CN104076082B - 一种正品冬虫夏草的检测方法 - Google Patents
一种正品冬虫夏草的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了十种新的、正品冬虫夏草特有的蛋白质。本发明还公开了一种正品冬虫夏草的检测方法，它是检测待检样品含有前述10种蛋白中任意一种或者任意多种蛋白的方法。本发明正品冬虫夏草的检测方法准确度高，操作方便，成本低廉，同时，本发明公开的新的蛋白具有促淋巴细胞增殖的作用，可以制备成为促进淋巴细胞增殖的药物，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及正品冬虫夏草的检测方法。
背景技术
冬虫夏草为麦角菌科冬虫夏草菌Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫幼虫体上的幼虫尸体及子座的复合体，具有补肾益肺、止血化痰之功效，与人参、鹿茸并称为中国三大补药，在临床上常用于治疗久咳虚喘、阳痿遗精、劳嗽咯血、腰膝酸软等肺肾疾病。现代药理学研究证明，冬虫夏草具有免疫调节、抑制肿瘤细胞生长、保护肝肾功能、促进心脑血管循环、降低血糖等药理作用，在临床上具有独特的疗效。
由于冬虫夏草作用明显，生长环境特殊、资源稀少，价格昂贵，市场上出现大量掺伪品、混淆品，常见的混淆品包括蛹虫草(又称北虫草)、凉山虫草、亚香椿虫草(又名古尼虫草)、金针虫草，常见的伪品主要由地蚕、石蚕、僵蚕、甘遂等。
然而，目前冬虫夏草的鉴定方法多以形状、大小、颜色等形状进行鉴别，跟鉴定人的经验技术有很大关系，难以准确鉴定。需要寻找一种简便、准确、可靠的鉴别方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种正品冬虫夏草的检测方法，还提供了冬虫夏草特有的10种蛋白质及其用途。
本发明首先提供了十种新的、正品冬虫夏草特有的蛋白质，它们的分子量和N端序列分别如下：
蛋白1：分子量为13.136KDa，N端序列为GAVLWVPSV；
蛋白2：分子量为11.749KDa，N端序列为DQEYTVF；
蛋白3：分子量为13.871KDa，N端序列为KRHEVVYPW；
蛋白4：分子量为22.535KDa，N端序列为YWSMNEK；
蛋白5：分子量为35.674KDa，N端序列为HRDQNPE；
蛋白6：分子量为34.061KDa，N端序列为CMTWYE；
蛋白7：分子量为36.931KDa，N端序列为LPWFRHY；
蛋白8：分子量为39.032KDa，N端序列为PVAGMSK；
蛋白9：分子量为96.178KDa，N端序列为CTWSPRV；
蛋白10：分子量为95.497KDa，N端序列为GAVLWVPSV。
本发明正品冬虫夏草的检测方法，它是检测待检样品中含有前述10种蛋白的任意一种或者任意多种的方法。
本发明正品冬虫夏草的检测方法，它包括如下步骤：
(1)取待检样品，组织破碎，用中性缓冲液浸提，离心，得上清液；
(2)检测步骤(1)所得上清液含有分子量为13.136kDa、11.749kDa、13.871kDa、22.535kDa、35.674kDa、34.061kDa、36.931kDa、39.032kDa、96.178kDa和/或95.497kDa的蛋白。
中性缓冲液，是指pH范围为6～8的缓冲液。
浸提，系指将药材中的可溶物转移到适宜溶剂中的过程。
优选地，步骤(1)所述组织破碎采用液氮研磨法，具体地，将待检样品置于冷研钵中，加入液氮迅速研磨成细粉。
优选地，步骤(1)所述中性缓冲液为磷酸盐缓冲液。进一步优选地，所述所述磷酸盐缓冲液的pH为7.3。
优选地，步骤(1)所述中性缓冲液加有抗氧化剂和表面活性剂。
优选地，所述抗氧化剂为β-巯基乙醇；所述表面活性剂为Tween80。
其中，所述β-巯基乙醇的浓度为0.2％～1％(w/v)；所述Tween80浓度为0.2％～1％(w/v)。优选地，Tween80浓度为0.5％(w/v)；所述β-巯基乙醇的浓度为0.2％(w/v)。
优选地，步骤(1)所述浸提是研磨浸提。
优选地，步骤(1)所述浸提的时间是1～4h，优选为4h。
步骤(2)中，所述分子量为13.136KDa的蛋白质，其N端序列为GAVLWVPSV。
所述分子量为11.749KDa的蛋白质，其N端序列为DQEYTVF。
所述分子量为13.871KDa的蛋白质，其N端序列为KRHEVVYPW。
所述分子量为22.535KDa的蛋白质，其N端序列为YWSMNEK。
所述其分子量为35.674KDa的蛋白质，其N端序列为HRDQNPE。
所述分子量为34.061KDa的蛋白质，其N端序列为CMTWYE。
所述分子量为36.931KDa的蛋白质，其N端序列为LPWFRHY。
所述分子量为39.032KDa的蛋白质，其N端序列为PVAGMSK。
所述分子量为96.178KDa的蛋白质，其N端序列为CTWSPRV。
所述分子量为95.497KDa的蛋白质，其N端序列为GAVLWVPSV。
优选地，步骤(2)所述检测包含如下步骤：
1)取步骤(1)所述上清液，纯化，加入样品缓冲液，即为上样液；
2)上样，电泳，染色，洗脱，即可。
步骤1)中，所述纯化采用TCA/丙酮法、Readyprep2-D cleanup kit纯化法或者TCA/丙酮法与Readyprep2-D cleanup kit法联用的方法。
所述TCA/丙酮法的步骤如下：在步骤(1)的上清液中，加入8～10倍体积的含有0.07％DTT的10％TCA/丙酮溶液，混匀，静置，离心，弃上清，加入丙酮洗涤，干燥，用2-DE水化液或者含有0.05％DTT的PBS磷酸盐缓冲液溶解解，离心，上清即为纯化蛋白液。
10％TCA/丙酮溶液：是指10gTCA(三氯乙酸)加入到100ml丙酮中形成的溶液。
所述Readyprep2-D cleanup kit纯化法是指采用Readyprep2-D cleanup kit纯化的方法，步骤如下：
①在步骤(1)的上清液中，加入上清液3倍体积的沉淀剂1，混合，冰浴15min；
②加入上清液3倍体积的沉淀剂2，混合；离心，弃上清，重复2～3次；
③加入上清液0.4倍体积的洗剂1，离心，弃洗剂；
④加入上清液3倍0.25倍体积的水，混匀，加入上清液0.01倍体积的洗剂2和上清液0.05倍体积的洗剂2附加剂，混匀，﹣20℃冷冻30min，过程中每10min漩涡混合30秒；
⑤离心，弃上清，重复1次，干燥；
⑥加入2-DE水化液或者含有0.05％DTT的磷酸盐缓冲液溶解，离心，上清液即为纯化样品液。
所述TCA/丙酮法与Readyprep2-D cleanup kit法联用的方法(即TCA/丙酮法﹢Readyprep2-D cleanup kit两步纯化法)，步骤如下：
Ⅰ、TCA/丙酮法：在步骤(1)的上清液中，加入8～10倍体积的含有0.07％DTT的TCA/丙酮溶液，混匀，静置，离心，弃上清，加入丙酮洗涤，干燥，用磷酸盐缓冲液溶解，得TCA/丙酮纯化液；
Ⅱ、Readyprep2-D cleanup kit法：采用Readyprep2-D cleanup kit纯化：
①在TCA/丙酮纯化液加入3倍体积的沉淀剂1，混合，冰浴15min；
②加入TCA/丙酮纯化液3倍体积的沉淀剂2，漩涡混合，离心，弃上清，重复2～3次；
③加入TCA/丙酮纯化液0.4倍体积的洗剂1，离心，弃洗剂；
