CN113466470A - 响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法 - Google Patents

响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113466470A
CN113466470A CN202110841687.1A CN202110841687A CN113466470A CN 113466470 A CN113466470 A CN 113466470A CN 202110841687 A CN202110841687 A CN 202110841687A CN 113466470 A CN113466470 A CN 113466470A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
extraction
seeds
seed
germinating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110841687.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113466470B (zh
Inventor
高顺
智西民
王梦颖
林熙
牛畔青
何靖雯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Agricultural University
Original Assignee
Sichuan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Agricultural University filed Critical Sichuan Agricultural University
Priority to CN202110841687.1A priority Critical patent/CN113466470B/zh
Publication of CN113466470A publication Critical patent/CN113466470A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113466470B publication Critical patent/CN113466470B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/002—Determining nitrogen by transformation into ammonia, e.g. KJELDAHL method
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G01N33/6839—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving dyes, e.g. Coomassie blue, bromcresol green
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/20—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions in agriculture, e.g. CO2
    • Y02P60/21—Dinitrogen oxide [N2O], e.g. using aquaponics, hydroponics or efficiency measures

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，包括如下步骤：(1)种子萌发；(2)蛋白含量和抗氧化活性测定；(3)响应面法优化萌芽种子蛋白最佳萃取试验(包括萌芽种子进行缓冲液单因素萃取试验)；(4)膜过滤处理对提取蛋白的抗氧化活性影响。本发明结合当前青桐资源利用情况和豆谷类种子萌发的研究进展，分析青桐萌芽种子蛋白含量和抗氧化活性的变化，确定最佳萌发时间点。以青桐萌芽种子为材料，利用正交试验设计蛋白萃取试验，结合抗氧化活性测定，构建青桐萌发期抗氧化蛋白分离工艺，以生产高附加值的抗氧化蛋白组份，有助于实现青桐种子高附加值活性蛋白的开发利用，提升青桐整体产业链的实用和经济价值。

Description

响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法
技术领域
本发明涉及青桐缓冲液萃取试验技术领域，尤其涉及一种响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法。
背景技术
面对食用蛋白的短缺与环境保护的双重压力，植物蛋白资源的利用与产品开发引起了全球广泛的关注。鉴于动物蛋白质出现的朊病毒、转基因、产品紧缺和成本高等风险，开发价优、安全可靠的植物蛋白，特别是木本油料种子蛋白，以满足对优质蛋白质的摄入需求，具有实际的应用价值和前景。蛋白质是生命活动的基础物质和能源物质，在种子形成、发育、萌发直至成苗的过程中都扮演着极其重要的角色，它为种子生长发育提供养料，还调控种子的各种生理生化反应和代谢过程，为种子自身的形成及成体植株的生长提供了必不可少的条件。此外，萌芽过程中包含较多的生物活性物质，如蛋白、γ-氨基丁酸(GABA)、多糖等，具有很高的开发利用价值。
青桐种子含有多种营养成分，如含有约20％粗脂肪，其中不饱和脂肪酸(棕榈油酸、油酸、亚油酸和亚麻酸)占总含量的67.02％，对心脏有保护作用，同时可抑制血糖、血脂和胆固醇的升高，具有良好的功效。亚油酸对人的大脑发育和视神经的形成具有重要作用，可促进胎儿的生长发育，并且可调节血管舒张和免疫系统。青桐种子作为中药材在医药方面有较高的利用价值，其蛋白含量约20-25％，其种子蛋白质中含有人体所需的17种氨基酸，7种为必需氨基酸，谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量较高，可作为品质优良的植物蛋白质。
