CN101445827A

CN101445827A - 鉴别川牛膝道地药材的核苷酸序列和方法

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Publication number: CN101445827A
Application number: CNA2008101480918A
Authority: CN
Inventors: 田孟良; 徐攀辉; 袁继超; 范巧佳; 郑顺林; 唐莉; 刘天成; 王巧; 胡丹; 胡莹莹
Original assignee: YAAN SANJIU CHINESE HERBS TECHNOLOGY INDUSTRY CO LTD
Current assignee: YAAN SANJIU CHINESE HERBS TECHNOLOGY INDUSTRY CO LTD
Priority date: 2008-12-29
Filing date: 2008-12-29
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2028-12-29
Also published as: CN101445827B

Abstract

本发明公开了一种鉴别川牛膝道地药材的核苷酸序列，该序列为来源于正品川牛膝(白牛膝)的rDNA ITS序列，可用于对照鉴别川牛膝道地药材；通过从DNA水平上分析川牛膝种质资源的遗传特征，为区分正品川牛膝、混杂川牛膝和怀牛膝等提供了有效的分子标记，为川牛膝道地药材的品种真伪鉴定和质量优劣鉴定、及筛选优良品种等奠定了良好的基础。同时，本发明提供了一种利用上述核苷酸序列鉴别川牛膝道地药材的方法，该方法操作简单易行，可达到方便、快速、客观、准确区分川牛膝道地药材与其它牛膝类药材等目的。

Description

鉴别川牛膝道地药材的核苷酸序列和方法

技术领域

本发明属于中药材种质资源的鉴定技术领域，特别涉及一种鉴别川牛膝道地药材的核苷酸序列和方法。

背景技术

川牛膝为苋科(Amaranthaceae)杯苋属(CyathulaBlume)植物，别名甜膝，为多年生草本植物；为著名的川产地道中药材，极常用且是重要的出口品种。1977年以后各版《中国药典》确定川牛膝植物来源为C.officinalis Kuan.(即白牛膝)。川牛膝的主要成分为生物碱和甾醇类物质，如杯苋甾酮(cyastelone)、头花蒽草甾酮、促脱皮甾酮、红甾酮等，另外还有阿魏酸；现代研究还从川牛膝根中提取出一种生物活性多糖——牛膝多糖(Achyranthesbidentata Polysaec-charzdesABP)。川牛膝的主要药理作用有活血通经、祛风湿、通利关节、利尿通淋以及对治疗高血压性心脏病和痛经作用等。

川牛膝主要分布于四川、云南和贵州，野生或栽培，生长于海拔1500米以上的地区，以四川雅安的天全、宝兴、汉源和乐山地区的金口河区产量最大，资源十分丰富。其中，又以天全川牛膝最为有名。

平时医药方面在使用川牛膝时经常与怀牛膝相混淆。唐代以前古籍本草中没有川牛膝和怀牛膝之分，总称为牛膝。怀牛膝(A.bidentata BL.)属于苋科(Amaranthaceae)牛膝属(Achyranthes L)，为苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata BL.)的根。主产于河南，在我国北方较流行。除怀牛膝外与川牛膝易混淆的还有土牛膝、麻牛膝、牛蒡根等。牛膝为怀牛膝的正名，川牛膝的异名，土牛膝的植物名。

在天全川牛膝的栽培中，民间将川牛膝Cyathula officinalis(习称“白牛膝”)和头花杯苋Cyathula capitata(习称“红牛膝”)两个品种统称为川牛膝，均混作川牛膝栽种和使用。同时由于白牛膝和红牛膝长期混种，造成了这两种植物的杂交，近年来道地产区出现了杂交品种，其新鲜的根和芦头的表皮均呈红色，且杂交化程度不同根的红色深浅也不相同，该类型品种产量高，根条粗短，易折段，断面菊花心不明显，味麻，常常被误用做川牛膝。每年有大量的红牛膝和杂交牛膝作为川牛膝流入市场，造成川牛膝药用品质下降，产业前景堪忧。

近年来，国内外对川牛膝的需求量日益增大，而作为道地产地川牛膝品种杂交退化，致使品质下降。川牛膝种源质量已成为川牛膝产业发展的瓶颈。有研究表明不同种群川牛膝在形态特征、内在质量、产量及抗病性等方面都有较大差异。目前在川牛膝遗传分化和遗传多样性研究方面，除采用形态及解剖学、细胞学、花粉学和植物化学等目前主要研究方法外，在分子水平上系统地对川牛膝种群间的遗传背景、亲缘关系的研究报道较少。

