CN111109200A

CN111109200A - 一种通过改变表观遗传修饰水平抵御mll白血病的小鼠模型及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN111109200A
Application number: CN202010008036.XA
Authority: CN
Inventors: 初雅婧; 袁卫平; 汪晓敏; 李孟柯
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-01-03
Filing date: 2020-01-03
Publication date: 2020-05-08

Abstract

本发明公开了一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型及其构建方法和应用。本发明利用慢病毒介导的基因导入技术，将上调H3K9me3水平的组蛋白赖氨酸甲基转移酶Suv39h1基因导入MLL白血病细胞中，通过移植给经半致死剂量照射的受体小鼠，获得抵御MLL白血病的小鼠模型。小鼠表现为生存期显著延长，白血病干细胞数目下降和功能下降，该小鼠模型可以简便、快速和高效地实现对MLL白血病的潜在药物进行的定性和/或定量的评价。

Description

一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型及其构建方法和应用。

背景技术

自2010年以来，癌症已经成为中国人死亡的首要因素。其中，白血病属于我国十大高发恶性肿瘤之一。2000年至2011年间的流行病学统计结果显示，男性白血病的发生率和死亡率呈上升趋势。白血病是一类造血系统恶性疾病，其特征为白血病细胞在骨髓及其它造血组织中呈恶性、无限制地增殖，浸润全身各组织和脏器，临床表现为发热、出血、贫血、肝脾肿大等。白血病通常被认为是起源于体内单一细胞恶变：即造血干/祖细胞由于细胞和分子水平异常发生恶性转化，形成具有自我更新、增殖能力以及生存优势的白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs)，最终形成白血病克隆；白血病干细胞的存在已经被确定为临床白血病难治愈和易复发的主要原因。

白血病干细胞最早由Bonnet和Dick等人在1997年发现，他们将急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者外周血CD34⁺CD38^-细胞移植给非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠，发现可以建立小鼠白血病模型；而移植更多数量的其他免疫表型的白血病细胞则不能再现白血病，说明只有CD34⁺CD38^-白血病细胞才能呈现克隆性增殖。这类细胞不仅在免疫表型上与造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)有不同程度的交叉，在生物学性质上如自我更新、增殖和分化的潜能上也与正常造血干细胞有相似之处。不同的是白血病干细胞的自我更新能力不受体内信号的正常调控，LSCs内部也存在一系列不同于造血干细胞和非干细胞白血病细胞的表观遗传学紊乱和基因表达的异常。而白血病干细胞被认为是白血病复发与耐药性产生的主要原因，因此，寻找白血病干细胞产生、维持及演进机制，从而找到靶向消除白血病干细胞的疗法成为研究的重点和热点。

AML是最常见的成人白血病，是指由于不成熟的髓系干/祖细胞失控，呈克隆性扩增，阻滞于一定的分化阶段而导致的一种造血系统的恶性肿瘤性疾病。目前研究普遍认为，AML所表现出的临床指征和生物学特性在很大程度上是由其本身的遗传学异常决定的。染色体易位是许多常见 AML的一个重要标志，其中，因11q23处染色体易位形成的MLL融合蛋白为主要突变的白血病占儿童白血病的70％以上，占成人AML约为 10％⁴。MLL融合引起的白血病(MLL白血病)具有独特的临床和生物学特征，是一类恶性程度高、预后差的难治性白血病。

MLL(Myeloid/Lymphoid or Mixed Lineage Leukemia)基因与果蝇 Trithorax(Trx)基因同源，因其在急性白血病中的作用而被发现。其功能主要是通过促进其下游靶基因如Hox家族基因等组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)的甲基化，而激活基因表达，但这一功能在MLL与其他基因发生融合后通常丢失，仅保留识别其靶基因的氨基端，并获得了伙伴蛋白的一部分。最常见的MLL融合基因是AF4，AF9，ENL，AF10 和ELL，占全部MLL易位突变的85％以上。

已有研究结果表明，MLL融合基因诱发白血病的机制主要发生在表观遗传调控水平。Bernt等人2011年的工作揭示，DOT1L介导的 H3K79me2水平的升高与MLL靶基因的过度激活有关。2015年最新研究发现，H3K4me3在维持MLL白血病干细胞的自我更新和增殖能力等方面发挥重要的调控作用。本实验室参与合作的工作显示，SETD2突变导致的H3K36位点三甲基化修饰的缺失会加速MLL白血病的发生发展。这些工作表明，表观遗传调控在MLL白血病发生发展和白血病干细胞功能调控中发挥了重要作用。然而，已有研究主要集中于阐明MLL融合基因诱发白血病的机制，而对表观遗传修饰在白血病干细胞功能维持中作用的研究尚少。

