CN107773537A - 大规模制备可长期稳定保存的SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白冻干制剂的方法 - Google Patents

大规模制备可长期稳定保存的SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白冻干制剂的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107773537A
CN107773537A CN201610715650.3A CN201610715650A CN107773537A CN 107773537 A CN107773537 A CN 107773537A CN 201610715650 A CN201610715650 A CN 201610715650A CN 107773537 A CN107773537 A CN 107773537A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hgm
csf
fusion proteins
freeze
screening
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610715650.3A
Other languages
English (en)
Inventor
高基民
张蕾
许晓玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Medical University
Original Assignee
Wenzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wenzhou Medical University filed Critical Wenzhou Medical University
Priority to CN201610715650.3A priority Critical patent/CN107773537A/zh
Publication of CN107773537A publication Critical patent/CN107773537A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种规模化冻干制备重组SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白的方法，所述方法可大规模生产SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白制剂，且该制剂在2‑8℃条件下能够长期稳定保存。本发明确定了该双功能融合蛋白制剂的最佳配方和冷冻干燥工艺曲线，从而有效地节约了能源，降低了生产成本。本发明的配方及工艺条件适用于大规模生产SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白制剂以及后续的肿瘤免疫治疗。

Description

大规模制备可长期稳定保存的SA-hGM-CSF双功能融合蛋白冻 干制剂的方法
技术领域
本发明应用了真空冷冻干燥技术，是一种综合的技术，涉及多学科、多领域。具体涉及冷冻干燥工艺曲线的设计和筛选。
背景技术
我国，泌尿系统恶性肿瘤中最常见的是膀胱癌，其发病率一直不断上升。对浅表性膀胱癌，无论进行何种手术治疗，副作用都较大且并发症也较多。30％的患者对该疗法无应答，即使有应答患者治疗后两年内复发率也高达14％至71％。因此，临床上寻找那种高效、副作用低、复发率低、可以诱导长期免疫保护作用的免疫疗法和新型药物就成为一大难题。
细胞膜表面锚定修饰技术是利用细胞膜表面蛋白的氨基(-NH2)易生物素化及生物素同链亲和素高效强有力且近乎不可逆结合这两个特性。主要有两个步骤：①通过生物素化试剂将生物素交联到待修饰的肿瘤细胞表面②借助链亲和素和生物素的特异性结合将链亲和素标记的免疫刺激因子融合蛋白锚定到肿瘤细胞表面。该技术能对肿瘤细胞进行快速表面修饰，使免疫刺激因子持久、定量地锚定在肿瘤细胞表面，整个过程对细胞、组织以及集体均没有明显的毒副作用。
利用细胞膜表面锚定修饰技术平台，本课题组已经研发出了链亲和素标记的人源的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(SA-hGM-CSF)双功能融合蛋白。对于这种蛋白类药物，在溶液状态下不耐高温，不易进行长途运输和长期稳定保存，因此，在临床研究前为其筛选出合适的制剂处方和工艺，并进行有针对性的稳定性试验研究显得十分必要。
发明内容
本发明需要解决的问题是，筛选SA-hGM-CSF双功能融合蛋白冻干制剂的最佳处方和工艺，并进行稳定性考察，为实现这个目的，本发明采用以下方案：
(1)保护剂、赋形剂的筛选：依次添加不同种类不同浓度的冻干保护剂、赋形剂，经冷冻干燥后分别考察其外观、溶解性、pH值、蛋白含量、比活等指标，并将0天的结果与37℃储存30天的检测结果进行对比，筛选出最佳处方。
(2)工艺曲线选择：根据冷冻干燥工艺曲线设计原则设计了四组冻干工艺曲线，对四组工艺下得到的SA-hGM-CSF双功能融合蛋白制剂进行外观、溶解性、生物学活性、残余水分指标考察，本着节约的原则选出最佳的工艺条件。
(3)稳定性试验考察：根据最佳处方和工艺条件中试生产SA-hGM-CSF双功能融合蛋白制剂，后分别储存于25℃和2-8℃条件下，进行加速稳定性和长期稳定性考察。主要采用外观、pH值、蛋白含量、SDS-PAGE、生物学活性及蛋白锚定率这几个能体现蛋白变化的指标。稳定性试验期间，25℃在1、2、3、6月随机取样检测，2-8℃在1、2、3、6、8月随机取样检测。检测并比较这几个时间点蛋白各指标的结果。
(4)本发明为之后该蛋白药物进行药效学、药代学等试验提供支持，本发明的工艺条件更好地节约了能源、降低了成本，适用于进一步GMP条件下扩大的工业化生产，得到的SA-hGM-CSF双功能融合蛋白制剂稳定性好，适合2-8℃长期稳定保存。