20世纪80年代以来，分子生物学技术的快速发展为遗传多样性检测提供了更直接、更精确的方法，即直接检测DNA本身的序列变化。由于避免了根据表型性来推断基因型时可能产生的各种问题，DNA分析方法成为目前为止最有效的遗传分析方法。ITS序列是中度重复序列，广泛分布于基因组并且是同步进化的，它的碱基序列同源性的程度决定生物之间的亲源关系远近，并以此作为分类依据来划分物种。

发明内容

本发明的主要目的是针对目前存在的川牛膝品种问题，提供一种鉴别川牛膝道地药材的核苷酸序列，从DNA水平上分析川牛膝种质资源的遗传特征，为区分正品川牛膝、混杂川牛膝和怀牛膝提供有效的分子标记，为川牛膝道地药材的品种真伪鉴定和质量优劣鉴定、及筛选优良品种等奠定基础。

本发明还提供了一种利用上述核苷酸序列鉴别川牛膝道地药材的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

鉴别川牛膝道地药材的核苷酸序列，该序列为来源于正品川牛膝(白牛膝)的rDNA ITS序列，具体如SEQ ID NO.1所述。

利用上述核苷酸序列鉴别川牛膝道地药材的方法，收集新鲜健康的样品材料，按照下述主要步骤进行品种鉴定工作：

(1)、总DNA提取：

收集新鲜健康的川牛膝等样品的幼嫩叶片，采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取总DNA。

改良CTAB法提取总DNA是现有技术中DNA提取的常用方法，多有报道；在本发明中的具体方法可按如下步骤操作：

①取样、研磨：

称取2～3g的无病健康植物幼嫩叶片，剪碎后放入研钵中，倒入液氮速冻，迅速将叶片研磨成粉末；

②水浴温浴：

在化冻之前将叶片粉末转入1.5mL离心管中，加入650μL经65℃水浴预热的2％CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，PH 8.0，10mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，2％ CTAB，2％ PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，2％ β-疏基乙醇v/v)，混匀(可猛摇几下，使叶片粉末在缓冲液中散开)；

将盛有叶片粉末混合物的1.5mL离心管在65℃水浴下温浴1～2h，其间每隔10分钟轻轻倒转混匀，每次持续1min左右，温浴结束后，取出离心管冷却至室温；

③离心、抽提：

在冷却至室温的离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1，体积比，下同)溶液，不停地倒转混匀10～15min，获得乳浊液，6000rpm离心15min，取上清液；对上清液重复抽提1次；

④沉淀DNA：

取上清夜转入新的1.5mL离心管中，加入0.7倍或等体积的预冷的异丙醇，轻轻倒转混匀，于-20℃冷冻沉淀DNA；

⑤清洗DNA：

挑出DNA，加入2mL 75％乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，加入2mL无水乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，晾干后加入200μL TE缓冲液溶解；

⑥除去RNA：

加入5μL RNA酶(10μg/μL)，37℃温育1h；加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，12000rpm离心10min，取上清液，对上清液重复抽提1次，取上清液；

⑦纯化DNA：

加入相当于上清液1/10体积NaAc(3mol/L，PH 5.2)，轻轻摇匀，加入相当于上清液2倍体积的冷冻的无水乙醇，于-20℃冷冻20-30分钟，5000rpm离心5min，加入2mL 75％乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，加入2mL无水乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，晾干至无乙醇气味，即得样品的总DNA；加入200μL TE缓冲液充分溶解DNA，备用。

TE缓冲液是指Tris-EDTA buffer(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.4，pH7.6，pH8.0)，为常用分子生物学试剂，用于DNA的溶解等；可从市场购买。

(2)PCR扩增：

通过大量文献分析及试验研究，设计出本发明中川牛膝ITS的PCR扩增引物正向引物P1、反向引物P2分别如下：

P1：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；

P2：5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上；

以上述(1)步提取的总DNA为模板，进行PCR扩增反应；

ITS的PCR反应体系为，每25μL中含有：Mg²⁺ 25mmol/L 1.7μL，10×Buffer2.5μL，dNTP 0.2mmol/L 0.2mM，模版DNA 50ng/μL 2ng/μL，Taq酶5U0.25μL，正反引物10pmol/L各1μL；

