CN101886075B

CN101886075B - 猪rosa26启动子及其应用

Info

Publication number: CN101886075B
Application number: CN2010102155278A
Authority: CN
Inventors: 孔庆然; 武美玲; 刘忠华
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2030-07-02
Also published as: CN101886075A

Abstract

本发明公布了猪ROSA26启动子序列及其应用，根据鼠，牛，人中ROSA26位点的序列比对得到保守序列，根据保守序列设计引物扩增得到猪内源ROSA26启动子；得到的ROSA26启动子用于外源基因的GFP的表达，GFP蛋白在猪中得到广泛稳定的表达，可解决转基因猪外源基因表达的不稳定性以及位置效应的不可预知性，为工业化生产提供了可能。

Description

猪ROSA26启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种猪启动子及其应用，尤其涉及ROSA26启动子及其应用。

背景技术

近十年来，转基因技术得到迅猛的发展和广泛的应用，其与克隆技术的结合使转基因动物的生产从基础研究向产业化迈进成为可能，而转基因动物产业化成功的关键就在于使外源基因在转基因动物中稳定、高效和广泛的表达，目前研究表明，这主要与外源基因启动子的活性相关，因此，得到能使外源基因在转基因动物中稳定高效表达的启动子是十分重要的。

在小鼠中，现已证明，ROSA26启动子无论是在各个胚胎发育时期还是在成体各种组织器官中，即几乎所有的细胞中都具有广泛且高效的活性，而且目前已有多个ROSA26转基因小鼠品系(Zambrowicz BP，Imamoto A，Fiering S，et al.(1997)Disruption of overlappingtranscripts in the ROSA beta geo 26 gene trap strain leads to widespread expressionof beta-galactosidase in mouse embryos and hematopoietic cells.Proc Natl Acad SciUSA，94(8)：3789-3794；Kisseberth WC，Brettingen NT，Lohse JK，et al.(1999)Ubiquitous expression of marker transgenes in mice and rats.Dev Biol，214(1)：128-138)。此外，最近人ROSA26启动子也以成功克隆，并也验证了其驱动外源基因在各种细胞类型中表达的广泛性(Stefan Irion，Herve Luche，Paul Gadue，et al.(2007)Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells.NatBiotechnol，25：1477-1482)。虽然ROSA26启动子在转基因小鼠中得到广泛应用，但在转基因大家畜中还未见报通。目前，转基因猪的生产多使用低等真核生物子或小鼠等其它物种来源的启动子，由于其异源性，容易受到免疫介导的排斥和表观遗传修饰，导致外源基因沉默，所以不利于外源基因在转基因猪中稳定、高效和广泛的表达。因此猪内源ROSA26启动子的鉴定与应用在转基因猪的生产和研究领域具有实际应用价值。

本发明应用的启动子是猪内源启动子，因此在猪或高等哺乳动物基因组中不会受到免疫介导的排斥和表观遗传修饰，能介导外源基因稳定高效的表达。另外，猪ROSA26启动子能介导外源基因在各个胚胎发育时期和成体各种组织器官中表达，即在几乎所有的细胞中都具有活性，能介导外源基因广泛的表达。因此本发明即获得了一个能介导外源基因在高等哺乳动物中广泛、高效和稳定表达的启动子。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪ROSA26启动子，用以解决转基因猪外源基因表达的不稳定性以及位置效应的不可预知性。

所述启动子的DNA序列如以下1)或2)或3)所示：

1)其DNA序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；

2)在严格条件下与2)限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列。

所述启动子的克隆方法包括：将人，鼠，牛中ROSA26位点的序列进行比对找到同源的保守序列；设计引物；以猪基因组为模板，克隆ROSA26启动子。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供所述猪ROSA26启动子的应用。

所述启动子的应用，其特征在于用于猪外源或内源基因的表达。

所述启动子的应用，其特征在于用于猪外源基因或内源基因的稳定表达。

本发明获得的猪内源启动子，因此在猪或高等哺乳动物基因组中不会受到免疫介导的排斥和表观遗传修饰，能介导外源基因稳定高效的表达。另外，猪ROSA26启动子能介导外源基因在各个胚胎发育时期和成体各种组织器官中表达，即在几乎所有的细胞中都具有活性，能介导外源基因广泛的表达。因此本发明即获得了一个能介导外源基因在高等哺乳动物中广泛、高效和稳定表达的启动子，为今后相关研究奠定基础。

附图说明

图1猪内源ROSA26启动子的克隆

A：通过PCR克隆得到的猪ROSA26启动子与猪基因组序列的Blast比对结果；B：pROSA26启动子定位；C：猪ROSA26启动子和小鼠ROSA26启动子的比对结果；D：猪ROSA26启动子的PCR克隆结果，红箭头所指为目的片段，大小为513bp。

图2第一外显子的表达检测

图3转基因阳性细胞的筛选结果

A：流式细胞仪对转基因阳性细胞的筛选；B：转基因阳性细胞在荧光镜下的照片。

图4GFP转基因胚胎的荧光照片

A-F：分别为1-细胞、2-细胞、3-细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚期胚胎的照片；A1-F1为细胞核；A2-F2为GFP蛋白；A3-F3为1和2的合成图。结果表明，在胚胎发育的各个时期pROSA26启动子都能介导外源基因的广泛表达。