碱提酸沉法，核心在于用碱溶解通过搅拌的方式将植物蛋白分离出来，再通过降低溶液pH值的方法使蛋白质析出。该方法由于萃取率高，所需设备简单且易于操作，在萃取蛋白质领域有着广泛的应用，是一种常见的萃取植物蛋白的方法。但碱提酸沉法试验过程较为复杂，不易控制，且碱提取以及酸沉淀过程中，NaOH本身具有较强的碱性，对蛋白质具有腐蚀性，可使提取的种子蛋白失去生物学活性和保健功能，进而影响其提取蛋白质的品质和色泽，降低蛋白质高附加值的应用。缓冲液萃取法相比碱萃取法，蛋白得率略有下降，但所得蛋白具有较强的生物活性和保健功能，如抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、抗炎、降血压、血脂和抗衰等。近年来，国内对植物蛋白研究主要集中在大豆蛋白、花生蛋白、菜籽蛋白、豌豆蛋白等农作物品种，有关木本油料作物种子蛋白如青桐、核桃、油茶等开发利用，仍有待于深入研究。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，包括如下步骤：
S1：种子萌发；
S2：蛋白含量和抗氧化活性测定；
S3：响应面法优化萌芽种子蛋白最佳萃取试验；
S4：膜过滤处理对提取蛋白的抗氧化活性影响。
进一步地，所述步骤S1包括如下子步骤：
S11：将采收的青桐种子进行筛选，挑选出同株、产量较大且颗粒饱满的青桐种子约3000颗；
S12：将上述青桐种子分装在6个烧杯(1L)，用水浴锅加热(恒温40℃)，浸泡24h，每隔4h换1次水，并用玻璃棒不断搅拌，使种子受热均匀；
S13：将准备好的花盆底盘，铺上4-5层纱布，上面覆盖3-4层纱布，将水浴好的种子均匀铺展放入花盘中(保证密度适中、平铺均匀)；
S14：将所述纱布浸湿，花盘底部保持湿润、无积水，放入人工气候培养箱，温度设置为30℃，保证每天在8点、16点和23点各浇水一次(将纱布润湿，保持湿度一致)；
S15：在时间段0-7天内，每天18点取样，称取0.3g的鲜样，加液氮研磨，并分别用50mM pH 7.4Tris-HCl溶液和0.2M pH 6.6磷酸缓冲液，各吸取3mL将其加入5mL的EP离心管中，在4℃条件下，以12000rpm的转速，离心10min，吸取上清液，将其存放到-80℃超低温冰箱中，保存备用。
进一步地，所述步骤S2具体包括：
S21：通过凯氏定氮法对青桐萌芽种子总蛋白质含量进行测定，选用考马斯亮蓝G-250比色法测定萃取液蛋白质浓度；其中，计算蛋白质得率的公式：
蛋白质得率/％(Y)＝[萃取液蛋白质质量(mg)/种子质量(mg)]×100％
用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白，吸取稀释15倍后的蛋白原液50μL，放入到试管中(3个重复)，而所有试管均加入2.5mL的考马斯亮蓝，加入原液后用混均器，充分震荡，将其混合均匀，在室温下，静置3min后，用756s分光光度计，依据牛血清蛋白制作的标准曲线，以波长595nm，进行光度值的测定。
S22：DPPH自由基清除能力测定；
S23：还原力测定；
S24：亚铁离子螯合能力测定。
进一步地，所述步骤S22具体包括：
吸取2mL的DPPH溶液加到5mL的棕色离心管中，再加1mL 50mM pH7.4Tris-HCl溶液，振荡均匀后，在517nm下，测定吸光值A0；同样吸取2mL DPPH溶液加到5mL的棕色离心管中，再加样品液100μL，再加50mM pH 7.4Tris-HCl 1mL，均匀混合，避光保存于室温，静置30min后，测定A值(517nm)。
进一步地，所述步骤S23具体包括：
将2mL样品加入5mL的离心管中，再分别吸取2mL 1％铁氰化钾和0.2M pH 6.6磷酸缓冲液，振荡均匀后，又把离心管置于50℃的温水中，持续加热20min后取出，放到冰堆里，迅速冷却；用冰水冷浴10min后，吸取2mL 10％TCA，用混均器震荡混均后，设置离心10min；再分别吸出1.5mL的去离子水和0.3mL 0.1％氯化铁，均匀混合反应10min；测吸光值OD(700nm)。
进一步地，所述步骤S24具体包括：
0.5mL样品加入5mL离心管中，再加入3.7mL甲醇及0.1mL 2mM FeCl2·4H2O；待溶液反应30s后，又把0.2mL 5mM的Ferrozine吸入到离心管里，待10min后，测定吸光值OD562nm。
进一步地，所述步骤S3包括如下子步骤：
S31：缓冲液pH对萌芽种子蛋白得率的影响；
S32：缓冲液离子强度对萌芽种子蛋白得率的影响；
S33：萃取时间对萌芽种子蛋白得率的影响；
S34：料液比对萌芽种子蛋白得率的影响；
S35：响应面法优化萌芽种子蛋白最佳萃取试验。
进一步地，所述步骤S31具体包括：
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，分别加8mL 60mM设定pH 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和10.5冰浴的缓冲液，在室温条件下，置于冰块上不停搅拌15min。萃取结束后，在4℃条件下，以12000rpm的转速，离心10min，吸取上清液，保存备用。
进一步地，所述步骤S32具体包括：
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，分别加入8mL pH 9.5的20、40、60、80和100mM冰浴的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，在室温条件下，置于冰块上不停搅拌15min。萃取结束后，在4℃条件下，将转速调为12000rpm，离心10min，吸取上清液，放入4℃的冰箱中，随时取用。
