CN102952878A - 一种鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的its序列及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的ITS序列及方法。本发明公开了正品玛咖的rDNAITS全序列及利用该序列鉴别真伪玛咖的方法，包括提取总DNA，利用ITS区引物扩增，回收纯化产物，连接载体并筛选阳性克隆，测序，序列比对，玛咖真伪判别。本发明可有效检测真伪玛咖，玛咖粉末中是否掺杂其它可能伪品，如芜菁、萝卜、玉米及土豆等，可靠稳定高效地对正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖进行鉴定。

Description

一种鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的ITS序列及方法

技术领域

本发明属于植物种质资源的鉴定技术领域，特别涉及一种新资源食品植物－玛咖的真伪鉴别核苷酸序列和鉴别方法。

背景技术

玛咖（Lepidium meyenii Walp.）为十字花科独荇菜属一年生草本植物，原产南美洲海拔3500-4500m的安第斯山脉。玛咖具有丰富的营养价值，当地印加人将其作为食物。此外，玛咖还可提高生育能力，被用于解决荒寒高地人畜不育问题。随着人们对玛咖营养价值及药用价值的了解，世界范围内对玛咖的需求也逐渐增多。目前，美国、日本、西班牙、厄瓜多尔、玻利维亚、澳大利亚等已相继进行种植，但未形成规模。我国于2002年开始在云南丽江引种种植，目前已经成为全球最大的玛咖种植基地。

随着科学研究的不断深入，研究者发现玛咖不仅具有提高生育能力的作用，还具有抗疲劳、缓解更年期综合症状、抗前列腺增生、抗氧化、延缓衰老及抗癌等重要功效。1992年联合国粮农组织（FAO）将玛咖作为营养补充剂向世界推荐；2001年美国食品与药品管理局（FDA）批准了玛咖保健药品进入美国。玛咖在国际市场上的需求逐渐增加，在中国市场的销量也不断提高。

巨大的经济利益使得一些不法分子利用与玛咖相似的其他低价材料冒充玛咖。我国独荇菜属植物一共有15种，均没有膨大的根茎，而萝卜属的萝卜和芸薹属的芜菁的根茎在外形及气味上与玛咖具有较高相似性，被用来冒充玛咖干片或参入玛咖粉进行销售。更有不法分子在玛咖粉中参入一定比例的玉米粉或土豆粉以攫取非法利益。这些伪品的出现极大地伤害了消费者的权益。由于玛咖引入我国仅10余年，还未出现对玛咖进行真伪鉴别的有效的公开方法。目前从性状、气味及味道等方面对玛咖干片及玛咖粉进行鉴别难度极大；利用气相、液相及质谱等方法分析玛咖次生代谢产物的鉴别方法，一方面价格昂贵，且次生代谢产物因植株生长阶段、环境影响等不同均会一定程度上影响产品成分含量，这就可能导致出现多重标准等。所以现在急需一种既简便又可靠且经济的方法对正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖进行鉴别。

20世纪80年代以来，分子生物学技术的快速发展使人们认识到直接检测DNA序列，可以从根本上避免由表型性状或成分分析来推断物种或品种时存在的问题。ITS序列是编码核糖体RNA的核DNA序列，作为非编码区，受外界环境因素影响小，承受的选择压力较小，为属以下水平的物种研究提供了便利，具有样品用量少，鉴定精准等优点，目前被广泛应用于药用植物的鉴别。本发明的优势在于，利于ITS序列通用引物对提取的DNA进行扩增，测序比对即可确认玛咖植株、玛咖干片及玛咖粉是否为真正的玛咖，是否掺杂，如掺杂，杂质为何种植物材料。

发明内容

本发明主要目的是针对目前存在的伪品玛咖及掺杂玛咖，提供一种鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的核苷酸序列及方法，将该序列作为从DNA水平上进行玛咖真伪鉴别的DNA商品条形码。

本发明解决其技术问题所用的技术方案是：

利用ITS序列通用引物ITS4和ITS5对丽江产黄、红、黑三种玛咖及秘鲁产玛咖进行ITS区序列扩增测序，结果表明丽江产黄、红、黑三种玛咖及秘鲁产玛咖的ITS序列高度保守，均为权利要求1中所述SEQ ID NO.1。利用上述ITS区序列鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的方法，包括以下步骤：

（1）总DNA的提取；（2）PCR扩增；（3）PCR产物电泳及染色；（4）PCR产物回收纯化；（5）连接T载体；（6）转化大肠杆菌；（7）阳性筛选；（8）测序；（9）序列比对及Blast；（10）真伪玛咖鉴别。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了来源于丽江产不同颜色玛咖及秘鲁产玛咖的rDNA ITS全序列，可用于对照鉴别正品玛咖；通过从DNA水平上分析玛咖及其可能伪品的遗传特征，为区分玛咖产品，如玛咖鲜样、玛咖干样、玛咖干片、纯玛咖粉及其他可进行DNA提取的玛咖产品等提供了有效的分子标记，同时为玛咖产品的真伪鉴别及分析玛咖系统发育地位奠定一定基础。