越来越多的研究表明，表观遗传调控在造血发育调控和白血病发生发展过程中扮演重要角色。H3K9me3是重要的转录抑制性修饰，这一修饰的正常分布对于基因的正常沉默、染色体的稳定非常重要。通过比较 H3K9me3修饰在AML病人与正常人CD34⁺细胞基因组上的分布，发现 H3K9me3在AML白血病细胞的包括ETS和CRE元件的启动子区域的分布低于正常水平，提示H3K9me3在启动子区域分布的下降可能与 AML的发生发展有关。

H3K9me3修饰水平的维持依赖于特异的甲基转移酶和去甲基化酶的共同调控。其中SUV39H1和SUV39H2是负责H3K9三甲基化的最主要的甲基转移酶，二者在建立异染色质和促进基因沉默过程中发挥着重要的作用。尽管在体外实验中发现，利用特异化合物chaetocin抑制或 shRNA敲低SUV39H1可以抑制白血病细胞系的增殖、诱导凋亡和分化；然而，基于动物模型的体内实验结果却与之相反：缺失了SUV39H1的小鼠自发B细胞淋巴瘤(Bcell lymphomas)频率的升高，提示SUV39H1 可能具有抑癌作用；在Myc诱发的AML小鼠模型中，SUV39H1的缺失有利于基因组稳定性的维持。在MLL白血病中，DOT1L可以通过抑制 SIRT和SUV39H1在MLL靶基因启动子区域的定位，抑制H3K9甲基化的发生，从而促进白血病的发生。这些结果提示，SUV39H1介导的 H3K9me3修饰在MLL白血病的发生或发展过程中发挥重要作用。此外， H3K9me3去甲基化酶也被报道参与AML的发生，Cheung等人发现 H3K9me3去甲基化酶KDM4C可以与H4R3甲基转移酶PRMT1协同促进MLL融合诱发的AML的发生发展。但是SUV39H1介导的H3K9me3 在MLL白血病发生发展中起到的作用，未曾有研究。

发明内容

本发明就是为了解决上述技术问题，所提供了一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型及其构建方法和应用。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型，所述小鼠具有上调的蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化修饰水平。

一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型在对 MLL白血病的潜在药物进行定性和/或定量评价中的用途。

一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型的构建方法，利用慢病毒介导的基因导入技术，将上调H3K9me3水平的组蛋白赖氨酸甲基转移酶Suv39h1基因导入MLL白血病细胞中，通过移植给经半致死剂量照射的受体小鼠，获得抵御MLL白血病的小鼠模型。

进一步的，一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

a.MLL-AF9白血病小鼠的构建

Ⅰ.富集小鼠骨髓c-Kit+细胞；

Ⅱ.病毒感染富集的小鼠骨髓c-Kit+细胞；

b.高表达Suv39h1基因载体的构建

Ⅰ.Suv39h1基因的扩增；

Ⅱ.酶切MSCV-IRES-EGFP Vector和PCR扩增产物SUV39H1

Ⅲ.目的片段与载体进行连接；

Ⅳ.连接产物转化大肠杆菌感受态，获得了 MSCV-mSUV39H1-IRES-GFP；

c.包装病毒和浓缩

Ⅰ.病毒包装；

Ⅱ.病毒浓缩；

d.病毒感染获得表达Suv39h1的阳性MLL白血病细胞

Ⅰ.包装过表达Suv39h1的病毒；

Ⅱ.病毒感染收集的MLL-AF9的白血病细胞；

e.将感染了Suv39h1的白血病细胞移植亚致死剂量照射小鼠，获得抵御MLL白血病小鼠模型。

本发明获得了如下的有益效果。

本发明提供的包含Suv39h1基因序列的核酸构建体可以在白血病细胞中高表达Suv39h1，可用于稳定构建抵御MLL白血病小鼠的模型，构建的抵御MLL白血病小鼠可以自发地抵御MLL白血病，不需要特别的处理，在筛选预防/治疗MLL白血病药物开发中具有重要的研究和应用意义。而且抵御MLL白血病小鼠模型的构建方法简便、经济，因此，极具市场价值和药物筛选研发的应用前景。

