CN109805890A

CN109805890A - 一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法

Info

Publication number: CN109805890A
Application number: CN201811463821.3A
Authority: CN
Inventors: 陈亮
Original assignee: Zhejiang Jing Jia Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Jing Jia Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2019-05-28

Abstract

本发明公开了一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法。本发明具有如下步骤：(1)交联透明质酸钠凝胶用含底物荧光素的透析液透析溶胀；(2)将溶胀完成的交联透明质酸钠凝胶制成凝胶颗粒；(3)凝胶颗粒，用预灌封注射器灌装、灭菌，得到交联透明质酸钠凝胶注射剂，注射于动物体皮下部位；(4)将可持续表达荧光蛋白的细胞注射至动物体腹腔部位，通过活体成像仪器观察出现荧光的细胞情况，从而评价注射的交联透明质酸钠凝胶在体内的降解周期。本发明具有数据真实准确、方法科学可行等优点。

Description

一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法

技术领域

本发明属于生物降解技术领域，特别是涉及一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法。

背景技术

透明质酸类产品是目前最流行的可吸收皮肤填充剂，作为一种生理活性物质，广泛分布在动物和人体结缔组织细胞外基质中。他在溶液中无规则转曲状态和它的流体动力学特性，赋予其某些重要的物理特性如高粘弹性，可塑性，独特的流变学特性以及良好的生物相容性。正因为如此，它是一种用途广泛的可吸收生物材料。随着科技发展，玻璃酸钠的交联技术也日益提高，通过交联可获得不同分子量大小和不同结构的交联玻璃酸钠，他们的性状如粘弹性，降解时间等也各不相同，根据这些特性，适应症和具体用途也各不相同。

在新产品开发过程中，一般是通过体外酶解的方式来评价透明质酸的交联度，从而间接反映该产品的降解周期，推断临床应用上的维持时间，但这种方法受到诸多因素影响，如体外酶解实验凝胶颗粒的分散状态和实际临床应用中凝胶颗粒的状态、模拟酶解条件中酶浓度和人体类实际酶浓度等都会影响最终结果的判断，且两种方法之间的关联性无法得到很好的认证。另外一种是采用动物皮下植入的方式，传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据，得到多个时间点的实验结果，动物的个体差异以及目视法评估的方法(尤其是降解后期)均对实验结果的判断存在一定的影响。

为了解决现有技术存在的问题，本发明开发了一种利用活体动物体内可见光成型技术原理，评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，该方法采用体内可见光成像技术通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)，所得的数据也更科学、真实可信，为评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期提供了更为科学的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法。本发明具有数据真实准确、方法科学可行的优点。

为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：

一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，具有如下步骤：

(1)透析与溶胀：交联透明质酸钠凝胶用含底物荧光素的透析液透析，直至凝胶溶胀至所需重量；

(2)制粒：将溶胀完成的交联透明质酸钠凝胶，用筛网进行制粒得到所需粒径的交联透明质酸钠凝胶颗粒；

(3)灌装灭菌：将步骤(2)制备得到的交联透明质酸钠凝胶颗粒，用预灌封注射器灌装、灭菌，得到交联透明质酸钠凝胶注射剂，注射于动物体皮下部位；

(4)将可持续表达荧光蛋白的细胞注射至动物体腹腔部位，通过活体成像仪器观察出现荧光的细胞情况，从而评价注射的交联透明质酸钠凝胶在体内的降解周期。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(1)中，所述交联透明质酸钠凝胶通过如下方法制备：透明质酸钠原料用含有交联剂的氢氧化钠溶液完全溶解得到透明质酸钠凝胶，溶解完成后将凝胶制备成一定厚度的块状，在水浴内加热保温，进行交联反应。

在本发明的一个优选实施中，所述透明质酸钠原料为发酵法或鸡冠提取法制备。

在本发明的一个优选实施中，所述氢氧化钠溶液的质量浓度为0.5-3.5％。

在本发明的一个优选实施中，溶解完成后的透明质酸钠质量浓度为12-24％。

在本发明的一个优选实施中，所述交联剂与透明质酸钠原料的质量比为1:5-1:30。

在本发明的一个优选实施中，所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、聚乙二醇、京尼平、碳化二亚胺中的一种或任意两种以上的混合。

