培养液中bFGF和BMP-2的质量比为(8～12)：(8～12)；

所述I型胶原水凝胶中I型胶原的浓度为5mg/mL～15mg/mL。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述接种的密度为1×10⁸个/mL。

6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述原代培养具体为：将牙髓组织经I型胶原酶消化后以原代培养液培养至细胞80％～90％汇合；所述原代培养液由DMEM/F12无血清培养液、血清替代物、bFGF和EGF组成。

7.根据权利要3所述的培养方法，其特征在于，所述原代培养液中bFGF和EGF的质量比为(8～12)：(8～12)。