附图说明

图1是本发明MLL-AF9白血病小鼠的构建示意图；

图2是本发明扩增获得符合目的大小的Suv39h1片段胶回收后的电泳图；

图3是本发明流式细胞术检测包装表达Suv39h1病毒感染MLL白血病细胞的细胞感染阳性率图；

图4是本发明Suv39h1病毒感染阳性细胞高表达Suv39h1和 H3K9me3电泳图；

图5是本发明Suv39h1过表达小鼠的生存期表现图；

图6是本发明AML小鼠模型白血病干细胞检测图；

图7是本发明AML细胞凋亡检测图；

图8是本发明AML细胞周期检测图；

图9是本发明极限稀释实验图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1MLL-AF9白血病小鼠的构建

1.1富集小鼠骨髓c-Kit⁺细胞

1)断颈法处死小鼠，75％乙醇溶液浸泡消毒，使用经高压消毒后的手术器械及无菌纱布取小鼠双侧后肢骨，分离出胫骨、股骨和髂骨。使用1ml注射器在3ml PBE液体中从骨两端反复冲洗骨髓腔获取骨髓细胞。

2)将收集的骨髓细胞用300目尼龙膜过滤离心，1500rpm，4℃，5min，弃上清。

3)10⁷细胞加入20μl CD117 Microbeads，混匀冰上静置15min。

4)10⁷细胞加入1-2ml PBE Buffer洗一次，1500rpm，4℃，离心5min，弃上清。

5)10⁸细胞用500μl PBE Buffer重悬。

6)将MS柱安装到磁铁上，MS柱上放置300目尼龙膜，防止后续细胞形成团块堵塞MS柱。加入3ml PBE Buffer润洗 MS柱，重力作用自然流尽。

7)将细胞悬液加入MS柱中，重力作用自然流尽。

8)用500μl PBE洗脱3次，洗脱液流尽后从磁铁上取下MS 柱。

9)向MS柱中加入3ml PBE Buffer，用活塞快速推出吸附于柱子上的细胞，收集于15ml离心管中。

1.2病毒感染富集的小鼠骨髓c-Kit⁺细胞

1)配MA9感染用培养基：IMDM+15％FBS+Cytokine(mSCF 50ng/ml,mIL-310ng/ml,mIL-610ng/ml)

2)Retronectin包被Non-tissue culture treated 24孔板： Retronectin0.2mg/ml，300μl/支分装于EP管中，使用前加 1.2ml PBS，24孔板每孔加250μl(10μg/孔)，室温包被2 h，或4℃最多可放置一周。

3)将24孔板中Retronectin除去，每孔用500μl PBS洗一遍备用。

4)预刺激：将富集的c-Kit⁺细胞1500rpm，4℃，离心5min，弃上清，用适量感染用培养基重悬细胞，每孔5×10⁵～1×10⁶细胞，体积为0.5ml，预刺激8h。

5)加入MA9病毒，1.5ml未浓缩病毒/孔，再加入polybrene 至终浓度6μg/ml。

6)将24孔板1800rpm 33℃离心90min。

7)细胞在37℃，5％CO₂培养8-10h后，换新鲜感染用培养基， 2ml/孔。

8)培养48h后，收集感染后的细胞，检测GFP⁺比例。

9)将感染后的细胞移植致死剂量(9.5Gy)照射小鼠，保证每只小鼠移植的GFP⁺细胞不少于2×10⁵，同时GFP^-细胞可作为保护细胞共移植。

10)移植后定期观察小鼠状态。移植后两周可取尾血检测GFP⁺细胞比例。当外周血GFP⁺细胞比例达到50％以上，并且小鼠伴随状态不佳，弓背，活动困难，处死小鼠，冻存细胞，获得MLL-AF9白血病模型的细胞。

实施例2高表达Suv39h1基因载体的构建

2.1带有EcoRI位点的引物，以小鼠骨髓cDNA为模板，扩增Suv39h1 EcoRI为限制性酶切位点，以下为使用的引物序列

Sense 5'CGGAATTC ATGGGGGAGCCGGCGACTCTAGGTTGC 3'

Anti-sense 5'CGGAATTC CTAGAAGAGGTATTTTCGGCAAGCC 3'