进一步地，所述步骤S33具体包括：
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，分别加8mL 60mM pH 9.5冰浴的Na2CO3-NaHCO3溶液，萃取时间设定5、10、15、20和25min，室温条件下，置于冰块上分别不停搅拌5、10、15、20和25min；搅拌时间到后，放入离心机，离心温度为4℃，转速12000rpm，离心10min，转移上清液，4℃条件下保存，以备取用。
进一步地，所述步骤S34具体包括：
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，速度倒入约10mL的液氮，并快速研磨，按照料液比1:4、1:6、1:8、1:10、1:12(g/mL)，分别加入4、6、8、10、12mL60mM pH 9.5冰浴的Na2CO3-NaHCO3溶液，在室温条件下，置于冰块上不停搅拌15min；萃取结束后，在4℃条件下，以12000rpm的转速，离心10min，吸取上清液，保存备用。
进一步地，所述步骤S35具体包括：
对单因素试验结果进行分析，筛选出缓冲液pH、缓冲液离子强度、料液比和萃取时间参数，通过JMP软件，运用Box-Bhnken中心组合模型，按照随机排序，设计四因素三水平试验，共计27组，以青桐种子蛋白质得率为响应值(Y/％)，缓冲液pH(X1)、缓冲液离子强度(X2)、料液比(X3)和萃取时间(X4)为试验因素进行试验，来确定青桐种子蛋白质萃取的最佳参数条件。
进一步地，所述步骤S4具体包括：
利用缓冲液提取萌芽青桐种子蛋白的试验方法，对获得的青桐萌芽种子蛋白液进行抗氧化活性检测，测定其DPPH自由基清除能力、还原力和亚铁离子螯合能力后，通过醋酸纤维膜过滤来对比过滤前后青桐萌芽种子蛋白抗氧化活性的差异。试验利用经过响应面分析得出的缓冲液提取青桐萌芽种子蛋白最佳提取工艺参数进行蛋白提取，测定获得的青桐蛋白液的抗氧化活性。
本发明具有如下潜在应用价值和市场效果：
本发明结合当前青桐资源利用情况，结合豆类或谷类种子萌发研究结果，分析青桐种子萌发期抗氧化活性的变化，确定最佳萌发时间点。以青桐萌芽种子为材料，利用正交试验设计蛋白萃取工艺，结合测定蛋白质含量和抗氧化活性，构建青桐萌发期具有抗氧化活性蛋白的萃取工艺，为生产高附加值的抗氧化蛋白组份提供最佳研究方案。研究结果有助于实现青桐萌芽种子的高附加值活性蛋白的开发利用，提升整体青桐产业链的实用和经济价值。此外，该萃取工艺和研究方案可经改进调整应用到其他富含蛋白质的农林生物资源的开发利用，提升农林生物资源的附加值和经济效益，为构建清洁、高效、连续的，具有抗氧化活性的蛋白分离工艺提供借鉴和方案参考。
附图说明
图1为缓冲液pH对萌芽种子蛋白得率的影响；
图2为缓冲液离子强度对萌芽种子蛋白得率的影响；
图3为料液比对萌芽种子蛋白得率的影响；
图4为萃取时间对萌芽种子蛋白得率的影响；
图5为模型预测值与实际试验值的拟合程度；
图6为X1(缓冲液pH)和X2(缓冲液离子强度)交互作用的响应面图和等高线图；
图7为X1(缓冲液pH)和X3(料液比)交互作用的响应面图和等高线图；
图8为X1(缓冲液pH)和X4(萃取时间)交互作用的响应面图和等高线图；
图9为X2(缓冲液离子强度)和X3(料液比)交互作用的响应面图和等高线图；
图10为X2(离子强度)和X4(萃取时间)交互作用的响应面图和等高线图；
图11为X3(料液比)和X4(萃取时间)交互作用的响应面图和等高线图；
图12为青桐种子蛋白质萃取率响应曲面的预测刻画器；
图13为提高萌芽种子蛋白的抗氧化活性方法膜过滤条件下的青桐萌芽种子蛋白DPPH自由基清除率；
图14为提高萌芽种子蛋白的抗氧化活性方法膜过滤条件下的青桐萌芽种子蛋白还原力；
图15为提高萌芽种子蛋白的抗氧化活性方法膜过滤条件下的青桐萌芽种子蛋白亚铁离子螯合能力；
图16为一种响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法的步骤流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
给予适宜的生长条件，具有生命力的种子破除休眠状态转变为更为活跃生理活动的动态过程，称为种子的萌发。在整个过程中，种子的呼吸作用越来越强，产生了更多种类和数量的酶类和蛋白，从而使种子的新陈代谢保持较高水平，并促进了原有物质转化成高活性成分的营养物质。在种子萌发过程，原有酶类被激发，不仅能生成新种类的酶，也能将大分子的营养物质分解为多种矿物质和维生素等小分子营养物质。而结合相关研究报道，在萌芽阶段，谷类和豆类都能生成具有显著生物活性的营养物质。糙米萌芽后，抗氧化活性增大，具有持续维持免疫力，减少胆固醇含量，降低血糖和血脂的作用。发芽是一种改善种子营养品质和加工特性的有效手段，可以改变种子氨基酸组成，提高蛋白质的利用率，增加维生素的含量并降低抗营养因子的水平。种子萌芽过程中，大分子物质被分解，生成了多肽和氨基酸等小分子活性物质，所以，萌芽种子抗氧化蛋白和多肽含量普遍高于未萌芽种子。
本发明结合当前青桐资源利用情况，结合豆类或谷类种子萌发研究进展，分析青桐种子萌发期抗氧化活性的变化，确定最佳萌发时间点。以青桐萌芽种子为材料，利用正交试验设计蛋白萃取工艺，结合测定抗氧化活性，构建青桐萌发期具有抗氧化活性蛋白的萃取工艺，为生产高附加值的抗氧化蛋白组份提供最佳研究方案。研究结果有助于实现青桐萌芽种子的高附加值活性蛋白的开发利用，提升整体青桐产业链的实用和经济价值。此外，该萃取工艺和研究方案可经改进调整应用到其他富含蛋白质的农林生物资源的开发利用，提升农林生物资源的附加值和经济效益，为构建清洁、高效、连续的，具有抗氧化活性的蛋白分离工艺提供借鉴和方案参考。