④加入TCA/丙酮纯化液3倍0.25倍体积的水，混匀，加入TCA/丙酮纯化液0.01倍体积的洗剂2和TCA/丙酮纯化液0.05倍体积的洗剂2附加剂，混匀，﹣20℃冷冻30min，过程中每10min漩涡混合30秒；
⑤离心，弃上清，重复1次，干燥；
⑥加入2-DE水化液或者含有0.05％DTT的磷酸盐缓冲液溶解，离心，上清液即为纯化样品液。
步骤1)中，所述上样液中，蛋白浓度为1～3μg/μl，优选为2μg/μl。
步骤1)中，所述样品缓冲液是添加有0.1mol/l溴酚蓝、2％(w/v)SDS、25％(v/v)甘油和14.4mmol/Lβ-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl的浓度为60mmol/l。
步骤2)中，所述电泳为SDS-PAGE电泳、Tricine-SDS-PAGE电泳或者双向电泳。
其中，所述SDS-PAGE电泳中，分离胶浓度为12％、交联度为3％，浓缩胶浓度为4％、交联度为3％。
其中，所述Tricine-SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为16.5％、交联度为5％，浓缩胶浓度为4％、交联度为3％。
所述双向电泳中，等电聚焦电泳的程序如下表：
| 程序 | 电压 | 时间 |
| 水化 | 50V | 12h |
| S1 | 250V | 0.5h |
| S2 | 500V | 0.5h |
| S3 | 1000V | 2h |
| S4 | 10000V | 5h |
| S5 | 10000V | 0.5～1h |
| S6 | 500V | 10min |
SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为12％、交联度为2.7％，浓缩胶浓度为4％、交联度为2.7％。
本发明蛋白(分子量为11.749KDa，N端序列为DQEYTVF)可以用于制备促进淋巴细胞增殖的药物。
本发明通过分离纯化得到了正品冬虫夏草特有的10种蛋白，并以这10种蛋白作为指标，通过检测待检样品是否含有这10种特有的蛋白，鉴定待检样品是否为正品冬虫夏草，准确度高，且检测方法简单、快速，可以替代传统检测方法，同时，本发明蛋白(分子量为11.749KDa，N端序列为DQEYTVF)具有促淋巴细胞增殖的作用，可以制备成为促进淋巴细胞增殖的药物，提高机体免疫力。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1冬虫夏草蛋白质双向电泳图谱(Blue Silver染色)；
图2三种纯化方法处理后冬虫夏草蛋白质的2-DE图谱；其中，1为TCA/丙酮法；2为2-D cleanup kit纯化法；3为TCA/丙酮法﹢2-D cleanup kit纯化法；
图3不同上样量双向电泳图谱；其中，A为400μg；B为600μg；C为1000μg；
图4冬虫夏草蛋白质2-DE表达谱；其中，A为四川康定雅加梗；B为四川阿坝马尔康；C为西藏那曲；D为青海；
图5各产地冬虫夏草共有蛋白分析图谱；
图6虫草蛋白质2-DE表达谱；其中，A-凉山虫草；B-金针虫虫草；C-古尼虫草；D-北虫草；
图7 MALDI-TOF-MS鉴定的26个差异表达蛋白质斑点图谱；
图8双向电泳重复性试验图谱(n＝3)；
图9超低分子量蛋白Marker电泳图谱；
图10蛋白质Marker标准曲线；
图11 SDS-PAGE鉴定图谱；其中，M-低分子量蛋白Marker，自上而下依次为97.4kDa、66.2kDa、43.0kDa、31.0kDa、20.1kDa；
图12是蛋白质分子量对数(lgM)对电泳迁移率(Rf)曲线；
图13 Tricine-SDS-PAGE验证图谱。
具体实施方式
实验材料：
1试剂
丙烯酰胺、N,Nˊ-甲叉丙烯酰胺、Tris碱、甘氨酸、碘乙酰胺、TEMED、SDS、尿素、过硫酸铵、BSA均为Sigma产品；凝胶贮液(0.3T，2.7％C)、IPG胶条(17cm，pH3～10)，Bio-lyte(pH3～10)，Readyprep2-D cleanup kit，矿物油购自Bio-rad公司；Tris碱、甘氨酸、碘乙酰胺、TEMED、过硫酸铵、尿素、TFA为Sigma产品；DTT(二硫苏糖醇)为Merck产品；胰蛋白酶为Gibco产品；考马斯亮蓝R-250、考马斯亮蓝G-250、溴酚蓝购自鹏程生物；低分子量Marker、超低分子量Marker购自中国科学院上海生物化学研究所；美国光谱医学再生纤维素透析袋；柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙酸铵、乙醇、冰乙酸、甲醇为成都科龙化工试剂厂产品，均为分析纯，乙腈为Fisher色谱纯，水为超纯水。
2工作液
(1)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.05mol/L(pH5.6)，4℃保存。
(2)样品缓冲液：PBS磷酸盐缓冲液：0.05mol/L(pH7.3)，4℃保存。
(3)Tris-HCl缓冲液：0.05mol/L(pH8.9)，4℃保存。
(4)凝胶贮液：0.3T，2.7％C。
(5)分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris，盐酸调pH至8.8，4℃保存。
(6)浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris，盐酸调pH至6.8，4℃保存。
(7)电泳缓冲液：25mmol/L Tris，192mmol/L甘氨酸，0.1％SDS。
(8)5×Loading Buffer(上样缓冲液)：60mmol/L Tris-Hcl(pH6.8)0.6ml，25％甘油，2％(w/v)SDS2ml，14.4mmol/Lβ-巯基乙醇，0.1％溴酚蓝，-20℃保存。
(9)10％AP：0.5g过硫酸铵加入5ml水，混匀，分装200μl/管。
(10)脱色液：95％乙醇250ml+冰乙酸80ml，用水定容至1000ml。
(11)染色液：250ml脱色液加入0.29g考马斯亮蓝R-250即为染色液。
(12)水化上样液(即2-DE水化液)：8M尿素，4％CHAPS，65mmol/LDTT(现加)，0.2％(w/v)Bio-Lyte(现加)，0.001％溴酚蓝，-20℃保存。
(13)胶条平衡缓冲液Ⅰ：6M Urea，2％(w/v)SDS，0.375mol/L Tris-Hcl(pH8.8)，20％甘油，-2％(w/v)DTT(现加)，-20℃保存。
(14)胶条平衡缓冲液Ⅱ：6M Urea，2％(w/v)SDS，0.375mol/L Tris-Hcl(pH8.8)，20％甘油，-2.5％(w/v)碘乙酰胺(现加)，-20℃保存。
(15)低熔点琼脂糖封胶液：0.5％(w/v)低熔点琼脂糖，0.25％(w/v)Tris，192mmol/L甘氨酸，0.1％SDS，溴酚蓝适量。
(16)BSA工作液：1μg/μLBSA贮液，稀释至0.1μg/μL、10ng/μL、1ng/μL工作液，备用。
(17)阳极缓冲液：0.04mol/LTris，4mol/L HCl调pH至8.9。
(18)阴极缓冲液：0.1mol/LTris，0.2mol/LTricine，SDS0.1％。