在本发明的一个优选实施中，所述水浴温度为20℃-60℃。

在本发明的一个优选实施中，所述交联反应时间为1h-4h。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(1)中，所述透析液为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和底物荧光素组成的生理平衡液。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(1)中，所述透析液所用的量为凝胶重量的10-50倍。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(1)中，透析过程中根据透析结果更换透析液的次数为2-6次。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(1)中，透析终点的控制为溶胀后的块状凝胶为溶胀前的块状凝胶重量的40-90倍。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(2)中，所述交联透明质酸钠凝胶颗粒的粒径为150-600μm。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(4)中，可持续表达荧光蛋白的细胞通过如下方法制备：

(4.1)质粒制备：将发光酶基因操纵子luxABCDE克隆进包含腺病毒末端重复序列的载体质粒pAOV.SYN.GFP，获得足够量的重组AAV表达质粒DNA；

(4.2)将液氮冻存的AAV293系细胞在37℃水浴中复苏，在完全培养基中进行培养，过程换液2-3次，汇合率达到50％用培养皿进行传代，，倒置显微镜观察细胞汇合率达到60-70％，即得到病毒包装用细胞；

(4.3)将步骤(4.1)得到的重组AAV表达质粒DNA，用pH7.5TE缓冲液将质粒的浓度调整到1mg/ml后，连同包装质粒和辅助质粒吸取各12ul，与1ml浓度为0.3mol/L的CaCl₂溶液混合，振匀备用；

(4.4)吸取1ml的2X HBS与0.8ml前一步骤得到的的DNA/CaCl2混合，观察产生的白色沉淀大小，如未出现明显的絮状沉淀，将混合液液缓慢滴加至细胞培养皿内，同时轻轻晃动，使得尽量均匀分散，在5％CO2培养箱，37℃条件下培养6h后更换新鲜的完全培养基，过程换液2-3次，约60h后观察出毒效果，倒置显微镜下观察绿色荧光达到70-90％覆盖面时病毒包装完成；

(4.5)弃去细胞培养皿上清液，用胰酶-EDTA溶液消化细胞2-3min后，反复吹打使贴壁细胞从培养皿上脱落，收集细胞后，在液氮中反复冻融三次使细胞破碎，离心，收集病毒上清液备用；

(4.6)配制4中不同浓度的碘克沙醇溶液，在高速冷冻离心管内制备密度梯度离心体系，从下到上分别为浓度依次升高的碘克沙醇溶液，最上一层为病毒上清液，高速冷冻离心，收集富集的病毒颗粒，用PBS缓冲液分散病毒颗粒后，再离心超滤，去除残留的碘克沙醇，最终得到0.5ml含发光酶基因的AAV病毒浓缩液；

(4.7)将含发光酶基因的AAV病毒感染293T细胞，培养4h后，加入浓度为150mg/ml的底物荧光素0.1ml培养20min，得到可持续表达荧光蛋白的细胞。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(4.6)中，密度梯度离心体系中碘克沙醇溶液的浓度为10％、20％、30％、40％、50％、60％中的任意四种组合。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(4.6)中，收集富集病毒颗粒的浓度区间为40％、50％、60％中的任意两种组合。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(4.6)中，密度梯度所使用离心力为50000至150000g。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(4.6)中，去除残留的碘克沙醇所用到超滤管内超滤膜分子量的范围为5000-100000道尔顿。

在本发明的一个优选实施中，所述步骤(4.7)中，加入底物荧光素的浓度为30-150mg/ml。

活体动物体内可见光成像技术的原理是：将荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源(腹腔或静脉注射)给予其底物荧光素，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。

本发明因植入动物体内的凝胶已被标记底物荧光素，随着交联透明质酸钠的降解缓慢而持续的释放出底物荧光素，3h被代谢出体外。在拟评价时间段内，给动物注射可持续表达荧光蛋白的细胞，交联联透明质酸钠凝胶降解而释放的底物荧光素激发细胞内表达的荧光蛋白，10min后荧光表达到达最高点，持续30min后开始衰减。如在1min至35min阶段内能持续捕捉到出现荧光的细胞，可以判断交联透明质酸钠凝胶在体内是否降解完成。