缓冲液蛋白萃取法是将萌芽种子先用液氮进行研磨后，将具有不同pH和不同离子强度缓冲液进行提取，设置萃取时间、pH参数、离子强度、料液比的四因素三水平试验，研究结果表明，缓冲液萃取法蛋白得率较低，但萃取的蛋白组分抗氧化活性高。
单因素试验结果表明，以蛋白质得率作为响应值，运用响应面法对青桐种子蛋白质的萃取条件进行优化，从而确定最优的萃取参数和工艺。基于上述讨论，本研究以青桐萌芽种子为材料，以缓冲液萃取法，以蛋白得率作为响应值，运用响应面法对影响蛋白得率的萃取参数进行优化，进而确定最佳萃取参数；结合测定抗氧化活性，构建青桐种子的抗氧化蛋白制备工艺，以生产高附加值的抗氧化蛋白组份。
一种响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，包括如下步骤：
(1)种子萌发
将采收的青桐种子进行筛选，挑选出同株、产量较大且颗粒饱满的青桐种子约3000颗，分装在6个烧杯(1L)，用水浴锅加热(恒温40℃)，浸泡24h，每隔4h换1次水，并用玻璃棒不断搅拌，使种子受热均匀。将准备好的花盆底盘，铺上4-5层纱布，上面覆盖3-4层纱布，将水浴好的种子均匀铺展放入花盘中(保证密度适中、平铺均匀)。将纱布浸湿，花盘底部保持湿润、无积水，放入人工气候培养箱，温度设置为30℃。保证每天在8点、16点和23点各浇水一次(将纱布润湿，保持湿度一致)。在时间段0-7天内，每天18点取样，称取0.3g的鲜样，加液氮研磨，并分别用50mM pH 7.4Tris-HCl溶液和0.2M pH 6.6磷酸缓冲液，各吸取3mL将其加入5mL的EP离心管中，在4℃条件下，以12000rpm的转速，离心10min，吸取上清液，将其存放到-80℃超低温冰箱中，保存备用。
(2)蛋白含量和抗氧化活性测定
(21)通过凯氏定氮法对青桐萌芽种子总蛋白质含量进行测定，选用考马斯亮蓝G-250比色法测定萃取液蛋白质浓度。计算蛋白质得率的公式：
蛋白质得率/％(Y)＝[萃取液蛋白质质量(mg)/种子质量(mg)]×100％
用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白。吸取稀释15倍后的蛋白原液50μL，放入到试管中(3个重复)，而所有试管均加入2.5mL的考马斯亮蓝，加入原液后用混均器，充分震荡，将其混合均匀，在室温下，静置3min后，用756s分光光度计，依据牛血清蛋白制作的标准曲线，以波长595nm，进行光度值的测定。
(22)DPPH自由基清除能力测定
吸取2mL的DPPH溶液加到5mL的棕色离心管中，再加1mL 50mM pH7.4Tris-HCl溶液，振荡均匀后，在517nm下，测定吸光值A0。同样的吸取2mL DPPH溶液加到5mL的棕色离心管中，再加样品液100μL，再加50mM pH 7.4Tris-HCl 1mL，均匀混合，避光保存于室温，静置30min后，测A值(517nm)。
(23)还原力测定
将2mL样品加入5mL的离心管中，再分别吸取2mL 1％铁氰化钾和0.2M pH 6.6磷酸缓冲液，振荡均匀后，又把离心管置于50℃的温水中，持续加热20min后取出，放到冰堆里，迅速冷却；用冰水冷浴10min后，吸取2mL 10％TCA，用混均器震荡混均后，设置离心10min；再分别吸出1.5mL的去离子水和0.3mL 0.1％氯化铁，均匀混合反应10min；测定吸光值OD(700nm)。
(24)亚铁离子螯合能力测定
0.5mL样品加入5mL离心管中，再加入3.7mL甲醇及0.1mL 2mM FeCl2·4H2O；待溶液反应30s后，又把0.2mL 5mM的Ferrozine吸入到离心管里，待10min后，测定吸光值OD(562nm)。
(3)青桐种子进行缓冲液萃取法单因素试验
(31)缓冲液pH对萌芽种子蛋白得率的影响
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，分别加8mL 60mM设定pH 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和10.5冰浴的缓冲液，在室温条件下，置于冰块上不停搅拌15min。萃取结束后，在4℃条件下，以12000rpm的转速，离心10min，吸取上清液，保存备用。
(32)缓冲液离子强度对萌芽种子蛋白得率的影响
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，分别加入8mL pH 9.5的20、40、60、80和100mM冰浴的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，在室温条件下，置于冰块上不停搅拌15min。萃取结束后，在4℃条件下，将转速调为12000rpm，待10min，吸取澄清液，放入4℃的冰箱中，随时取用。
(33)萃取时间对萌芽种子蛋白得率的影响
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，分别加8mL 60mM pH 9.5冰浴的Na2CO3-NaHCO3溶液，萃取时间设定5、10、15、20和25min，室温条件下，置于冰块上分别不停搅拌5、10、15、20和25min。搅拌时间到后，放入离心机，离心温度为4℃，转速12000rpm，时间10min，转移上清液，4℃条件下保存，以备取用。
(34)料液比对萌芽种子蛋白得率的影响
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，按照料液比1:4、1:6、1:8、1:10、1:12(g/mL)，分别加入4、6、8、10、12mL60mM pH 9.5冰浴的Na2CO3-NaHCO3溶液，在室温条件下，置于冰块上不停搅拌15min。萃取结束后，在4℃条件下，以12000rpm的转速，离心10min，吸取上清液，保存备用。
(35)响应面法优化萌芽种子蛋白最佳萃取试验