附图说明
图1、制备SA-hGM-CSF双功能融合蛋白制剂的中试工艺流程图。
图2、最佳处方和中试工艺制备的SA-hGM-CSF双功能融合蛋白冻干品。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例和实验所用的材料及设备如下：
德国Christ公司真空冷冻干燥机，Triad压盖冷冻干燥机。
实施例1：冻干保护剂、赋形剂筛选：
1)甘露醇浓度的筛选：分别配置含有20mM PB(pH7.4)、1.0mg/ml的SA-hGM-CSF、不同浓度的甘露醇，后经0.22μm滤器过滤，再分装到已经灭菌的西林瓶中，每瓶里装量1.0ml。进行冷冻干燥。后置于37℃条件下储存，检测并比较0天和37℃储存30天后其外观、溶解性、pH值、蛋白含量、生物学活性等指标的结果。甘露醇筛选的配方如下：
2)糖种类及浓度筛选：在步骤1)得到的较好配方中分别添加三种浓度(0.5％、1.0％、2.0％)的海藻糖及蔗糖，后用0.22μm滤器过滤，再分装到已灭菌的西林瓶中，装量1.0ml/瓶。进行冷冻干燥后置于37℃条件下储存，同上检测并比较0天和37℃储存30天后各个指标的结果。
3)氨基酸种类及浓度筛选：再在步骤2)得到的较好配方中分别添加两种浓度(1.0％、2.0％)的甘氨酸及精氨酸，之后操作同步骤1)。
实施例2：冷冻干燥工艺曲线筛选：
根据冻干曲线设计原则设计下表所示四组冻干曲线，以SA-hGM-CSF双功能融合蛋白冻干后外观、溶解性、水分、生物学活性为指标对四组样品进行比较，后确定最佳工艺。四组冻干曲线为：
实施例3：稳定性试验考察
在最佳的制剂处方和工艺条件中试生产SA-hGM-CSF融合蛋白制剂，后将蛋白制剂分别储存于25℃和2-8℃条件下，进行加速稳定性和长期稳定性考察。稳定性试验期间，25℃在1、2、3、6月随机取样检测，2-8℃在1、2、3、6、8月随机取样检测。主要考察外观、pH值、蛋白含量、SDS-PAGE、生物学活性及蛋白锚定率这几个能体现蛋白变化的指标。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述实施例并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种大规模制备可长期稳定保存的SA-hGM-CSF双功能融合蛋白冻干制剂的方法，此过程特征在于包含以下方法：
(1)进行保护剂、赋形剂种类和浓度的筛选，获得SA-hGM-CSF融合蛋白制剂最佳配方；
(2)将采用最佳配方获得的SA-hGM-CSF融合蛋白进行冷冻干燥工艺曲线筛选，得到最佳的工艺条件；
(3)在最佳配方和工艺条件下中试生产SA-hGM-CSF双功能融合蛋白，并对其进行稳定性考察。
2.根据权利要求1所述，其步骤(1)所述的保护剂、赋形剂种类和浓度筛选的方法为：
1)甘露醇浓度的筛选：分别配置含有20mM PB(pH7.4)、1.0mg/ml的SA-hGM-CSF、不同浓度的甘露醇，后经0.22μm滤器过滤，再分装到已经灭菌的西林瓶中，每瓶里装量1.0ml。进行冷冻干燥。后置于37℃条件下储存，检测并比较0天和37℃储存30天后各个指标的结果。冻干配方如下：
2)糖种类及浓度筛选：在步骤1)得到的较好配方中分别添加三种浓度(0.5％、1.0％、2.0％)的海藻糖及蔗糖，之后步骤同1)。
3)氨基酸种类及浓度筛选：再在步骤2)得到的较好配方中分别添加两种浓度(1.0％、2.0％)的甘氨酸及精氨酸，之后操作同步骤1)。
3.根据权利要求1所述，其步骤(2)所述的SA-hGM-CSF融合蛋白进行冷冻干燥工艺曲线筛选方法为：根据冻干曲线设计原则设计了四组冻干曲线优化实验，以SA-hGM-CSF双功能融合蛋白冻干后外观、溶解性、水分、生物学活性为指标对四组样品进行比较，后确定最佳工艺。四组冻干曲线为：
4.根据权利要求1所述，其步骤(3)所述的SA-hGM-CSF蛋白制剂进行稳定性考察方法为：首先通过前面的实验筛选出了最佳的制剂处方和最佳的冷冻干燥工艺条件。按照此条件经中试规模生产得到SA-hGM-CSF融合蛋白制剂，后分别储存于25℃和2-8℃条件下，进行加速稳定性和长期稳定性考察。主要对外观、pH值、蛋白含量、SDS-PAGE、生物学活性及蛋白锚定率这几个能体现蛋白变化的指标进行考察。稳定性试验期间，25℃在1、2、3、6月随机取样检测，2-8℃在1、2、3、6、8月随机取样检测。检测并比较这几个时间点蛋白各指标的结果(由于之前蛋白处于溶液状态下锚定率一直很高，故该指标的检测时间点可适当减少，25℃检测第六个月，2-8℃检测第六和第八个月)。
CN201610715650.3A 2016-08-18 2016-08-18 大规模制备可长期稳定保存的SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白冻干制剂的方法 Pending CN107773537A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610715650.3A CN107773537A (zh) 2016-08-18 2016-08-18 大规模制备可长期稳定保存的SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白冻干制剂的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610715650.3A CN107773537A (zh) 2016-08-18 2016-08-18 大规模制备可长期稳定保存的SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白冻干制剂的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107773537A true CN107773537A (zh) 2018-03-09