PCR扩增反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性40s，52℃复性40s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

(3)PCR产物纯化：

可采用常用的PCR产物纯化方法进行纯化；

(4)DNA序列测定：

对纯化后的PCR产物直接测序，确立rDNA ITS区，包括18S、5.8S和26SrDNA区的全序列。

(5)DNA序列数据分析：

运用ClustalX程序对上述测定的rDNA ITS序列进行对位排列，并辅以人工校对，以尽量减少排列所需缺失的数目，比对得到的序列用分析软件MEGAVersion 1.02进行聚类分析；

与前述正品川牛膝的rDNA ITS序列进行比对分析，采用比对后序列进行聚类分析，从而区分其种质资源，达到鉴别川牛膝道地药材的目的；为川牛膝药材的品种鉴定和质量优劣鉴定、及筛选优良品种等奠定良好的基础。

为了使测定结果尽可能准确可靠，每一个样品可从提取总DNA、PCR扩增、产物纯化、到测序、分析等重复进行多次。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的来源于正品川牛膝(白牛膝)的rDNA ITS序列，可用于对照鉴别川牛膝道地药材；通过从DNA水平上分析川牛膝种质资源的遗传特征，为区分正品川牛膝、混杂川牛膝和怀牛膝等提供了有效的分子标记，为川牛膝道地药材的品种真伪鉴定和质量优劣鉴定、以及筛选优良品种等奠定了基础。

同时，本发明提供的利用上述核苷酸序列鉴别川牛膝道地药材的方法，操作简单易行，可达到方便、快速、客观、准确区分川牛膝道地药材与其它牛膝类药材等目的。

附图说明

图1为19个样品材料DNA的PCR扩增产物电泳图谱。

图1中：M为DNA marker DL2000，1、2、3、4、6、8、9、10、11、13是白牛膝样品，7、12、14、15、16、19是红牛膝样品，5是杂交牛膝样品，17、18是怀牛膝样品。

图2为不同材料ITS序列聚类分析结果图。

图2中：1、2、3、4、6、8、9、10、11、13等白牛膝样品聚为一类，7、12、14、15、16、19等红牛膝样品聚为一类，杂交牛膝样品5单独聚为一类，17、18两个怀牛膝样品聚为一类。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例

本实施例测定了来自不同地区的19份川牛膝种质资源(包括10份白牛膝、6份红牛膝、1份杂交牛膝及2份怀牛膝)的核糖体DNA ITS序列，采用的方法包括如下具体步骤：

(1)、总DNA提取：

收集新鲜健康的川牛膝等样品的幼嫩叶片，采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取总DNA，具体方法按如下步骤操作：

①取样、研磨：

称取2g左右的无病健康植物幼嫩叶片，剪碎后放入研钵中，倒入液氮速冻，迅速将叶片研磨成粉末；

②水浴温浴：

在化冻之前将叶片粉末转入1.5mL离心管中，加入650μL经65℃水浴预热的2％ CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，PH 8.0，10mmol/L EDTA，2％ CTAB，2％ PVP，2％ β-疏基乙醇v/v)，混匀(猛摇几下，使叶片粉末在缓冲液中散开)；

③离心、抽提：

在冷却至室温的离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)溶液，不停地倒转混匀10～15min，获得乳浊液，6000rpm离心15min，取上清液；对上清液重复抽提1次；

④沉淀DNA：

⑤清洗DNA：

挑山DNA，加入2mL 75％乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，加入2mL无水乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，晾干后加入适量TE溶解；

⑥除去RNA：

加入5μL RNA酶(10mg/mL＝10μg/μL)，37℃温育1h；加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，12000rpm离心10min，取上清液，对上清液重复抽提1次；

⑦纯化DNA：

加入1/10体积NaAc(3mol/L，PH 5.2)，轻轻摇匀，加入2倍体积冷冻的无水乙醇，于-20℃冷冻20～30分钟，5000rpm离心5min，加入2mL 75％乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，加入2mL无水乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，晾干至无乙醇气味，即得样品的总DNA；加入适量TE缓冲液充分溶解DNA，备用。

取适量的总DNA溶液，用0.8％的加有Goldview的琼脂糖电泳，在凝胶成像系统(Bio-Rad公司)下检测DNA的浓度和降解情况；用核酸-蛋白仪检测DNA的浓度和纯度(结果见下述表1)。将样品稀释为50ng/μl，用于PCR扩增。

