CN101863984B - GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗 - Google Patents

Abstract

GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗，其特征在于链亲合素标记的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子双功能融合蛋白和肿瘤坏死因子α双功能融合蛋白同时修饰锚定在已生物素化且灭活的前列腺癌细胞表面，并且这些锚定在前列腺癌细胞表面的GM-CSF和TNF-α仍然能保持相应的生物活性；该疫苗可用于前列腺癌的预防和治疗。

Description

GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗

技术领域

本发明属基因工程和细胞工程应用领域，GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗，其特征在于链亲合素标记的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(SA-GM-CSF)双功能融合蛋白和肿瘤坏死因子α(SA-TNFα)双功能融合蛋白同时修饰锚定在已生物素化且灭活的前列腺癌细胞表面，并且这些锚定在前列腺癌细胞表面的GM-CSF和TNF-α仍然能保持相应的生物活性。

背景技术

当前，前列腺癌的发病率在不断升高，已成为危害我国老年男性健康的最常见恶性肿瘤之一。前列腺癌常常容易发展为雄激素非依赖，而目前对此类前列腺癌尚无有效的治疗方法。

GM-CSF基因修饰的前列腺癌细胞治疗性疫苗对晚期激素非依赖的转移性前列腺癌Ⅱ期临床试验显示：接受疫苗组的病人中位生存期为35.2个月，而常规紫杉醇化疗组的病人中位生存期仅为18个月。该疫苗是用腺病毒作载体将GM-CSF基因导入前列腺癌细胞株PC-3(对雄激素不敏感)和LNCaP(对雄激素敏感)肿瘤细胞内，筛选出能高效分泌GM-CSF的肿瘤细胞克隆、γ-射线灭活后制成的前列腺癌治疗性疫苗。

但是，用基因修饰法制备肿瘤细胞疫苗存在如下固有缺陷：修饰效率一般都较低，并取决于肿瘤细胞的类型；肿瘤细胞疫苗接种到机体后，因经γ-射线灭活作用瘤苗细胞已进入凋零程序，从而导致导入基因的表达效率较低，致使表达产物的有效浓度在局部常常不能达到且不能较长时间地维持，从而实际抗肿瘤的临床效果有限；往往有潜在的病毒载体安全性问题和免疫原性问题(反复使用同一病毒载体会影响导入基因的表达效率)；很难同时高效表达多个具有协同作用的免疫刺激因子(如GM-CSF和TNFα)，不能对它们的表达量进行有效控制。此外，制备基因修饰的自体肿瘤细胞疫苗比较费时，成本较高，不易大规模开展。

为了克服目前基因修饰法制备肿瘤细胞疫苗存在的诸多固有缺陷，我们建立了一种快速、高效、安全的细胞膜表面锚定修饰技术。这个技术平台的基本原理是充分利用了细胞膜表面蛋白质的氨基(即-NH2)易生物素化以及生物素与链亲和素高效而强有力、几乎不可逆的结合——这两个特性。该技术有二个步骤：先用生物素化试剂将生物素交联到欲修饰的肿瘤细胞表面，然后链亲和素标记的免疫刺激因子(如细胞因子或/和免疫共刺激分子等)双功能融合蛋白借助链亲和素与生物素的特异结合将免疫刺激因子锚定在肿瘤细胞表面。利用该技术平台，可在体外对肿瘤细胞进行快速表面锚定修饰(4小时内完成)，使多种具有免疫协同作用的免疫刺激因子共同迅速永久地锚定修饰在肿瘤细胞的表面，且锚定修饰的量可进行精确控制。

因此，本发明将制备的SA-GM-CSF和SA-TNFα双功能融合蛋白、同时修饰锚定在已生物素化且酒精灭活的前列腺癌细胞表面，制备成新型的前列腺癌治疗性疫苗。

发明内容

GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗的发明过程如下：

首先制备SA-GM-CSF和SA-TNFα双功能融合蛋白(参见发明专利2004100525364)；用30％酒精灭活肿瘤细胞，因该处理能使细胞的形态不改变和细胞膜保持完整；用生物素化试剂将生物素化学交联到酒精灭活的肿瘤细胞表面；最后，将SA-GM-CSF和SA-TNFα这两个双功能融合蛋白持久锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，制备成前列腺癌治疗性疫苗。