本发明的评价方法采用体内可见光成像技术通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)，所得的数据也更科学、真实可信，为评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期提供了更为科学的方法。

具体实施方式

以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。

实施例1

配制0.8％浓度的氢氧化钠溶液200ml，加入2000μL的BDDE，混匀备用，常温条件下取30g的透明质酸钠原料，与上述溶液混匀，搅拌溶解，直至肉眼无可见白色未溶解HA为止。调节水浴温度至45℃，将溶解完的HA水浴保温交联反应60min后取出，冰箱冷藏，过夜保存。将交联完的HA凝胶分割成尺寸为1-2cm的正方形块状，备用。配制渗透压为250-350mosmol/kg的生理平衡液(含氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，底物荧光素(luciferin)，注射用水)，将块状凝胶加入，低速搅拌溶胀，分别间隔2h，20h和24h更换缓冲液，每次8L，直至缓冲液PH至中性和凝胶重量为1500g左右，达到透析终点，停止透析。将透析完成的凝胶用40目筛网制粒，连续2次，收集最终样品后，灌装至预灌封注射器内，1ml/支，于121℃-F0＝12条件下灭菌，样品编号A。制备浓度为8U/ml透明质酸酶溶液，备用。称取0.2g的编号A样品3份，置10ml西林瓶中，每份依次加入磷酸盐缓冲液2ml、透明质酸酶溶液1.0ml，加塞，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于1h、3h、24h取出，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液经12000r/min，离心15min，取1ml上清液于试管中，采用咔唑法检测HA含量，计算不同时间点的酶解效率【各时间点体外酶解率＝上清液HA含量/样品标示含量x100％)】。分别配制2xHBS缓冲液，氯化钙溶液，EDTA-胰酶溶液，TE缓冲液，DMEM完全培养基(含10％胎牛血清)，PBS缓冲液，10％、30％，40％和60％浓度的碘克沙醇溶液备用。液氮冻存的AAV293系细胞在37℃水浴中复苏，在DMEM完全培养基中进行培养，调节培养箱CO₂浓度为5％，设置温度37℃，在2h和12h更换完全培养基，显微镜观察细胞汇合率达到50％左右，用3x100mm培养皿进行传代，调节培养箱CO₂浓度为5％，设置温度37℃，在6和24和36h更换培养基，显微镜观察细胞汇合率达到70％左右，得到病毒包装用细胞。将含发光酶基因的质粒，用pH7.5TE缓冲液将质粒的浓度调整到1mg/ml后，连同包装质粒和辅助质粒吸取各12ul，与1ml浓度为0.3mol/L的CaCl₂溶液混合，漩涡振荡器振匀制备得DNA/CaCl₂混合物。吸取1ml的2X HBS与0.8ml DNA/CaCl₂混合，观察产生的白色沉淀大小，立即将混合液液缓慢滴加至细胞培养皿内，同时轻轻晃动细胞培养皿，使得尽量均匀分散，在5％CO2培养箱，37℃条件下培养6h后更换新鲜的完全培养基，过程换液2-3次，55h后观察出毒效果，倒置显微镜下观察绿色荧光达到90％覆盖面，病毒包装完成。弃去细胞培养皿上清液，用胰酶-EDTA溶液消化细胞约3min后，反复吹打使贴壁细胞从培养皿上脱落，收集细胞后，在液氮中反复冻融三次使细胞破碎裂解，于8000转/min条件下离心20min，收集病毒裂解液备用。配制密度梯度离心体系，碘克沙醇从下到上浓度分别为10％、30％，40％和60％，最上一层为病毒裂解液，高速冷冻离心16h，在50％浓度碘克沙醇和40％浓度碘克沙醇浓度区间内收集富集的病毒颗粒，用30ml的PBS缓冲液分散病毒颗粒后，在12000道尔顿的超滤管内离心超滤，去除残留的碘克沙醇，最终得到0.5ml含发光酶基因的AAV病毒浓缩液。将含发光酶基因的AAV病毒感染293T细胞，在5％CO2培养箱，37℃条件下培养4h，加入浓度为150mg/ml的底物荧光素(luciferin)0.1ml培养20min，采用活体成像仪器检测活细胞，结果可捕捉荧光，说明受感染的细胞能持续表达荧光蛋白。将细胞离心收集，弃去上清液，用0.5ml无菌PBS缓冲液分散细胞，注射至步骤小鼠腹腔部位，通过活体成像仪器，等待约1min后开始采用CCD直接捕捉光信号，直至40min后结束。