(19)Tris·HCl/SDS：3mol/LTris，3％SDS，盐酸调pH至8.45。
(20)10％TCA/丙酮：10gTCA(三氯乙酸)加入到100ml丙酮中，即可
3仪器
电泳仪(BIO-RAD，POWERPAC UNIVERSAL164-5070)，电泳仪(BIO-RAD，POWERPAC200)；小型垂直电泳槽(BIO-RAD，MINI-PROTEAN3)，大型垂直电泳槽(BIO-RAD，PROTEANⅡXI)；等点聚焦系统(BIO-RAD，PROTEAN IEF CELL)；高速低温冷冻离心机(THERMOSCIENTIFIC，SORVALL LEGEND MICRO21)；高速离心机(THERMO SCIENTIFIC，SORVALLBIOFUGE PRIMOR)；数字控制器扩展型制冷水浴(THERMO SCIENTIFIC，THERMO NESLAB RTE-7)；pH计(METTLER TOLEDO，FE20)；电子天平(SARTORIUS，BSA124S)；全波长多功能酶标仪(THERMO SCIENTIFIC，VARIOSKAN FLASH)，凝胶扫描成像系统(GE，IMAGESCANNER III)；真空冷冻干燥仪(Thermo，Modulyo D-230)；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(BrukerDaltonics，Autoflex Ⅲ smartbeam)。
实施例1 本发明冬虫夏草特异蛋白的制备
1、药材
冬虫夏草药材购自四川甘孜州康定县，经四川省食品药品检验所主任药师鉴定确认。药材粉碎(过二号筛)，备用。
2、制备方法
(1)提取：取冬虫夏草药材粗粉0.2g，置预冷研钵中，加入液氮迅速研磨成细粉，加入预冷PBS磷酸盐缓冲液(pH7.3，含0.2％巯基乙醇，0.5％Tween80)2ml，研磨浸提4h后转入离心管，离心30min(8000×g，4℃)，刮去上层脂质，取上清液，即得虫草总蛋白提取液，﹣20℃保存备用。
(2)纯化：取虫草总蛋白提取液，加入预冷10倍体积预冷10％TCA/丙酮(含0.07％DTT)，漩涡混合后﹣20℃静置1h，离心15min(12000×g，4℃)，弃去上清液，加入﹣20℃预冷丙酮洗涤2～3次，室温自然干燥后PBS溶解。
①取100μlPBS溶解液置1.5ml离心管，加入300μl沉淀剂1，漩涡混合，冰浴15min；
②加入300μl沉淀剂2，漩涡混合，高速离心(12000×g，5min)，小心吸取上清液，弃去，再次离心15～30s，尽量完全吸取上清液，弃去；
③加入40μl洗剂1，离心(12000g，5min)，弃去洗剂；
④加入超纯水25μl，漩涡混合10～20s，加入1ml洗剂2(﹣20℃预冷1小时以上)和5μl洗剂2附加剂，漩涡混合1min。将离心管置﹣20℃冷冻30min，在此过程中每10min漩涡混合30秒；
⑤离心(12000g，5min)，弃去上清液，再快速离心15～30s，弃去剩余洗液，置室温自然晾干；
⑥加入2-DE水化液溶解，室温高速离心2～5min，上清液即为纯化样品液。
(3)制纯品蛋白
Ⅰ、跑胶：
①取纯化样品液，用上样缓冲液稀释至浓度为2μg/μl。采用17cm、pH3-10IPG预制胶条，被动水化上样，上样量为600μg(上样体积300μl)，水化温度20℃，水化时间12h。采用Bio-Rad PROTEAN IEF等电聚焦电泳仪，等电聚焦过程如表1所示：
表1 等电聚焦过程
聚焦后胶条直接进行第二向SDS-PAGE电泳或置﹣70℃保存备用。
②胶条平衡后，采用Bio-Rad PROTEAN II xi大型垂直电泳槽、电泳仪进行第二向SDS-PAGE电泳，凝胶浓度经优化筛选采用0.120T，2.7％C，电泳过程起始采用低电流(10mA/gel)，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(30mA/gel)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。
③电泳结束后，采用Blue Silver染色法进行凝胶染色(冬虫夏草蛋白质双向电泳图谱的Blue Silver染色结果如图1所示)。
Ⅱ、胶内酶切
①脱色分子量分别为13.136KDa、11.749KDa、13.871KDa、22.535KDa、35.674KDa、34.061KDa、36.931KDa、39.032KDa、96.178KDa、95.497KDa的斑点分别取下，转入Eppendorf管中，加入脱色液(50％乙腈、100mmol/LNH4HCO3)50μl浸泡，振荡脱色20min，弃去溶液，重复2-3次至胶粒蓝色褪尽，超纯水漂洗3次；
②干胶将脱色后的胶粒真空干燥30min至呈白色颗粒状；
③胶内胰蛋白酶消化加入5～10μl胰蛋白酶液(0.01μg/μl，含25mmol/LNH4HCO3、5mmol/LCaCl2)，4℃消化30min，吸弃多余酶液。补充5～10μl125mmol/L NH4HCO3溶液作为保温反应缓冲液，密封，超声2min，37℃水浴12h。
④肽段提取加入5％TFA至刚好覆盖胶粒，37℃水浴1h，离心吸取上清液；在胶内加入2.5％TFA/50％乙腈至刚好覆盖胶粒，37℃水浴1h，离心吸取上清液与上一步合并，抽真空冷冻干燥，即可。
检测：将提取得到肽段用2μl0.5％TFA充分溶解进行质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定。
3、检测结果
各蛋白质斑点分子量(Mw)和N-端序列鉴定结果见下表：
表2MALDI-TOF-MS鉴定结果
| 编号 | 分子量(kDa) | N-端序列 |
| 1 | 13.136 | GAVLWVPSV |
| 2 | 11.749 | DQEYTVF |
| 3 | 13.871 | KRHEVVYPW |
| 4 | 22.535 | YWSMNEK |
| 5 | 35.674 | HRDQNPE |
| 6 | 34.061 | CMTWYE |
| 7 | 36.931 | LPWFRHY |
| 8 | 39.032 | PVAGMSK |
| 18 | 96.178 | CTWSPRV |
| 19 | 95.497 | GAVLWVPSV |
将获得的10种蛋白质N-端序列与NCBI蛋白质数据库中进行比对发现，具有前述N-短序列的10种蛋白质均为首次发现。
实验结果说明，本发明分离提取得到了新的、冬虫夏草特有的10种蛋白。
实施例2本发明正品冬虫夏草的检测方法
(1)提取：取待检样品0.2g，置预冷研钵中，加入液氮迅速研磨成细粉，加入预冷PBS磷酸盐缓冲液(pH7.3，含0.2％巯基乙醇，0.5％Tween80)2ml，研磨浸提4h后转入离心管，离心30min(8000×g，4℃)，刮去上层脂质，取上清液；
(2)TCA/丙酮纯化法：取步骤(1)的上清液，加入8倍体积﹣20℃预冷10％TCA丙酮溶液(含0.07％DTT)，﹣20℃静置1h，离心(8000×g，5min)，取沉淀预冷丙酮洗涤两次，离心(8000×g，5min)，得沉淀，取沉淀加入适量2-DE水化液溶解，室温高速离心2～5min，上清液即为纯化样品液，备用。
(3)检测：
