CN101358191A - 转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法及应用，包含AML1a基因的逆转录病毒载体的构建、逆转录病毒的制备、骨髓细胞的感染、小鼠骨髓移植和模型鉴定。本发明采用分子生物学、细胞生物学等方法转导了AML1a基因至小鼠骨髓细胞中，成功建立了具有双表型的T－淋巴细胞白血病的模型，为进一步阐述白血病的发病机制以及靶向治疗奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，尤其是转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法及应用。
背景技术
目前，恶性肿瘤已成为威胁人类健康的最严重疾病之一。随着社会经济的发展，肿瘤的发病率呈上升趋势。所以针对各种肿瘤的预防、发病机制、诊断、治疗和预后的相关研究成为迫切亟待解决的问题。而恶性肿瘤细胞的过度无限增殖、分化障碍及凋亡受阻是其发病的主要病理生理学基础。已经发现，不少肿瘤的发生机制就是由于增殖分化异常引起的，如白血病等。因此，以肿瘤细胞增殖分化相关基因为靶点的关于各种肿瘤的发病机制、诊断、治疗和预后的基础及临床研究成为目前临床与基础研究的热点课题。细胞的增殖分化受到严格调控，转录因子协调细胞中多种基因的表达是其中重要的调控机制。造血细胞的增殖失控、分化能力的丧失将可能导致细胞的恶性转化及白血病的发生。因此，阐明转录因子的功能对于确定细胞增殖分化调控机制以及在细胞恶性转化中的作用具有重要意义。
AML1也称之为PEBP2αB、CBFα2或RUNX1，是一种重要的转录调节因子。它在造血细胞中普遍表达，调节造血细胞的分化和增殖，其异常将导致造血细胞发育异常和血液系统恶性肿瘤的发生。在白血病中，AML1常发生染色体移位，如t(8；21)，t(3；21)和t(12；21)。t(8；21)是急性髓系白血病中最为常见的染色体移位之一。AML1基因和染色体8q22上的ETO基因(又称MTG8)发生重排，由此形成的融合蛋白AML1-ETO中，AML1缺少TD，仅保留了RHD。约25％的儿童ALL存在t(12；21)易位，形成TEL-AML1融合基因。此融合基因可通过Runt同源结构域与野生型AML1竞争DNA结合位点，并可募集N-CoR、mSin3和SMRT核辅助抑制因子，进而与HDAC结合，抑制AML1靶基因的转录。在约6.7％AML中发现有AML1突变，包括点突变、插入、缺失，造成单个氨基酸的改变、肽链合成提前终止和读码框架易位等。这些突变常可以造成AML1表达下降或转录活性丧失。由此可见，AML1不能与靶基因启动子结合或者结合后不能起始转录将会影响靶基因的转录，从而影响正常造血功能。
AML1基因转录后通过选择性剪接产生至少三种异构体AML1a、AML1b和AML1c。其中，AML1b与AML1c仅在氨基末端存在27个氨基酸残基的差异，均具有两个主要的功能结构域：RHD和TD，两者的功能基本相同。AML1c为全长型AML1，即我们通常所说的AML1。AML1a与AML1c起源于相同的启动子，由于剪接的不同，转录剪接后产生不同的mRNA，使得AML1a较之AML1c在羧基端缺少230个氨基酸残基。AML1a具有RUNT同源结构域，但缺少转录激活结构域，因此通常被认为不具有转录激活功能，但由于其具有RHD，可以与AML1b/1c竞争结合靶基因的DNA结合位点，导致靶基因不能正常转录，提示AML1a可能干扰AML1的功能。AML1b可以激活TCRs和GM-CSF的转录，但AML1a却没有此功能。并且，AML1a的过表达可以抑制由G-CSF诱导的髓系祖细胞32Dcl3细胞系的终末分化。有研究表明，在AML中AML1a的表达远高于正常对照。实验也已证实AML1a在急性白血病(AL)中的高表达。此外，AML1a可以抑制由AML1b介导的M-CSFR启动子的转录，提示AML1a对AML1b具有拮抗作用。在成体中，AML1基因的缺失易于发生恶性血液疾病。因此，基于以上结果，AML1a在白血病发生中可能发挥类似于AML1相关白血病中融合蛋白的作用，干扰AML1的正常功能从而导致白血病的发生。
但是，AML1a在造血细胞增殖分化中发挥了何种作用，是否会导致小鼠发生白血病，如果发生白血病，白血病细胞呈现何种表型，目前均不清楚。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法及应用，建立一种小鼠白血病模型，是进行白血病发病机制和靶向治疗的有力工具。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：