附图说明

图1.不同浓度酒精处理的肿瘤细胞免疫原性。

图2.GM-CSF和TNF-α同时锚定在酒精灭活且已生物素化的RM-1前列腺癌细胞表面。

图3.锚定在生物素化的RM-1前列腺癌细胞表面的SA-GM-CSF之GM-CSF生物活性测定。

图4.锚定在生物素化的RM-1前列腺癌细胞表面的SA-TNFα之TNF-α生物活性测定。

图5.GM-CSF/TNF-α膜表面修饰RM-1前列腺癌细胞疫苗免疫原性的检测，观察肿瘤的发生率(A图)、肿瘤体积(B图)、小鼠的生存时间(C图)。

图6.GM-CSF/TNF-α膜表面修饰RM-1前列腺癌疫苗对小鼠正位前列腺癌模型的疗效(生存曲线)。

图7.GM-CSF/TNF-α膜表面修饰RM-1前列腺癌疫苗治疗正位前列腺癌模型后第1周，取小鼠脾行细胞毒性试验，比较各组裂解前列腺癌靶细胞的能力。

图8.脾细胞、IL-2和丝裂霉素处理过的肿瘤细胞三者共同孵育5天，各组上清含有IFN-γ、IL-4的定量分析及比较。

图9.治疗后脾细胞流式分析。

图10.免疫组化分析治疗后肿瘤组织CD4和CD8T淋巴细胞的浸润情况。

具体实施方式

通过下述实施例对本发明的技术特征作详细描述。

材料：

(1)细胞因子：SA-GM-CSF和SA-TNFα本实验室制备。

(2)细胞株、动物：前列腺癌细胞RM-1，C57BL/6雄性小鼠，C57BL/6小鼠的骨髓细胞。

(3)主要生化试剂及材料：FITC-抗GM-CSF、FITC-抗TNF-α、抗CD4、抗CD8抗体(BDBiosciences Pharmingen)；RMPI-1640、放线菌素(上海化工)；胎牛血清、胰酶(Sigma)；Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)；GM-CSF和TNF-α标准品(R & D Systems)；30％的酒精。

实施例1.SA-TNFα双功能融合蛋白的制备

参照SA-GM-CSF的制备方法(发明专利2004100525364)，从人体的外周血的单核细胞提取总RNA，通过RT-PCR的实验后得到hTNFα的基因片段，克隆于6His-SA-pET24a载体中，构建重组质粒6His-SA-L-hTNFα-pET24a，L为富含甘氨酸、丝氨酸的链接肽(15AA)；鉴定后转化入E.coli BL21(DE3)中，优化表达条件，获得高效表达的SA-hTNFα双功能融合蛋白。

实施例2.优化RM-1细胞酒精灭活的条件(图1)

方法：用100％，70％，50％，30％酒精与1×10⁶/ml RM-1肿瘤细胞室温孵育1小时，0.4％台盼蓝染色，观察细胞的形态，并计数统计分析，实验重复三次。

结果：30％酒精处理肿瘤细胞，1天内100％细胞形态保持不变，并保持细胞膜完整；10天内，90％细胞形态保持不变；16天内，仍然有72％细胞形态保持不变，具有显著性差异(P＜0.05)。

实施例3.GM-CSF和TNFα同时锚定在酒精灭活且已生物素化的RM-1前列腺癌细胞表面(图2)

RM-1细胞收获：0.25％胰酶消化，800rpm，离心5min，收集细胞，调整细胞浓度1×10⁷/ml；RM-1肿瘤细胞与30％酒精灭活孵育1h，PBS洗3次；生物素化试剂作用0.5h，PBS洗3次；加入等分子摩尔浓度的SA-GM-CSF、SA-TNFα双功能融合蛋白混合物(按200ng/10⁶细胞)，孵育1h，PBS洗3次。