采用SDS-PAGE检测上清液(纯化样品液)中含有分子量为13.136kDa、11.749kDa、13.871kDa、22.535kDa、35.674kDa、34.061kDa、36.931kDa、39.032kDa、96.178kDa和/或95.497kDa的蛋白：
①胶的制备：按下表数据依次灌注分离胶、浓缩胶
表3 分离胶与浓缩胶的配制(SDS-PAGE)
②上样：取上清液50μl，加入Loading Buffer20μl，沸水浴5min，离心(12000×g，15min)，取上清液上样，上样量15μl，另取低分子量蛋白Marker5μl上样；
③电泳：电泳槽内、外槽加入电极缓冲液，电压设定90V约30min，样品进入分离胶后升至120V，待溴酚蓝跑至凝胶底部，停止电泳。
④染色、脱色：将胶移入染色液中，摇床振荡染色约1h，弃去染液，将胶在水中漂洗数次，加入脱色液振荡脱色至背景清晰，将胶取出，观察分析。
实施例3本发明正品冬虫夏草的检测方法
(1)提取：取待检样品0.2g，置预冷研钵中，加入液氮迅速研磨成细粉，加入预冷PBS磷酸盐缓冲液(pH7.3，含0.2％巯基乙醇，0.5％Tween80)2ml，研磨浸提4h后转入离心管，离心30min(8000×g，4℃)，刮去上层脂质，取上清液；
(2)Readyprep2-D cleanup kit纯化法：
①取100μl步骤(1)的上清液置于1.5ml离心管，加入300μl沉淀剂1，漩涡混合，冰浴15min；
②加入300μl沉淀剂2，漩涡混合，高速离心(12000×g，5min)，小心吸取上清液，弃去，再次离心15～30s，尽量完全吸取上清液，弃去；
③加入40μl洗剂1，离心(12000g，5min)，弃去洗剂；
④加入超纯水25μl，漩涡混合10～20s，加入1ml洗剂2(﹣20℃预冷1小时以上)和5μl洗剂2附加剂，漩涡混合1min。将离心管置﹣20℃冷冻30min，在此过程中每10min漩涡混合30秒；
⑤离心(12000g，5min)，弃去上清液，再快速离心15～30s，弃去剩余洗液，置室温自然晾干；
⑥加入适量2-DE水化液溶解，室温高速离心2～5min，上清液即为纯化样品液。
(3)检测：采用双向电泳(2-DE)检测步骤(2)得到的上清液(纯化样品液)是否含有分子量为13.136kDa、11.749kDa、13.871kDa、22.535kDa、35.674kDa、34.061kDa、36.931kDa、39.032kDa、96.178kDa和/或95.497kDa的蛋白：
Ⅰ、第一向等点聚焦(IEF)
(1)取出IPG预制胶条(﹣20℃冷冻保存)，室温放置10min；
(2)取纯化样品液，用上样缓冲液稀释，自左向右加入聚焦盘；
(3)撕去IPG胶条保护层，将胶条胶面朝下置于聚焦盘样品溶液上，胶条正负极对应聚焦盘正负极，每根胶条覆盖2～3ml矿物油；
(4)设置等点聚焦程序，见下表：
表4 等电聚焦程序
(5)聚焦结束后立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，或将胶条置于样品水化盘中，﹣20℃冰箱保存。
Ⅱ、IPG胶条的平衡
(1)用滤纸吸干IPG胶条表面矿物油，将胶条转移入溶胀盘中，加入5ml平衡缓冲液I，置摇床上水平摇晃15min；
(2)第一次平衡结束后，将胶条竖在滤纸上吸取多余平衡缓冲液I，再加入5ml胶条平衡缓冲液II，摇床水平摇晃15min；
(3)取出IPG胶条，置电泳缓冲液中轻荡几下，洗去多余平衡缓冲液II，取出备用。
Ⅲ、第二向SDS-PAGE(17cm)
(1)按下表分别制备分离胶与浓缩胶：
表5 分离胶与浓缩胶的配制(2-DE)
(2)将处理好的胶条转移至SDS-PAGE凝胶上部，加入预热的低熔点琼脂糖封胶液，用镊子将胶条向下轻推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面紧密接触，放置3min，待封胶液完全凝固后转移至电泳槽中。
(3)加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用低电流(10mA/gel/17cm)，待样品在走出浓缩胶，浓缩成一条线后，加大电流(20～30mA/gel/17cm)，待溴酚蓝前沿跑至凝胶底部，停止电泳。
(4)取出凝胶，切角作记号，Blue Silver染色法染色，观察分析并拍照保存。
Ⅳ、凝胶扫描及图像分析
凝胶染色后用GE ImageScanner III扫描仪透射扫描并记录，Image master7.0双向电泳分析软件进行图谱分析。
实施例4本发明正品冬虫夏草的检测方法
(1)提取：取待检样品0.2g，置预冷研钵中，加入液氮迅速研磨成细粉，加入预冷PBS磷酸盐缓冲液(pH7.3，含0.2％巯基乙醇，0.5％Tween80)2ml，研磨浸提4h后转入离心管，离心30min(8000×g，4℃)，刮去上层脂质，取上清液；
(2)TCA/丙酮法﹢Readyprep2-D cleanup kit两步纯化法
取粗蛋白液，加入预冷10倍体积预冷10％TCA/丙酮(含0.07％DTT)，漩涡混合后﹣20℃静置1h，离心15min(12000×g，4℃)，弃去上清液，加入﹣20℃预冷丙酮洗涤2～3次，室温自然干燥后PBS溶解。
①取100μlPBS溶解液置1.5ml离心管，加入300μl沉淀剂1，漩涡混合，冰浴15min；
②加入300μl沉淀剂2，漩涡混合，高速离心(12000×g，5min)，小心吸取上清液，弃去，再次离心15～30s，尽量完全吸取上清液，弃去；
③加入40μl洗剂1，离心(12000g，5min)，弃去洗剂；
④加入超纯水25μl，漩涡混合10～20s，加入1ml洗剂2(﹣20℃预冷1小时以上)和5μl洗剂2附加剂，漩涡混合1min。将离心管置﹣20℃冷冻30min，在此过程中每10min漩涡混合30秒；
⑤离心(12000g，5min)，弃去上清液，再快速离心15～30s，弃去剩余洗液，置室温自然晾干；
⑥加入适量2-DE水化液溶解，室温高速离心2～5min，上清液即为纯化样品液。
(3)检测：采用Tricine-SDS-PAGE检测上清液(纯化样品液)含有分子量为13.136kDa、11.749kDa、13.871kDa、22.535kDa、35.674kDa、34.061kDa、36.931kDa、39.032kDa、96.178kDa和/或95.497kDa的蛋白：
①胶的制备：按下表数据依次灌注分离胶、浓缩胶
表6 分离胶与浓缩胶的配制(Tricine-SDS-PAGE)
②上样：各上清液50μl，加入Loading Buffer20μl，40℃水浴30-60min，离心(12000×g，15min)，取上清液上样，上样量15μl，另取超低分子量蛋白标准品加5μl上样。
③电泳：电泳槽内、外槽加入电极缓冲液，电压设定30V约30min，样品进入分离胶后升至150V，待指示剂跑至凝胶底部，停止电泳。
④染色、脱色：将胶移入染色液中，摇床振荡染色约1h，弃去染液，将胶在水中漂洗数次，加入脱色液振荡脱色至背景清晰，将胶取出，观察分析。
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1 本发明检测方法的参数筛选实验
一、仪器与试药
1.1药材
冬虫夏草药材购自四川甘孜州康定县，经四川省食品药品检验所主任药师鉴定确认。药材粉碎(过二号筛)，备用。