1)载体构建：自pCDNA3-FLAG-AML1a中，PCR扩增FLAG-AML1a，连接入pMD18-T Simple载体中，转化E.coli DH5菌株，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒经Xho I双酶切鉴定后测序，测序正确的克隆，经XhoI酶切得到FLAG-AML1a片段，pMSCV-IRES-YFP经XhoI酶切，CIAP去磷酸化，与自pMDsimple-T-FLAG-AML1a载体XhoI酶切纯化所得的FLAG-AML1a片段连接，转化DH5α感受态细胞后挑取克隆，EcoI酶切鉴定已插入目的片段正反向，正向插入的质粒命名为pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP；
2)病毒制备：逆转录病毒载体质粒pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP或pMSCV-IRES-YFP分别与辅助质粒pV Pack-Eco(含Env)和pV Pack-GP(含gal-pol)组合，组合通过磷酸钙沉淀法转染293T细胞，制备逆转录病毒，病毒感染3T3细胞，检测病毒滴度，并测定AML1a的表达情况；
3)骨髓细胞的感染：C57雄性小鼠的骨髓单个核细胞置于含mSCF、mIL-3、mIL-6的IMDM培养液中培养，加入ploybrene进行三轮逆转录病毒转导；
4)将转导了AML1a基因的小鼠骨髓单个核细胞经尾静脉注射至经137Cs致死剂量照射的C57雌性小鼠体内，建立转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型；
5)模型鉴定。
所述的逆转录病毒的载体是插入人AML1a的真核表达质粒，插入核苷酸的长度为912个核苷酸，FLAG和AML1a共用ATG起始密码子，形成融合基因，由此融合基因编码的蛋白具有260个氨基酸，使FLAG成为AML1a表达的筛选标记。
所述的逆转录病毒载体pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP用于哺乳动物细胞表达，长约7.2kb，带有PGK启动子、多克隆位点及黄色荧光蛋白基因(YFP)；其多克隆位点上存在Eco I、Hpa I和Xho I酶切位点；IRES使FLAG-AML1a和YFP共表达。
所述的模型鉴定采用如下指标：
1)小鼠外周血荧光率的检测——流式细胞术；
2)外周血及骨髓细胞形态学改变——瑞氏-吉姆萨染色观察；
3)各脏器病理变化——HE染色观察；
4)白血病小鼠细胞表型的鉴定——流式细胞术；
5)AML1a基因整合至小鼠基因组中的检测——PCR；
6)AML1a基因转录水平的RT-PCR检测；
7)AML1a基因翻译水平的Western blot检测；
8)AML1a基因高表达对小鼠骨髓细胞细胞周期改变的检测——流式细胞术。
所述模型具有两种细胞表型：一种为CD3+CD4+CD8+，另一种为Sca-1+cCD3+，这两种表型都为T-淋巴细胞白血病的免疫表型。
所述模型中两种表型的细胞均具有二次移植能力。
所述的方法构建的转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型。
所述的转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型在白血病的靶向治疗中的应用。
本发明的有益效果是：本发明的白血病小鼠模型可以为白血病的靶向治疗提供新的靶向分子AML1a。为白血病的靶向治疗提供新的动物模型，从而进一步研究和阐述淋巴细胞白血病的发病机制。
附图说明
图1是PCR扩增FLAG-AML1a片断的凝胶电泳分析(M：DL2,000Maker)；
图2是pMD18-T-FLAG-AML1a质粒克隆及XhoI酶切鉴定(M：DL 15,000Maker；P：Plasmid；C：XhoI酶切)；
图3是EcoI酶切鉴定pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP正反向，正向存在一长约900bp的片段(2、10、14、15号克隆为正向插入)；
图4是pV Pack-Eco、pV Pack-Eco、pMSCV-IRES-YFP及pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP质粒结构图；
图5是转染MSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP的293T细胞(光镜及荧光显微镜，400×)；
图6是共转染pV Pack-Eco、pV Pack-Eco、pMSCV-IRES-YFP或pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP的293T细胞转染效率测定293T-CON：未转染对照组293T-YFP：载体质粒为pMSCV-IRES-YFP的转染组；293T-AML1a：载体质粒为pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP的转染组)；
图7是逆转录病毒滴度测定(3T3-CON：未感染对照组；YFP：仅转导YFP的感染组，病毒滴度1.2×105；AML1a转导AML1a及YFP的感染组，病毒滴度4.1×104。ml数为所加入病毒上清的体积)；
