CN114525355B - 一种鉴定野豌豆属品种真实性的方法及其专用ssr引物组合 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定野豌豆属品种真实性的方法及其专用SSR引物组合。本发明提供的SSR引物组合由5个引物对组成，每个引物对由2条引物序列组成，5个引物对中各个引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10所示。本发明提供的SSR引物组合可用于对野豌豆属品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益。本发明提供的方法具有准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等优点，具有十分广阔的应用前景。

Description

一种鉴定野豌豆属品种真实性的方法及其专用SSR引物组合
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定野豌豆属品种真实性的方法及其专用SSR引物组合。
背景技术
野豌豆属(Vicia L.)是豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionatae)野豌豆族(Viciae)植物中的一个重要类群，该属多为一、二年生或多年生草本，具有很高的饲草、绿肥、中药及观赏利用价值，其中箭筈豌豆、山野豌豆的粗蛋白含量均高于20％，饲用价值可媲美苜蓿。但是，野豌豆属内物种间形态相似度较高、易混淆，传统的形态学分类存在较大的争议，分类系统不完善及物种精准鉴定方法的缺乏已经成为限制本属种质资源收集、鉴定及开发利用的主要因素之一。目前野豌豆属通过国家审定的品种有9个，分别是江淮(光叶紫花苕)、凉山(光叶紫花苕)、公农(广布野豌豆)、兰箭2号(救荒野豌豆)、川北(救荒野豌豆)、兰箭3号(救荒野豌豆)、清水河(救荒野豌豆)、延边(山野豌豆)、333/A(狭叶野豌豆)。
近年来，随着牧草种质资源的发展，牧草育种越来越受到学者重视，培育推广新的牧草品种是我国牧草育种发展的重要方向。现阶段而言，牧草种质资源繁多，不同品种混杂、掺假现象比较严重，这直接影响了种质资源的使用和保护。因此，牧草品种的鉴定至关重要，不仅对新品种的保护与审定，也是区分假劣种子，维护培育者自知识产权的重要手段。
传统的品种鉴定主要是依靠荚果、花、叶及卷须等形态学标记作为分类的依据。虽然形态标记研究简单直观且较经济，但野豌豆属中不同种或品种间的形态特征极为相似，在种间交互难以区分，另外形态性状极易受到环境的影响而发生变化，这给种或品种鉴别带来困难。在分子水平上对种质进行鉴定不受环境和生长阶段的影响，结果稳定，可靠性强。因此，寻求从分子水平真正准确识别野豌豆属植物品种具有现实意义。DNA分子标记的出现和快速发展，有望为野豌豆属植物品种的准确鉴定提供了一种新的技术手段。
简单重复序列(simple sequences repeats，SSR)分子标记具有信息含量高、共显性遗传、数量丰富、分析方法简单、结果重复性好、省事省力省钱等优点。目前SSR标记是种质鉴定方面最灵敏、最可靠的一种分子标记，已成为鉴别品种分子身份证的较理想的分子标记技术。然而银染法由于制胶过程受环境影响较大、垂直电泳加样中易于串样、显影后分离片段无法确定分子量大小，从而会造成不同批次样品数据比对中产生误差，降低了检测的效率及精确性。SSR荧光标记毛细管电泳法是基于DNA测序仪为平台的检测方法，具有高效、自动化等技术优势，检测效率远高于银染法，结果更为精确、灵敏。
发明内容
本发明的目的是鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种。
本发明首先保护鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的引物组合，可为引物组合2或引物组合1；所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A。
所述引物组合2可由引物对VA42、引物对VA100、引物对VA107、引物对VA114和引物对VA118组成。所述引物对VA42由SEQ ID NO:1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:2所示的单链DNA分子组成。所述引物对VA100由SEQ ID NO:3所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:4所示的单链DNA分子组成。所述引物对VA107由SEQ ID NO:5所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:6所示的单链DNA分子组成。所述引物对VA114由SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:8所示的单链DNA分子组成。所述引物对VA118由SEQ ID NO:9所示的单链DNA分子和SEQID NO:10所示的单链DNA分子组成。
所述引物组合1由引物组VA42、引物组VA100、引物组VA107、引物组VA114和引物组VA118组成。所述引物组VA42由所述引物对VA42和荧光标记甲修饰的引物M13组成。所述引物组VA100由所述引物对VA100和荧光标记乙修饰的引物M13组成。所述引物组VA107由所述引物对VA107和荧光标记丙修饰的引物M13组成。所述引物组VA114由所述引物对VA114和荧光标记丁修饰的引物M13组成。所述引物组VA118由所述引物对VA118和荧光标记戊修饰的引物M13组成。
上述任一所述引物M13的核苷酸序列可如SEQ ID NO:1自5’末端起第1-19位所示。
所述荧光标记甲、所述荧光标记乙、所述荧光标记丙、所述荧光标记丁和所述荧光标记戊可以发出相同的荧光，也可以发出不同的荧光。
在本发明的实施例中，所述荧光标记甲、所述荧光标记乙、所述荧光标记丙、所述荧光标记丁和所述荧光标记戊依次为VIC、FAM、ROX、NED和VIC，发出绿色、蓝色、红色、黄色和绿色颜色的光。
本发明还保护用于鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的方法。
本发明所保护的用于鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的方法，具体可为方法一，包括如下步骤：以待测野豌豆的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物对VA42、上述任一所述引物对VA100、上述任一所述引物对VA107、上述任一所述引物对VA114和上述任一所述引物对VA118进行PCR扩增，然后依次按照(标准a1)、(标准a2)、(标准a3)、(标准a4)和/或(标准a5)进行判断：
(标准a1)采用引物对VA42进行PCR扩增：
如果仅得到182bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为凉山；
如果仅得到208bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为兰箭2号、兰箭3号、清水河或333/A；
如果得到112bp和134bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为川北；
如果得到210bp和214bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为延边；
(标准a2)采用引物对VA100进行PCR扩增：
如果仅得到232的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为江淮；
如果仅得到248的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为凉山；
如果仅得到238的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河或333/A；
(标准a3)采用引物对VA107进行PCR扩增：
如果仅得到448bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为江淮、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河或333/A；