对单因素试验结果进行分析，筛选出缓冲液pH、缓冲液离子强度、料液比和萃取时间参数，通过JMP软件，运用Box-Bhnken中心组合模型，按照随机排序，设计四因素三水平试验，共计27组，以青桐种子蛋白质得率为响应值(Y/％)，缓冲液pH(X1)、缓冲液离子强度(X2)、料液比(X3)和萃取时间(X4)为试验因素进行试验，来确定青桐种子蛋白萃取的最佳参数条件。
表1缓冲液萃取中心组合设计因素与水平编码表
Figure BDA0003179172730000101
(36)数据处理及统计学分析
将单因素试验的不同数据进行初步整合和处理，再采用Origin 8.5绘图软件进行绘制和图像采集；该试验的中心组合设计，进行方差分析，并比较F值得大小，来观察各个单因素以及之间的交互作用是否具有显著性，并确保试验的置信区间在95％以上。
(4)膜过滤处理对提取蛋白的抗氧化活性影响
将提取液先使用普通滤纸过滤出大部分残渣，再利用抽气过滤装置来清除剩余固体，最后分别用3kDa和30kDa的醋酸纤维膜利用扫流过滤系统进行过滤，获得青桐萌芽种子蛋白的两种分子量蛋白组分。
结论：
(1)缓冲液pH对青桐萌芽种子蛋白得率的影响
在萃取条件为缓冲液的离子强度为60mM、料液比1:8和萃取时间15min，不同pH对青桐种子萌发期蛋白得率的影响结果如图1所示：当溶液pH在8.0-9.0之间时，因为碱性条件下蛋白质发生酸式解离，使其本身带相同的负电荷而相互排斥，增加其在水溶液中的分散性，同时对蛋白质的次级键氢键有一定的破坏作用，对蛋白质有一定的增溶作用。而溶液pH在9.0时，溶液中某些蛋白质的等电点在其附近，使得蛋白质所带电荷为零，蛋白分子间的静电排斥作用消失而相互聚集沉淀。因此，确定最佳萃取缓冲液pH为9.0。
(2)离子强度对青桐萌芽种子蛋白得率的影响
在萃取条件为缓冲液的pH 9.5、料液比1:8和萃取时间15min，不同离子强度的缓冲液对青桐萌芽种子蛋白得率的影响如图2所示：当离子强度在20到80mM中，青桐萌芽种子蛋白得率随溶液浓度的增加而略微升高，且在缓冲液离子强度为80mM时，达到最大值；当溶液浓度超过80mM后，萌芽种子的蛋白得率逐渐下降。因此，最终确定最佳萃取缓冲液离子强度为80mM。
(3)料液比对青桐萌芽种子蛋白得率的影响
在萃取条件为缓冲液的pH 9.5、离子强度为60mM和萃取时间15min，不同的料液比对青桐萌芽种子蛋白得率的影响，由图3可知。料液比在1:4到1:12中，青桐萌芽种子蛋白得率呈现出剧烈上升的趋势，并且在料液比为1:10时，蛋白得率效果最好；当料液比超过1:10后，随料液比的增加，青桐萌芽种子蛋白得率呈现出下降的趋势。由于在料液比较低时，溶液黏度较大，影响分子扩散速度，而当料液比过大时，分子扩散速度几乎不会发生明显变化。故将1:10定为最佳的料液比。
(4)萃取时间对青桐萌芽种子蛋白得率的影响
在萃取条件为缓冲液的pH 9.5、离子强度为60mM和料液比为1:8，萃取时间对青桐萌芽种子蛋白得率的影响，如图4所示：在5min到20min，萌芽蛋白得率随时间的延长而增加，在20min时效果最好，20min后出现较小的逆转趋势，萌芽蛋白得率略微下降。因此，将缓冲液法萃取蛋白的最佳时间定为20min。
(5)缓冲液对青桐萌芽种子蛋白的回归模型建立与分析
对单因素试验结果进行综合性比较，参考响应曲面的中心组合设计对响应面的试验设计进行优化，从而得到响应面的优化设计方案。
使用统计分析SAS 13.1.0软件，对表2试验数据建立二次回归模型，得到四因素三水平的二次多元回归拟合方程为：
Y(％)＝427.74204-62.88527X1-1.398554X2-11.26609X3-2.416013X4+0.064422X1X2+0.387995X1X3+0.05794X2X3-0.012949X1X4-0.005015X2X4+0.141497X3X4+3.107744X1 2-0.0022801X2 2+0.035916X3 2+0.040447X4 2
表2青桐种子蛋白缓冲液萃取产量中心组成设计、反应值与预测值(g/100g)(n＝4).
Figure BDA0003179172730000121
Figure BDA0003179172730000131
X1:缓冲液pH；X2:缓冲液离子强度，Ionic strength of buffer/(mM)；X3:萃取时间Extraction time/h；
X4:料液比，Soild-liquid ratio(g/mL).RP:还原力，reducing power.FICP:亚铁离子螯合能力，ferrous ion chelating power
采用Box-Behnken中心组合模型，设计出四因素三水平的响应面分析试验，进行随机排序，以萌芽种子蛋白得率为响应值。该试验有27个试验点，其中析因点有24个，零点(水平的中心点)有3个，零点试验重复3次，用来估计试验误差。
将统计分析SAS 13.1.0软件中二次回归模型得出的预测值与试验测得的实际值进行比较，得出结论，从图5中可以得出二者具有较好的拟合程度。
表3回归方程的方差分析结果
Figure BDA0003179172730000141
注：P<0.001，代表极显著“***”；P<0.01，代表较显著“**”；P<0.05，代表显著“*”，P>0.05，代表不显著。
回归方程的方差分析结果见表3。回归模型中因变量与所考察自变量之间具有显著的线性关系(R2＝0.95)，模型调整确定系数Adj R2＝0.8809，说明该模型能解释88.09％响应值变化，拟合程度高，失拟项不显著(P>0.05)，能很好的对响应值进行预测。响应曲面的中心组合设计的F值为14.7296，P值小于0.0001，以此得知该试验模型可信度相当大。模型误差失拟项表示模型预测与实际值不拟合的概率，此失拟项中P值(P＝0.0328)小于0.05，回归方程与试验的拟合度很高，可靠性很强。因此所建立的二项回归模型成立，试验所得萃取蛋白质的工艺参数，对青桐种子蛋白质的萃取效果可以得到较好的分析与预测。
表4回归模型系数的显著性检验.