取上述制备好的RM-1肿瘤细胞疫苗100ml，分别与带有FITC标志的抗GM-CSF抗体和抗TNF-α抗体，以及这两种单克隆抗体混合物孵育30分钟，用PBS+1％BSA洗三遍；经流式细胞仪分析表明，GM-CSF和TNF-α双功能融合蛋白能同时锚定在生物素化的RM-1细胞表面。

实施例4.GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌疫苗之TNF-α的活性测定(图3)

方法：1.将上述制备的GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌疫苗，调整细胞浓度1×10⁷/ml，放入冻存管中，将冻存管放入液氮中反复6-8次，使细胞膜破碎，并对胞膜碎片进行超声10次，15000rpm/min，离心15min，取上清与L929细胞孵育，观察上清对L929细胞的杀伤作用，以检测该前列腺癌疫苗的TNF-α的活性。2.收集呈对数生长期的L929，用10％FBS-RPMI 1640调整细胞浓度为1×10⁶/ml；将含TNFα的上清疫苗样品按不同稀释浓度(1∶2，1∶4...)加入96孔板，100μl/孔，设三复孔；每孔加入L929细胞悬液100μl，同时设空白对照组、标准品hTNF-α单克隆抗体、单独细胞组对照组；每孔加入0.75μg/ml放线菌素，空白对照组不加。37℃，5％CO2培养24小时后，每孔加20μl MTT振板混匀；37℃，5％CO2培养4h后，终止培养，小心吸取孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，脱色摇床振荡10min，使甲瓒溶解，选择OD570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以rhTNFα标准品和待检样品的稀释度为横坐标标，MTT的测定值OD₅₇₀为纵坐标，以直接作图法确定样品浓度。

结果：疫苗与标准品TNF-α一样具有对L929细胞杀伤的特性，根据标准品活性单位及浓度大约估计10⁶细胞可锚定60ng TNF-α。

实施例5.GM-CSF/TNF-α膜修饰的前列腺癌疫苗之GM-CSF的活性测定(图4)

方法：GM-CSF/TNF-α膜修饰的前列腺癌疫苗的上清制备同例3；无菌取小鼠骨髓细胞，用含血清培养液调骨髓细胞至1×10⁶/ml；将含GM-CSF的疫苗上清样品按不同稀释浓度(1∶2，1∶4...)加入96孔板，100μl/孔，设三复孔；每孔加入骨髓细胞悬液100μl，同时设空白对照组、单独细胞组、标准品mGM-CSF单克隆抗体对照组；37℃，5％CO2培养96h后，每孔加20μl MTT振板混匀；37℃，5％CO2培养4h后，终止培养，小心吸取孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，脱色摇床振荡10min，使甲瓒溶解，选择OD₅₇₀波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

结果：疫苗与标准品GM-CSF一样具有对骨髓细胞增殖的特性，根据标准品的活性单位和浓度大约估计10⁶细胞可锚定60ng GM-CSF。

实施例6.GM-CSF/TNF-α膜修饰的RM-1前列腺癌疫苗的免疫原性检测(图5)

方法：建立小鼠前列腺癌皮下移植瘤模型：用RM-1前列腺癌细胞1×10⁵/只(200μl PBS)右侧皮下注射。免疫治疗方案：分为五组，治疗组：GM-CSF/TNF-α膜修饰的RM-1前列腺癌细胞疫苗治疗组。对照组：(1)SA-GM-CSF膜修饰的RM-1前列腺癌细胞疫苗治疗组；(2)SA-TNF-α膜修饰的RM-1前列腺癌细胞疫苗治疗组；(3)酒精灭活RM-1前列腺癌细胞疫苗组；(4)PBS组。一周一次，连续3次，每次疫苗细胞数1×10⁶个/200μl，PBS组给予200μl PBS治疗；最后一次治疗后一周进行攻击，每只1×10⁵RM-1活细胞(200μl PBS)右侧皮下注射。每周测肿瘤大小两次，肿瘤直径超过2mm处死，试验反复三次。