PCR扩增体系

PCR扩增条件：

1.预变性：94℃2min

2.变性：94℃30s

3.退火：68℃30s

4.延伸：72℃40s

5.重复2-4步40个循环

6.延伸：72℃10min

跑胶鉴定条带大小，利用天根胶回收试剂盒进行切胶回收，结果参见图 2(上样量5μl，Marker 5μl，目的条带1242bp)。

2.2EcoRI酶切MSCV-IRES-EGFP Vector和PCR扩增产物

SUV39H1

酶切体系：

载体或PCR回收产物：1μg

10×缓冲液：2μl

EcoRIFastDigest(Thermofisher)：1μl

用无酶水补齐到20μl

酶切条件：

37℃，30min；

80℃5min灭活。

跑胶鉴定酶切效率，利用天根胶回收试剂盒进行切胶回收

2.3目的片段与载体进行连接

连接体系：插入片段：8μl

载体：2μl

10x T4 DNA Ligase Buffer:2μl

T4 DNA Ligase:0.2μl(1weiss U)

用无酶水补齐到20μl

连接条件：4℃过夜连接

2.4连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，涂氨苄抗性平板培养过夜。挑取单克隆，液体LB进行培养，利用LXSN-F正向及IRES-R反向进行测序反应，最终获得了MSCV-mSUV39H1-IRES-GFP。

实施例3包装病毒和浓缩

3.1病毒包装

1)冻存于液氮的293T细胞37℃水浴复苏，复苏后将细胞培养于 10cm²皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。培养基为高糖 DMEM+10％FBS。当293T细胞汇合度达到80-90％时进行1:3 传代。

2)加入质粒转染前8h换新鲜培养基，保证转染前293T处于对数生长期。当细胞汇合度达到90％以上时进行转染。

3)配质粒和lipofectamine 2000混合液(每10cm²皿)

i.15μg质粒体系：适用于载体片段＞10kb

ii.30μl Lipofectamine2000﹢500μl OPTI-MEM室温静置 5min。

iii.15μg质粒(MA97μg；Pkat 5μg；VSVG 3μg)﹢500μl OPTI-MEM

将ⅰ与ⅱ轻轻混合，室温静置20min。

4)将10cm²皿中培养基更换为5ml新鲜DMEM+5％FBS

5)将质粒混合液逐滴加入10cm²皿中，1ml/皿，混匀，37℃5％ CO₂培养箱培养。

6)培养6-8h后，更换新鲜DMEM+5％FBS。

7)在培养48h后于荧光显微镜下观察是否有荧光，细胞是否发生融合，融合细胞为产毒细胞

8)培养后48h和72h收集病毒上清，0.45μm滤器过滤。

3.2病毒浓缩

超速离心：70000g 4℃离心2h，弃去上清，用适量PBS重悬，

直接用于实验或分装冻存于-80℃。

实施例4病毒感染获得表达Suv39h1的阳性MLL白血病细胞

4.1包装过表达Suv39h1的病毒

4.2病毒感染收集的MLL-AF9的白血病细胞

11)配感染用培养基：IMDM+15％FBS+Cytokine(mSCF 50 ng/ml,mIL-310ng/ml,mIL-610ng/ml)

12)Retronectin包被Non-tissue culture treated 24孔板：

13)将24孔板中Retronectin除去，每孔用500μl PBS洗一遍备用。

14)预刺激：收集MLL-AF9的白血病细胞，用适量感染用培养基重悬细胞，保证每孔5×10⁵～1×10⁶细胞，体积为0.5ml，预刺激8h。

15)加入Suv39h1病毒，1.5ml未浓缩病毒/孔，再加入polybrene 至终浓度6μg/ml。

16)将24孔板1800rpm 33℃离心90min。

17)细胞在37℃，5％CO₂培养8-10h后，换新鲜感染用培养基， 2ml/孔。

18)培养48h后，收集感染后的细胞，检测EGFP⁺比例，实验结果参见图3。

实施例5测定H3K9me3水平和Suv39h1表达水平

5.1细胞总蛋白提取及定量

1)RIPA裂解细胞及BCA定量：

i.收集细胞，PBS洗一次，转移至1.5ml EP管中，加入500μl 预冷的RIPA裂解液+PMSF，4℃Rotor旋转30min；

ii.若细胞未充分裂解，则用超声破碎仪进行超声裂解蛋白。超声条件为15secon；5sec off；6cycle。

iii.12000rpm离心15min，收集上清转移至新EP管

iv.BCA定量：

按照下表配制用于绘制标准的各浓度梯度蛋白溶液，蛋白标准品使用试剂盒自带BSA蛋白溶液(2mg/ml)，使用与待测蛋白相同的溶剂。

a)按体积比50:1将BCA试剂A和试剂B充分混匀，配制成适量 BCA工作液。每孔加入190μl BCA

b)将蛋白标准品各取10μl/孔，加入96孔板，每个浓度设3个重复孔。

c)将10倍稀释后的待测蛋白样品加入96孔板中，10μl/孔，设3 个复孔，并设置背景孔(注意标准品与待测样品加样过程操作应较为迅速，否则加样时间太长则AB液与起始加入的样品反应导致最后结果不准确)