二、实验方法
1、方法
考察三种样品纯化方法：①TCA/丙酮法；②Readyprep2-D cleanup kit纯化法；③TCA/丙酮法﹢Readyprep2-D cleanup kit两步纯化法。
取冬虫夏草药材粗粉0.2g，置预冷研钵中，加入液氮迅速研磨成细粉，加入预冷PBS磷酸盐缓冲液(pH7.3，含0.2％巯基乙醇，0.5％Tween80)2ml，研磨浸提4h后转入离心管，离心30min(8000×g，4℃)，刮去上层脂质，取上清液，分别按照如下三种方法纯化：
(1)TCA/丙酮纯化法：取粗蛋白液，加入8倍体积﹣20℃预冷10％TCA丙酮溶液(含0.07％DTT)，﹣20℃静置1h，离心(8000×g，5min)，取沉淀预冷丙酮洗涤两次，离心(8000×g，5min)，取沉淀加入适量2-DE水化液溶解，室温高速离心2～5min，取上清液供IEF使用或置-80℃保存备用。
(2)Readyprep2-D cleanup kit纯化法：
①取100μl粗蛋白液置1.5ml离心管，加入300μl沉淀剂1，漩涡混合，冰浴15min；
②加入300μl沉淀剂2，漩涡混合，高速离心(12000×g，5min)，小心吸取上清液，弃去，再次离心15～30s，尽量完全吸取上清液，弃去；
③加入40μl洗剂1，离心(12000g，5min)，弃去洗剂；
④加入超纯水25μl，漩涡混合10～20s，加入1ml洗剂2(﹣20℃预冷1小时以上)和5μl洗剂2附加剂，漩涡混合1min。将离心管置﹣20℃冷冻30min，在此过程中每10min漩涡混合30秒；
⑤离心(12000g，5min)，弃去上清液，再快速离心15～30s，弃去剩余洗液，置室温自然晾干；
⑥加入适量2-DE水化液溶解，室温高速离心2～5min，取上清液供IEF使用或置﹣80℃保存备用。
(3)TCA/丙酮法﹢Readyprep2-D cleanup kit两步纯化法
取粗蛋白液，加入预冷10倍体积预冷10％TCA/丙酮(含0.07％DTT)，漩涡混合后﹣20℃静置1h，离心15min(12000×g，4℃)，弃去上清液，加入﹣20℃预冷丙酮洗涤2～3次，室温自然干燥后PBS溶解。
再用步骤(2)所述Readyprep2-DE cleanup kit方法纯化，加入适量2-DE水化液溶解，室温高速离心2～5min，取上清液供IEF使用或置﹣80℃保存备用。
采用双向电泳对三种纯化方法纯化的样品进行分析。
双向电泳(2-DE)：
Ⅰ、第一向等点聚焦(IEF)
(1)取出IPG预制胶条(虫草蛋白在酸性端、碱性端分布较少，主要集中在pH4～9范围内，为使分析效果更佳，选择了非线性IPG预制胶条)(﹣20℃冷冻保存)，室温放置10min；
(2)取上样缓冲液(﹣20℃冷冻保存)1ml，溶解蛋白样品，离心(12000×g，5min)，取300μL上清液(上样量分别为400μg、600μg、1000μg)自左向右加入聚焦盘；
(3)撕去IPG胶条保护层，将胶条胶面朝下置于聚焦盘样品溶液上，胶条正负极对应聚焦盘正负极，每根胶条覆盖2～3ml矿物油；
(4)设置等点聚焦程序，见下表：
表7 等电聚焦程序
(5)聚焦结束后立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，或将胶条置于样品水化盘中，﹣20℃冰箱保存。
Ⅱ、IPG胶条的平衡
(1)用滤纸吸干IPG胶条表面矿物油，将胶条转移入溶胀盘中，加入5ml平衡缓冲液I，置摇床上水平摇晃15min；
(2)第一次平衡结束后，将胶条竖在滤纸上吸取多余平衡缓冲液I，再加入5ml胶条平衡缓冲液II，摇床水平摇晃15min；
(3)取出IPG胶条，置电泳缓冲液中轻荡几下，洗去多余平衡缓冲液II，取出备用。
Ⅲ、第二向SDS-PAGE(17cm)
(1)按下表分别制备分离胶与浓缩胶：
表8 分离胶与浓缩胶的配制(2-DE)
(2)将处理好的胶条转移至SDS-PAGE凝胶上部，加入预热的低熔点琼脂糖封胶液，用镊子将胶条向下轻推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面紧密接触，放置3min，待封胶液完全凝固后转移至电泳槽中。
(3)加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用低电流(10mA/gel/17cm)，待样品在走出浓缩胶，浓缩成一条线后，加大电流(20～30mA/gel/17cm)，待溴酚蓝前沿跑至凝胶底部，停止电泳。
(4)取出凝胶，切角作记号，Blue Silver染色法染色，观察分析并拍照保存。
Ⅳ、凝胶扫描及图像分析
凝胶染色后用GE ImageScanner III扫描仪透射扫描并记录，Image master7.0双向电泳分析软件进行图谱分析。
2、结果
结果如图2所示，TCA/丙酮法得到蛋白斑点最少，仅可见十几个较深蛋白质点，多数蛋白质点未得到分离显色，且横条纹多，背景深，杂质干扰严重；2-D cleanup kit纯化法效果优于TCA/丙酮法，与前者相比，有更多蛋白质点被显示，但仍有较多纵横条纹，蛋白质边缘不锐利；比较而言，TCA/丙酮法﹢2-D cleanup kit两步纯化法效果最佳，蛋白质点多，纵、横条纹明显减少。
实验结果说明，采用TCA/丙酮法﹢2-D cleanup kit两步纯化方法纯化冬虫夏草提取液，效果较佳。
从图3可以看出，上样400μg仅能得到少量斑点，蛋白组信息量少；上样1000μg虽能得到较多蛋白质斑点，但多数模糊不清，上样量过大导致高丰度蛋白拖尾严重，纵、横条纹明显；上样量600μg效果最佳，Image master7.0检测显示蛋白斑点775±27个，蛋白质点清晰、锐利，无明显拖尾和横向及纵向条纹，图谱较理想。
实验结果说明，本发明采用双向电泳检测冬虫夏草时，上样量为600μg时，效果较佳。
实验例2 使用本发明检测方法检测待检样品
1、仪器与试药
1.1药材
表9 虫草样品
药材粉碎(过二号筛)，备用。
2、实验方法
2.1样品制备
(1)分别取表9中各种虫草药材粗粉0.2克，置预冷研钵中，加入液氮迅速研磨成细粉，加入预冷PBS磷酸盐缓冲液(pH7.3，含0.2％巯基乙醇，0.5％Tween80)10ml，研磨浸4h提后转入离心管，离心30min(8000×g，4℃)，刮去上层脂质，取上清液，即得虫草总蛋白提取液，﹣20℃保存备用。
(2)TCA/丙酮法﹢Readyprep2-D cleanup kit两步纯化法：
取虫草总蛋白提取液，加入预冷10倍体积预冷10％TCA/丙酮(含0.07％DTT)，漩涡混合后﹣20℃静置1h，离心15min(12000×g，4℃)，弃去上清液，加入﹣20℃预冷丙酮洗涤2～3次，室温自然干燥后PBS溶解。
用Readyprep2-DE cleanup kit再次纯化：
①取100μlPBS溶解液置1.5ml离心管，加入300μl沉淀剂1，漩涡混合，冰浴15min；
②加入300μl沉淀剂2，漩涡混合，高速离心(12000×g，5min)，小心吸取上清液，弃去，再次离心15～30s，尽量完全吸取上清液，弃去；
③加入40μl洗剂1，离心(12000g，5min)，弃去洗剂；
④加入超纯水25μl，漩涡混合10～20s，加入1ml洗剂2(﹣20℃预冷1小时以上)和5μl洗剂2附加剂，漩涡混合1min。将离心管置﹣20℃冷冻30min，在此过程中每10min漩涡混合30秒；