实施例2

配制0.8％浓度的氢氧化钠溶液200ml，加入2000μL的BDDE，混匀备用，常温条件下取30g的透明质酸钠原料，与上述溶液混匀，搅拌溶解，直至肉眼无可见白色未溶解HA为止。调节水浴温度至45℃，将溶解完的HA水浴保温交联反应120min后取出，冰箱冷藏，过夜保存。将交联完的HA凝胶分割成尺寸为1-2cm的正方形块状，备用。配制渗透压为250-350mosmol/kg的生理平衡液(含氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，底物荧光素(luciferin)，注射用水)，将块状凝胶加入，低速搅拌溶胀，分别间隔2h，20h和24h更换缓冲液，每次8L，直至缓冲液PH至中性和凝胶重量为1500g左右，达到透析终点，停止透析。将透析完成的凝胶用40目筛网制粒，连续2次，收集最终样品后，灌装至预灌封注射器内，1ml/支，于121℃-F0＝12条件下灭菌，样品编号B。制备浓度为8U/ml透明质酸酶溶液，备用。称取0.2g的编号B样品3份，置10ml西林瓶中，每份依次加入磷酸盐缓冲液2ml、透明质酸酶溶液1.0ml，加塞，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于1h、3h、24h取出，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液经12000r/min，离心15min，取1ml上清液于试管中，采用咔唑法检测HA含量，计算不同时间点的酶解效率【各时间点体外酶解率＝上清液HA含量/样品标示含量x100％)】。分别配制2xHBS缓冲液，氯化钙溶液，EDTA-胰酶溶液，TE缓冲液，DMEM完全培养基(含10％胎牛血清)，PBS缓冲液，10％、30％，40％和60％浓度的碘克沙醇溶液备用。液氮冻存的AAV293系细胞在37℃水浴中复苏，在完全培养基中进行培养，调节培养箱CO₂浓度为5％，设置温度37℃，在2h和12h更换完全培养基，显微镜观察细胞汇合率达到50％左右，用3x100mm培养皿进行传代，调节培养箱CO₂浓度为5％，设置温度37℃，在6和24和36h更换培养基，显微镜观察细胞汇合率达到70％左右，得到病毒包装用细胞。将含发光酶基因的质粒，用pH7.5TE缓冲液将质粒的浓度调整到1mg/ml后，连同包装质粒和辅助质粒吸取各12ul，与1ml浓度为0.3Mol/L的CaCl₂溶液混合，漩涡振荡器振匀制备得DNA/CaCl₂混合物。吸取1ml的2X HBS与0.8ml DNA/CaCl₂混合，观察产生的白色沉淀大小，立即将混合液液缓慢滴加至细胞培养皿内，同时轻轻晃动细胞细胞培养皿，使得尽量均匀分散，在5％CO₂培养箱，37℃条件下培养6h后更换新鲜的完全培养基，过程换液2-3次，55h后观察出毒效果，倒置显微镜下观察绿色荧光达到90％覆盖面，病毒包装完成。弃去细胞培养皿上清液，用胰酶-EDTA溶液消化细胞约3min后，反复吹打使贴壁细胞从培养皿上脱落，收集细胞后，在液氮中反复冻融三次使细胞破碎裂解，于8000转/min条件下离心20min，收集病毒裂解液备用。配制密度梯度离心体系，碘克沙醇从下到上浓度分别为10％、30％，40％和60％，最上一层为病毒裂解液，高速冷冻离心16h，在50％浓度碘克沙醇和40％浓度碘克沙醇浓度区间内收集富集的病毒颗粒，用30ml的PBS缓冲液分散病毒颗粒后，在12000道尔顿的超滤管内离心超滤，去除残留的碘克沙醇，最终得到0.5ml含发光酶基因的AAV病毒浓缩液。将含发光酶基因的AAV病毒感染293T细胞，在5％CO₂培养箱，37℃条件下培养4h，加入浓度为150mg/ml的底物荧光素(luciferin)0.1ml培养20min，采用活体成像仪器检测活细胞，结果可捕捉荧光，说明受感染的细胞能持续表达荧光蛋白。将细胞离心收集，弃去上清液，用0.5ml无菌PBS缓冲液分散细胞，注射至步骤小鼠腹腔部位，通过活体成像仪器，等待约1min后开始采用CCD直接捕捉光信号，直至40min后结束。