表1 总DNA的紫外分析结果

(2)PCR扩增：

通过大量文献分析及试验研究，设计出本发明中川牛膝ITS的PCR扩增引物P1、P2分别如下：

P1：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；

P2：5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上；

由上海英骏生物技术有限公司合成。用ddH₂O配成10pmol/L溶液待用；

以上述(1)步提取的总DNA为模板，进行PCR扩增反应；

ITS的PCR反应体系为，每25μL中含有：Mg²⁺ 25mmol/L 1.7μL，10×Buffer2.5μL，dNTP 0.2mmol/L 0.2mM，模版DNA 50ng/μL 2ng/μL，Taq酶5U 0.25μL，正反引物10pmol/L各1μL；

(3)PCR产物纯化：

用1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，电压为80-100V，时间1小时30分钟左右，用DL2000作Marker.预期结果：出现一条约650bp的清晰条带；

电泳完后，用小刀片把目标片段轻轻切下来(切胶的时候不能在紫外灯下照射太久，防止DNA降解)，放入干净的EP管中；PCR产物纯化参照TIANGEN公司的“小量胶回收试剂盒”说明书进行；具体步骤如下：

①小心切下电泳后琼脂糖凝胶上的DNA目的条带，并称胶重；避免切下多余凝胶；放进干净的1.5ml离心管；

②加入3倍体积的溶胶液PN，50℃水浴锅加热10min；如果胶块没有完全溶解，可适量加入溶胶液PN，直至胶完全溶解；

③加入500ml平衡液(BL)到吸附柱CA2中，12000rpm，离心1min；

④当上述步骤②的溶胶液冷却至室温，加入经上述步骤③处理过的吸附柱CA2中，12000rpm，离心30-60sec；

⑤倒掉废液，加入700ml漂洗液PW(使用前确认已加60ml无水乙醇)，2min后，12000rpm，离心30-60sec；

⑥倒掉废液，加入500ml漂洗液PW，12000rpm，离心30-60sec；倒掉废液，12000rpm，离心2min；

⑦几分钟后，加入一定体积的洗脱缓冲液EB(体积大于30ml)，2min后，12000rpm，离心2min；

⑧为了提高回收的效率，重复步骤⑦；

⑨电泳检测回收的DNA(用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果，回收回来的DNA通过电泳，都应该发现只有一条带)。

对PCR扩增产物进行电泳检测的结果：在500-650bp之间，出现单一条带且条带清晰，表明样品PCR扩增特异性较高，其电泳图谱如图1所示。

(4)DNA序列测定：

PCR产物纯化回收与序列测定均由深圳华大基因科技股份有限公司完成。

(5)DNA序列数据分析：

运用ClustalX程序对上述测定的rDNA ITS序列进行对位排列，并辅以人工校对，以尽量减少排列所需缺失的数目，得到的序列用分析软件MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)Version 1.02进行聚类分析，聚类分析结果如图2所示；

为了使测定结果尽可能准确可靠，每一个样品均从提取总DNA、PCR扩增、产物纯化、到测序、分析等重复进行5次以上，获得结论一致。

所得白牛膝、红牛膝、杂交牛膝和怀牛膝的rDNA ITS序列分别如SEQ IDNO.1～4所述。通过与前述正品川牛膝的rDNA ITS序列进行比对分析和聚类分析，根据序列比对和聚类结果区分不同的种质资源，达到鉴别川牛膝道地药材品种真伪等目的。

本实施例中用到的TE缓冲液(PH8.0)、溶胶液PN、平衡液(BL)、漂洗液PW、缓冲液EB等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

序列表

<110>雅安三九中药材科技产业化有限公司

<120>鉴别川牛膝道地药材的核苷酸序列和方法

<160>4

<210>1

<211>590

<212>DNA

<213>白牛膝(Cyathula officinalis)

<400>1

<210>2

<211>590

<212>DNA

<213>红牛膝(Cyathula capitata)

<400>2

<210>3

<211>590

<212>DNA

<213>杂交牛膝(Cyathula)

<400>3

<210>4

<211>586

<212>DNA

<213>怀牛膝(Achyranthes Bidentata)

