CN101933960A - 一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法，涉及植物生物化学领域。为解决川牛膝生产用种混杂，以及川牛膝及其易混物种的鉴别往往只能在出苗或成株乃至收获后才能进行且实施复杂、成本高，目前尚无有效鉴别川牛膝与杂牛膝的方法等问题，本发明提供了一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在川牛膝及其易混物种的种子中提取溶于稀酸的谷蛋白；(2)SDS-PAGE电泳，再染色、脱色、固定；(3)种子蛋白电泳谱带的分析与鉴定。本发明的方法准确且简单易行，并能有效鉴定杂交牛膝与川牛膝。

Description

一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法

技术领域

本发明涉及植物生物化学领域，特别是涉及川牛膝与其易混物种的鉴别方法。

背景技术

川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan.的干燥根，又名甜牛膝，大牛膝，白牛膝。川牛膝是著名的川产地道药材之一，主产于四川的天全、宝兴、汉源和金口河等地。川牛膝性平，味甘，微苦，具有逐瘀通经，通利关节，利尿通淋等功效，临床用于治疗血滞经闭，风湿痹痛，尿血血淋，跌打损伤，产后胞衣不下等症。早年有研究发现川牛膝在改善微循环，抗炎，延缓衰老等方面均胜于怀牛膝。近年又发现川牛膝中分离的阿魏酸对非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫功能均有较强的促进作用。从川牛膝根中提取的牛膝多糖(Achyranthes bidentata Polysaec-charzdes，ABP)还具有抗肿瘤的作用。因而，川牛膝的研究和利用再次受到广泛关注。

近年来地道的川牛膝品种已越来越少，大多被其同属植物头花杯苋和两者的杂种所取代。头花杯苋为苋科植物头花杯苋Cyathula capitata(Wall.)Moq.的根，又名金沙牛膝、头花蒽草、红牛膝等，在四川、云南常被混称川牛膝，其具有祛风除湿、祛瘀通经、强筋壮骨等功效。由于杯苋属的植物之间很易杂交，川牛膝与头花杯苋由于杂交，退化的现象十分严重。对于杂交牛膝(以下简称杂牛膝)，其成分、药理作用是否与川牛膝一致，尚未见报道。怀牛膝为苋科牛膝属植物牛膝Achyranthes bidentata Blume的根，主产于河南、山东、浙江地区。其性平，味苦、酸，主要功效是补肝肾，强筋骨，逐瘀通经，引血下行，用于治疗腰膝酸软，筋骨无力，月经不调，四肢拘挛，炮制成炭能止血。以上所述的头花杯苋、杂牛膝和怀牛膝为生产上川牛膝的易混物种。

目前，对川牛膝与其易混物种头花杯苋、怀牛膝的鉴别方法主要有：原植物鉴别、药材外观性状鉴别、根横切面显微鉴别、茎纵切面显微鉴别、粉末显微鉴别、叶片同工酶分析等。此外，有提取植株叶片DNA，采用RAPD、AFLP和ITS序列等分子标记技术对川牛膝、头花杯苋以及怀牛膝进行鉴别的报道。

以上鉴别方法不足之处在于：(1)无论是原植物鉴别、药材外观性状鉴别、显微鉴别还是分子标记技术鉴别，均未涉及川牛膝与其易混物种杂牛膝鉴别方法方面的报道，即通过以上方法尚无法鉴别川牛膝与杂牛膝；(2)以上方法均无法在川牛膝播种前对其与易混物种区分开，所需的试验材料必须是新鲜植株，新鲜叶片或是药材，即必须将种子播种下去，至少出苗或成株乃至收获后才能对其进行鉴别。(3)上述有的鉴别方法实施比较复杂或是成本较高，如RAPD、AFLP和ITS序列等分子标记技术。