Figure BDA0003179172730000142
Figure BDA0003179172730000151
对模型进行回归方程系数显著性检验分析，由表4可知，用各因素F值可评价该因素对试验指标的影响，F值越大，该因素影响越显著。一次项，X1(缓冲液pH)极显著，X3(缓冲液料液比)较显著，X2(缓冲液离子强度)、X4(萃取时间)不显著；交互作用项X1*X3、X1*X4、X2*X4都不显著；平方项X1 2为极显著，X2 2、X4 2为显著，X3 2影响不显著。其中，F(X1)＝47.7318，F(X2)＝3.5538，F(X3)＝9.5641，F(X4)＝3.4682，因此，各因素对青桐种子蛋白得率的影响程度大小为缓冲液pH(X1)>缓冲液料液比(X3)>缓冲液离子强度(X2)>萃取时间(X4)。
根据方差分析结果，将不显著项去除，来简化该试验的回归方程：
Y(％)＝427.74204-62.88527X1-11.26609X3+0.064422X1X2+0.05794X2X3+0.141497X3X4+3.107744X1 2-0.0022801X2 2+0.040447X4 2
(6)缓冲液法萃取萌芽种子蛋白得率的响应面分析
响应面图形能较直观地反映出各因素对响应值的影响，较陡峭的曲面坡度对蛋白质得率影响较大。较平缓的响应曲面，说明对蛋白质得率影响较小。等高线图的形状表明变量间的交互作用是否显著，椭圆等高线表明变量间的交互作用显著，圆形等高线表明交互作用不显著。
从图6-11可以看出，X1(缓冲液pH)对蛋白质萃取率的影响最显著，表现出曲面相对较陡的图像，X3(料液比)次之，X4(萃取时间)最小；并且X2(缓冲液离子强度)和X3(料液比)交互作用相对最大，表现出等高线图最扁平的图像，X3(料液比)和X4(萃取时间)相互作用次之，X1(缓冲液pH)和X4(萃取时间)交互作用最小，与该回归模型的方差分析结果一致。
在考察的因素范围内，青桐种子萌发期间蛋白质的得率随缓冲液pH增加而先增加后趋于平缓；随缓冲液离子强度增大，蛋白质萃取率呈现缓慢上升的趋势；随时间增加蛋白质得率出现缓慢上升的现象；随料液比增加，蛋白质得率呈现先缓慢增加后缓慢减小的趋势。
(7)缓冲液法萃取萌芽种子蛋白最佳萃取条件及验证
对该试验的各因素范围进行筛选，通过SAS 13.1.0软件分析得出，最佳种子蛋白的萃取条件为：缓冲液pH 9.26，缓冲液离子强度78.78mM，料液比1:9.18，萃取时间为17.38min，蛋白质得率的预测值为16.81％。按照试验操作的可行性，将最佳条件调整为缓冲液pH 9.3，缓冲液离子强度78mM，料液比1:9，萃取时间17min。为检验响应面分析方法的可靠性，采用上述优化参数进行三次验证试验，实际测得提取率为15.53％，与理论预测值的相对误差为0.32％。因此，说明本试验得到的模型回归方程和试验结果可靠。
(8)缓冲液法萃取萌芽种子蛋白抗氧化活性分析
通过对试验数据的分析可以看出，缓冲液萃取萌芽种子蛋白DPPH自由基清除率范围为8.85-18.28％，缓冲液萃取萌芽种子蛋白还原力值范围为0.3446-0.8086，缓冲液萃取萌芽种子蛋白亚铁离子螯合能力值范围为47.97-99.03％。
总结：
(1)试验利用缓冲液法萃取青桐萌芽种子蛋白，通过完整的单因素试验和中心组合设计及响应面分析得出以下结论：
以蛋白得率为响应值，其回归模型为：
Y(％)＝427.74204-62.88527X1-11.26609X3+0.064422X1X2+0.05794X2X3+0.141497X3X4+3.107744X1 2-0.0022801X2 2+0.040447X4 2
影响蛋白质得率四个因素的主次顺序为：缓冲液pH(X1)>缓冲液料液比(X3)>缓冲液离子强度(X2)>萃取时间(X4)，并且最佳的萃取条件为：缓冲液pH9.26，缓冲液离子强度78.78mM，料液比1:9.18，萃取时间为17.38min，蛋白质得率的预测值为16.81％。按照试验操作的可行性，将最佳条件调整为缓冲液pH 9.3，缓冲液离子强度78mM，料液比1:9，萃取时间17min。
(2)缓冲液萃取萌芽种子蛋白DPPH自由基清除率范围为8.85～18.28％，缓冲液萃取萌芽种子蛋白还原力值范围为0.3446～0.8086，缓冲液萃取萌芽种子蛋白亚铁离子螯合能力值范围为47.97～99.03％。
(3)将青桐萌芽种子蛋白分别用3kDa和30kDa醋酸纤维膜过滤，对数据分析可知，用3kDa醋酸纤维膜过滤后提高了青桐萌芽种子蛋白的抗氧化活性，与未过滤前相比，DPPH自由基清除率增加21.85％，还原力增加6.35％，亚铁离子螯合能力增加4.48％，而30kDa醋酸纤维膜过滤后与未过滤的抗氧化活性略微下降。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.响应面法优化青桐萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：种子萌发；
S2：蛋白含量和抗氧化活性测定；
S3：响应面法优化萌芽种子蛋白最佳萃取试验；
S4：膜过滤处理对提取蛋白的抗氧化活性影响。
2.根据权利要求1所述的响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下步骤：
S11：将采收的青桐种子进行筛选，挑选同株、产量较大且颗粒饱满的青桐种子2900-3100颗；
S12：将上述青桐种子分装在6个烧杯(1L)，用水浴锅加热(恒温40℃)，浸泡24h，每隔4h换1次水，并用玻璃棒不断搅拌，使种子受热均匀；
S13：将准备好的花盆底盘，铺上4-5层纱布，上面覆盖3-4层纱布，将水浴好的种子均匀铺展放入花盘中(保证密度适中、平铺均匀)；
S14：将所述纱布浸湿，花盘底部保持湿润、无积水，放入人工气候培养箱，温度设置为30℃，保证每天在8点、16点和23点各浇水一次(将纱布润湿，保持湿度一致)；
S15：在时间段0-7天内，每天18点取样，称取0.3g的鲜样，加液氮研磨，并分别用50mMpH 7.4Tris-HCl溶液和0.2M pH 6.6磷酸缓冲液，各吸取3mL将其加入5mL的EP离心管中，在4℃条件下，以12000rpm转速，离心10min后，吸取上清液，将其存放到-80℃超低温冰箱中，保存备用。
3.根据权利要求1所述的响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：
S21：通过凯氏定氮法对青桐萌芽种子总蛋白质含量进行测定，选用考马斯亮蓝G-250比色法测定萃取液蛋白质浓度；其中，计算蛋白质得率的公式：
蛋白质得率/％(Y)＝[萃取液蛋白质质量(mg)/种子质量(mg)]×100％