<400>4

Claims

1.鉴别川牛膝道地药材的核苷酸序列，该序列为来源于白牛膝的rDNA ITS序列，具体序列如下：

tcgaaacctg cctagcagaa tgaccagcga acatgtttgt accatggatt gggagggggt

gctggattgc ccagtccctc cctaatgccg aggggtaccc ccttgtttgg gggtgctgct

tggcacaaca acgaaccccg gcgtgttaag cgccaaggaa catacacaag agtgtgctta

ttttctgctc ggattttccg cgtatggatg tttgcaccca atataagtca ttaaatgact

ctcggcaacg gatatctcgg ctctcgcatc gatgaagaac gtagcgaaat gcgatacttg

gtgtgaattg cagaatcccg tgaaccatcg agtttttgaa cgcaagttgc gcctgaagcc

ttttggccaa ggcacgtctg cctgggcgtc acgcatagcg tctttcctca ccccaagtgt

gtggtgggga aaggatgatg gcctcccata tctcaccggg tgtggatggc ttaaataagg

agccttgggt tgcaagatgc cgcggcgatt ggtggtggta taatacatgg ccttaccttg

cgtcgtgcat catgtagccc tggtgggctc gtaggaccct tgaaaacctt。

2.利用权利要求1所述的核苷酸序列鉴别川牛膝道地药材的方法，其特征在于：收集新鲜健康的样品材料，按照下述主要步骤进行品种鉴定工作：

(1)、总DNA提取：

收集新鲜健康样品的幼嫩叶片，采用改良CTAB法提取总DNA；

(2)PCR扩增：

利用下列引物：

P1：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；

P2：5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上；

以上述(1)步提取的总DNA为模板，进行PCR扩增反应；

(3)PCR产物纯化；

(4)DNA序列测定：

以上述(3)步纯化后的PCR产物直接测序，确立rDNA ITS区，包括18S、5.8S和26S rDNA区的全序列；

(5)DNA序列数据分析：

运用ClustalX程序对上述测定的rDNA ITS序列进行对位排列，并辅以人工校对，比对得到的序列用分析软件MEGA Version1.02进行聚类分析，根据序列比对和聚类分析结果鉴定川牛膝道地药材。

3.根据权利要求2所述的鉴别川牛膝道地药材的方法，其特征在于：所述的步骤(1)的改良CTAB法包括如下具体步骤：

①取样、研磨：

②水浴温浴：

在化冻之前将叶片粉末转入1.5mL离心管中，加入650μL经65℃水浴预热的2％ CTAB提取缓冲液，混匀；

将盛有叶片粉末混合物的1.5mL离心管在65℃水浴下温浴1～2h，其间每隔10分钟轻轻倒转混匀，温浴结束后，取出离心管冷却至室温；

③离心、抽提：

在冷却至室温的离心管中加入等体积的体积比为24:1的氯仿-异戊醇溶液，不停地倒转混匀，获得乳浊液，6000rpm离心15min，取上清液；对上清液重复离心、抽提1次，取上清液；

④沉淀DNA：

⑤清洗DNA：

挑出DNA，加入2mL75％乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，加入2mL无水乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，晾干后加入200μL TE缓冲液溶解；

⑥除去RNA：

加入5μL浓度为10μg/μL的RNA酶，37℃温育1h；加入等体积的体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇，12000rpm离心10min，取上清液；对上清液重复抽提1次，取上清液；

⑦纯化DNA：

加入相当于上清液体积1/10的NaAc，NaAc浓度为3mol/L，PH＝5.2，轻轻摇匀，加入相当于上清液2倍体积的冷冻的无水乙醇，于-20℃冷冻20～30分钟，5000rpm离心5min，倒掉溶液，加入2mL75％乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，加入2mL无水乙醇清洗，5000rpm离心5min，倒掉溶液，晾干至无乙醇气味，即得样品材料的总DNA；加入200μL TE缓冲液充分溶解DNA，备用。

4.根据权利要求2所述的鉴别川牛膝道地药材的方法，其特征在于：所述的(2)步PCR扩增的反应体系中，每25μL中含有：

Mg²⁺25mmol/L1.7μL，10×Buffer2.5μL，dNTP0.2mmol/L0.2mM，模版DNA50ng/μL2ng/μL，Taq酶5U0.25μL，正反引物10pmol/L各1μL。

5.根据权利要求2所述的鉴别川牛膝道地药材的方法，其特征在于：所述的(2)步PCR扩增的反应程序为：

95℃预变性4min，95℃变性40s，52℃复性40s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。