附图说明

图1为提取玛咖及其伪品芜菁、萝卜、玉米和土豆总DNA后，利用ITS区通用引物扩增得到700bp左右DNA片段。图1中LYM为丽江产黄玛咖，LRM为丽江产红玛咖，LBM为丽江产黑玛咖，PM为秘鲁产玛咖，WJ为芜菁，LB为萝卜，YM为玉米，TD为土豆；

图2为玛咖与芜菁rDNAITS全区比对图，其中序列maca为玛咖，wj为芜菁；

图3为玛咖与萝卜rDNAITS全区比对图，其中序列maca为玛咖，lb为萝卜；

图4为玛咖与玉米rDNAITS全区比对图，其中序列maca为玛咖，ym为玉米；

图5为玛咖与土豆rDNAITS全区比对图，其中序列maca为玛咖，td为土豆；

具体实施方式：

实施例1

本实施例测定了ITS通用引物ITS4和ITS5对丽江产黄、红、黑玛咖，秘鲁产玛咖，丽江产芜菁，市售萝卜、玉米及土豆的rDNA ITS序列的可扩增性，并比对了这8份材料的ITS区全序列，表明玛咖ITS区具有高度保守性，与芜菁、萝卜、玉米及土豆的ITS区有巨大差异，玛咖ITS全序列可作为玛咖的商品条形码以进行正品玛咖与伪品玛咖的判别，采用的方法包括如下具体步骤：

（1）总DNA的提取：取丽江产黄、红、黑玛咖干片，秘鲁产玛咖粉，其伪品芜菁干片，市售萝卜叶片、市售玉米叶片及市售土豆块根，利用Genestar试剂盒提取总DNA，具体方法按如下步骤操作：

①取各样品少许，剪碎后放入预冷的研钵中，倒入液氮速冻，迅速将其磨成粉末，利用预冷的勺子装入预冷的2ml离心管中，秘鲁玛咖粉不需研磨直接提取DNA；

②加入700μL试剂盒中A液，轻微震荡混匀10s，于65℃水浴30min，15min时轻轻摇匀一次；

③加入700μL氯仿:异戊醇(24:1)混合液剧烈震荡10s后，12000rpm离心10min；

④200μL枪头剪去尖头，小心吸取上清转移入1.5mL新离心管中；

⑤加入两倍体积的预冷无水乙醇，缓慢摇匀后置于-20℃冰箱20min；

⑥用枪头挑取絮状DNA样转入装有500mL预冷的70%乙醇的1.5mL离心管中洗涤DNA；

⑦12000rpm离心5min，弃上清，置于37℃温箱挥发剩余乙醇；

⑧根据⑥中絮状DNA大小适量加入50-100μL DNA储存液B溶解；

⑨检测DNA浓度后取少量稀释至20ng/μL作为工作液，剩余部分-80℃保存备用；

（2）PCR扩增：选择ITS通用引物的ITS4和ITS5作为引物进行扩增，引物序列如下：

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

该引物由华大基因合成，用ddH₂O稀释为10μM。以总DNA为模版，按照以下体系和程序进行PCR反应；

PCR反应体系：每25μL含有：100ng DNA模版、2.5μL含Mg²⁺10×Buffer，5nmol 4×dNTP，1.5U Taq酶，正反引物各10pmol，14.7μL ddH2O；

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。

（3）PCR产物电泳及染色：利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，TAE做缓冲液进行电泳检测，固定功率为12W，电泳20min左右，染色剂为Goldview，约4μL/40mL，以赛百盛公司的DNA Marker E为marker，预期结果：出现一条约700bp的清晰条带。

（4）测序：PCR产物送美吉生物公司测序，通过与NCBI数据库比对确定rDNA ITS区，包括18S、5.8S和25S rDNA区的全序列。

（5）序列比对及Blast：利用ClustalX软件对ITS序列进行比对，与SEQ ID NO.1一致为正品玛咖，不一致，利用NCBI的Blast功能确认伪品玛咖为何种植物材料。

（6）经序列比对，丽江产黄、红、黑玛咖及秘鲁产玛咖ITS区完全一致，玛咖伪品经Blast确认为芜菁、萝卜、玉米和土豆。将各玛咖伪品的ITS区全序列与玛咖ITS区进行比对，统计结果如下：