图5第一外显子及GFP基因在转基因胚胎中的表达

A：Q-PCR检测第一外显子(Exonl)和GFP基因在各时期克隆胚胎和转基因供体细胞(donor cell)中的表达；B：RT-PCR检测第一外显子(Exonl)和GFP基因在各时期克隆胚胎和转基因供体细胞(donor cell)中的表达。Tg+为转基因阳性，Tg-为转基因阴性；RT+为加入反转录酶，RT-为没加反转录酶。

具体实施方式

实施例1猪ROSA26启动子

ROSA26启动子如SEQ ID NO.1所示，或在严格条件下(Tm-10～15℃)与SEQ ID NO.1限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列，或与SEQ ID NO.1限定的DNA序列高于90％同源性且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列。

实施例2猪ROSA26启动子的克隆

根据碱基互补配对原则在序列SEQ ID NO.15’和3’两侧设计克隆全长序列的上、下游引物，并在上、下游引物序列5’端分别加入AseI和NheI酶切位点，用于载体构建，最后通过Oligo 6.0软件校验Tm值和GC含量等各项参数。引物序列为：5’GCATTAATCTCGAGTTAGGCCCAACGCGGC3’(上游)和5’CGGCTAGCCCGCGGCCGCCCATCCC3’(下游)。PCR反应体系为(20ul)：

试剂体积

rTaq 0.1μl

dNTP 2.5ul

Buffer(10X) 2ul

上游引物(5μM) 1μl

下游引物(5μM) 1μl

DNA模板 0.4μl

蒸馏水 13μl

PCR反应条件为：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min(30cycles)；72℃10min；4℃1h。

通过PCR克隆得到的猪ROSA26启动子与猪基因组序列的Blast比对结果。结果表明克隆得到的pROSA26与猪基因组序列100％匹配，没有任何突变(图1A)；通过Blast比对发现pROSA26位于猪第13号染色体上(图1B)；猪ROSA26启动子和小鼠ROSA26启动子的比对结果。结果表明两个启动子的同源率达到92％(图1C)；猪ROSA26启动子的PCR克隆结果。红箭头所指为目的片段，大小为513bp(图1D)。

实施例3ROSA26基因第一外显子在猪各种组织中的表达

根据第一外显子的DNA序列，使用Primer Premier 5.0软件设计，并通过Oligo 6.0软件校验各项参数，筛选引物对。引物序列为：5’CGCCTAGAGAAGAGGCTGTGCTCTG3’(上游)和5’CAGAGTCCCGCTCCCCTACCTAGC3’(下游)。

Q-PCR反应体系为(20ul)：

试剂体积

SYBR Premix Ex Taq(2X) 10μl

上游引物(5μM) 1μl

下游引物(5μM) 1μl

cDNA模板 0.2μl

蒸馏水 7.8μl

Q-PCR反应条件为：95℃10sec；95℃5sec，60℃31sec(40cycl es)；95℃15sec，60℃30sec，95℃15sec。

通过Q-PCR检测第一外显子在猪各种组织中的表达情况。检测结果表明，pROSA26可以介导第一外显子在猪各种组织中广泛表达，见图2。

实施例4猪转基因胚胎的获得

构建质粒pEGFP-C1/pR26，转染猪胎儿成纤维细胞；流式细胞仪对转基因阳性细胞的筛选，转然后24h，阳性率为27.2％，第4天阳性率为4.9％，进行流式细胞仪分选，分选后阳性细胞率为57.1％(图3-A)；转基因阳性细胞在荧光镜下的照片。绿色为绿色荧光蛋白，蓝色为细胞核(图3-B)。

PFF为对照细胞，tPFF为转基因阳性细胞，以这两种为核供体，构建重构胚，囊胚率分别为27.33％和24.56％，没有显著差异，囊胚细胞数分别为28.92和25.18，也没有显著差异，而且我们检测了13个以转基因阳性细胞为核供体构建的重构胚，在这13个胚胎中都检测到GFP的表达，胚胎阳性率达到100％，上述结果表明pROSA26启动子能介导外源基因在胚胎中高效表达，并对胚胎的发育没有显著影响(表1)。转基因胚胎的荧光照片见图4.

表1转基因胚胎的体外发育

相同的上标代表差异不显著，P＞0.05

pEGFP-C1/pR26质粒构建：

分别用AseI和NheI(Takara)酶切质粒pEGFP-C1(clontech)，酶切产物电泳，采用凝胶回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit(北京天根生化科技有限公司)回收CMV启动子去除后的质粒片断，PMD18-T载体(Takara)16℃过夜连接，转化DH5α感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养10～15h，挑取单克隆，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养10～15h，4℃条件下8000r/min离心1min，收集菌液，采用质粒大提试剂盒Endofree Plasmid Kit(TIANGEN)提取pEGFP-C1/pR26质粒。

