CN102864172B - 基因共转染技术建立的白血病小鼠模型及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因共转染技术移植建立白血病小鼠模型及其制备方法。本发明提供了一种白血病小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：一、进行K-ras突变体与AML1-ETO融合基因慢病毒载体构建与包装；二、骨髓细胞分离及病毒感染情况监测；三、感染细胞植入小鼠建立白血病动物模型；四、模型鉴定。本发明率先采用了尾静脉注射导入人工定点突变K-ras突变体与AML1-ETO融合基因共转染骨髓细胞的方式建立白血病小鼠模型的方法，本发明提供的白血病小鼠模型，成功率高，病理特征与临床白血病的发病状况相似性高，可以为白血病髓外浸润机制研究，白血病药物筛选，基因和分子靶向治疗提供新的动物模型。

Description

基因共转染技术建立的白血病小鼠模型及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及ras突变体及AML1-ETO融合基因共转染骨髓细胞移植建立白血病小鼠模型及其制备方法。

背景技术

急性骨髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML），是一种骨髓造血前体细胞异常增殖的血液恶性肿瘤，是白血病的一种。其特点是骨髓中不成熟白血球剧增，使得骨髓无法制造健康的血细胞。AML是成年人最常见的急性白血病，其发病率随着人的年龄而增加。AML可以是原发性的，也可能是因为放射线暴露、致癌化学药物暴露造成。目前治疗方法主要以化疗法杀死恶性增殖的癌细胞为主，为了更好的为治疗提供新的策略，建立和人AML尽量接近的动物模型并以此研究确切的发病机制尤为迫切。

小鼠在遗传学与造血系统等方面和人类十分相似，因此建立小鼠白血病模型以研究人类白血病的细胞分子生物学特性、生化免疫特征、病理生理改变、发病机制以及药物治疗和预后具有重要意义。较为常用的C57BL小鼠对白血病因子较敏感，而对化学致癌物诱导作用敏感性低，但全身经放射线照射后，淋巴瘤发生率可达90%～100%。因此C57BL小鼠在评价特定基因或者基因突变在白血病发生中的作用尤其适合。

通过全身辐照后，结合骨髓移植的方法修改供体骨髓中的基因，使外源的基因得以表达并在后续观察其在白血病发病过程中的功能是新近出现的一种快速而便捷的探索新的基因和突变在AML发病中的方法，已经有报道成功的利用这个策略研究了例如N-ras，c-KIT等基因的突变对于AML的影响。

国内外的研究报道表明，N-ras^G12D突变比例高与白血病发病有较强的相关性，通过骨髓重建的小鼠模型验证发现N-ras^G12D突变确实可以显著的促进AML疾病发生及严重程度。K-ras基因是Ras家族的另一个重要成员，它与N-ras基因具有极高的同源性，并且有报道发现AML病人中也存在K-ras^G12D突变，这个突变发生的比例接近前者，但在AML发生中K-ras^G12D突变对于疾病的发生具有怎样的影响目前尚无报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因共转染技术建立的白血病小鼠模型，本发明的另一目的是提供该白血病小鼠模型的制备方法。

本发明所采用的技术方案是，提供一种通过对于K-ras基因进行定点突变，经过病毒包装后导入小鼠骨髓细胞中，而后与转染AML1-ETO融合基因的骨髓细胞应用尾静脉注射的方法共同移植建立白血病小鼠模型的方法注入C57BL小鼠体内，建立一种白血病小鼠模型。

本发明提供了一种白血病小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：

一、K-ras突变体及AML1-ETO融合基因慢病毒载体的构建

设计K-ras突变引物如下：

通过PCR扩增目的基因，回收、酶切、连接至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，进一步完成克隆筛选，测序正确后重新培养含有阳性目的克隆的菌液，提取质粒保存备用；

以Addgene公司购买的AML1-ETO融合基因的质粒为模板，引物设计如下：

PCR产生AML1-ETO（AML1/ETO）基因（基因序列参见文献：Chou FS,Wunderlich M,Griesinger A,Mulloy JC:N-Ras(G12D)induces features ofstepwise transformation in preleukemic human umbilical cord blood culturesexpressing the AML1-ETO fusion gene.Blood 2011,117(7):2237-2240.），将扩增的目的基因亚克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP病毒载体。