目前，尚无用SDS-PAGE电泳方法对川牛膝及其易混物种进行鉴别的报道。

发明内容

本发明的主要目的是针对上述现有技术中存在的川牛膝与其易混物种的鉴别往往只能在出苗或成株乃至收获后才能进行，许多方法实施复杂、成本高，且目前尚无有效鉴别川牛膝与杂牛膝的方法等问题，提供一种准确且简单易行的川牛膝与其易混物种的鉴别方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在川牛膝及其易混物种的种子中提取溶于稀酸的谷蛋白；(2)SDS-PAGE电泳，再染色、脱色、固定；(3)种子蛋白电泳谱带的分析与鉴定。

具体地，步骤(1)所述的提取是指，取单粒种子研磨成细粉，加入提取缓冲液于室温下提取2h，其间涡旋，然后将样品于沸水中煮4min，离心取上清备用。

进一步地，步骤(1)所述提取缓冲液由以下成分组成：62.5mmol/LTris-HCL pH6.8，2％(W/V)SDS，10％(V/V)甘油，1.5％(W/V)DTT，0.002％(W/V)溴酚兰，提取缓冲液用量为每mg种子细粉加入5μL；所述离心转速为8000rpm/min，时间为5min。

具体地，步骤(2)所述SDS-PAGE电泳是指，在分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为3％的SDS-PAGE不连续分离系统进行电泳。

进一步地，步骤(2)所述的SDS-PAGE电泳是指，在分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为3％的SDS-PAGE不连续分离系统，恒压500V，指示剂在浓缩胶时电流为40mA，指示剂进入分离胶时，电流调为60mA，进行电泳，前沿指示剂迁移至板底后30min停止电泳。

再进一步地，步骤(2)所述的分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为3％的SDS-PAGE不连续分离系统是指：(1)浓度为15％的分离胶：蒸馏水4.6mL，40％丙烯酰胺3.75mL，2％甲叉双丙稀酰胺0.52mL，分离胶缓冲液(pH＝8.9)1mL，10％过硫酸胺0.09mL，TEMED 4.2μL，其中分离胶缓冲液由溶解378g Tris、25g SDS、95g硼酸，加蒸馏水定溶至2.5L制备而成；(2)浓度为3％的浓缩胶：蒸馏水3.7mL，40％丙烯酰胺0.375mL，2％甲叉双丙稀酰胺0.2mL，浓缩胶缓冲液0.62mL，10％SDS 0.05mL，10％过硫酸胺0.05mL，TEMED5μL，其中浓缩胶缓冲液由1.0mol/L Tris-HCL(pH6.8)，10％(V/V)SDS制备而成；(3)电泳缓冲液：分离胶缓冲液稀释10倍。

具体地，步骤(2)所述染色是指，每块胶用300mL染色液染色过夜；所述脱色是指，将凝胶板用蒸馏水漂洗数次，加入脱色液反复脱色，至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质谱带清晰为止；所述固定，是指于固定液(冰醋酸∶水＝1∶9)中保存，其中染色液由0.3g考马斯亮蓝R-250、135mL甲醇、30mL冰醋酸和135mL水制备而成，脱色液由37.5mL冰醋酸，25mL甲醇加水至500mL制备而成

本发明的最优选方案是，一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法，包括以下步骤：

(1)在川牛膝及其易混物种的种子中提取溶于稀酸的谷蛋白，其中，所述的提取是指，取单粒种子研磨成细粉，加入提取缓冲液于室温下提取2h，其间涡旋，然后将样品于沸水中煮4min，离心取上清备用；所述提取缓冲液由以下成分组成：62.5mmol/L Tris-HCL pH6.8，2％(W/V)SDS，10％(V/V)甘油，1.5％(W/V)DTT，0.002％(W/V)溴酚兰，提取缓冲液用量为每mg种子细粉加入5μL；所述离心转速为8000rpm/min，时间为5min；

(2)SDS-PAGE电泳，再染色、脱色、固定，其中，SDS-PAGE电泳是指，在SDS-PAGE不连续分离系统，恒压500V，指示剂在浓缩胶时电流为40mA，指示剂进入分离胶时，电流调为60mA，进行电泳，前沿指示剂迁移至板底后30min停止电泳，所述的SDS-PAGE不连续分离系统是指：

①浓度为15％的分离胶：蒸馏水4.6mL，40％丙烯酰胺3.75mL，2％甲叉双丙稀酰胺0.52mL，分离胶缓冲液(pH8.9)1mL，10％过硫酸胺0.09mL，TEMED4.2μL，其中分离胶缓冲液由溶解378g Tris、25g SDS、95g硼酸，加蒸馏水定溶至2.5L制备而成；

②浓度为3％的浓缩胶：蒸馏水3.7mL，40％丙烯酰胺0.375mL，2％甲叉双丙稀酰胺0.2mL，浓缩胶缓冲液0.62mL，10％SDS 0.05mL，10％过硫酸胺0.05mL，TEMED 5μL，其中浓缩胶缓冲液由1.0mol/L Tris-HCL(pH6.8)，10％(V/V)SDS制备而成；

③电泳缓冲液：分离胶缓冲液稀释10倍；

所述适宜电压是指，恒压500V；适宜电流是指，指示剂在浓缩胶时电流为40mA，指示剂进入分离胶时，电流调为60mA；适当时间是指，前沿指示剂迁移至板底后30min停止电泳；

染色是指，每块胶用300mL染色液染色过夜；所述脱色是指，将凝胶板用蒸馏水漂洗数次，加入脱色液反复脱色，至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质谱带清晰为止；所述固定，是指于固定液(冰醋酸∶水＝1∶9)中保存，其中染色液由0.3g考马斯亮蓝R-250、135mL甲醇、30mL冰醋酸和135mL水制备而成，脱色液由37.5mL冰醋酸，25mL甲醇加水至500mL制备而成；

(3)种子蛋白电泳谱带的分析与鉴别。

SDS-PAGE电泳方法是根据蛋白分子量的不同而分离蛋白。SDS-PAGE电泳方法的不连续分离系统，其电泳迁移率主要取决于相对分子量的大小，而与所带电荷和分子形状无关，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而与连续分离系统相比，其条带清晰度及分辨率更佳。SDS-PAGE不连续分离系统技术中，待鉴别物质不同，在选择具体的分离胶、浓缩胶时，存在差异。目前，对于川牛膝及其易混物种的蛋白质分子量等尚无报道。本发明通过大量研究，选择了合适的SDS-PAGE不连续分离系统，并将其应用于川牛膝及其易混物种的种子蛋白鉴别中，成功地通过电泳谱带将川牛膝与其易混物种，尤其是杂牛膝区分开。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)直接用种子进行鉴别，省去大量的播种、田间管理、取样和收获的时间，节省土地资源；(2)利用种子直接进行蛋白的提取、分离，提取方法简便、效率高，电泳条件成熟，谱带清晰，无需使用任何分析软件，直接观察鉴别；(3)通过谱带完全能将川牛膝及其易混物种，包括头花杯苋、怀牛膝，尤其是杂牛膝区分开；(4)可在一张胶片上同时鉴定同一材料多粒种子或多个材料，直观易辨，重复性好，稳定性好，有利于实验批量操作。

关于本发明的有关术语解释：SDS-PAGE电泳是指十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，Tris-HCL指三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，SDS指十二烷基磺酸钠，DTT指二硫苏糖醇，TEMED指四甲基二乙胺。

附图说明

图1是川牛膝、头花杯苋、杂牛膝与怀牛膝的种子蛋白电泳图谱。图1第1-3泳道为怀牛膝，第4-6泳道为头花杯苋，第7-9泳道为川牛膝，第10泳道为空白，第11泳道为Marker，第12-14泳道为杂牛膝，第15泳道为Marker，第16-18泳道为川牛膝，第19泳道为空白，第20-22泳道为头花杯苋。

图2是川牛膝、头花杯苋每种材料取7粒种子进行的重复试验。第1-7泳道为川牛膝，第8泳道为空白，第9-15泳道为头花杯苋。

图3是川牛膝、杂牛膝每种材料取7粒种子进行的重复试验。第1-7泳道为川牛膝，第8泳道为Marker，第9-15泳道为杂牛膝。

图4是11份不同来源地的川牛膝、头花杯苋和杂牛膝的种子蛋白电泳图谱。第1泳道为重庆奉节太和川牛膝，第2泳道为重庆奉节长安川牛膝，第3、4泳道为四川乐山金口河川牛膝，第5泳道为四川雅安天全思经川牛膝、第6泳道为四川雅安宝兴蜂桶寨川牛膝；第8泳道为Marker；第7、9泳道为四川雅安宝兴中岗杂牛膝、第10泳道为四川乐山金口河杂牛膝、第11、12泳道为四川雅安天全新沟杂牛膝；第13泳道为四川雅安宝兴民治头花杯苋、第14泳道为四川乐山金口河头花杯苋、第15泳道为四川雅安天全小河头花杯苋。

图5是不同贮藏方式的川牛膝种子蛋白电泳图谱。第1-3泳道为干燥器贮藏，第5-7泳道为-20℃贮藏，第9-11泳道为常规袋存，第4、8泳道为空白。

图6是不同生长年限和不同贮藏年限材料的种子蛋白电泳图谱。第1-3泳道为四川乐山金口河一年生川牛膝，第4-6泳道为四川乐山金口河三年生川牛膝，第7泳道为Marker，第8-10泳道为四川雅安宝兴头花杯苋(2008年贮藏)，第11-13泳道为四川雅安宝兴头花杯苋(2009年贮藏)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

实施例1

采用本发明的方法对川牛膝、头花杯苋、杂牛膝和怀牛膝的种子蛋白图谱进行比较，每份材料用三十粒以上种子进行重复试验。川牛膝采自四川省雅安市宝兴县蜂桶寨乡新康村，头花杯苋采自四川省乐山市金口河区永胜乡，杂牛膝采自四川省雅安市天全县新沟乡大顶坪，怀牛膝由中国医学科学院药用植物研究所提供，采自河南省。具体操作步骤如下：

1、种子蛋白的提取：分别取川牛膝、头花杯苋、杂牛膝和怀牛膝单粒种子研磨成细粉后，按1mg样品加入5μL提取缓冲液[62.5mmol/L Tris-HCLpH6.8，2％(W/V)SDS，10％(V/V)甘油，1.5％(W/V)DTT，0.002％(W/V)溴酚兰]于室温下提取2h，其间涡旋几次。将蛋白质样品于沸水中煮4min，8000rpm/min离心5min，取上清35μL点样。

2、不连续分离系统的制备：分离胶缓冲液(2.5L)：溶解378g Tris，25g SDS，95g硼酸，加蒸馏水定溶至2.5L，pH＝8.9；浓缩胶缓冲液：1.0mol/LTris-HCL，pH＝6.8，10％(V/V)SDS；电泳缓冲液：分离胶缓冲液稀释10倍。聚丙烯酰胺凝胶组成如表1所示：

表1聚丙烯酰胺凝胶组成

组成成分

浓缩胶(3％)

分离胶(15％)

40％丙烯酰胺(mL)	0.375	3.75
			2％甲叉双丙稀酰胺(mL)	0.2	0.52
分离胶缓冲液(mL)	-	1.0
			浓缩胶缓冲液(mL)	0.62	-
10％SDS(W/V，mL)	0.05	-
			H2O(mL)	3.7	4.6
10％过硫酸胺(W/V，mL)	0.05	0.09
			TEMED(μL)	5	4.2

采用Bio-Rad公司的II Xiell型电泳槽，将两玻板清洗干净后用酒精擦拭，晾干，夹好。将配制好的分离胶倒入两玻板之间，迅速加水将胶面压平。待胶完全凝固后将水倒掉，用滤纸吸干，加入配制好的浓缩胶，插上点样梳。待浓缩胶完全凝固后装上电泳槽，注满电泳缓冲液，小心拔出点样梳。用移液器将点样孔内的残胶和气泡吹去，点样。Marker为购于宝生物公司的D530A，分子量由大至小为：97.2KDa(磷酸酶b)、66.4KDa(牛血清蛋白)、44.3KDa(卵清蛋白)、29.0KDa(碳酸苷酶)、20.1KDa(胰蛋白酶抑制剂)、14.3KDa(溶菌酶)。

采用Bio-Rad公司的Power Poc 1000型电泳仪，电泳条件：恒压500V，指示剂溴酚兰的蓝色条带在浓缩胶时电流为40mA，进入分离胶时，电流调为60mA，在常温下进行。电泳时间为前沿溴酚蓝迁移至板底后30min停止电泳。每块胶用300mL染色液(0.3g考马斯亮蓝R-250、135mL甲醇、30mL冰醋酸和135mL水)染色过夜，然后将凝胶板用蒸馏水漂洗数次，加入脱色液(37.5mL冰醋酸，25mL甲醇加水至500mL)反复脱色，至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质谱带清晰为止。保存于固定液(冰醋酸∶水＝1∶9)，拍照。

川牛膝、头花杯苋、杂牛膝与怀牛膝的种子蛋白电泳图谱如图1。由图可以看出，本发明的方法具有很好的重复性与稳定性。通过谱带很容易将川牛膝、头花杯苋与怀牛膝区分开，怀牛膝与其它差异较大，主带区别在于：怀牛膝在分子量约55KD、40KD、33KD、23KD和22KD分别有一条明显亮带；川牛膝的主带分别在约58KD、35KD、31KD、25KD和22KD；头花杯苋的主带分别在约51KD、35KD、32KD、25KD和23KD。川牛膝和头花杯苋的条带较多且差异很小，二者主要区别在于第一条主带的位置不同，川牛膝约58KD，头花杯苋约51KD。

通过将每份种子取30粒进行重复性试验，结果发现，川牛膝和头花杯苋的谱带非常稳定，通过第一主带的位置很容易将两种材料区分开。杂牛膝取多粒种子进行重复试验，会发现可能同时存在三种谱带类型：即一种与川牛膝谱带相似；一种与头花杯苋谱带相似；还有一种是兼具川牛膝与头花杯苋的第一主带(特征带)的综合谱带类型。或者一份材料的不同种子出现以上三种谱带类型中的两种谱带类型，本实施例中图3中所示即为杂牛膝出现两种谱带类型。图2为川牛膝、头花杯苋各取7粒种子进行重复试验的图谱，图3为川牛膝、杂牛膝各取7粒种子进行重复试验的图谱。

将实验所述各物种同一批的剩余种子播种，待花期进行各物种的全植株鉴别，经验证，各物种的植株特征均与本实施例的蛋白质谱带所指向的物种相对应。因此，本发明的方法具有准确性。

由此，通过本发明的技术方案，可以明显区分川牛膝、头花杯苋、杂牛膝与怀牛膝的种子，特别是通过多粒种子重复实验可鉴定种子的纯度，区分出杂牛膝，并且可以了解杂牛膝中亲本谱带类型以及综合谱带类型所占比例。

实施例2

采用本发明的方法对不同来源地(见表2)的川牛膝、头花杯苋和杂交牛膝的种子蛋白图谱进行比较，每份材料用三十粒以上种子进行重复试验，方法同实施例1。

表2  11份不同来源地的川牛膝、头花杯苋和杂牛膝

11份材料的种子蛋白电泳图谱见图4。由图4可以看出，第1-6泳道为川牛膝，其谱带均表现很高的一致性。第13-15泳道为头花杯苋，其谱带也表现一致，并与川牛膝在第一主带存在差异，根据此带位置的不同可将川牛膝与头花杯苋区分开来。第7、9-12泳道为杂牛膝，第7、9泳道的谱带与头花杯苋相似，第10泳道的谱带与川牛膝相似，第11、12泳道的谱带一个与头花杯苋谱带相似，而另一个具有川牛膝和头花杯苋二者的带。

此实施例可表明，本发明的方法能将川牛膝与头花杯苋区分开，且稳定性较好。对杂牛膝的鉴别，可通过多粒种子反复实验鉴定其谱带更接近川牛膝还是头花杯苋，或兼具二者的特征带。

实施例3

采用本发明的方法对不同贮藏方式的同一材料(来源于四川省乐山市金口河区永胜乡的川牛膝)进行比较，每种贮藏方式的材料用三十粒以上种子进行重复试验，方法同实施例1。

得到的种子蛋白电泳图谱见图5。其中，第1-3泳道为干燥器贮藏，第5-7泳道为-20℃贮藏，第9-11泳道为常规袋存，第4、8泳道为空白。由图5可以看出，同一份材料的种子蛋白电泳谱带，不因贮藏方式的不同而发生较大变化，鉴别种子纯度的主带只有条带强弱的差别，并未增加或减少。说明本发明的方法具有很好的重复性和稳定性。

实施例4

采用本发明的方法对不同生长年限(一年生和三年生)同一材料(来自四川省乐山市金口河区永胜乡的川牛膝)，以及不同贮藏年限(分别于2008年和2009年贮藏)同一材料(来自四川省雅安市宝兴县的头花杯苋)的种子蛋白电泳谱带进行比较，每份材料用三十粒以上种子进行重复试验，方法同实施例1。

得到的种子蛋白电泳图谱见图6。第1-3泳道为四川乐山金口河一年生川牛膝，第4-6泳道为四川乐山金口河三年生川牛膝，第7泳道为Marker，第8-10泳道为四川雅安宝兴头花杯苋(2008年贮藏)，第11-13泳道为四川雅安宝兴头花杯苋(2009年贮藏)。

由图6可以看出，同一份材料的种子蛋白电泳谱带，不因生长年限或贮藏年限的不同而发生变化，鉴别种子纯度的主带数目和强弱几乎完全相同。说明本发明的方法具有很好的重复性和稳定性。

Claims (8)

1.一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在川牛膝及其易混物种的种子中提取溶于稀酸的谷蛋白；（2）SDS-PAGE电泳，再染色、脱色、固定；（3）种子蛋白电泳谱带的分析与鉴别。

2.根据权利要求1所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，步骤（1）所述的提取是指，取单粒种子研磨成细粉，加入提取缓冲液于室温下提取2 h，其间涡旋，然后将样品于沸水中煮4 min，离心取上清备用。

3.根据权利要求2所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，所述提取缓冲液由以下成分组成：62.5 mmol/L Tris-HCL pH6.8，2%（W/V）SDS，10%（V/V）甘油，1.5%（W/V）DTT，0.002%（W/V）溴酚兰，提取缓冲液用量为每mg种子细粉加入5 μL；所述离心转速为8000 rpm/min，时间为5 min。

4.根据权利要求1所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，步骤（2）所述的SDS-PAGE电泳是指，在分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为3%的SDS-PAGE不连续分离系统进行电泳。

5.根据权利要求4所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，步骤（2）所述的SDS-PAGE电泳是指，在分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为3%的SDS-PAGE不连续分离系统，恒压500 V，指示剂在浓缩胶时电流为40 mA，指示剂进入分离胶时，电流调为60 mA，进行电泳，前沿指示剂迁移至板底后30 min停止电泳。

6.根据权利要求5所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，所述的分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为3%的SDS-PAGE不连续分离系统是指： 

（1）浓度为15%的分离胶：蒸馏水 4.6 mL，40%丙烯酰胺 3.75 mL，2%甲叉双丙稀酰胺 0.52 mL，分离胶缓冲液（pH8.9）1 mL，10%过硫酸胺0.09 mL， TEMED 4.2 μL，其中分离胶缓冲液为溶解378 g Tris、25 g SDS、95 g硼酸，加蒸馏水定溶至2.5 L制备而成；

（2）浓度为3%的浓缩胶：蒸馏水3.7 mL，40%丙烯酰胺 0.375 mL，2%甲叉双丙稀酰胺 0.2 mL，浓缩胶缓冲液0.62 mL，10% SDS 0.05 mL，10%过硫酸胺0.05 mL，TEMED 5 μL，其中浓缩胶缓冲液由1.0 mol/L Tris-HCL（pH6.8），10% （V/V）SDS制备而成；

（3）电泳缓冲液：分离胶缓冲液稀释10倍。

7.根据权利要求1所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，步骤（2）所述染色是指，每块胶用300 mL染色液染色过夜；所述脱色是指，将凝胶板用蒸馏水漂洗数次，加入脱色液反复脱色，至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质谱带清晰为止；所述固定，是指于固定液（冰醋酸--水=1:9）中保存；其中染色液由0.3 g考马斯亮蓝R-250、135 mL甲醇、30 mL冰醋酸和135 mL水制备而成，脱色液由37.5 mL冰醋酸，25 mL甲醇加水至500 mL制备而成。

8.根据权利要求1所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在川牛膝及其易混物种的种子中提取溶于稀酸的谷蛋白，其中，所述的提取是指，取单粒种子研磨成细粉，加入提取缓冲液于室温下提取2 h，其间涡旋，然后将样品于沸水中煮4 min，离心取上清备用；所述提取缓冲液由以下成分组成：62.5 mmol/L Tris-HCL pH6.8，2%（W/V）SDS，10%（V/V）甘油，1.5%（W/V）DTT，0.002%（W/V）溴酚兰，提取缓冲液用量为每mg种子细粉加入5 μL；所述离心转速为8000 rpm/min，时间为5 min；

（2）SDS-PAGE电泳，再染色、脱色、固定，其中，SDS-PAGE电泳是指， 在SDS-PAGE不连续分离系统，恒压500 V，指示剂在浓缩胶时电流为40 mA，指示剂进入分离胶时，电流调为60 mA，进行电泳，前沿指示剂迁移至板底后30 min停止电泳，所述的SDS-PAGE不连续分离系统是指：

①浓度为15%的分离胶：蒸馏水 4.6 mL，40%丙烯酰胺 3.75 mL，2%甲叉双丙稀酰胺 0.52 mL，分离胶缓冲液（pH8.9）1 mL，10%过硫酸胺0.09 mL， TEMED 4.2 μL，其中分离胶缓冲液由溶解378 g Tris、25 g SDS、95 g硼酸，加蒸馏水定溶至2.5 L制备而成；

②浓度为3%的浓缩胶：蒸馏水3.7 mL，40%丙烯酰胺 0.375 mL，2%甲叉双丙稀酰胺 0.2 mL，浓缩胶缓冲液0.62 mL，10% SDS 0.05 mL，10%过硫酸胺0.05 mL，TEMED 5 μL，其中浓缩胶缓冲液由1.0 mol/L Tris-HCL（pH6.8），10% （V/V）SDS制备而成；

③电泳缓冲液：分离胶缓冲液稀释10倍；

染色是指，每块胶用300 mL染色液染色过夜；所述脱色是指，将凝胶板用蒸馏水漂洗数次，加入脱色液反复脱色，至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质谱带清晰为止；所述固定，是指于固定液（冰醋酸--水=1:9）中保存，其中染色液由0.3 g考马斯亮蓝R-250、135 mL甲醇、30 mL冰醋酸和135 mL水制备而成，脱色液由37.5 mL冰醋酸，25 mL甲醇加水至500 mL制备而成；

（3）种子蛋白电泳谱带的分析与鉴别。

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