CN110507855B - 一种用于局部支撑作用的异种肋软骨制备方法 - Google Patents

一种用于局部支撑作用的异种肋软骨制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于局部支撑作用的异种肋软骨制备方法，包括原材料的选择、取材、保存处理、缓动、切割处理、清洗、浸泡、再次清洗、钝化处理、成品保存；该技术完全不同于传统的生物组织产品制备工艺，是采用高浓度盐溶液渗透破坏材料内细胞后利用表面活性剂和低氧化剂对进行固定和钝化处理。使用该技术处理的异种肋软骨，在消除其中的免疫原性物质外，对材料本身的生物相容性和生物强度不产生影响。

Description

一种用于局部支撑作用的异种肋软骨制备方法
技术领域
本发明涉及异种肋软骨的制备，具体的说是一种用于局部支撑作用的异种肋软骨制备方法。
背景技术
异种肋软骨制备方法是基于目前在临床使用过程中，常见的多种同种异体产品和异种异体产品传统制备工艺上研发衍生而出的。随着现代生物医学技术的发展，同种异体和异种异体组织工程产品越来越丰富，应用范围也越来越广泛。肋软骨就是其中的一种，其主要应用于医疗美容方面，用于鼻中隔手术当中。目前市场当中主要以假体材料和同种异体肋软骨为主，异种肋软骨的应用还较为少见。
假体材料主要是以膨化材料和硅胶为主，目前应用也较为普遍，具有价格相对较低、使用方便简单、无免疫原性等优点。但其缺点也较为明显：1、移植部位会出现麻木无感的情况，在手术过程中除会破坏手术部位部分血管神经外，假体材料通常无法与组织产生融合的作用。即受体的血管和组织永远无法延假体材料生长，受体会长期存在异物感和植入处麻木无感的情况；2、材料形状固定无法个性化生产，假体材料通常是批量进行生产，只拥有固定的几种模型。而在实际应用中每一位接受植入的受体需求均不相同，手术医生也无法进行个性化的雕塑成型；3、生物相容性要求不一致，目前我国还没用对此类假体材料进行明确的要求，而每一厂家对产品的生物相容性要求也不一致，目前在实际应用当中出现较多的就是材料的降解和局部的炎性反应，这进一步增加了使用的风险。
同种异体肋软骨，其是一种优秀的鼻假体植入材料。除具有良好的生物相容性和低免疫原性外，在手术过程医生更具需要手术者不同的要求进行个性化的雕塑成型。植入后形状自然且基本不会出现异样的感觉。但目前原材料的来源限制让该产品产量，并非所有捐献的人肋软骨都可以制备成为产品。通常捐献者的年龄较大，其肋软骨断面中心处已出现了明显的软骨钙化显现，外层纤维化且伴有大量色素沉积，部分在软骨内侧会出现大量的脂质沉积。在软骨膜去除后表面会出现大量裂纹或空泡。这样的捐献体无法用于同种异体肋软骨的生产。而年龄较小的捐献体肋软骨发育不全无法使用。只有发育完全且骨骼健康的捐献体方可使用。通常筛选后材料的数量十不存一。
对于异种异体组织材料，如果需要应用在患者身体上，首要面对的就是如何除去组织上携带的免疫原性的问题。在传统的同种异体、异种异体组织产品制备过程中，均难免会使用到如：醇类、醚类、酮类、强氧化物、强酸、强碱等化学试剂；或是在物理上进行高温、高压、强辐射等工艺。这些方式虽然可以有效的去除组织中的免疫原性物质。但同时，也会破坏软骨的结构组成，使其发生变性，产品也无法正常使用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种能够解决原材料的来源问题、同时不会破坏软骨的结构组成的异种肋软骨制备方法。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明是一种用于局部支撑作用的异种肋软骨制备方法，包括如下步骤：
1）原材料的选择：选择与成年人相似的动物，并遵循YY/T0771.2-2009《动物源医疗器械第2部分：来源、收集与处置的控制》中的要求，供应方应提供动物的属性及进三代的血统证明，调查和排出可能含有传播性海绵状脑病因子的动物；