二、K-ras突变体及AML1-ETO融合基因慢病毒载体的包装

接种细胞16-20小时后，当细胞接近饱和时进行转染。将293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为polybrene和2%FBS的细胞培养基。第一天，细胞胰酶消化计数后，按照每孔8000细胞接种96孔板，37℃培养过夜，感染时细胞长至30～50％的融合密度；第二天，当天转染时，将病毒液用含有8ug/ml polybrene和2%FBS的细胞培养液进行梯度稀释，然后小心吸去96孔板中的培养基，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100ul加入每孔细胞中，每个稀释度两个重复，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养；第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100ul的完全培养基；第五、六天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数。

三、骨髓细胞分离及病毒感染情况监测

断颈处死小鼠，游离出小鼠的两条下肢，剥离肌肉，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。用无菌注射器轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出，然后离心，去上清。

离心沉淀下来的细胞用PBS冲洗，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养并接种于6孔板中。每孔加入K-ras突变体与AML1-ETO融合基因慢病毒的病毒悬液1～2ml，感染8h后离心收集细胞去上清，一部分种于96孔板中加入新鲜培养液继续培养24h，其它部分用于小鼠骨髓移植用。96孔板中的细胞在培养24～48h后用荧光显微镜观察并拍照。

四、感染细胞植入小鼠建立白血病动物模型

取8周的C57小鼠，先服用一周含有抗生素的水后进行8Gy辐照量的处理，辐照后部分小鼠尾静脉注射0.5～1×10⁶小鼠骨髓细胞/只。

本发明还提供了上述方法建立的一种白血病小鼠模型。

本发明制备得到的一种白血病小鼠模型的性能鉴定：

1、骨髓细胞分型鉴定：

利用c-KIT，Gr-1，Mic-1的抗体对骨髓细胞进行染色后，应用流式细胞仪分析其各组阳性细胞的比例，从而确定AML的恶性程度，结果显示存在大量GFP⁺/c-Kit⁺/Mac-1^-/Gr-1^-细胞，表明模型小鼠具有AML细胞分化比例的显著表征。

2、分子水平鉴定：

对骨髓细胞进行了QPCR鉴定，实验结果显示，模型小鼠的骨髓细胞中仍然具有前述的外转K-ras基因，这说明K-ras基因具有较高的转录产物。

3、蛋白水平的鉴定：

进一步的Western Blot实验结果证明，以上各种蛋白在模型小鼠骨髓中一直处于高表达状态。

4、外周血细胞分型鉴定：

进一步对外周血中的恶性肿瘤细胞的情况进行分析，结果发现，在外周血的图片中，经过Wright-Giemsa染色后，发现存在许多早幼粒白血病细胞，这一特点与临床白血病的发生具有较强的相似性。

本发明首次先采用尾静脉注射导入人工定点突变K-ras突变体骨髓细胞的方式建立白血病小鼠模型的方法，且制备的白血病小鼠模型成功率高，病理特征与临床白血病的发病状况相似性高，本发明建立的白血病小鼠模型可以为白血病发病机理的研究，特别是白血病髓外浸润机制研究；新药的快速研发，特别是白血病药物的筛选；基因和分子靶向治疗提供新的动物模型。

附图说明

图1：突变Ras基因逆转录病毒载体构建及序列验证（构建的突变载体经过测序验证突变位点的正确性）

图2：突变K-ras基因逆转录病毒感染小鼠骨髓细胞荧光成像

图3：骨髓重建小鼠疾病发病情况检测（对发病过程中的部分小鼠（AML1-ETO+K-ras）脾脏，淋巴结，外周血中GFP阳性细胞比率检测）

图4：模型小鼠白血病相关细胞学及分子生物学指标分析

其中A、利用荧光定量PCR技术检测不同组的骨髓移植小鼠骨髓中外源基因mRNA转录水平分析；B、利用western blot技术检测不同组的骨髓移植小鼠骨髓中外源基因蛋白表达水平分析；C、流式细胞术分析部分小鼠（AML1-ETO+K-ras）骨髓细胞表面Mac-1，c-KIT，Gr-1等蛋白表达情况；D、血细胞及骨髓细胞涂片Wright-Giemsa染色检测早幼粒白血病细胞。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1：