⑤离心(12000g，5min)，弃去上清液，再快速离心15～30s，弃去剩余洗液，置室温自然晾干；
⑥加入适量2-DE水化液溶解，室温高速离心2～5min，上清液即为纯化样品液。
(3)采用Bradford法对样品蛋白液进行含量测定，上样缓冲液稀释至2μg/μl。
2.2双向电泳(2-DE)
采用17cm、pH3～10IPG预制胶条，被动水化上样，上样量为600μg(上样体积300μl)，水化温度20℃，水化时间12h。采用Bio-Rad PROTEAN IEF等电聚焦电泳仪，等电聚焦过程如下：
表10等电聚焦程序
聚焦后胶条直接进行第二向SDS-PAGE电泳或置﹣70℃保存备用。
第二向SDS-PAGE(17cm)：
(1)按下表分别制备分离胶与浓缩胶：
(2)将处理好的胶条转移至SDS-PAGE凝胶上部，加入预热的低熔点琼脂糖封胶液，用镊子将胶条向下轻推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面紧密接触，放置3min，待封胶液完全凝固后转移至电泳槽中。
(3)加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用低电流(10mA/gel/17cm)，待样品在走出浓缩胶，浓缩成一条线后，加大电流(30mA/gel/17cm)，待溴酚蓝前沿跑至凝胶底部，停止电泳。
2.3染色
电泳结束后，采用Blue Silver染色法进行凝胶染色。
2.4扫描及图像分析
染色后采用GE ImageScanner III投射扫描记录，Image master7.0双向电泳分析软件进行图谱分析。
2.5胶内酶切
(1)脱色将选定的差异蛋白点切下，转入Eppendorf管中，加入脱色液(50％乙腈、100mmol/L NH4HCO3)50μl浸泡，振荡脱色20min，弃去溶液，重复2-3次至胶粒蓝色褪尽，超纯水漂洗3次；
(2)干胶将脱色后的胶粒真空干燥30min至呈白色颗粒状；
(3)胶内胰蛋白酶消化加入5～10μl胰蛋白酶液(0.01μg/μl，含25mmol/L NH4HCO3、5mmol/LCaCl2)，4℃消化30min，吸弃多余酶液。补充5～10μl125mmol/L NH4HCO3溶液作为保温反应缓冲液，密封，超声2min，37℃水浴12h。
(4)肽段提取加入5％TFA至刚好覆盖胶粒，37℃水浴1h，离心吸取上清液；在胶内加入2.5％TFA/50％乙腈至刚好覆盖胶粒，37℃水浴1h，离心吸取上清液与上一步合并，抽真空冷冻干燥，2μl0.5％TFA充分溶解肽段进行质谱鉴定。
2.6分辨率及重现性分析
取冬虫夏草(样品4)按照前述方法制样后，在同等条件下进行2-DE，重复3次。BlueSilver染色后，采用GE ImageScanner III扫描仪透射扫描凝胶，采用Imagemaster7.0软件分析自动点检测。
3、结果
3.1正品冬虫夏草与混淆品虫草、伪品虫草的差异
各产地冬正品虫夏草的蛋白表达谱如图4所示，平均检测蛋白质斑点分别为775±27、712±18、798±25、634±21个，蛋白质点分布模式相似，多集中于pH4～9和分子量30～90kDa范围内。不同产地冬虫夏草的表达图谱间匹配蛋白点为共同点，经图谱分析得到共同表达蛋白点88个(如图5所示)
各混淆品虫草和伪品虫草的蛋白表达谱如图6所示。
正品虫夏草与混淆品虫草、伪品虫草的差异表达图谱如图7所示，有26种蛋白在冬虫夏草中表达，而在混淆品虫草、伪品虫草中无表达。
因此，可以采用本发明方法提取纯化待检样品，并通过检测样品中是否存在表7所示的26种蛋白来鉴定待检样品是否为正品冬虫夏草。
3.2差异蛋白质斑点分析
从上述26个差异蛋白点中选择表达量大、斑点清晰的10个蛋白质点，进行胶内酶解和酶切后多肽的提取，放入质谱仪，进行MALDI-TOF-MS鉴定，各蛋白质斑点分子量(Mw)和N-端序列鉴定结果见下表：
表11 MALDI-TOF-MS鉴定结果
| 编号 | 分子量(kDa) | N-端序列 |
| 1 | 13.136 | GAVLWVPSV |
| 2 | 11.749 | DQEYTVF |
| 3 | 13.871 | KRHEVVYPW |
| 4 | 22.535 | YWSMNEK |
| 5 | 35.674 | HRDQNPE |
| 6 | 34.061 | CMTWYE |
| 7 | 36.931 | LPWFRHY |
| 8 | 39.032 | PVAGMSK |
| 18 | 96.178 | CTWSPRV |
| 19 | 95.497 | GAVLWVPSV |
表11中10种蛋白在正品冬虫夏草中存在，而在混淆品虫草、伪品虫草中不存在。
因此，可以采用本发明方法提取纯化待检样品，并通过检测样品中是否存在表11中10种蛋白来鉴定待检样品是否为正品冬虫夏草。
3.3分辨率及重现性分析结果
取冬虫夏草(样品4)适量制样后，在同等条件下进行2-DE，重复3次。BlueSilver染色后，采用GE ImageScanner III扫描仪透射扫描凝胶，采用Imagemaster7.0软件分析自动点检测。
如图8所示，平均检测蛋白点数为827±34个。以其中一块胶为参比胶进行3块凝胶间的蛋白质点匹配，平均匹配点数为711个，匹配率为86％。选择3块凝胶中相互匹配且分辨清晰的50个蛋白点，选择位置偏中间的一个点为原点，以参比胶为参考位置进行测量，发现在IEF方向上其平均偏差为1.64±0.23mm，在SDS方向上其平均偏差为2.09±0.36mm。
实验结果说明，本发明检测方法具有良好的分辨率和重复性。
综上，将待检样品用本发明方法提取、纯化后，鉴定其中是否存在表11中10种蛋白的方法，可以准确鉴定待检样品是否为正品冬虫夏草，重复性好。
实验例3 使用本发明方法检测正品冬虫夏草
1、仪器与试药
1.1药材
表12 各虫草样品
| 编号 | 名称 | 产地 | 收集时间 |
| 1 | 凉山虫草Cordyceps.liangshanensis | 四川省凉山州雷波县 | 2009-10 |
| 2 | 金针虫虫草C.agriota | 四川省凉山州雷波县 | 2009-10 |
| 3 | 北虫草C.militaris | 广东省江门市 | 2009-01 |
| 4 | 冬虫夏草C.sinensis | 四川省甘孜州康定雅加梗 | 2009-05 |
| 5 | 古尼虫草C.gunnii | 四川省成都市邛崃县 | 2009-04 |
各药材适量粉碎(过二号筛)，备用。
2、实验方法
2.1各虫草蛋白质的提取
取虫草药材粗粉0.2g，置预冷研钵中，加入液氮迅速研磨成细粉，加入预冷PBS磷酸盐缓冲液(pH7.3，含0.2％巯基乙醇，0.5％Tween80)10ml，研磨浸提4h后转入离心管，离心30min(8000×g，4℃)，刮去上层脂质，取上清液，即得虫草粗蛋白提取液，﹣20℃保存备用。
2.2虫草粗蛋白的纯化
采用TCA/丙酮沉淀纯化法，取各粗蛋白液，加入8倍体积(﹣20℃预冷)10％TCA丙酮溶液(含0.07％DTT)，﹣20℃静置1h，离心(8000×g，5min)，取沉淀﹣20℃预冷丙酮洗涤两次，离心(8000×g，5min)，取沉淀加入适量2-DE水化液或预冷PBS磷酸盐缓冲液(0.05M，含0.05％DTT)溶解，高速(＞12000g)离心2-5min，取上清液，即为虫草蛋白液，备用或置﹣80℃保存备用。