用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白，吸取稀释15倍后的蛋白原液50μL，放入到试管中(3个重复)，而所有试管均加入2.5mL的考马斯亮蓝，加入原液后用混均器，充分震荡，将其混合均匀，在室温下，静置3min后，用756s分光光度计，依据牛血清蛋白制作的标准曲线，以波长595nm，进行光度值的测定。
S22：DPPH自由基清除能力测定；
S23：还原力测定；
S24：亚铁离子螯合能力测定。
4.根据权利要求1所述的响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，其特征在于，所述步骤S3包括如下子步骤：
S31：缓冲液pH对萌芽种子蛋白得率的影响；
S32：缓冲液离子强度对萌芽种子蛋白得率的影响；
S33：萃取时间对萌芽种子蛋白得率的影响；
S34：料液比对萌芽种子蛋白得率的影响；
S35：响应面法优化萌芽种子蛋白最佳萃取试验。
5.根据权利要求4所述的响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，其特征在于，所述步骤S31具体包括：
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，分别加8mL 60mM设定pH 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和10.5冰浴的缓冲液，在室温条件下，置于冰块上不停搅拌15min。萃取结束后，在4℃条件下，以12000rpm的转速，离心10min，吸取上清液，保存备用。
6.根据权利要求4所述的响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，其特征在于，所述步骤S32具体包括：
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，分别加入8mL pH 9.0的20、40、60、80和100mM冰浴的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，在室温条件下，置于冰块上不停搅拌15min。萃取结束后，在4℃条件下，以12000rpm的转速，离心10min，吸取澄清液，放入4℃的冰箱中，随时取用。
7.根据权利要求4所述的响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，其特征在于，所述步骤S33具体包括：
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，分别加8mL 60mM pH 9.0冰浴的Na2CO3-NaHCO3溶液，萃取时间设定5、10、15、20和25min，室温条件下，置于冰块上分别不停搅拌5、10、15、20和25min；搅拌时间到后，放入离心机，离心温度为4℃，以12000rpm的转速，离心10min，转移上清液，4℃条件下保存，以备取用。
8.根据权利要求4所述的响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，其特征在于，所述步骤S34具体包括：
称取萌发第5天的青桐种子0.4g的鲜样，放入冰浴的研钵中，迅速倒入约10mL的液氮，并快速研磨，按照料液比1:4、1:6、1:8、1:10、1:12(g/mL)，分别加入4、6、8、10、12mL 60mMpH 9.0冰浴的Na2CO3-NaHCO3溶液，在室温条件下，置于冰块上不停搅拌15min；萃取结束后，在4℃条件下，以12000rpm的转速，离心10min，吸取上清液，保存备用。
9.根据权利要求4所述的响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，其特征在于，所述步骤S35具体包括：
对单因素试验结果进行分析，筛选出缓冲液pH、缓冲液离子强度、料液比和萃取时间参数，通过JMP软件，运用Box-Bhnken中心组合模型，按照随机排序，设计四因素三水平试验，共计27组，以青桐种子蛋白得率为响应值(Y/％)，缓冲液pH(X1)、缓冲液离子强度(X2)、料液比(X3)和萃取时间(X4)为试验因素进行试验，来确定青桐萌芽种子蛋白质萃取的最佳参数条件。
10.根据权利要求1所述的响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括：
利用缓冲液提取青桐萌芽种子蛋白的试验方法，对获得青桐萌芽蛋白液进行抗氧化活性检测，测定其DPPH自由基清除能力、还原力和亚铁离子螯合能力后，通过醋酸纤维膜过滤来对比过滤前后青桐萌芽种子蛋白抗氧化活性的差异。试验利用响应面分析得出的缓冲液提取青桐萌芽种子蛋白最佳提取工艺参数进行蛋白提取，测定获得的青桐蛋白液的抗氧化活性。
CN202110841687.1A 2021-07-26 2021-07-26 响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法 Active CN113466470B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110841687.1A CN113466470B (zh) 2021-07-26 2021-07-26 响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110841687.1A CN113466470B (zh) 2021-07-26 2021-07-26 响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113466470A true CN113466470A (zh) 2021-10-01
CN113466470B CN113466470B (zh) 2023-07-25

Family

ID=77882339

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110841687.1A Active CN113466470B (zh) 2021-07-26 2021-07-26 响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113466470B (zh)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050160488A1 (en) * 2000-11-07 2005-07-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Grain quality through altered expression of seed proteins