基因共转染技术建立的白血病小鼠模型及其制备方法，包括以下技术步骤：

1K-ras突变体及AML1-ETO融合基因慢病毒载体的构建

1.1K-ras突变体融合基因慢病毒载体的构建

通过检索Genbank获得K-ras基因的编码序列（NM_004985），同时结合查阅文献，确定其突变位点信息，利用Primer 5软件设计点突变引物如下

从病人组织中提取总RNA，经逆转录获得的cDNA作为模板PCR克隆K-Ras（G12D）突变体基因，反应条件为：93℃预变性2min，93℃30s，65℃40s，72℃1min，30个循环，扩增K-Ras突变体基因。将扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳，采用Tiangen回收试剂盒进行割胶回收、酶切、连接至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，进一步完成克隆筛选，测序正确后重新培养含有阳性目的克隆的菌液，提取质粒保存备用；

利用限制性内切酶NheI，NotI双酶切购自SBI公司的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。将切胶回收片段克隆至该病毒载体多克隆位点（MCS）中，重组载体称为pCDH-K-Ras^G12D

1.2AML1-ETO融合基因慢病毒载体的构建

以Addgene公司购买的AML1-ETO融合基因的质粒为模板，PCR产生AML1-ETO基因（基因序列参见文献：Chou FS,Wunderlich M,Griesinger A,Mulloy JC:N-Ras(G 12D)induces features of stepwise transformation inpreleukemic human umbilical cord blood cultures expressing the AML1-ETOfusion gene.Blood 2011,117(7):2237-2240.）。PCR反应条件为：95℃预变性5min，25个循环：95℃60s，60℃40s，72℃2min，72℃5min。引物设计如下：

将AML1/ETO基因的PCR产物电泳回收经XbaI和NotI酶切后克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP病毒载体。重组载体称为pCDH-AML1/ETO。

2K-ras突变体及AML1-ETO融合基因慢病毒包装

2.1接种细胞16～20小时后，当细胞接近饱和时进行转染。

2.1.1首先制备DNA（质粒）、H₂O及CaCl₂的混合物，体系如下：

10cm plate：20μl载体质粒，15μl包装质粒PAX1，10μl外膜蛋白质粒VSVg,加入130μl 2M CaCl₂，无菌水补足体积至1ml。

15cm plate：40μl载体质粒，30μl包装质粒Δ8.9，20μl外膜蛋白质粒VSVg,加入260μl 2M CaCl₂，无菌水补足体积至2ml。

2.1.2在超净台中准备好1ml（10cm plate）获2ml（15cm plate）2XHBSS（pH7.05），这一步须无菌操作以防污染。

2.1.3将带转染细胞从培养箱中取出，一次仅取一盘细胞，尽量缩短每一盘细胞暴露在空气中的时间，以避免pH的显著改变。将DNA与CaCl₂的混合物吸至2XHBSS中，用枪上下剧烈吹打10次左右以保证混合均匀。而后将此混合物沿平皿壁加至细胞中，边加边旋转平皿以混合均匀。

2.1.4转染至4小时后，更换培养液。首先用PBS洗两次，而后加入10ml新的DMEM+10%FBS培养基，继续孵育，48至60小时后可收集上清，此上清即可用于感染靶细胞或进一步纯化病毒。转然后24小时可观察报告基因的表达情况，同时监测细胞的生长状态。

2.2滴度测定

慢病毒液滴度测定：将293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为polybrene和2%FBS的细胞培养基。第一天，细胞胰酶消化计数后，按照每孔8000细胞接种96孔板，37℃培养过夜，感染时细胞长至30～50％的融合密度；第二天，当天转染时，将病毒液用含有8ug/ml polybrene和2%FBS的细胞培养液进行梯度稀释：

1号稀释液 1ul病毒液+249ul病毒稀释用培养基，

2号稀释液 25ul 1号稀释液+225ul病毒稀释用培养基

3号稀释液 25ul 2号稀释液+225ul病毒稀释用培养基

4号稀释液 25ul 3号稀释液+225ul病毒稀释用培养基

5号稀释液 25ul 4号稀释液+225ul病毒稀释用培养基

……

12号稀释液 25ul 11号稀释液+225ul病毒稀释用培养基

小心吸去96孔板中的培养基，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100ul加入每孔细胞中，每个稀释度两个重复，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养；第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100ul的完全培养基；第五、六天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数。

3骨髓细胞分离及病毒感染情况监测

3.1断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。

3.2用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。

3.3小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias,剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。

3.4拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS,50/50u/mlPen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。