结果：GM-CSF/TNF-α膜修饰的RM-1前列腺癌疫苗组肿瘤生长缓慢，生存期较长；与各对照组比较，联合锚定疫苗的免疫原性最强，具有显著性差异(P＜0.05)。

实施例7.GM-CSF/TNF-α膜修饰的RM-1肿瘤疫苗治疗正位前列腺癌的研究(图6)

方法：正位前列腺癌模型的建立：C57BL/6小鼠用0.6％戊巴比妥钠0.25ml麻醉，取仰卧位，下腹部正中横切口1-2cm，暴露膀胱和精囊腺，用无菌棉签轻压膀胱顶壁、腹侧壁，并向下游离至膀胱颈，推开肌肉及生殖腺进一步暴露前列腺可见其大小约1.0mm×2.0mm×1.5mm，分左右2叶，呈粉红色，有明显的腺体组织特征。在一侧前列腺包膜，缓慢进针，再缓慢推注RM-1细胞悬液25μl(5×10³个)，以包膜向上鼓起，脱离腺体表面为满意标准.恢复脏器的解剖位置，用非吸收线分别间断缝合腹壁肌肉层和皮肤层。2.免疫治疗方案：分为五组，治疗组：GM-CSF/TNF-α膜修饰的RM-1前列腺癌细胞疫苗治疗组。对照组：(1)GM-CSF膜修饰的RM-1前列腺癌细胞疫苗治疗组；(2)TNF-α膜修饰的RM-1前列腺癌细胞疫苗治疗组；(3)酒精灭活RM-1前列腺癌细胞疫苗组；(4)PBS组。在前列腺癌模型建立后，同时皮内给予疫苗细胞数2×10⁶个/200μl，PBS组给予200μl PBS治疗，每周一次，连续3次，观察生存期。

结果：GM-CSF/TNF-α膜修饰的RM-1前列腺癌细胞疫苗组生存期明显延长，与对照组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。

实施例8.CTL的检测(图7)

方法：1.脾细胞的制备：在上述第三次治疗后第1周，每组随机取一只小鼠，脱臼处死，无菌状态下分离小鼠脾脏，将脾脏置于200目筛网上，研磨，4℃，1000rpm，离心8min，收获单细胞悬液；用无血清RPMI-1640洗涤，加红细胞裂解液2ml，室温孵育2分，加RPMI-1640至10ml，离心去除红细胞，洗涤2次，获得脾细胞悬液，与rhIL2孵育5天，离心1000rpm，10min，调整脾细胞浓度为2×10⁷/ml。同时，取生长状态良好的靶细胞RM-1，0.25％胰酶消化，调整细胞浓度2×10⁵/ml。

2.分为五组：a.实验组(孔)：效靶比为100∶1，50∶1，25∶1，12.5∶1，6.25∶1终体积为100μl，靶细胞为50μl，设复孔三个。b.效应细胞释放组：效应细胞与实验组相同，加50μl全陪使终体积100μl。c.靶细胞自发释放LDH组：靶细胞50μl，加入培养基50μl。d.靶细胞最大释放LDH组：50μl靶细胞+10μl裂解液+40μl培养基。e.空白对照组：100μl培养基。

收集上清前45min加入10μl裂解液，37℃，5％CO₂孵育4小时后，离心250g×4min，取上清。将上清转移到新96孔板，加50μl Substrate Mix到每孔，避光，室温孵育30min，每孔加50μl终止液。在1小时内，测490nm的OD值，取平均值。

根据公式：％Cytotoxicity＝100×(Experimental-Effector Spontaneous-Target)/(TargetMaximum-Target Spontaneous)，计算每组杀伤细胞的百分率，采用析因方差分析，比较各组细胞毒性淋巴裂解靶向细胞能力。