2.3蛋白质浓度的测定
采用Bradford法，建立BSA蛋白质定量标准曲线，对各虫草蛋白液进行含量测定，上样缓冲液稀释至1μg/μl。
2.4电透析回收蛋白
(1)取透析袋10cm，超纯水煮沸10min，备用；
(2)将选定的特征性蛋白斑点切下，装入预先处理好的透析袋，加入1mL电洗脱液，封口；
(3)在小垂直板电泳槽内、外槽加入电洗脱液，将装好的透析袋放入内槽中。开启电源，电压设置100V，运行2h；结束后反接电源100V运行1min，停止电泳；
(4)将透析袋从电泳槽中取出，放入预冷PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)中4℃搅拌透析12h脱盐(其间更换缓冲液2～3次)；
(5)透析结束后吸出溶液，TCA/丙酮法沉淀蛋白，预冷PBS磷酸盐缓冲液(0.05M，含0.05％DTT)溶解，高速(＞12000g)离心2～5min，取上清液备用或置-80℃保存备用。
2.5利用SDS-PAGE(17cm)快速鉴定冬虫夏草
2.5.1胶的制备
按下表数据依次灌注分离胶、浓缩胶：
表13 分离胶与浓缩胶的配制(SDS-PAGE)
2.5.2上样
将特征性蛋白CS pro-8斑点(同实验例2表11中编号为8的特征蛋白)取下，电透析法回收蛋白，作为鉴定的指标性成分。另取各虫草蛋白液(1μg/μL)50μL，分别加入LoadingBuffer20μl，沸水浴5min，离心(12000×g，15min)，取上清液上样，上样量30μl，另取低分子量蛋白Marker10μl上样。
2.5.3电泳
电泳槽内、外槽加入电极缓冲液，电流设定10A约30min，样品进入分离胶后升至30A，待溴酚蓝跑至凝胶底部，停止电泳。
2.5.4染色、脱色
将胶移入染色液中，摇床振荡染色约1h，弃去染液，将胶在水中漂洗数次，加入脱色液振荡脱色至背景清晰，将胶取出，观察分析并拍照保存。
2.6Tricine-SDS-PAGE方法优化
2.6.1胶的制备
按下表灌注浓缩胶与分离胶，分别灌制①0.100T,5％C；②0.100T,6％C；③0.150T,5％C；④0.150T,6％C；⑤0.165T,5％C；⑥0.165T,6％C共6个浓度分离胶；进行比较研究，优选最佳Tricine-SDS-PAGE电泳凝胶浓度。
表14浓缩胶与分离胶的组成
2.6.2电泳
超低分子量蛋白标准加样5μl，先30V电泳约1h，再升至150V，电泳3～4h，至前沿迁移至距尾端约1cm停止电泳。
2.6.3染色与脱色
染色液染色30min，再置脱色液中脱色至条带清晰，背景无色为止，拍照。
2.6.4电泳图谱与标准曲线的绘制
依表14数据进行多次电泳后，发现在分离胶0.165T、5％C，浓缩胶为0.04T、2.7％C，蛋白质分离效果最好，对3～20kDa蛋白质都有良好的分辨率。结果如图9所示。
根据图9中蛋白Marker的电泳结果，以标准蛋白分子量对数(lgM)对其在分离胶中的迁移率(Rf)进行线性回归，得回归方程：Y＝-1.4109X+4.8207(r＝0.9799)。标准曲线如图10所示。
2.6.5结果
在优化条件下，各标准极低分子量蛋白(3.313kDa～20.100kDa)分离度良好，14.400kDa、7.823kDa、5.856kDa、3.313kDa四个极低分子量蛋白着色明显，克服文献报道中小分子量蛋白易扩散流失、难着色等问题。标准蛋白分子量对数与迁移率线性关系良好，弥补了常规SDS-PAGE在20kDa以下线性差、不能用于分子量分析等缺点。
2.7利用Tricine-SDS-PAGE快速鉴定冬虫夏草
2.7.1胶的制备
按下表数据依次灌注分离胶、浓缩胶
表15分离胶与浓缩胶的配制(Tricine-SDS-PAGE)
| 配液 | 分离胶(T＝16.5％,C＝5％) | 浓缩胶(T＝4％,C＝3％) |
| 0.495T,5％C凝胶贮液/ml | 3.33 | / |
| 0.3T,3％C贮液/ml | / | 0.85 |
| 凝胶缓冲液/ml | 3.33 | 1.53 |
| 蒸馏水/ml | 2.20 | 3.90 |
| 甘油/ml | 1.09 | / |
| 10％AP/μl | 45 | 45 |
| TEMED/μl | 6 | 6 |
2.7.2上样
将特征性蛋白CS pro-2斑点(同实验例2表11中编号为2的特征蛋白)取下，电透析法回收蛋白。另取各虫草蛋白液(1μg/μL)50μL，加入Loading Buffer20μl，40℃水浴30～60min，离心(12000×g，15min)，取上清液上样，上样量15μl，平行进行Tricine-SDS-PAGE。
2.7.3电泳
电泳槽内、外槽加入电极缓冲液，电压设定30 V约30 min，样品进入分离胶后升至150 V，待指示剂跑至凝胶底部，停止电泳。
2.7.4染色、脱色
方法同2.6.3。
3、结果
3.1SDS-PAGE鉴定
以标准蛋白分子量对数(lgM)对其在分离胶中的迁移率(Rf)进行线性回归，得回归方程：Y＝﹣0.9543X+5.0848(r＝0.9897)，标准曲线如图12所示。根据标准曲线可以看出，CS pro-8回收蛋白的分子量为39032 Da，与实验例2中MALDI-TOF-MS鉴定结果一致。
电泳图谱如图11所示，正品冬虫夏草SDS-PAGE图谱中CS pro-8蛋白质条带清晰明显，而凉山虫草、人工北虫草、金针虫虫草、古尼虫草这四种混淆品虫草中均未见CS pro-8蛋白质条带。
实验结果说明，本发明通过检测CS pro-8蛋白(分子量为39.032KD，N端序列为PVAGMSK)，可以有效鉴定待检样品是否为正品冬虫夏草。
3.2 Tricine-SDS-PAGE鉴定
将特征性蛋白CS pro-2斑点取下，电透析法回收蛋白，与各虫草蛋白液(1μg/μL)平行进行Tricine-SDS-PAGE检测，结果见图13所示。
由图13可以看出，正品冬虫夏草SDS-PAGE图谱中CS pro-2蛋白质条带清晰明显，而凉山虫草、人工北虫草、金针虫虫草、古尼虫草这四种混淆品虫草中均未见CS pro-2蛋白质条带。
实验结果说明，本发明通过检测CS pro-2蛋白(分子量为11.749KD，N端序列为DQEYTVF)，可以有效鉴定待检样品是否为正品冬虫夏草。
实验结果说明，本发明通过检测待检样品中是否有CS pro-8蛋白(分子量为39.032KD，N端序列为PVAGMSK)和/或CS pro-2蛋白(分子量为11.749KD，N端序列为DQEYTVF)，可以准确鉴定待检样品是否为正品冬虫夏草，重复性好。
实验例4 本发明冬虫夏草特征蛋白对促进淋巴细胞增殖的作用
1、材料
实施例1制备的分子量为11.749KDa，N-端序列为：DQEYTVF的蛋白质2。
动物昆明种小白鼠，雌雄兼用，体重18～22g,普通级,由成都中医药大学实验动物中心提供。
2、方法
小鼠T淋巴细胞增殖试验对蛋白质2(分子量为11.749KDa，N-端序列为：DQEYTVF)，进行初步的免疫调节活性研究。
小鼠脱颈处死,无菌取脾置平皿中挤压或剪碎,置200目筛网上用RPMI-1640培养液冲洗,离心后去上清液。加无菌水去除红细胞,获得单个的脾细胞悬液,再用RPM I-1640培养液洗涤两次,沉淀细胞用RPM I-1640培养液制备成脾单细胞悬液,血球计数板计数后,使细胞浓度在5×105～2×106个/ml。