3.5低于30℃下离心，1200rpm，10min，去上清。

3.6用5ml PBS洗涤细胞2次。

3.7离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养。按照5×10⁷细胞/孔种于6孔板中。

3.8每孔加入病毒悬液1～2ml，感染8h后离心收集细胞去掉上清，一部分（5×10⁵）种于96孔板中加入新鲜培养液继续培养24h，其它部分用于小鼠骨髓移植用。

3.9 96孔板中的细胞在培养24～48h后用荧光显微镜观察并拍照。

4感染细胞植入小鼠建立白血病动物模型

取8周的C57BL小鼠（购自SLAC实验动物中心），先服用一周含有抗生素的水后进行8Gy辐照量的处理，辐照后部分小鼠尾静脉分别注射0.5～1×10⁶K-ras突变体及AML1-ETO融合基因共感染的小鼠骨髓细胞/只，建立白血病小鼠模型。

实施例2：本发明制备得到的小鼠白血病模型的鉴定

1、骨髓细胞表面染色分析：

骨髓细胞分型鉴定：利用c-KIT，Gr-1，Mic-1的抗体对骨髓细胞进行染色后，应用流式细胞仪分析其各组阳性细胞的比例，从而确定AML的恶性程度，结果表明存在大量GFP⁺/c-Kit⁺/Mac-1^-/Gr-1^-未成熟的原始和幼稚细胞，表明模型小鼠具有AML细胞分化比例的显著表征。

2、分子水平鉴定：

（1）总RNA抽提：

组织样品的收集及处理：取50-100mg组织放入1ml Trizol中，使用电动匀浆器匀浆，匀浆10秒，停顿10秒。取上述裂解好的Trizol样品，Vortex 15s，室温放置5min。按照0.5mlTrizol样品加入100μl氯仿（三氯甲烷），vortex 15s（直至看到混匀充分），室温放置7min，分层即可。离心12000g，4℃，15min。小心拿出管子，尽量不要大的晃荡。取上清后，按照200μl上清加入异丙醇250μl混匀，室温放置15min。离心12000g，4℃，10min。动作连续轻柔直接倒掉，残留的液体不需要吸，然后加入预冷的75%乙醇至少1ml，vortex 15s。离心12000g，4℃，10min。弃上清，尽量吸净。沉淀室温风干（室温放置5min），加DEPC处理水20μl，充分溶解。样品置于冰上。

（2）逆转录

冰上操作，取PCR管，按下表配置反应体系（Oligo和dNTP两者可按需先混合好，量的确定为10个样品配11个样品所需量，再每管加混合液2μl）。样品放入PCR仪，进入程序RT-PCR-step1：65℃，10min，变性。

记好时间，利用10min混合好如下表所示的Mix。上一步完成后取出立即放于冰上，1min以上（降温是保证后续加入TRase的酶活力）。每管加入Mix后吹打2下，需换枪头。

混匀后，冰上放置5min。样品放入PCR仪，进入程序RT-PCR-step2：37℃70min→70℃10min→4℃forever。

（3）qPCR

qPCR水可用新50ml离心管直接灌超纯水使用。Template制备：取普通管，按1:15稀释母液。标准曲线制备：取进口管，举例说明，如有8个样品，则每个样品取1μl于S1管中混合，再加入32μl水混匀，即1:5稀释。S2-S5每管加20μl（倒加液，且直接加到管底）。从S1管中取20μl到S2中混匀，以此类推，倍比稀释。如表1所示，合成荧光定量PCR引物。按下表配置反应体系，将2×mix、Primer和H₂O混合液配好，（量的确定：10个样品配11个样品所需量）注意2×Mix不要反复冻融，如果经常使用，融解后放在4度冰箱。取8联管，先倒加液法在管底加入5μl Template，再用进口枪头倒加液法贴壁加入混合液，由于光的激发和吸收都是通过8联管专用盖，所以盖盖子时保证手套的干净且盖子上面不可写字。由于不能写字标记，可通过放8联管的底座确定方向。加样完毕后离心。