玛咖与芜菁、萝卜、玉米及土豆的rDNA ITS区比对图为附图中2、3、4和5。

实施例2

本实施例利用玛咖ITS全序列鉴别掺入50%土豆粉的玛咖干粉，采用的方法包括如下具体步骤：

（1）总DNA的提取：取混和有50%土豆粉的玛咖干粉2g左右，利用Genstar试剂盒进行总DNA的提取，具体方法按如下步骤操作：

①加入700μL试剂盒中A液，轻微震荡混匀10s，于65℃水浴30min，15min时轻轻摇匀一次；

②加入700μL氯仿:异戊醇（24:1）混合液剧烈震荡10s后，12000rpm离心10min；

③200μL枪头剪去尖头，小心吸取上清转移入1.5mL新离心管中；

④加入两倍体积的预冷无水乙醇，缓慢摇匀后置于-20℃冰箱20min；

⑤用枪头挑取絮状DNA样转入装有500mL预冷的70%乙醇的1.5mL离心管中洗涤DNA；

⑥12000rpm离心5min，弃上清，置于37℃温箱挥发剩余乙醇；

⑦根据⑤中絮状DNA大小适量加入50-100μL DNA储存液B；

⑧检测DNA浓度后取少量稀释至20ng/μL作为工作液，剩余部分-80℃保存备用；

（2）PCR扩增：选择ITS通用引物的ITS4和ITS5作为引物进行扩增，引物序列如下：

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

该引物由华大基因合成，用ddH₂O稀释为10μM。以总DNA为模版，按照以下体系和程序进行PCR反应；

PCR反应体系：每25μL含有：100ng DNA模版、2.5μL含Mg²⁺10×Buffer，5nmol 4×dNTP，1.5U Taq酶，正反引物各10pmol，14.7μL ddH2O；

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。

（3）PCR产物电泳及染色：利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，TAE做缓冲液进行电泳检测，固定功率为12W，电泳20min左右，染色剂为Goldview，约4μL/40mL，以赛百盛公司的DNA Marker E为marker，预期结果：出现一条约700bp的清晰条带。

（4）PCR产物回收纯化：电泳结束后紫外光下迅速查看预期条带，日光灯下可见该条带，用刀片将目的条带切胶后放入干净的EP管中，利用Axygen胶回收试剂盒进行PCR产物回收，具体步骤如下：

①小心切下目的条带，放入干净的1.5mL离心管中；

②加入三倍胶体积的Buffer DE-A，混匀后75℃金属浴使凝胶块完全融化，此时溶液为红色；

③加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。此时溶液变为黄色；

④吸取上述混合液转移到DNA制备管(置于2mL离心管中)，12000rpm离心1min，弃滤液；

⑤将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1,12000rpm离心30s，弃滤液；

⑥将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液，重复一次；

⑦将制备管置回2mL离心管中，12000rpm离心1min；

⑧将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25-30μL去离子水，室温静置1min后12000rpm离心1min洗脱DNA。

（5）连接T载体：质粒载体为pMD18-t，4℃过夜连接。

（6）转化大肠杆菌：感受态为E.coli DH5α，37℃培养12h后随机挑取10个阳性克隆。

（7）利用ITS通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，PCR体系调整为每20μL体系中包括：2.5μL含Mg²⁺10×Buffer，5nmol 4×dNTP，1.5U Taq酶，正反引物各10pmol，13.2μL ddH2O，牙签沾取菌液于体系中，PCR产物电泳后确定真阳性克隆。

（8）测序：送6个阳性样品送美吉生物公司测序，利用ClustalX软件将获得序列与玛咖ITS全序列进行比对，一致为玛咖，不一致的序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)中利用blast功能比对，确认该掺杂物质为土豆。

需要说明的是，按照本发明上述各实施例，本领域技术人员是完全可以实现本发明独立权利要求及从属权利的全部范围，实现过程及方法同上述各实施例；且本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。

以上所述，仅为本发明部分具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的ITS区序列，其特征在于：所述核苷酸序列来源于丽江产黄、红、黑玛咖及秘鲁产玛咖的rDNAITS全序列，如SEQ ID NO.1所示。

2.一种利用权利要求1所述的玛咖ITS区序列鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的方法，包括以下步骤：

（1）总DNA的提取：收集玛咖及其伪品的根或叶片，利用Genstar试剂盒进行总DNA的提取；

（2）PCR扩增：引物采用ITS区通用引物ITS4和ITS5，如下所示：

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

（3）PCR产物电泳及染色：以获得一条约700bp的目的条带为成功；

如仅需鉴别步骤（1）中材料为正品玛咖、伪品玛咖或掺杂玛咖，不需鉴别掺杂玛咖中掺杂为何种植物材料，可直接进行步骤（8）、（9）和（10），若（8）获得结果为单峰，则为正品玛咖或伪品玛咖，进行步骤（9），与权利要求1中所述SEQ ID NO.1一致，则为正品玛咖，不一致为伪品玛咖，利用NCBI中Blast功能比对可确认该伪品玛咖为何种植物材料；若（8）获得结果为套封，则为掺杂玛咖，鉴别掺杂玛咖中掺杂为何种植物材料，需进行以下步骤：

（4）PCR产物回收纯化：利用Axygen胶回收试剂盒进行产物回收纯化；

（5）连接T载体：质粒载体为pMD18-t；

（6）转化大肠杆菌：使用的大肠杆菌为E.coli DH5α；

（7）阳性筛选：利用步骤（2）中引物ITS4/ITS5进行扩增，筛选阳性克隆；

（8）测序；

（9）序列比对及Blast；

（10）真伪玛咖鉴别。

3.根据权利要求2所述的一种鉴别正品玛咖、伪品玛咖或掺杂玛咖的方法，其特征在于步骤（2）中PCR反应体系为：每25μL含有：100ng DNA模版、2.5μL含Mg²⁺10×Buffer，5nmol 4×dNTP，1.5U Taq酶，正反引物各10pmol，14.7μLddH2O；PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。 

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