d)37℃反应30min后，测560nm波长。

e)用Excel软件绘制标准曲线，获得直线方程，计算待测蛋白浓度(g/L)

2)1×SDS上样缓冲液裂解蛋白：

i.细胞计数，保证对照组与实验组细胞数目一致。

ii.离心弃干上清，加入1×SDS上样缓冲液。1×SDS上样缓冲液由5×SDS上样缓冲液加ddH₂O稀释。一般1×10⁷小鼠骨髓细胞加入200μl 1×SDS上样缓冲液。

iii.室温裂解30min。期间将样品在涡旋振荡器上震荡数次

iv.100℃煮蛋白10min。

5.2SDS-PAGE凝胶电泳

1)配胶

i.配制适当浓度分离胶，小心注入玻璃板间隙，为浓缩胶留有足够空间、轻轻在顶层加入无水乙醇或ddH₂O将分离胶压平

ii.分离胶完全凝固，倒掉无水乙醇，在配制浓缩胶过程中无水乙醇可自行蒸发干。

iii.注入浓缩胶，插入梳子，注意所选梳子厚度与玻璃板厚度相吻合，并避免产生气泡。若有气泡产生，则将胶板略微向左或向右倾斜，气泡会自动浮起。

iv.浓缩胶凝固后，小心拔取梳子。依次将蛋白Marker、蛋白样品加到浓缩胶，电压为80V，进入分离胶后调为130V，继续电泳直至染料抵达分离胶底部，断开电源。

v.电泳缓冲液配方：10×电泳液配方：

Tris-base	30.3g
		Glycine	144g
SDS	10g
		ddH<sub>2</sub>O	To1L

10×转膜液配方：

Tris-base	30.3g
		Glycine	144g
ddH<sub>2</sub>O	To1L

20×TBST配方：

NaCl	176g
		1MTris-HCl(pH8.0)	400ml
Tween20	10ml
		ddH<sub>2</sub>O	To1L

2)转膜(湿转)

i.将与SDS凝胶大小一致的PVDF膜浸入甲醇中活化20sec 后转移至预冷的1×转膜液中。

ii.电泳结束后，切去浓缩胶。

iii.按照负极-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-正极的顺序安装湿转装置。

iv.转膜条件：350mA，70-90min。冰上进行

3)封闭：5％脱脂奶粉(TBST配)室温封闭1h。

4)一抗孵育：TBST配制3％BSA，按照合适比例稀释一抗。4℃ Rotor过夜。

5)除去一抗(一抗可回收)，TBST洗3次，10min/次。

6)二抗孵育：TBST配制3％BSA，按照合适比例稀释二抗，室温孵育1h。

7)除去二抗，TBST洗3次，10min/次。

8)化学发光显色

i.按照ECL底物显色A、B液按照1:1比例混合，配制适当体积显色液。

ii.膜正面向上，滴加ECL底物显色液，室温显色1min。

iii.在超灵敏化学发光及荧光影像分析仪中显影。

实验结果参见图4，结果表明Suv39h1病毒感染阳性细胞高表达 Suv39h1和H3K9me3。

实施例6获得抵御MLL白血病小鼠模型

1)将感染了Suv39h1的白血病细胞移植亚致死剂量(4.75Gy)照射小鼠

2)受体小鼠处理：实验中所用受体小鼠除特殊注明外均为8-10 周CD45.2雌鼠。移植前一天至移植后一周内饮用水中加抗生素(拜诺欣)，给予半致死剂量(4.75Gy)照射后4-12h内进行移植实验。

3)尾静脉移植：用适量PBS重悬AML细胞，每只受体小鼠移植 1×10⁴～1×10⁵细胞，注射体积为400μl/只。

4)移植后定期观察小鼠状态。移植后两周可取尾血检测EGFP⁺细胞比例。当对照组外周血EGFP⁺达到60％，小鼠弓背，行动迟缓，实验组小鼠外周血低于对照组，小鼠生存状态明显优于对照组(图5)。