反应体系	20μl
		2×mix	10μl
Primer	0.6μl
		H2O	4.4μl
Template	5μl

样品放入Mx3000P荧光定量PCR仪，参数设置如下表所示。

荧光定量PCR引物设计如下：

3、Western blot检测蛋白表达

提取细胞或组织蛋白、测定大致含量：取骨髓细胞，加入RIPA buffer[150mM NaCl，1.0%NP-40，0.5%sodium deoxycholate，0.1%SDS(sodium dodecylsulphate)，50mM Tris-HCl pH 8.0，Protease Inhibitors]进行裂解后，利用BSA法进行蛋白含量测定。制备10％SDS-PAGE胶，蛋白样品加入等体积的loadingbuffer后100℃煮5min后置于冰上，进行上样后120V电泳恒压电泳1～1.5h，直至溴酚蓝染料到达凝胶的底部结束电泳。电泳转膜后封闭。然后将PVDF膜放入5％的脱脂奶粉溶液中摇床摇动封闭30～60min。将上述膜取出后蒸馏水漂洗一下后用一次性手套封装，并加入1：1000不等的稀释度的一抗，室温杂交2h。后经TBST洗涤3～5min，并重复三次。执行类似一抗一样的操作给膜进行HRP标记的二抗杂交1h。后经TBST洗涤3～5min，并重复三次。在工作台上铺一张保鲜膜，将PVDF膜放在保鲜膜上。将ECL的A和B两种试剂在EP管内等体积混合，然后均匀滴在PVDF膜的蛋白面，反应1～2min后，将PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，包上保鲜膜之后转移到扫描仪器扫描成像并进行分析。

4、细胞涂片染色：

断颈处死小鼠，投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3～5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。小心剥离肌肉，分别剪下股骨和胫骨,剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS,50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。低于30℃下离心，1200转/10分钟，去上清。用5ml PBS洗涤细胞2次；离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS重悬，获得骨髓细胞，采用剪尾取血法获得血细胞，用涂片法制作小鼠血涂片和骨髓细胞涂片，血片加Wright-Giemsa染液7～8滴，放置1min后再加入中性蒸馏水15滴混匀后染色15min，自来水冲洗。骨髓片染色加样方法同血片染色，但加蒸馏水后须放置30min后自来水冲洗，晾干后镜检拍照。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (1)

1.一种基因共转染技术建立的白血病小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：A、K-ras突变体及AML1-ETO融合基因慢病毒载体的构建 

设计K-ras突变引物如下： 

K-Ras^G12D正向引物序列如SEQ ID NO:1所示， 

K-Ras^G12D反向引物序列如SEQ ID NO:2所示， 

通过PCR扩增目的基因，回收、酶切、连接至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，进一步完成克隆筛选，测序正确后重新培养含有阳性目的克隆的菌液，提取质粒保存备用； 

以Addgene公司购买的AML1-ETO融合基因的质粒为模板，引物设计如下： 

AML1-ETO正向引物序列如SEQ ID NO:3所示， 

AML1-ETO反向引物序列如SEQ ID NO:4所示， 

PCR产生AML1-ETO基因，将扩增的目的基因亚克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP病毒载体； 

B、K-ras突变体及AML1-ETO融合基因慢病毒载体的包装 

接种细胞16-20小时后，当细胞接近饱和时进行转染，将293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为polybrene和2%FBS的细胞培养基，第一天，细胞胰酶消化计数后，按照每孔8000细胞接种96孔板，37℃培养过夜，感染时细胞长至30～50％的融合密度；第二天，当天转染时，将病毒液用含有8ug/ml polybrene和2%FBS的细胞培养液进行梯度稀释，然后小心吸去96孔板中的培养基，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100ul加入每孔细胞中，每个稀释度两个重复，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养；第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100ul的完全培养基；第五、六天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数； 

C、骨髓细胞分离及病毒感染情况监测 

断颈处死小鼠，游离出小鼠的两条下肢，剥离肌肉，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔，用无菌注射器轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管， 将细胞冲出，然后离心，去上清； 

离心沉淀下来的细胞用PBS冲洗，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养并接种于6孔板中，每孔加入K-ras突变体与AML1-ETO融合基因慢病毒的病毒悬液1～2ml，感染8h后离心收集细胞去上清，一部分种于96孔板中加入新鲜培养液继续培养24h，其它部分用于小鼠骨髓移植用，96孔板中的细胞在培养24～48h后用荧光显微镜观察并拍照； 

D、感染细胞植入小鼠建立白血病动物模型 

取8周的C57小鼠，先服用一周含有抗生素的水后进行8Gy辐照量的处理，辐照后部分小鼠尾静脉注射0.5～1×10⁶小鼠骨髓细胞/只。