图8是Western blot检测感染3T3细胞中AML1a的表达(CON：未感染的3T3细胞；YFP：单一转导YFP的3T3细胞；AML1a：转导AML1a的3T3细胞)；
图9是逆转录病毒感染C57小鼠骨髓细胞感染效率测定(CON：未感染对照组；YFP：仅转导YFP的对照组；AML1a：转导AML1a及YFP的感染组)；
图10是Western blot检测C57小鼠BMMNC中AML1a的表达(CON.未感染对照组；YFP.单一转导YFP的小鼠BMMNC；AML1a.转导AML1a的小鼠BMMNC)；
图11是105#、109#、110#和111#AML1a移植小鼠及YFP对照小鼠外周血5w、12w及处死前荧光率测定；
图12是骨髓移植小鼠生存情况(A.骨髓移植小鼠生存情况；B.骨髓移植小鼠生存曲线AML1a：转导AML1a小鼠(n＝12)；YFP：仅转导YFP的对照小鼠(n＝12))；
图13是AML1a骨髓移植小鼠中发病鼠的解剖外观(105#(A)109#(D)均可见肝脾肿大。B：105#小鼠脾脏，上方为正常对照；C：105#小鼠肝脏，右侧为正常对照。109#伴有胸腺瘤(E)，F：109#小鼠脾脏)
图14是105#小鼠外周血、骨髓细胞形态及组织病理切片结果(a.外周血瑞氏染色；b.骨髓瑞氏-吉姆萨染色；c.股骨；d.脾；e.肝；f.胸骨；g.肺)；
图15是109#小鼠外周血、骨髓细胞形态及组织病理切片结果(a.外周血瑞氏染色；b.骨髓瑞氏-吉姆萨染色；c.股骨；d.脾；e.肝；f.肺；g.肾)；
图16是109#、105#小鼠脾细胞、骨髓细胞免疫表型测定(A.109#小鼠免疫表型示Sca-1+C-KIT+Thy1.2+CD3+CD4+CD8+，YFP：单一转导YFP的对照组；B.109#小鼠YFP阳性细胞为Sca-1+C-KIT+双阳和CD3+CD4+CD8+双阳性表型；C.105#小鼠YFP阳性细胞中免疫表型示Sca-1+cCD3+)；
图17是发病小鼠AML1a基因整合及表达的鉴定(a.发病小鼠SP基因组DNA扩增AML1a基因；b.AML1a在mRNA水平的表达情况；c.相应-actin的表达d.AML1a蛋白在小鼠SP细胞中的表达。21#为单一转导YFP的对照小鼠，AML1a vector为pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP质粒，293T-AML1a为已证实有AML1a表达的293T细胞)；
图18是二次移植小鼠BM细胞周期测定(a.正常对照细胞周期测定；b.发病小鼠细胞周期测定；c.发病小鼠BMCG0/G1期百分比与正常对照的比较，P＜0.05)。
具体实施方式
结合下述实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅限于下述实施实例。
1携带AML1a的逆转录表达载体的构建
利用高保真DNA多聚酶，自pCDNA3-FLAG-AML1a中，PCR扩增FLAG-AML1a，序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，上游引物和下游引物分别为5’-CTCGAGGGATCCCACTATAGGGAGACCCAAG-3’和5’-CCCTATTCTATAGTGTCACCT-3’，反应条件为95℃预变性5min，95℃45s，53℃45s，72℃45s，30个循环后72℃延伸2min，扩增片段长度为954bp，电泳定量(图1)并进行胶回收纯化，连接入pMD18-T Simple载体中，转化E.coli DH5α菌株，在LB平皿中进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒经Xho I双酶切鉴定后(图2)，送测序。测序正确的克隆，经XhoI酶切得到FLAG-AML1a片段，胶回收纯化。pMSCV-IRES-YFP经XhoI酶切，CIAP去磷酸化，纯化定量，与自pMD18-T-FLAG-AML1a载体XhoI酶切纯化所得的FLAG-AML1a片段连接，转化DH5α感受态细胞后挑取克隆，EcoI酶切鉴定已插入目的片段正反向(图3)。
2逆转录病毒的制备
2.1磷酸钙共沉淀法转染293T细胞制备逆转录病毒
大量提取质粒，分别将pMSCV-IRES-YFP、pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP与辅助质粒pV Pack-Eco(含Env)、pV Pack-GP(含gal-pol)(图4)组合，共同转染293T细胞。转染前24h用胰酶消化、收集处于对数生长期的第4-12代293T细胞，用含10％FBS的DMEM培养液以5×106细胞/孔均匀平铺于10-20个10cm培养皿中。37℃5％CO2孵箱培养24h，达50-60％汇合度后开始转染。于转染前1h更换为5％FBS的DMEM培养液。于1.5ml灭菌EP管内加入20μg质粒，加入10μl 2.5M的CaCl2，用无菌去离子水补齐至1ml；在10ml灭菌EP管内加入已达室温的2×BBS液1ml，将质粒与CaCl2的混合液缓慢滴入BES液中，边滴边轻弹管壁，混匀；室温放置15min后将上液缓慢滴入10cm培养皿上，边滴边摇，混匀；将10cm培养皿放入37℃5％CO2孵箱孵育12h；吸去培养基；加5ml含5％FBS的DMEM培养液，于37℃5％CO2孵箱孵育；48h观察293T细胞转染情况，荧光显微镜下可见转染AML1a293T细胞的荧光表达(图5)。流式细胞术检测293T细胞的转染效率(图6)。