实施例3

配制0.8％浓度的氢氧化钠溶液200ml，加入2000μL的BDDE，混匀备用，常温条件下取30g的透明质酸钠原料，与上述溶液混匀，搅拌溶解，直至肉眼无可见白色未溶解HA为止。调节水浴温度至45℃，将溶解完的HA水浴保温交联反应180min后取出，冰箱冷藏，过夜保存。将交联完的HA凝胶分割成尺寸为1-2cm的正方形块状，备用。配制渗透压为250-350mosmol/kg的生理平衡液(含氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，底物荧光素，注射用水)，将块状凝胶加入，低速搅拌溶胀，分别间隔2h，20h和24h更换缓冲液，每次8L，直至缓冲液PH至中性和凝胶重量为1500g左右，达到透析终点，停止透析。将透析完成的凝胶用40目筛网制粒，连续2次，收集最终样品后，灌装至预灌封注射器内，1ml/支，于121℃-F0＝12条件下灭菌，样品编号C。制备浓度为8U/ml透明质酸酶溶液，备用。称取0.2g的编号C样品3份，置10ml西林瓶中，每份依次加入磷酸盐缓冲液2ml、透明质酸酶溶液1.0ml，加塞，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于1h、3h、24h取出，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液经12000r/min，离心15min，取1ml上清液于试管中，采用咔唑法检测HA含量，计算不同时间点的酶解效率【各时间点体外酶解率＝上清液HA含量/样品标示含量x100％)】。分别配制2xHBS缓冲液，氯化钙溶液，EDTA-胰酶溶液，TE缓冲液，DMEM完全培养基(含10％胎牛血清)，PBS缓冲液，10％、30％，40％和60％浓度的碘克沙醇溶液备用。液氮冻存的AAV293系细胞在37℃水浴中复苏，在完全培养基中进行培养，调节培养箱CO₂浓度为5％，设置温度37℃，在2h和12h更换完全培养基，显微镜观察细胞汇合率达到50％左右，用3x100mm培养皿进行传代，调节培养箱CO₂浓度为5％，设置温度37℃，在6和24和36h更换培养基，显微镜观察细胞汇合率达到70％左右，得到病毒包装用细胞。将含发光酶基因的质粒，用pH7.5TE缓冲液将质粒的浓度调整到1mg/ml后，连同包装质粒和辅助质粒吸取各12ul，与1ml浓度为0.3Mol/L的CaCl₂溶液混合，漩涡振荡器振匀制备得DNA/CaCl₂混合物。吸取1ml的2X HBS与0.8ml DNA/CaCl₂混合，观察产生的白色沉淀大小，立即将混合液液缓慢滴加至细胞培养皿内，同时轻轻晃动细胞细胞培养皿，使得尽量均匀分散，在5％CO₂培养箱，37℃条件下培养6h后更换新鲜的完全培养基，过程换液2-3次，55h后观察出毒效果，倒置显微镜下观察绿色荧光达到90％覆盖面，病毒包装完成。弃去细胞培养皿上清液，用胰酶-EDTA溶液消化细胞约3min后，反复吹打使贴壁细胞从培养皿上脱落，收集细胞后，在液氮中反复冻融三次使细胞破碎裂解，于8000转/min条件下离心20min，收集病毒裂解液备用。配制密度梯度离心体系，碘克沙醇从下到上浓度分别为10％、30％，40％和60％，最上一层为病毒裂解液，高速冷冻离心16h，在50％浓度碘克沙醇和40％浓度碘克沙醇浓度区间内收集富集的病毒颗粒，用30ml的PBS缓冲液分散病毒颗粒后，在12000道尔顿的超滤管内离心超滤，去除残留的碘克沙醇，最终得到0.5ml含发光酶基因的AAV病毒浓缩液。将含发光酶基因的AAV病毒感染293T细胞，在5％CO₂培养箱，37℃条件下培养4h，加入浓度为150mg/ml的底物荧光素(luciferin)0.1ml培养20min，采用活体成像仪器检测活细胞，结果可捕捉荧光，说明受感染的细胞能持续表达荧光蛋白。将细胞离心收集，弃去上清液，用0.5ml无菌PBS缓冲液分散细胞，注射至步骤小鼠腹腔部位，通过活体成像仪器，等待约1min后开始采用CCD直接捕捉光信号，直至40min后结束。