2）取材：供体死亡后立即在洁净环境下进行取材，在取材时应严格避免碰触或破坏内脏；
3）保存处理：将步骤2中获取的肋软骨材料密封先放入到深低温冰箱内进行保存，保存时间为2-48小时，保存温度应设定为-70℃～-80℃；
4）缓动：将步骤3中肋软骨材料取出先放入到温度为-20℃～-40℃的冰箱内进行缓动，使材料逐渐升温，缓动后逐渐使肋软骨材料升温至常温；
5）切割处理：将步骤4中常温的肋软骨材料转到洁净区域内按照规定尺寸和形状进行剪裁或切割，在不破话材料原本结构的基础上并采用机械的方式去除异种异体肋软骨表面的骨膜，去除率应达到95%以上；
6）清洗：在洁净环境下，采用纯化水或纯化水以上用水对步骤5中的肋软骨材料的表面进行初步清洗，将材料表面的血液、组织液清洗干净，清洗时间不超过20min，清洗结束后将材料表面水分自然控干至无水珠滴落；
7）浸泡：将经过步骤6处理的软骨材料采用饱和盐溶液进行浸泡，使用精密衡温水域器进行控温，使温度保持在40℃下，浸泡时间为1～6小时，完成浸泡后关闭精密衡温水域器，使得温度逐步升至常温后取出材料，使用纯化水进行浸泡并逐渐升温至40℃保持浸泡1～2小时，该步骤反复2～3次；
8）再次清洗：使用超声波清洗机，并加入表面活性剂，对步骤7中的软骨材料进行均匀清洗，表面活性剂的浓度为0.01%～45%，PH为5.0～8.0，清洗时间为0.5～2小时；
9）钝化处理：使用氧化剂对经过步骤8处理的软骨材料表面进行钝化处理，钝化处理时间为5～10min，钝化结束后使用纯化水进行清洗；
10）成品保存：选用一种或几种保护液对经过步骤9处理的软骨材料进行保护，并实用密封的方式进行密封保存，使用低剂量的辐照方式进行灭菌，辐照计量应控制在5～25Kgy，经过灭菌后的产品保存在-20℃以下的环境内。
本发明的进一步改进在于：步骤3中的肋软骨材料相互间隔放置在深低温冰箱内进行保存，避免堆积。
本发明的进一步改进在于：步骤7中的饱和盐溶液为氯化钠、氯化钙、氯化锂、氯化镁、氯化钾中的一种或几种组合溶液，在40℃下配置。
本发明的进一步改进在于：步骤8中的表面活性剂为聚氧乙烯醇、聚山梨酯、月桂酰肌酸盐、二甲基亚砜、月桂酸钾、甲基对苯而酚或苏拉明钠。
本发明的进一步改进在于：步骤9中的氧化剂为5%过氧化氢、稀硝酸、氯酸钾或臭氧。
本发明的进一步改进在于：步骤10中的保护液位甘油、二甲基亚砜、聚山梨酯、聚氧乙烯醇或乙酰胺。
本发明的有益效果是：本发明采用的异种肋软骨制备方法完全不同于传统的生物组织产品的制备工艺，是采用高浓度盐溶液渗透破坏材料内细胞后利用表面活性剂和低氧化剂对进行固定和钝化处理，过大量实验表明，使用该技术处理的异种肋软骨，在消除其中的免疫原性物质外，对材料本身的生物相容性和生物强度不产生影响。同时原材料选自动物，能够有效解决材料来源问题。
附图说明
图1是免疫原性检测结果统计图。
具体实施方式
为了加强对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明进行详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
本发明是一种用于局部支撑作用的异种肋软骨制备方法，包括如下步骤：
1）原材料的选择：选择与成年人相似的动物，并遵循YY/T0771.2-2009《动物源医疗器械 第2部分：来源、收集与处置的控制》中的要求，供应方应提供动物的属性及进三代的血统证明，调查和排出可能含有传播性海绵状脑病因子的动物；
2）取材：供体死亡后立即在洁净环境下进行取材，在取材时应严格避免碰触或破坏内脏；
3）保存处理：将步骤2中获取的肋软骨材料密封后先放入到深低温冰箱内进行保存，保存时间为2-48小时，保存温度应设定为-70℃～-80℃；在放入深低温冰箱内使应相互间隔存放，避免相互堆积。
4）缓动：将步骤3中肋软骨材料取出先放入到温度为-20℃～-40℃的冰箱内进行缓动，使材料逐渐升温，缓动后逐渐使肋软骨材料升温至常温；