Family

ID=61388400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610715650.3A Pending CN107773537A (zh) 2016-08-18 2016-08-18 大规模制备可长期稳定保存的SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白冻干制剂的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107773537A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1651464A (zh) * 2004-12-07 2005-08-10 高基民 链抗生物素/粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白
CN101773453A (zh) * 2010-02-10 2010-07-14 冯来坤 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在制备美容化妆品中的用途
CN101863984A (zh) * 2010-05-27 2010-10-20 温州医学院 GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗
CN104043129A (zh) * 2014-07-01 2014-09-17 哈药集团生物工程有限公司 一种含有重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的冻干药物组合物及制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1651464A (zh) * 2004-12-07 2005-08-10 高基民 链抗生物素/粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白
CN101773453A (zh) * 2010-02-10 2010-07-14 冯来坤 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在制备美容化妆品中的用途
CN101863984A (zh) * 2010-05-27 2010-10-20 温州医学院 GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗
CN104043129A (zh) * 2014-07-01 2014-09-17 哈药集团生物工程有限公司 一种含有重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的冻干药物组合物及制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAI LI, ET AL: "Generation of streptavidin-tagged human-granulocyte macrophage colony-stimulating factor fusion proteins", 《J SOUTH MED UNIV》 *
王妍等: "冻干重组rhGM-CSF的稳定性", 《中国生物制品学杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Costantino et al. Lyophilization of biopharmaceuticals
Green et al. Biochemical studies on adenovirus multiplication, VI. Properties of highly purified tumorigenic human adenoviruses and their DNA's
CN106177961B (zh) Vcp抑制剂和溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用
CN102657870B (zh) 一种无明胶及人血蛋白成分的疫苗冻干保护剂
CN100506213C (zh) 一种注射用兰索拉唑冻干粉及其制备方法
CN105012963B (zh) 一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法
CN102928526A (zh) 高效液相色谱法分析蛹虫草中腺苷和虫草素含量的方法
Su et al. Lyophilized bone marrow cell extract functionally restores irradiation‐injured salivary glands
CN105866260A (zh) 一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法
ES2621675T3 (es) Una composición farmacéutica que comprende PCMV-VEGF165 para la estimulación de angiogénesis
CN104076082B (zh) 一种正品冬虫夏草的检测方法
CN106222151A (zh) 一种重组枯草杆菌纤溶酶及其肠溶胶囊的制备方法
CN107773537A (zh) 大规模制备可长期稳定保存的SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白冻干制剂的方法
CN105418731B (zh) 鹿茸蛋白提取物及其药学用途
CN104473978B (zh) 一种富含活性成分的虫草菌丝体加工方法
CN101109754B (zh) 胆红素测定冻干校正液及其制备方法
CN102138908A (zh) 一种注射用胸腺五肽冻干粉针及其制备工艺
CN109745326A (zh) 一种包含吉非替尼和组蛋白去乙酰酶抑制剂的药物组合物，其脂质体制剂及其制药用途
CN107722121A (zh) 蜜蜂幼虫芽孢杆菌plmp多抗及其在免疫层析纸的应用
CN100506212C (zh) 一种注射用去甲斑蝥酸钠冻干粉及其制备方法
CN102626520B (zh) 一种水貂犬瘟热活疫苗耐热冻干保护剂的应用
US20200345000A1 (en) Compositions and methods for storing liquid biospecimens
CN114344305A (zh) Cdk7抑制剂thz1在鼻咽癌放疗抵抗治疗中的应用
ES2882582T3 (es) Dispositivos microfluídicos que implementan el circuito de sangre y orina para emular el sistema microfisiológico homeostático
CN108047306B (zh) 一种灰树花硒螯合肽及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
DD01 Delivery of document by public notice

Addressee: Gao Jimin

Document name: Notification of Acceptance of Patent Application

PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180309