实施例4

配制0.8％浓度的氢氧化钠溶液200ml，加入2000μL的BDDE，混匀备用，常温条件下取30g的透明质酸钠原料，与上述溶液混匀，搅拌溶解，直至肉眼无可见白色未溶解HA为止。调节水浴温度至45℃，将溶解完的HA水浴保温交联反应180min后取出，冰箱冷藏，过夜保存。将交联完的HA凝胶分割成尺寸为1-2cm的正方形块状，备用。配制渗透压为250-350mosmol/kg的生理平衡液(含氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，底物荧光素，注射用水)，将块状凝胶加入，低速搅拌溶胀，分别间隔2h，20h和24h更换缓冲液，每次8L，直至缓冲液PH至中性和凝胶重量为1500g左右，达到透析终点，停止透析。将透析完成的凝胶用100目筛网制粒，连续2次，收集最终样品后，灌装至预灌封注射器内，1ml/支，于121℃-F0＝12条件下灭菌，样品编号D。制备浓度为8U/ml透明质酸酶溶液，备用。称取0.2g的编号D样品3份，置10ml西林瓶中，每份依次加入磷酸盐缓冲液2ml、透明质酸酶溶液1.0ml，加塞，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于1h、3h、24h取出，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液经12000r/min，离心15min，取1ml上清液于试管中，采用咔唑法检测HA含量，计算不同时间点的酶解效率【各时间点体外酶解率＝上清液HA含量/样品标示含量x100％)】。分别配制2xHBS缓冲液，氯化钙溶液，EDTA-胰酶溶液，TE缓冲液，DMEM完全培养基(含10％胎牛血清)，PBS缓冲液，10％、30％，40％和60％浓度的碘克沙醇溶液备用。液氮冻存的AAV293系细胞在37℃水浴中复苏，在完全培养基中进行培养，调节培养箱CO₂浓度为5％，设置温度37℃，在2h和12h更换完全培养基，显微镜观察细胞汇合率达到50％左右，用3x100mm培养皿进行传代，调节培养箱CO₂浓度为5％，设置温度37℃，在6和24和36h更换培养基，显微镜观察细胞汇合率达到70％左右，得到病毒包装用细胞。将含发光酶基因的质粒，用pH7.5TE缓冲液将质粒的浓度调整到1mg/ml后，连同包装质粒和辅助质粒吸取各12ul，与1ml浓度为0.3Mol/L的CaCl₂溶液混合，漩涡振荡器振匀制备得DNA/CaCl₂混合物。吸取1ml的2X HBS与0.8ml DNA/CaCl₂混合，观察产生的白色沉淀大小，立即将混合液液缓慢滴加至细胞培养皿内，同时轻轻晃动细胞细胞培养皿，使得尽量均匀分散，在5％CO₂培养箱，37℃条件下培养6h后更换新鲜的完全培养基，过程换液2-3次，55h后观察出毒效果，倒置显微镜下观察绿色荧光达到90％覆盖面，病毒包装完成。弃去细胞培养皿上清液，用胰酶-EDTA溶液消化细胞约3min后，反复吹打使贴壁细胞从培养皿上脱落，收集细胞后，在液氮中反复冻融三次使细胞破碎裂解，于8000转/min条件下离心20min，收集病毒裂解液备用。配制密度梯度离心体系，碘克沙醇从下到上浓度分别为10％、30％，40％和60％，最上一层为病毒裂解液，高速冷冻离心16h，在50％浓度碘克沙醇和40％浓度碘克沙醇浓度区间内收集富集的病毒颗粒，用30ml的PBS缓冲液分散病毒颗粒后，在12000道尔顿的超滤管内离心超滤，去除残留的碘克沙醇，最终得到0.5ml含发光酶基因的AAV病毒浓缩液。将含发光酶基因的AAV病毒感染293T细胞，在5％CO₂培养箱，37℃条件下培养4h，加入浓度为150mg/ml的底物荧光素(luciferin)0.1ml培养20min，采用活体成像仪器检测活细胞，结果可捕捉荧光，说明受感染的细胞能持续表达荧光蛋白。将细胞离心收集，弃去上清液，用0.5ml无菌PBS缓冲液分散细胞，注射至步骤小鼠腹腔部位，通过活体成像仪器，等待约1min后开始采用CCD直接捕捉光信号，直至40min后结束。