5）切割处理：将步骤4中常温的肋软骨材料转到洁净区域内按照规定尺寸和形状进行剪裁或切割，在不破话材料原本结构的基础上并采用机械的方式去除异种异体肋软骨表面的骨膜，去除率应达到95%以上；
6）清洗：在洁净环境下，采用纯化水或纯化水以上用水对步骤5中的肋软骨材料的表面进行初步清洗，将材料表面的血液、组织液清洗干净，清洗时间不超过20min，清洗结束后将材料表面水分自然控干至无水珠滴落；不可使用烘吹的方式加速干燥，且在洁净的环境下进行；
7）浸泡：将经过步骤6处理的软骨材料采用饱和盐溶液进行浸泡，使用精密衡温水域器进行控温，使温度保持在40℃下，浸泡时间为1～6小时，完成浸泡后关闭精密衡温水域器，使得温度逐步升至常温后取出材料，使用纯化水进行浸泡并逐渐升温至40℃保持浸泡1～2小时，该步骤反复2～3次；饱和盐溶液为氯化钠、氯化钙、氯化锂、氯化镁、氯化钾中的一种或几种组合溶液，在40℃下配置；
8）再次清洗：使用超声波清洗机，并加入表面活性剂，对步骤7中的软骨材料进行均匀清洗，表面活性剂的浓度为0.01%～45%，PH为5.0～8.0，清洗时间为0.5～2小时；其中表面活性剂为聚氧乙烯醇、聚山梨酯、月桂酰肌酸盐、二甲基亚砜、月桂酸钾、甲基对苯而酚或苏拉明钠重的任意一种；
9）钝化处理：使用氧化剂对经过步骤8处理的软骨材料表面进行钝化处理，钝化处理时间为5～10min，钝化结束后使用纯化水进行清洗，钝化处理以浸泡为主；其中，氧化剂为5%过氧化氢、稀硝酸、氯酸钾或臭氧中的一种。
10）成品保存：选用一种或几种保护液对经过步骤9处理的软骨材料进行保护，并实用密封的方式进行密封保存，使用低剂量的辐照方式进行灭菌，辐照计量应控制在5～25Kgy，经过灭菌后的产品保存在-20℃以下的环境内。
为了验证通过本方法制备的产品的安全性，对采用本方法制备的软骨组织进行残留细胞的检测和免疫原性的检测。其中残留细胞的检测是按照YY/T1562-2017《组织工程医疗器械产品 生物材料支架细胞活性试验指南》中的方法进行检测，当无法观察到被染色的染色体，或无法检测到有活性的细胞时证明材料无残留细胞。
最终制备后的异种异体骨材料将会应用于临床，对于组织材料中的免疫原性物质必须严格的进行控制。通过体外淋巴细胞刺激试验，可快速进行对组织材料是否残留免疫原性物质进行检测。
选取本方法制备的产品样品进行免疫原性的检测，取适量组织材料样品和浸提液，在无菌条件下操作，在 37℃的条件下，打碎样品并与浸提液混合，静置 12～72h，以3000～6000rpm，3～10min 离心并取上清浸提液，-20℃冻存。使用淋巴细胞分离液分离健康成人外周血中的淋巴细胞，并制备成悬浮液，调整浓度至 1～3*106 /ml。根据 MTT 细胞增殖试验，使用 96 孔板分三组：
a、刺激组；人淋巴细胞和浸提液各 50～100μl；
b、阳性对照组：人淋巴细胞和植物血凝素各 50～100μl；
c、阴性对照组：人淋巴细胞和空白缓冲液各 50～100μl，取平均值。
置于 5%二氧化碳培养箱 37℃，24～72h，每日观察细胞生长情况，离心，取上清液，加入 DMSO，震荡反应 5～10s。在酶标仪上于一定波长处测吸光度A，记录各组吸光度 A的平均值并进行对比。若组织材料中不含有免疫原性物质，吸光度对比应为：试验组≤阴性对照组＜阳性对照组。也可以按YY/T1465.1-2016《医疗器械免疫原性评价方法 第1部分:体外T淋巴细胞转化试验》中的方法来进行检测和判断。
免疫原性检测试验分为四组：试验组 A、本发明方法制备的异种异体软骨材料；
试验组 B、仅对材料进行清洗、灭菌和低温保存；
阴性组 C、不加入任何产品；
阳性组 D、使用一定量的可刺激淋巴细胞增殖的物质，为植物血凝素组；
对这四组进行如下处理：
A 组和 B 组：将样品在无菌条件下制作一定量无菌小颗粒，使用生理盐水进行混合。在 37℃情况下静止 24h 以上，4000rpm离心3min，去上清液-20℃备用；
C 组直接使用等量等温的无菌生理盐水备用；