猪胎儿成纤维细胞的转染：

转染前24h，将培养的细胞消化稀释到一定密度(2×105)，接种于大平皿中，38.5℃、饱和湿度、5％CO2培养箱培养至70～90％汇合。将0.8μg质粒DNA溶于50μl无血清的DMEM中，轻轻混匀；将2μl脂质体(用前轻轻摇匀)溶于50μl无血清的DMEM中，轻轻混匀，然后在5min之内将两者混合，用移液器轻轻混匀，室温静置孵育20min，使DNA-脂质体复合物形成。之后补加400μl无血清的DMEM，轻轻混匀。用PBS洗待转染的细胞两次，再用无血清的DMEM洗待转染的细胞一次，然后将上述混合液加入细胞中，6h后，倒出转染液，用含20％血清的DMEM取代转染液，38.5℃、饱和湿度、5％CO2继续培养。24h后，荧光显微镜观察。

流式细胞仪分选：

胰酶消化转基因猪成纤维细胞，PBS清洗、悬浮，用于流式细胞仪(Becton-Dickinson)检测。细胞检测时，激发波长设为488nm，接受波长设为525nm，并通过对野生型猪成纤维细胞(对照)的检测，确定测量点(排除阴性细胞的自发荧光)、检测门(排除细胞碎片和死细胞)和检测速度(保证细胞的生物活性)，然后对阳性细胞进行分选。

实施例5第一外显子及GFP基因在转基因胚胎中的表达

通过Q-PCR检测第一外显子(Exonl)和GFP基因在各时期克隆胚胎和转基因供体细胞(donor cell)中的表达(图5A)，结果表明在胚胎发育的各个时期pROSA26启动子都能介导第一外显子和外源基因的广泛、高效和稳定的表达。

通过RT-PCR检测第一外显子(Exonl)和GFP基因在各时期克隆胚胎和转基因供体细胞(donor cell)中的表达(图5B)。结果表明，在胚胎发育的各个时期pROSA26启动子都能介导第一外显子和外源基因的广泛、高效和稳定的表达。

Q-PCR对第一外显子和GFP基因表达的检测：

相对定量PCR反应采用SYBR Green I荧光染料法，应用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)试剂盒。20μl反应体系如下：

试剂体积

SYBR Premix Ex Taq(2X) 10μl

上游引物(5μM) 1μl

下游引物(5μM) 1μl

cDNA模板 0.2μg

蒸馏水 7.8μl

反应体系在MicroAmp^TMOptical 96-Well Reaction Plate中混匀并用MicroAmp^TMOpticalAdhesiveFilm(美国ABI公司)封口。反应条件按ABI 7500仪器使用说明书设置，95℃10sec；95℃5sec，60℃31sec(40cycles)；95℃15sec，60℃30sec，95℃15sec，最后进行融解反应(dissociation stage)。反应结果使用Sequence Detection System software收集、分析。

基因表达量分析采用2^-ΔΔCT法。扩增的荧光信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值定义为阈值，而PCR扩增反应在到达阈值时，发生的循环数定义为CT值。根据扩增曲线设定阈值，然后得到CT值。

以18S rRNA作为内参，靶基因在实验组中相对于对照组的ΔΔCT值通过以下公式计算：

ΔΔCT＝(CT_靶基因-CT_18SrRNA)实验组-(CT_靶基因-CT_18SrRNA)对照组

靶基因在实验组中相对表达水平通过以下公式求出：

靶基因相对表达水平＝2^-ΔΔCT

每组实时定量PCR实验都独立重复至少三次。所得数据使用SPSS13.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，当P＜0.05时即认为差异显著。实时定量PCR结果按照“平均值±标准差”的形式进行绘图处理。

核苷酸序列表

<110>东北农业大学

<120>猪ROSA26启动子及其应用

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>513

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400>1

ctcgagttag gcccagcgcg gcgccacggc gtttcctggc cgggaatggc ccgtgcccgt 60

gaggtggggg tggggggcaa aaaggcggag cgagccaaag gcggtgaggg gggagggcca 120

gggaaggagg ggggggccgg cactactgtg ttggcggact ggcgggactg gggctgcgtg 180

agtctctgag cgcaggcggg cggcggccgc ccctcccccg gcggcggcgg cggcggcggc 240

ggcggcggca gcagctcact cagcccgctg cccgagcgga aacgccactg accgcacggg 300

gattcccagc gccggcgcca ggggcacccg ggacacgccc cctcccgccg cgccattggc 360

ccctccgccc accgtctcgc acccattggc cagctccccgc caatcagcg gaagccgccg 420

gggccgccta gagaagaggc tgtgctctgg ggctccggct cctcagagag cctcggctag 480

gtaggggagc gggactctgg tttgggggag ggc 513

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400>2

gcattaatct cgagttaggc ccaacgcggc 30

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400>3

cggctagccc gcggccgccc atccc 25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400>4

cgcctagaga agaggctgtg ctctg 25

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400>5

cagagtcccg ctcccctacc tagc 24

Claims

1.猪ROSA26基因启动子，其特征在于其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述启动子的应用，其特征在于用于猪外源或内源基因的表达。

3.根据权利要求2所述的启动子的应用，其特征在于用于猪外源基因或内源基因的稳定表达。