2.2逆转录病毒的浓缩及滴度测定
转染48h及72h后小心收集293T细胞培养上清，4℃25,000rpm离心100min，弃上清，以4℃无血清IMDM培养基2ml溶解沉淀，分装，-80℃冻存。留取少量上清，将上清样品梯度稀释，感染NIH/3T3细胞，测定YFP阳性率，估算病毒滴度。具体方法为：感染前24h用胰酶消化、收集第4-12代3T3细胞，用含10％FBS的DMEM培养液以1×105细胞/孔均匀平铺于六孔板上。37℃5％CO2孵箱培养24h，于感染前1h更换为含10％FBS的DMEM培养液。在未浓缩病毒上清中按1∶1,000比例加入8μg/μl ploybrene，混匀，按0.1、0.2、0.5、1ml的浓度梯度分别加入六孔板中，使总培养体系为2ml，混匀，6h后更换为10％FBS的DMEM培养液，每孔重复三次。感染48h后胰酶消化、收集3T3细胞，PBS液洗涤细胞，悬于1％多聚甲醛的PBS液中，1h内流式细胞仪检测荧光率。取荧光阳性率在10％左右的3T3计算病毒滴度。计算公式见下：病毒滴度(cfu/ml)＝细胞数(1×105)×荧光阳性率/病毒量(ml)
结果显示仅转导YFP的感染组，病毒滴度约为1.2×105，转导AML1a及YFP的感染组，病毒滴度约为4.1×104(图7)。剩余病毒上清离心浓缩，-80℃保存备用。
3 Western blot对感染3T3细胞中AML1a的表达的鉴定
收集1×1073T3细胞，PBS洗涤后悬浮于细胞裂解液中裂解细胞，冰上放置30min，4℃12,000g离心10min，收集上清。以Bicinchoninic Acidassay法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳的分离胶与浓缩胶的浓度分别为10％和4％。待测细胞裂解液和蛋白分子量标准首先加入4×变性凝胶上样缓冲液，100℃煮沸3min。然后依次加入上样孔中。电泳开始时电流为20mA/cm凝胶，染料进入分离胶后，电流加大至40mA/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。取下凝胶，用转移缓冲液浸泡数min，然后进行转膜。用半干蛋白转移装置将蛋白转移到硝酸纤维素滤(NC)膜上，按转移蛋白的常规方法进行，电转3h。转移结束后去除滤纸。把凝胶转移至考马斯亮蓝染液的托盘中染色，以检查蛋白转移是否完全。将转移上蛋白的NC膜浸在5％脱脂奶4℃封闭过夜后，将膜与抗FLAG抗体(1∶2000稀释)孵育2h，然后用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次5min。将膜与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶500稀释)共同孵育1.5h，PBS-T缓冲液洗膜3次，每次5min。最后以DAB为底物显色。结果显示AML1a在AML1a病毒转导组高表达，在未转导组及YFP对照组均无表达(图8)。
3小鼠模型的建立
3.1逆转录病毒感染C57小鼠BMMNC及感染效率的测定
4-6周龄雄性C57小鼠，腹腔内注射5氟脲嘧啶(5-Fu)150mg/kg，3d后处死小鼠，取股骨及胫骨骨髓，分离单个核细胞，培养于加mSCF 50ng/ml、mIL-3 50ng/ml和mIL-6 10ng/ml的20％FBS的IMDM中，刺激细胞增殖24h后离心，留取上清4℃保存，加入病毒浓缩液及polybrene 8ug/ml，混匀，1,500rpm离心90min，加入FBS，使终浓度为5％，感染4h后2,000rpm离心10min，弃上清，加入含有上述4℃保存的含细胞因子的培养液及20％FBS的IMDM中培养，每24h感染一次，维持相同的细胞因子浓度。浓缩病毒上清感染三次。感染72h后，取1×106细胞流式细胞仪测定YFP阳性率。结果显示逆转录病毒可以感染小鼠骨髓细胞，YFP的对照组及AML1a组的感染效率分别为36％和27％(图9)。
3.2AML1a蛋白在C57BMMNC中表达的测定
收集感染72h的BMMNC进行蛋白电泳，以FLAG抗体来检测AML1a的表达情况。结果显示AML1a在携带AML1a的病毒转导组高表达，在未转导组及YFP对照组均无表达(图10)。由此进一步证实病毒感染的有效性。
3.3骨髓移植小鼠定期外周血荧光检测