CN101164622A (zh) * 2006-10-18 2008-04-23 浙江我武生物科技有限公司 植物种子蛋白提取物及应用
CN101933960A (zh) * 2010-09-15 2011-01-05 四川农业大学 一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法
CN102311867A (zh) * 2011-08-18 2012-01-11 新疆大学 一种水酶法-冻融耦合技术提取油莎豆油的方法
CN106105586A (zh) * 2016-06-23 2016-11-16 四川省中医药科学院 一种超低温贮藏白芷种子的方法
CN107085078A (zh) * 2017-05-11 2017-08-22 四川农业大学 小型集水区复合生态系统对重金属储滤效应的方法
CN108484751A (zh) * 2018-04-19 2018-09-04 西南大学 川陈皮素抗原及其制备方法与应用
GB201912780D0 (en) * 2019-09-05 2019-10-23 Maatschap De Milliano Meijer Plants
CN110710592A (zh) * 2019-11-16 2020-01-21 四川农业大学 一种提高核桃饼粕蛋白的抗氧化活性方法
WO2021030672A1 (en) * 2019-08-14 2021-02-18 The University Of Massachusetts Cell culture methods

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050160488A1 (en) * 2000-11-07 2005-07-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Grain quality through altered expression of seed proteins
CN101164622A (zh) * 2006-10-18 2008-04-23 浙江我武生物科技有限公司 植物种子蛋白提取物及应用
CN101933960A (zh) * 2010-09-15 2011-01-05 四川农业大学 一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法
CN102311867A (zh) * 2011-08-18 2012-01-11 新疆大学 一种水酶法-冻融耦合技术提取油莎豆油的方法
CN106105586A (zh) * 2016-06-23 2016-11-16 四川省中医药科学院 一种超低温贮藏白芷种子的方法
CN107085078A (zh) * 2017-05-11 2017-08-22 四川农业大学 小型集水区复合生态系统对重金属储滤效应的方法
CN108484751A (zh) * 2018-04-19 2018-09-04 西南大学 川陈皮素抗原及其制备方法与应用
WO2021030672A1 (en) * 2019-08-14 2021-02-18 The University Of Massachusetts Cell culture methods
GB201912780D0 (en) * 2019-09-05 2019-10-23 Maatschap De Milliano Meijer Plants
CN110710592A (zh) * 2019-11-16 2020-01-21 四川农业大学 一种提高核桃饼粕蛋白的抗氧化活性方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
姜福星: "探析植物体胚发生的关键基因" *
张清: "葵种子蛋白提取工艺优化及其抑菌和抗氧化特性分析" *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113466470B (zh) 2023-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104120160B (zh) 一种小球藻抗氧化肽的制备方法
CN108822230B (zh) 一种超声提取刺梨果渣的多糖
CN101326981B (zh) 双蛋白多肽豆浆粉固体饮料的制备方法
CN104472851B (zh) 一种酶法处理富硒大米生产富硒蛋白粉的方法
CN101255391B (zh) 一种新鲜天麻发酵酒的制作方法
CN109303922A (zh) 一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物及其制备方法与在降糖药物中的应用
CN103734836B (zh) 一种发芽黑苦荞麦山楂果醋饮料的制备方法
CN104137733A (zh) 一种富硒杏鲍菇的栽培及成份检测方法
CN102703408A (zh) 从香蕉皮中提取谷氨酸脱羧酶及生产γ-氨基丁酸的方法
CN110257308A (zh) 一种富有机硒葛仙米的培养方法
CN112574276A (zh) 一种菜籽蛋白的提取工艺
CN113466470A (zh) 响应面法优化萌芽种子蛋白最佳缓冲液萃取试验方法
CN110218755A (zh) 一种降血糖的牡丹活性肽的制备方法
CN109722341A (zh) 一种金花葵烟用香料的制备方法和应用
CN113229507A (zh) 一种复配膳食纤维及其制备方法
CN109956811A (zh) 一种氧化石墨烯液体肥料及其制备方法
CN102283377A (zh) 清除人体羟自由基的活性肽水解液的制法及活性肽口服液
CN113698981A (zh) 一种改性林蛙油的生产方法
CN106399219A (zh) 利用水稻叶片提取液培养提高蛋白核小球藻产量的方法
JPS5929221B2 (ja) マイタケエキスを主成分とする健康飲料の製造法
CN107594249B (zh) 一种鹰嘴豆饮料的制备方法
CN116849304B (zh) 促进反刍家畜消化代谢的叶用枸杞配合饲料及其制备方法
TWI750817B (zh) 銀耳組合物之製備方法及銀耳組合物
Sullivan THE ORIGIN OF CREATININE IN SOILS.
CN110746231A (zh) 一种蔬菜作物种植用含硒肥料及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant