CN103609519A - Balb/c小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了BALB/C小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法，包括：a）细胞悬液的制作步骤：将间变性大细胞淋巴瘤细胞株加入适量的培养液中，充分吹打混匀后，转移至离心管中，用封口膜密封好，置于离心机内在1000rpm的转速下离心5分钟，弃去上清，加注射用生理盐水，吹打混匀，生成间变性大细胞淋巴瘤细胞重悬至1×107个/ml的细胞悬液；b）移植步骤：用注射器吸取0.5ml的所述细胞悬液，注入具有正常免疫功能的小鼠的皮下，即移植量为5×106个细胞。本发明的建模方法操作简单，成瘤率高，较好模拟了正常免疫环境下肿瘤的发生发展，且小鼠状态较好，死亡率低，是一种行之有效的建模方法。

Description

BALB/C小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法
技术领域
本发明涉及医学研究领域，尤其是具有正常免疫功能的BALB/C小鼠上建立淋巴瘤模型的方法。
背景技术
间变性大细胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL)由德国病理学家Stein于1985年第一次描述，由于肿瘤细胞高表达CD30抗原，又称Ki-1抗原，因而也被称为Ki阳性大细胞淋巴瘤。其细胞形态特殊，类似R-S细胞，有时可与霍奇金淋巴瘤和恶性组织细胞病相混淆，其病理形态和临床表现比较复杂，具有异质性，因而临床上的明确诊断有一定的困难，容易造成漏诊、误诊。
        间变性大细胞瘤发病率很低，是一种比较罕见的淋巴瘤疾病，其肿瘤细胞常呈间变性，且高度恶性，5年生存率仅为52%。因此，为进一步了解ALCL，建立ALCL肿瘤模型，模拟ALCL患者的免疫状态。探讨其发病机制，构建此种肿瘤的动物模型就显得尤为重要。
目前建立的ALCL的动物模型比较少，并且建立的这种模型也都是直接将肿瘤细胞或患者的肿瘤组织做些简单处理后移植到免疫功能缺陷鼠（包括裸鼠、SCID小鼠或者NOD/SCID鼠等）的体内而形成。而ALCL为恶性淋巴瘤，它属于免疫系统恶性肿瘤的一种，与免疫系统的关系十分密切，其发生、发展与机体的免疫微环境是密不可分的。由于小鼠具有免疫功能的缺陷，这些动物模型并不能真实的模拟具有免疫功能的ALCL患者，更无法运用此类模型去揭示ALCL肿瘤的发生机制、肿瘤细胞和宿主机体之间的相互作用以及肿瘤的发生、发展与人体免疫能力的相互影响。
因此，需要在具有免疫功能的动物身上构建此种肿瘤的动物模型，让人们可以在与机体非常相似的情形下开展研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种其组织病理学形态符合人类间变性大细胞淋巴瘤的生物学特性的动物模型的构建方法。
为实现上述目的，本发明的BALB/C小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法包括：a）细胞悬液的制作步骤：将间变性大细胞淋巴瘤细胞株加入适量的培养液中，充分吹打混匀后，转移至离心管中，用封口膜密封好，置于离心机内在1000rpm的转速下离心5分钟，弃去上清，加注射用生理盐水，吹打混匀，生成 间变性大细胞淋巴瘤细胞重悬至1×107个/ml的细胞悬液；b）移植步骤：用注射器吸取0.5ml的所述细胞悬液，注入具有正常免疫功能的小鼠的皮下，即移植量为5×106个细胞。
优选地，移植步骤每隔三天进行一次，共进行三次。
优选地，在移植步骤前，用环磷酰胺溶液处理小鼠。
优选地，用环磷酰胺处理小鼠时，先对小鼠称重，按照250mg/kg环磷酰胺的用药剂量及小鼠的重量，计算出小鼠所需要环磷酰胺的剂量，取相应剂量的环磷酰胺注射液，注入小鼠体内。
优选地，培养液可由改良型RPMI 1640培养基90 ml、10 ml Hyclone胎牛血清或Gibco血清、及1 ml双抗配制而成，其中Hyclone胎牛血清或Gibco血清的加入量可适当增加。
优选地，在培养间变性大细胞淋巴瘤细胞时，可包括对间变性大细胞淋巴瘤细胞进行传代的步骤。
本发明的建模方法操作简单，成瘤率高，较好模拟了正常免疫环境下肿瘤的发生发展，且小鼠状态较好，死亡率低，是一种行之有效的建模方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明。
本实施例中采用的小鼠为BALB/C小鼠，雌性，4-6周龄，在饲养时保证小鼠每日有10小时白天、14小时黑夜的昼夜节律。正式试验前先在动物饲养房里预养3天，使其适应饲养实验室的室内环境。本实施例中选用的间变性大细胞淋巴瘤细胞株是人间变性大细胞淋巴瘤细胞株Karpas-299，此细胞株来自间变性大细胞淋巴瘤患者，抽其腹水先分离瘤细胞，继而纯化，然后培养所得，它具有间变性大细胞淋巴瘤的特点，为T细胞型，细胞高表达CD30抗原。
由于BALB/C小鼠自身存在免疫力，因此移植的肿瘤细胞或肿瘤组织块易被小鼠的NK细胞和LAK细胞（即淋巴因子激活的杀伤细胞）所破坏，不容易形成肿瘤。因此，在移植肿瘤细胞前，先对小鼠进行环磷酰胺预处理，这样不仅可减少GVHD发生率与死亡率，同时也可降低BALB-c小鼠的免疫力。具体预处理方法为：分别称重小鼠，按照250mg/kg环磷酰胺的用药剂量及所称小鼠的重量，计算出每只小鼠所需要环磷酰胺的剂量。然后用注射器吸取相应剂量的环磷酰胺注射液，对小鼠进行常规消毒后，注入小鼠体内。
BALB/C小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型构建方法的步骤如下：
1、间变性大细胞淋巴瘤细胞的培养
将人间变性大细胞淋巴瘤细胞株Karpas-299细胞株置于37℃ CO2培养箱，静止培养8小时以上。之后，检查细胞生长状况（细胞数量、形态、亮度等），并适当加入一些培养液，培养液由改良型RPMI 1640培养基90 ml、10 ml Hyclone胎牛血清或Gibco血清及1 ml双抗制成。如果细胞状态不好，可以将胎牛血清浓度调整到20%，然后将培养瓶置于37℃ CO2培养箱继续培养。镜下观察细胞的状态比较好且细胞密度比较大时，需要对细胞进行传代。传代方法为：用吸管轻柔吹打，使培养瓶内的细胞均匀散开，取出3ml左右细胞悬液至新的培养瓶，各培养瓶都加入适量培养液，放入CO2培养箱培养。
2、细胞悬液的制作
将培养瓶中的ALCL细胞充分吹打混匀后，吸至无菌离心管中，用封口膜密封好，置于离心机内离心（1000rpm）5min，弃去上清，加注射用生理盐水，吹打混匀，使 ALCL细胞重悬至1×107个/ml。
3、移植
将上述制备好的ALCL细胞悬液充分混匀后，用1ml注射器吸取0.5ml，即每只小鼠的移植量为5×106个细胞，对小鼠常规消毒后，按照0.5ml/只的剂量将ALCL细胞悬液分别注射入各小鼠皮下。
注射后观察各移植实验组小鼠有无异常，注射部位有无出血，随后将各移植实验组小鼠放回SPF环境中继续饲养。每隔三天，在小鼠相同部位皮下注射，共移植3次。
4、病理切片HE、免疫组化观察。
将成瘤的BALB-c小鼠的肿瘤组织常规病理取材，取下肿瘤组织置于中性甲醛中固定，后行包埋、切片、HE染色，封片后在光镜下观察成瘤小鼠肿瘤组织的病理学变化，并通过免疫组化加以鉴定。
在本实施例中，移植细胞的数目多少对建模十分关键。细胞数目过多，常引起接种部位明显组织坏死、溃疡形成并伴细菌感染，增加小鼠死亡率；细胞数目过少，受机体免疫功能的影响，很容易被清除，不易形成肿瘤。本实施例应用5×106个细胞数目进行移植，是在预实验的基础上摸索出的最佳剂量，成瘤率比较高，达到80%。
另外，本实施例中采用间隔注射法，每隔三天，在小鼠相同部位皮下注射，共移植3次。移植次数少，肿瘤不易形成；移植次数太多，又容易破坏已生长的肿瘤组织。本实施例的实验方法较简单，实验周期短，成瘤率较高，移植瘤表现为实体瘤，容易观察，其组织病理学形态和免疫表型特征符合人类间变性大细胞淋巴瘤的特性。

Claims (6)

1.BALB/C小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法，包括：
a）细胞悬液的制作步骤：将间变性大细胞淋巴瘤细胞株加入适量的培养液中进行培养，然后将培养好的间变性大细胞淋巴瘤细胞充分吹打混匀后，转移至离心管中，用封口膜密封好，置于离心机内在1000rpm的转速下离心5分钟，弃去上清，加注射用生理盐水，吹打混匀，生成间变性大细胞淋巴瘤细胞重悬至1×107个/ml的细胞悬液；
b）移植步骤：用注射器吸取0.5ml的所述细胞悬液，注入具有正常免疫功能的小鼠的皮下，即移植量为5×106个细胞。
2.根据权利要求1所述的BALB/C小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法，其特征在于：
所述移植步骤每隔三天进行一次，共进行三次。
3.根据权利要求1或2所述的BALB/C小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法，其特征在于：
在所述移植步骤前，用环磷酰胺溶液处理所述小鼠。
4.根据权利要求3所述的BALB/C小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法，其特征在于：
用所述环磷酰胺处理所述小鼠时，先称重所述小鼠，按照250mg/kg环磷酰胺的用药剂量及所称小鼠的重量，计算出所述小鼠所需要环磷酰胺的剂量，取相应剂量的环磷酰胺注射液，注入所述小鼠体内。
5.根据权利要求1或2所述的BALB/C小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法，其特征在于：
所述培养液可由改良型RPMI 1640培养基90 ml、10 ml Hyclone胎牛血清或Gibco血清、及1 ml双抗配制而成，其中所述Hyclone胎牛血清或Gibco血清的加入量可适当增加。
6.根据权利要求5所述的BALB/C小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法，其特征在于：
在培养所述间变性大细胞淋巴瘤细胞时，可包括对所述间变性大细胞淋巴瘤细胞进行传代的步骤。
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