移植小鼠定期尾静脉取血，流式细胞术检测外周血单个核细胞荧光阳性率变化情况。转导AML1a组小鼠外周血YFP阳性率随移植时间的延长而逐渐增加，而YFP对照组阳性率变化不明显(图11)。
3.4接受AML1a骨髓移植的小鼠发生白血病
用D-Hanks洗涤逆转录病毒基因转导的BMMNC两次，计数。4-6周龄雌性C57小鼠经9Gy致死剂量照射后，尾静脉输入3×106转导后的BMMNC，剪耳做标记，在SPF级动物合格环境下饲养，移植4w后定期经尾静脉取血，查血象、白细胞分类和荧光阳性率。血象有异常改变后，处死小鼠，研究有无肝、脾、淋巴结肿大，及细胞表型改变。结果显示在12个月的观察期内移植了转导AML1a组的12只小鼠有9只相继发病(表1和图12A、B)，而12只YFP对照组小鼠健康存活。发病鼠解剖可见肝脾肿大，可伴有胸腺瘤(图13)。
表1 AML1a骨髓移植小鼠中发病鼠的基本情况
ND：未测定
4白血病小鼠模型的鉴定
4.1发病小鼠外周血、骨髓细胞形态及病理结果
小鼠外周血涂片、1×105BMMNC甩片，瑞氏-吉姆萨染色普通光学显微镜下观察(图14a、14b、15a、15b)。取发病小鼠肝、脾、骨髓、胸腺、肾等组织器官石蜡包埋切片，进行HE染色：①取材裸鼠移植瘤肿瘤组织块，10％中性福尔马林固定24小时，常规石蜡包埋，4μm切片；②切片常规用二甲苯脱蜡，经梯度乙醇至水洗：二甲苯I 5min→二甲苯II 5min→100％乙醇2min→95％乙醇2min→80％乙醇2min→75％乙醇2min→蒸馏水水洗2min；③苏木素染色5min，自来水洗5min；④盐酸乙醇分化30sec，自来水洗3min；⑤弱碱性水溶液返蓝60sec，自来水洗10min；⑥伊红染色2min，蒸馏水洗2次；⑦常规脱水、透明、封片：75％乙醇2min→80％乙醇2min→95％乙醇2min→100％乙醇2min→二甲苯I 5min→二甲苯II 5min→中性树胶封片。普通光学显微镜观察、摄片。结果显示相关组织均有白血病细胞浸润(图14c-g、15c-g)。
4.2发病小鼠免疫表型分析
取BMMNC及脾细胞标记各系抗体进行流式检测。流式结果显示主要有两种免疫表型(图18)：一种为CD3+CD4+CD8+(图16A，B)，另一种为Sca-1+cCD3+，提示发病小鼠均为T-淋巴细胞白血病(图16C)。
5白血病小鼠中AML1a基因整合的鉴定
提取C57移植小鼠脾单个核细胞的基因组DNA，PCR扩增AML1a，上游引物和下游引物分别为5’-GGATCCCACTATAGGGAGACCCAAG和5’-CCCTATTCTATAGTGTCACCT，反应条件为95℃预变性5min，95℃45s，53℃45s，72℃45s，30个循环后72℃延伸2min，预计扩增片段长度为948bp，结果显示白血病小鼠中均有AML1a基因的整合，对照组中没有该基因的整合(图17a)。
6发病小鼠AML1a基因表达的鉴定
提取C57移植小鼠脾单个核细胞RNA及蛋白质，用RT-PCR及WesternBlot方法检测小鼠造血系统内AML1a的表达情况。用分光光度计测定A260/A280，计算RNA含量，并经12g/L琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整。20l逆转录反应体系含2g总RNA，4l RT缓冲液，50pmol/L oligo(dT)16，1mol/L dNTPs，0.1mol/L DTT，15U RNA酶抑制剂(Takara)，200UMLV(Invitrogen)，于65℃水浴5min，冰浴5min，37℃水浴60min，70℃15min终止反应，所得cDNA-20℃保存备用。上游引物和下游引物分别为5’-GGATCCCACTATAGGGAGACCCAAG-3’和5’-CCCTATTCTATAGTGTCACCT-3’，反应条件为95℃预变性5min，95℃45s，53℃45s，72℃45s，30个循环后72℃延伸2min，预计扩增片段长度为948bp，结果显示AML1a在白血病小鼠中无论是转录阶段还是翻译阶段均高表达，在YFP对照组无表达(图17b-17d)。
7发病小鼠白血病细胞二次移植能力的鉴定
为确定发病小鼠白血病细胞的二次移植能力，取上述已鉴定细胞表型的7只小鼠的脾细胞(5×106)分别经尾静脉注射至半数致死剂量(4.5Gy)照射的同类小鼠中，每只原代发病小鼠的脾细胞各移植4只。第二代小鼠移植后4-9w内均可发病，平均移植后生存期为47d。组织病理及细胞表型与第一代发病鼠一致。
8AML1a对小鼠BM细胞周期的影响的鉴定
将AML1a小鼠脾细胞传代后取第二代发病鼠的骨髓细胞进行细胞周期测定。与对照组相比，AML1a组小鼠BM中G0/G1细胞比例增高，S期细胞比例明显降低(图18a，18b)，两组小鼠BM G0/G1期细胞差异有统计学意义(P＜0.05)(图18c)，说明AML1a基因可以抑制细胞自G0/G1期向S期转换。