取淋巴细胞加入96孔培养板中，200μL/孔，加入不同浓度的蛋白溶液，设置无药物组作为空白对照，一半培养孔加入100μg/ml ConA，另一半不不加，5％CO2、37℃培养72小时,加5mg/mlMTT(pH7.4PBS溶解)20μL后,再置5％CO237℃培养4小时或过夜,加溶解剂30％DMSO(pH7.4PBS溶解)100μL充分混匀待甲月替溶解后,在酶标仪上取检测波长570nm,参考波长630nm,测出吸光度A值,以测定的OD值为实验结果进行分析。
3、结果
结果如表16所示：
表16 蛋白质3的免疫调节活性检测结果表
由上表可以看出，与空白组相比，不同浓度的本发明蛋白组的细胞数量更多，随着蛋白浓度的增加，细胞数量增加，说明本发明蛋白质2对小鼠T淋巴细胞自然增殖和ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖均有明显促进作用。
实验结果说明，本发明分子量为11.749KDa、N端序列为DQEYTVF的蛋白质具有促淋巴细胞增殖的作用。
综上，本发明分离得到了10种新的正品冬虫夏草特有蛋白质，以其本发明正品冬虫夏草检测方法检测准确度高，操作简便，成本低廉，同时，的、具有淋巴细胞增殖作用的，应用前景良好。
Claims (15)
1.一种正品冬虫夏草的检测方法，其特征在于：它是检测待检样品含有10种蛋白中任意一种或者任意多种蛋白的方法；
所述10种蛋白质的分子量和N端序列分别如下：
蛋白1：分子量为13.136KDa，N端序列为GAVLWVPSV；
蛋白2：分子量为11.749KDa，N端序列为DQEYTVF；
蛋白3：分子量为13.871KDa，N端序列为KRHEVVYPW；
蛋白4：分子量为22.535KDa，N端序列为YWSMNEK；
蛋白5：分子量为35.674KDa，N端序列为HRDQNPE；
蛋白6：分子量为34.061KDa，N端序列为CMTWYE；
蛋白7：分子量为36.931KDa，N端序列为LPWFRHY；
蛋白8：分子量为39.032KDa，N端序列为PVAGMSK；
蛋白9：分子量为96.178KDa，N端序列为CTWSPRV；
蛋白10：分子量为95.497KDa，N端序列为GAVLWVPSV；
所述检测方法包括如下步骤：
（1）取待检样品，组织破碎，用中性缓冲液浸提，离心，得上清液；
（2）检测步骤（1）所得上清液含有分子量为13.136 kDa、11.749 kDa、13.871 kDa、22.535 kDa、35.674 kDa、34.061 kDa、36.931 kDa、39.032 kDa、96.178 kDa和/或95.497kDa的蛋白；
步骤（2）所述检测的步骤如下：
1）取步骤（1）所述上清液，纯化，得纯化蛋白液；
2）上样，电泳，染色，洗脱，即可；
步骤1）中，所述纯化采用TCA/丙酮法与Readyprep 2-D cleanup kit法联用的方法；
所述TCA/丙酮法与Readyprep 2-D cleanup kit法联用的方法，步骤如下：
Ⅰ、TCA/丙酮法：在步骤（1）的上清液中，加入8~10倍体积的含有0.07%DTT的TCA/丙酮溶液，混匀，静置，离心，弃上清，加入丙酮洗涤，干燥，用磷酸盐缓冲液溶解，得TCA/丙酮纯化液；
Ⅱ、Readyprep 2-D cleanup kit法：采用Readyprep 2-D cleanup kit纯化：
①在TCA/丙酮纯化液加入3倍体积的沉淀剂1，混合，冰浴15min；
②加入TCA/丙酮纯化液3倍体积的沉淀剂2，漩涡混合，离心，弃上清，重复2~3次；
③加入TCA/丙酮纯化液0.4倍体积的洗剂1，离心，弃洗剂；
④加入TCA/丙酮纯化液3倍0.25倍体积的水，混匀，加入TCA/丙酮纯化液0.01倍体积的洗剂2和TCA/丙酮纯化液0.05倍体积的洗剂2附加剂，混匀，﹣20℃冷冻30 min，过程中每10min漩涡混合30秒；
⑤离心，弃上清，重复1次，干燥；
⑥加入2-DE水化液或者含有0.05%DTT 的磷酸盐缓冲液溶解，离心，上清液即为纯化样品液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于： 步骤（1）所述组织破碎的方法为液氮研磨法。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）所述中性缓冲液是磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的pH为7.3。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）所述中性缓冲液中添加有抗氧化剂和表面活性剂。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述抗氧化剂为β-巯基乙醇；所述表面活性剂为Tween80。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述β-巯基乙醇的浓度为0.2%~1%w/v；所述Tween80浓度为0.2%~1%w/v。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述β-巯基乙醇的浓度为0.2%w/v；所述Tween80浓度为0.5%w/v。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）所述浸提的时间是1~4h。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2）中，所述电泳为SDS-PAGE电泳、Tricine-SDS-PAGE电泳或者双向电泳。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：所述SDS-PAGE电泳中，分离胶浓度为12%、交联度为3%，浓缩胶浓度为4%、交联度为3%。
12.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：所述Tricine-SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为16.5%、交联度为5%，浓缩胶浓度为4%、交联度为3%。
13.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：所述双向电泳中，等电聚焦电泳的程序如下表：
SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为12%、交联度为2.7%，浓缩胶浓度为4%、交联度为2.7%。
14.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：所述电泳为双向电泳时，上样量以蛋白重量计为600 µg。
15.一种冬虫夏草中的分子量为11.749Kda、N端序列为DQEYTVF 的蛋白质在制备促进淋巴细胞增殖的药物中的用途。
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