实施例5

以上实施例1-4中，含荧光素酶基因的293系细胞，注射至小鼠体内观察是否出现光信号的时间点，分别为含底物荧光素的交联透明质酸钠注射至小鼠体内的2个月，4个月，6个月，8个月，10个月。活体成像仪器CCD捕捉光信号观察情况利于表1中。表2是体外酶解率的检测指标所反应的降解速率。

表1实施例1-4活体成像仪器CCD捕捉光信号观察情况

表2

实施例中，通过调整交联反应时间，最终得到的样品交联度有所区别，实施例1→实施例3逐渐加大，理论上在动物体内降解周期也会逐渐增加。表1中，随着交联透明质酸钠的降解，缓慢释放出的底物荧光素激发含荧光素酶的细胞表达荧光的结果，与表2体外酶解率的检测指标所反应出的降解速率的趋势一致。交联度低的A样品在6个月未能捕捉到荧光说明交联透明质酸在4-6个月之内已经降解完毕，B和D样品结果一致，6个月可见荧光信号、8个月未见荧光信号，说明降解周期接近，均在6-8个月内降解完毕。编号C样品在8个月仍然可捕捉到激发的荧光，说明在这个时间点内小鼠体内含底物荧光素的交联透明质酸钠还未完全降解完成，与编号C样品交联度最高、体外酶解率的结果是符合的。

通过以上结论，该发明体现的一种评价交联透明质酸钠降解周期的方法是合理可行的。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

Claims

1.一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，具有如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，交联透明质酸钠凝胶通过如下方法制备：透明质酸钠原料用含有交联剂的氢氧化钠溶液完全溶解得到透明质酸钠凝胶，溶解完成后将凝胶制备成一定厚度的块状，在水浴内加热保温，进行交联反应。

3.根据权利要求2所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的质量浓度为0.5-3.5％；溶解完成后的透明质酸钠质量浓度为12-24％；所述交联剂与透明质酸钠原料的质量比为1:5-1:30；所述水浴温度为20℃-60℃，交联反应时间为1h-4h。

4.根据权利要求2所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、聚乙二醇、京尼平、碳化二亚胺中的一种或任意两种以上的混合。

5.根据权利要求2所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述透析液为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和底物荧光素组成的生理平衡液。

6.根据权利要求1所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，透析终点的控制为溶胀后的块状凝胶为溶胀前的块状凝胶重量的40-90倍。

7.根据权利要求1所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述交联透明质酸钠凝胶颗粒的粒径为150-600μm。

8.根据权利要求1所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，可持续表达荧光蛋白的细胞通过如下方法制备：

9.根据权利要求8所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(4.6)中，密度梯度离心体系中碘克沙醇溶液的浓度为10％、20％、30％、40％、50％、60％中的任意四种组合。

10.根据权利要求8所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(4.7)中，加入底物荧光素的浓度为30-150mg/ml。