综上所述，本发明通过构建pMSCV-FLAG-AML 1a-IRES-YFP质粒，将此质粒和pMSCV-IRES-YFP分别与辅助质粒pV Pack-Eco(含Env)、pVPack-GP(含gal-pol)组合，通过磷酸钙沉淀法转染293T细胞，制备逆转录病毒。病毒感染3T3细胞，检测病毒滴度，并测定AML1a的表达情况。C57雄性小鼠的骨髓单个核细胞(BMMNC)置于含mSCF、mIL-3、mIL-6的IMDM培养液中培养，通过三轮逆转录病毒转导AML1a后，将此BMMNC尾静脉注射至致死剂量照射的C57雌性小鼠体内。定期尾静脉取血，查血象及白细胞分类。血象有异常改变后，处死小鼠，解剖查看肝、脾、淋巴结等器官肿大情况，流式细胞术分析细胞表型变化。各器官组织进行病理检测，流式分析显示细胞表型。
所得的小鼠模型具有两种细胞表型：CD3+CD4+CD8+，另一种为Sca-1+cCD3+。两种表型的细胞均具有二次移植能力。小鼠模型的脾细胞传代，第二代发病鼠的骨髓细胞的细胞周期阻滞于G1期。
本发明的白血病小鼠模型可以为白血病的靶向治疗提供新的靶向分子AML1a。为白血病的靶向治疗提供新的动物模型，从而进一步研究和阐述淋巴细胞白血病的发病机制。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>中国医学科学院血液学研究所
<120>转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法及应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>783
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(783)
<400>1
atg gac tac aag gac gac gac gat aag gaa ttc cgt atc ccc gta gat 48
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Phe Arg Ile Pro Val Asp
1 5 10 15
gcc agc acg agc cgc cgc ttc acg ccg cct tcc acc gcg ctg agc cca 96
Ala Ser Thr Ser Arg Arg Phe Thr Pro Pro Ser Thr Ala Leu Ser Pro
20 25 30
ggc aag atg agc gag gcg ttg ccg ctg ggc gcc ccg gac gcc ggc gct 44
Gly Lys Met Ser Glu Ala Leu Pro Leu Gly Ala Pro Asp Ala Gly Ala
35 40 45
gcc ctg gcc ggc aag ctg agg agc ggc gac cgc agc atg gtg gag gtg 192
Ala Leu Ala Gly Lys Leu Arg Ser Gly Asp Arg Ser Met Val Glu Val
50 55 60
ctg gcc gac cac ccg ggc gag ctg gtg cgc acc gac agc ccc aac ttc 240
Leu Ala Asp His Pro Gly Glu Leu Val Arg Thr Asp Ser Pro Asn Phe
65 70 75 80
ctc tgc tcc gtg ctg cct acg cac tgg cgc tgc aac aag acc ctg ccc 288
Leu Cys Ser Val Leu Pro Thr His Trp Arg Cys Asn Lys Thr Leu Pro
85 90 95
atc gct ttc aag gtg gtg gcc cta ggg gat gtt cca gat ggc act ctg 336
Ile Ala Phe Lys Val Val Ala Leu Gly Asp Val Pro Asp Gly Thr Leu
100 105 110
gtc act gtg atg gct ggc aat gat gaa aac tac tcg gct gag ctg aga 384
Val Thr Val Met Ala Gly Asn Asp Glu Asn Tyr Ser Ala Glu Leu Arg
115 120 125
aat gct acc gca gcc atg aag aac cag gtt gca aga ttt aat gac ctc 432
Asn Ala Thr Ala Ala Met Lys Asn Gln Val Ala Arg Phe Asn Asp Leu
130 135 140
agg ttt gtc ggt cga agt gga aga ggg aaa agc ttc act ctg acc atc 480
Arg Phe Val Gly Arg Ser Gly Arg Gly Lys Ser Phe Thr Leu Thr Ile
145 150 155 160