结果：经LDH试剂盒检测，运用SPSS17.0统计软件，析因方差分析表明。各组脾细胞的杀伤毒性实验具有显著性差异，F＝281.475，P＜0.001；不同效靶比毒性不同F＝63.802，P＜0.001；在此基础上进行多重比较(SNK)，实验组(GM-CSF/TNF-α膜表面修饰RM-1细胞疫苗组)发现一部分裂解靶细胞RM-1，与对照组的比较，脾细胞毒性裂解靶向细胞能力具有显著性意义(P＜0.05)；对照组：PBS组和酒精灭活细胞组极小部分裂解靶细胞，GM-CSF膜表面修饰细胞组和TNF-α膜表面修饰细胞组裂解靶细胞RM-1均无显著差异(P＞0.05)，但后两组细胞毒性优于前两组(P＜0.05)。

实施例9.INF-γ和IL-4的检测(图8)

方法：取上述实施例7实验中，取攻击(建模)后21天的小鼠脾细胞1×10⁶/ml与rhIL2以及MMC处理过的RM-1细胞共同孵育48小时，离心250g×4min，收集上清。加样：96孔板，加入上清100μl，标准品100μl于反应在孔中，并设复孔两个，空白1个；洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，用滤纸吸干。每孔加入第一抗体工作液100μl，将反应板置37℃，30min。洗板同前。每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板置37℃，30min。洗板同前。每孔加底物工作液100μl，置37℃，暗处反应15min。每孔加入100μl终止液混匀。30min内用酶标仪在450nm处测吸光值。将测出OD值做纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制曲线，根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。多个样品均数比较，采用单因素方差分析。

IL-4检测的按INF-γ检测步骤操作。

结果：运用SPSS17.0软件，采用单因素方差分析，F＝518.9，P＝0.000，在此基础上行多重比较(LSD)。GM-CSF/TNFα膜表面修饰RM-1细胞疫苗组产生的INFγ明显多于对照组，具有极显著性差异(P＜0.001)；对照组中GM-CSF或TNFα锚定细胞疫苗组优于酒精灭活组和PBS，具有显著性差异(P＜0.05)；但酒精灭活组和PBS比较，产生的INFγ无显著性差异(P＞0.05)。5组动物实验所产生的IL4无显著性差异(P＞0.05)。说明肿瘤疫苗产生的免疫反应以Ⅰ型免疫反应为主，疫苗刺激DC的成熟，将抗原提呈于CD8⁺T淋巴细胞，产生大量IFNγ，直接介导抗肿瘤免疫反应。

实施例10.治疗后脾细胞的流式分析(图9)

方法：从实施例7的实验中，取攻击(建模)后21天的小鼠，将其处死，取脾器官，研磨，加入红细胞裂解液孵育2分钟，离心除去红细胞，加入带有FITC标志的抗CD4和抗CD8的抗体孵育30分钟，用PBS+1％BSA洗一遍，经流式细胞分析仪检测脾细胞含有的CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞。

结果：GM-CSF/TNF-α膜修饰的RM-1前列腺癌细胞疫苗组脾组织里含有大量的CD4⁺和CD8⁺T细胞，与对照组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。

实施例11.免疫组化分析肿瘤组织浸润的CD4和CD8淋巴细胞(图10)

方法：从实施例7的实验中，取肿瘤组织，在液氮中气化，放入-80℃，24小时后，冰冻切片4～8mm，室温放置30分钟后，放入4℃丙酮固定15分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2次。10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗CD4或CD8，37℃孵育2小时。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1％BSA-PBS稀释)，37℃孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37℃孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，复染，封片。

结果：GM-CSF/TNF-α膜修饰的RM-1前列腺癌细胞疫苗组肿瘤组织里含有大量的浸润CD4⁺和CD8⁺T细胞，与对照组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。

Claims (1)

1.一种肿瘤疫苗，即：GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗，是由链亲合素标记的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子双功能融合蛋白和链亲合素标记的肿瘤坏死因子α双功能融合蛋白同时修饰锚定在已生物素化且灭活的前列腺癌细胞表面而获得的。

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