D 组使用一定量的植物血凝素和无菌生理盐水在等量等温的情况下备用。
抽取健康成年人外周血，使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，并制备悬浮液，调整浓度。根据 MTT 细胞增殖试验，在多孔板中设立四组，即 A、B、C、D 组。每组复设多个复孔，取平均值。放入一定浓度二氧化碳培养箱内 37℃下培养数天。后加入 MTT 继续培养数小时。离心弃上清液，加入 DMSO（二甲基亚砜），中速震荡数秒。设置酶标仪，于 550nm 波长处侧吸光度，参考波长 570nm，分别记录各组吸光度平均值。得到附图1的试验结果。
根据实际测量统计数值：阴性组 C 组吸光度平均值为 600nm，表明 C 组中淋巴细胞未出现明显增殖。A 组与 C 组较为接近，表明 A 组中淋巴细胞增殖不明显。B 组较高于 A、C 两组，表明 B 组中淋巴细胞有一定量的增殖。阳性组 D 组吸光度平均值达到1740nm，表明淋巴细胞在收到免疫源性物质刺激后增殖明显，与其他三组形成明显反差。

Claims (2)

1.一种用于局部支撑作用的异种肋软骨制备方法，包括如下步骤：
1）原材料的选择：选择与成年人相似的动物，并遵循YY/T0771.2-2009《动物源医疗器械第2部分：来源、收集与处置的控制》中的要求，供应方应提供动物的属性及进三代的血统证明，调查和排除可能含有传播性海绵状脑病因子的动物；
2）取材：供体死亡后立即在洁净环境下进行取材，在取材时应严格避免碰触或破坏内脏；
3）保存处理：将步骤2） 中获取的肋软骨材料密封先放入到深低温冰箱内进行保存，保存时间为2-48小时，保存温度应设定为-70℃～-80℃；
4）缓动：将步骤3） 中肋软骨材料取出先放入到温度为-20℃～-40℃的冰箱内进行缓动，使材料逐渐升温，缓动后逐渐使肋软骨材料升温至常温；
5）切割处理：将步骤4） 中常温的肋软骨材料转到洁净区域内按照规定尺寸和形状进行剪裁或切割，在不破坏 材料原本结构的基础上并采用机械的方式去除异种异体肋软骨表面的骨膜，去除率应达到95%以上；
6）清洗：在洁净环境下，采用纯化水或纯化水以上用水对步骤5） 中的肋软骨材料的表面进行初步清洗，将材料表面的血液、组织液清洗干净，清洗时间不超过20min，清洗结束后将材料表面水分自然控干至无水珠滴落；
7）浸泡：将经过步骤6） 处理的软骨材料采用饱和盐溶液进行浸泡，使用精密衡温水浴器进行控温，使温度保持在40℃下，浸泡时间为1～6小时，完成浸泡后关闭精密衡温水浴器，使得温度逐步升至常温后取出材料，使用纯化水进行浸泡并逐渐升温至40℃保持浸泡1～2小时，该步骤反复2～3次；
8）再次清洗：使用超声波清洗机，并加入表面活性剂，对步骤7） 中的软骨材料进行均匀清洗，表面活性剂的浓度为0.01%～45%，pH 为5.0～8.0，清洗时间为0.5～2小时；
9）钝化处理：使用氧化剂对经过步骤8） 处理的软骨材料表面进行钝化处理，钝化处理时间为5～10min，钝化结束后使用纯化水进行清洗；
10）成品保存：选用一种或几种保护液的混合溶液对经过步骤9） 处理的软骨材料进行保护，并使用密封的方式进行密封保存，使用低剂量的辐照方式进行灭菌，辐照计量应控制在5～25kGy ，经过灭菌后的产品保存在-20℃以下的环境内；保护液为甘油、二甲基亚砜、聚山梨酯、聚氧乙烯醇或乙酰胺；
步骤3） 中的肋软骨材料相互间隔放置在深低温冰箱内进行保存，避免堆积；
步骤7） 中的饱和盐溶液为氯化钠、氯化钙、氯化锂、氯化镁、氯化钾中的一种或几种组合溶液，在40℃下配置；
步骤8） 中的表面活性剂为聚氧乙烯醇、聚山梨酯、月桂酰肌酸盐、二甲基亚砜、月桂酸钾、甲基对苯二 酚或苏拉明钠。
2.根据权利要求1所述一种用于局部支撑作用的异种肋软骨制备方法，其特征在于：步骤9） 中的氧化剂为5%过氧化氢、稀硝酸、氯酸钾或臭氧。
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