act gtc ttc aca aac cca ccg caa gtc gcc acc tac cac aga gcc atc 528
Thr Val Phe Thr Asn Pro Pro Gln Val Ala Thr Tyr His Arg Ala Ile
165 170 175
aaa atc aca gtg gat ggg ccc cga gaa cct cga aga cat cgg cag aaa 576
Lys Ile Thr Val Asp Gly Pro Arg Glu Pro Arg Arg His Arg Gln Lys
180 185 190
cta gat gat cag acc aag ccc ggg agc ttg tcc ttt tcc gag cgg ctc 624
Leu Asp Asp Gln Thr Lys Pro Gly Ser Leu Ser Phe Ser Glu Arg Leu
195 200 205
agt gaa ctg gag cag ctg cgg cgc aca gcc atg agg gtc agc cca cac 672
Ser Glu Leu Glu Gln Leu Arg Arg Thr Ala Met Arg Val Ser Pro His
210 215 220
cac cca gcc ccc acg ccc aac cct cgt gcc tcc ctg aac cac tcc act 720
His Pro Ala Pro Thr Pro Asn Pro Arg Ala Ser Leu Asn His Ser Thr
225 230 235 240
gcc ttt aac cct cag cct cag agt cag atg cag gag gaa gac aca gca 768
Ala Phe Asn Pro Gln Pro Gln Ser Gln Met Gln Glu Glu Asp Thr Ala
245 250 255
ccc tgg aga tgt taa 783
Pro Trp Arg Cys
260
<210>2
<211>260
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>2
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Phe Arg Ile Pro Val Asp
1 5 10 15
Ala Ser Thr Ser Arg Arg Phe Thr Pro Pro Ser Thr Ala Leu Ser Pro
20 25 30
Gly Lys Met Ser Glu Ala Leu Pro Leu Gly Ala Pro Asp Ala Gly Ala
35 40 45
Ala Leu Ala Gly Lys Leu Arg Ser Gly Asp Arg Ser Met Val Glu Val
50 55 60
Leu Ala Asp His Pro Gly Glu Leu Val Arg Thr Asp Ser Pro Asn Phe
65 70 75 80
Leu Cys Ser Val Leu Pro Thr His Trp Arg Cys Asn Lys Thr Leu Pro
85 90 95
Ile Ala Phe Lys Val Val Ala Leu Gly Asp Val Pro Asp Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Met Ala Gly Asn Asp Glu Asn Tyr Ser Ala Glu Leu Arg
115 120 125
Asn Ala Thr Ala Ala Met Lys Asn Gln Val Ala Arg Phe Asn Asp Leu
130 135 140
Arg Phe Val Gly Arg Ser Gly Arg Gly Lys Ser Phe Thr Leu Thr Ile
145 150 155 160
Thr Val Phe Thr Asn Pro Pro Gln Val Ala Thr Tyr His Arg Ala Ile
165 170 175
Lys Ile Thr Val Asp Gly Pro Arg Glu Pro Arg Arg His Arg Gln Lys
180 185 190
Leu Asp Asp Gln Thr Lys Pro Gly Ser Leu Ser Phe Ser Glu Arg Leu
195 200 205
Ser Glu Leu Glu Gln Leu Arg Arg Thr Ala Met Arg Val Ser Pro His
210 215 220
His Pro Ala Pro Thr Pro Asn Pro Arg Ala Ser Leu Asn His Ser Thr
225 230 235 240