实施例7抵御MLL白血病小鼠模型功能检测

1)AML小鼠模型白血病干细胞(LSC)检测

流式抗体配制：

i.L-GMP为LSC Marker：

AML流式分析用Lin-cocktail配方

流式抗体用量及组合：

ii.每管样品管中加入5×10⁶～1×10⁷/50μl，同时配备各自单阳管，每管1×10⁶。

iii.样品管中加入上述抗体组合，单阳管中加入相应抗体1μl， K⁺G^-冰上孵育30min，L-GMP冰上孵育60min。

iv.加入1ml PBE Buffer洗一遍，1500rpm，4℃离心5min。

v.400μl重悬，过膜，上机检测。

2)AML细胞凋亡检测(BDAnnexinV Kit)

流式抗体用量及组合：

i.样品管中加入表面Marker抗体，单阳管中加入相应抗体各 1μl(AnnexinV和7-AAD除外)，冰上孵育30min。

ii.每管加入1ml Binding Buffer洗一遍，1500rpm，4℃离心 5min。

iii.弃上清，留约50μl液体，每管样品中加5μlAPCAnnexinV、 5μl 7-AAD。单阳管中加入各自抗体5μl，混匀后室温避光孵育15min。

iv.每管加入300μl Binding Buffer重悬，过300目尼龙膜，1h 内上机检测。

3)AML细胞周期(Ki67)检测(破膜剂使用BD IntraSure Kit)

流式抗体用量及组合

i.样品管中加入表面Marker抗体(Ki67除外)，单阳管中加入相应抗体各1μl，冰上孵育30min。

ii.每管加入100μl ReagentA混匀，室温避光放置5min。

iii.每管加入1ml BD FACS lysing buffer(固定裂红液)，室温避光孵育10min，2000rpm 4℃离心5min，弃上清，留约50 μl液体。

iv.每管加入50μl Reagent B，样品管中加入APC-Ki675μl，单阳管中加Ki671μl，室温避光孵育30min。

v.每管加入1ml PBE洗一遍，2000rpm 4℃离心5min，弃上清。300μl重悬。过300目尼龙膜至流式管中。上机前加Hoechst 33342终浓度至10～20μg/ml。

4)极限稀释实验

i.移植一定数量的白血病细胞至半致死剂量照射的受体鼠。

ii.观察生存期。

iii.利用ELDA software(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) 来计算白血病干细胞的数目。

实验结果参见图6-9，实验结果表明Suv39h1过表达小鼠体内白血病干细胞数目显著降低。

Claims

1.一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型，其特征在于：所述小鼠具有上调的蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化修饰水平。

2.一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型在对MLL白血病的潜在药物进行定性和/或定量评价中的用途。

3.一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型的构建方法，其特征在于：利用慢病毒介导的基因导入技术，将上调H3K9me3水平的组蛋白赖氨酸甲基转移酶Suv39h1基因导入MLL白血病细胞中，通过移植给经半致死剂量照射的受体小鼠，获得抵御MLL白血病的小鼠模型。

4.根据权利要求3所述的一种通过改变表观遗传修饰水平抵御MLL白血病的小鼠模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

a. MLL-AF9白血病小鼠的构建

Ⅰ.富集小鼠骨髓c-Kit+细胞；

Ⅱ. 病毒感染富集的小鼠骨髓c-Kit+细胞；

b. 高表达Suv39h1基因载体的构建

Ⅰ.Suv39h1基因的扩增；

Ⅱ.酶切MSCV-IRES-EGFP Vector和PCR扩增产物SUV39H1

Ⅲ. 目的片段与载体进行连接；

Ⅳ. 连接产物转化大肠杆菌感受态，获得MSCV-mSUV39H1-IRES-GFP；

c. 包装病毒和浓缩

Ⅰ.病毒包装；

Ⅱ.病毒浓缩；

d.病毒感染获得表达Suv39h1的阳性MLL白血病细胞

Ⅰ.包装过表达Suv39h1的病毒；

Ⅱ.病毒感染收集的MLL-AF9的白血病细胞；

e. 将感染了Suv39h1的白血病细胞移植亚致死剂量照射小鼠，获得抵御MLL白血病小鼠模型。