Ala Phe Asn Pro Gln Pro Gln Ser Gln Met Gln Glu Glu Asp Thr Ala
245 250 255
Pro Trp Arg Cys
260
Claims (8)
1、一种转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：
1)载体构建：自pCDNA3-FLAG-AML1a中，PCR扩增FLAG-AML1a，连接入pMD18-T Simple载体中，转化E.coli DH5菌株，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒经XhoI双酶切鉴定后测序，测序正确的克隆，经XhoI酶切得到FLAG-AML1a片段，pMSCV-IRES-YFP经XhoI酶切，CIAP去磷酸化，与自pMDsimple-T-FLAG-AML1a载体XhoI酶切纯化所得的FLAG-AML1a片段连接，转化DH5α感受态细胞后挑取克隆，EcoI酶切鉴定已插入目的片段正反向，正向插入的质粒命名为pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP；
2)病毒制备：逆转录病毒载体质粒pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP或pMSCV-IRES-YFP分别与辅助质粒pV Pack-Eco和pV Pack-GP组合，辅助质粒pV Pack-Eco含Env，pV Pack-GP含gal-pol，组合通过磷酸钙沉淀法转染293T细胞，制备逆转录病毒，病毒感染3T3细胞，检测病毒滴度，并测定AML1a的表达情况；
3)骨髓细胞的感染：C57雄性小鼠的骨髓单个核细胞置于含mSCF、mIL-3、mIL-6的IMDM培养液中培养，加入ploybrene进行三轮逆转录病毒转导；
4)将转导了AML1a基因的小鼠骨髓单个核细胞经尾静脉注射至经137Cs致死剂量照射的C57雌性小鼠体内，建立转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型；
5)模型鉴定。
2、根据权利要求1所述的转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法，其特征在于，所述的逆转录病毒的载体是插入人AML1a的真核表达质粒，插入核苷酸的长度为912个核苷酸，FLAG和AML1a共用ATG起始密码子，形成融合基因，由此融合基因编码的蛋白具有260个氨基酸，使FLAG成为AML1a表达的筛选标记。
3、根据权利要求2所述的转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法，其特征在于，所述的逆转录病毒载体pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP用于哺乳动物细胞表达，长约7.2kb，带有PGK启动子、多克隆位点及黄色荧光蛋白基因(YFP)；其多克隆位点上存在EcoI、HpaI和XhoI酶切位点；IRES使FLAG-AML1a和YFP共表达。
4、根据权利要求1所述的转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法，其特征在于，所述的模型鉴定采用如下指标：
1)小鼠外周血荧光率的检测——流式细胞术；
2)外周血及骨髓细胞形态学改变——瑞氏-吉姆萨染色观察；
3)各脏器病理变化——HE染色观察；
4)白血病小鼠细胞表型的鉴定——流式细胞术；
5)AML1a基因整合至小鼠基因组中的检测——PCR；
6)AML1a基因转录水平的RT-PCR检测；
7)AML1a基因翻译水平的Western blot检测；
8)AML1a基因高表达对小鼠骨髓细胞细胞周期改变的检测——流式细胞术。
5、根据权利要求4所述的转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法，其特征在于，所述模型具有两种细胞表型：一种为CD3+CD4+CD8+，另一种为Sca-1+cCD3+，这两种表型都为T-淋巴细胞白血病的免疫表型。
6、根据权利要求5所述的转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型的制备方法，其特征在于，所述模型中两种表型的细胞均具有二次移植能力。
7、用权利要求1-6中任一项所述的方法构建的转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型。
8、权利要求7所述的转导人AML1a基因的淋巴细胞白血病小鼠模型在白血病的靶向治疗中的应用。
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-
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