如果仅得到252bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为公农；
如果仅得到250bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为延边；
(标准a4)采用引物对VA114进行PCR扩增：
如果仅得到144bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为江淮或333/A；
如果仅得到240bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为为公农或延边；
如果得到144bp和152bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为兰箭2号、川北、兰箭3号或清水河；
(标准a5)采用引物对VA118进行PCR扩增：
如果得到218bp和238bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为江淮或清水河；
如果得到218bp和258bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为兰箭2号；
如果得到218bp和248bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为川北、兰箭3号或333/A；
所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A。
上述方法中，所述PCR扩增产物可通过电泳检测或测序检测。
本发明所保护的用于鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的方法，具体可为方法二，包括如下步骤：以待测野豌豆的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组VA42、上述任一所述引物组VA100、上述任一所述引物组VA107、上述任一所述引物组VA114和上述任一所述引物组VA118进行PCR扩增，之后将PCR扩增产物进行毛细管电泳检测，按照(标准b1)、(标准b2)、(标准b3)、(标准b4)和/或(标准b5)进行判断：
(标准b1)采用引物组VA42进行PCR扩增：
如果得到峰值为182的扩增产物，则野豌豆品种为凉山；
如果得到峰值为208的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号、兰箭3号、清水河或333/A；
如果得到峰值为112和134的扩增产物，则野豌豆品种为川北；
如果得到峰值为210和214的扩增产物，则野豌豆品种为延边；
(标准b2)采用引物组VA100进行PCR扩增：
如果得到峰值为232的扩增产物，则野豌豆品种为江淮；
如果得到峰值为248的扩增产物，则野豌豆品种为凉山；
如果得到峰值为238的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河或333/A；
(标准b3)采用引物组VA107进行PCR扩增：
如果得到峰值为448的扩增产物，则野豌豆品种为江淮、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河或333/A；
如果得到峰值为252的扩增产物，则野豌豆品种为公农；
如果得到峰值为250的扩增产物，则野豌豆品种为延边；
(标准b4)采用引物组VA114进行PCR扩增：
如果得到峰值为144的扩增产物，则野豌豆品种为江淮或333/A；
如果得到峰值为240的扩增产物，则野豌豆品种为公农或延边；
如果得到峰值为144和152的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号、川北、兰箭3号或清水河；
(标准b5)采用引物组VA118进行PCR扩增：
如果得到峰值为218和238的扩增产物，则野豌豆品种为江淮或清水河；
如果得到峰值为218和258的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号；
如果得到峰值为218和248的扩增产物，则野豌豆品种为川北、兰箭3号或333/A；
所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A。
本发明所保护的用于鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的方法，具体可为方法三，包括如下步骤：以待测野豌豆的基因组DNA为模板，分别采用引物对进行PCR扩增；以野豌豆属国审品种的基因组DNA为模板，分别采用引物对进行PCR扩增；所述野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边或333/A；然后按照如下标准进行判断：
C1)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与江淮采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为江淮；
C2)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与凉山采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为凉山；
C3)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与公农采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为公农；
C4)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与兰箭2号采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为兰箭2号；
C5)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与川北采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为川北；
C6)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与兰箭3号采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为兰箭3号；
C7)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与清水河采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为清水河；
C8)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与延边采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为延边；
C9)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与333/A采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为333/A；
所述引物对为上述任一所述引物对VA42、上述任一所述引物对VA100、上述任一所述引物对VA107、上述任一所述引物对VA114或上述任一所述引物对VA118。
上述方法中，所述PCR扩增产物可通过电泳检测或测序检测。
上述任一所述电泳可为琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳的凝胶浓度可为3％-3.5％(v/v)。
本发明还保护一种试剂盒，包括上述任一所述引物组合；所述试剂盒的功能可为鉴定待测野豌豆为9种野豌豆属国审品种中的哪一种；所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法。所述试剂盒的制备方法可包括将上述任一所述引物组合中的各条引物分别单独包装的步骤。
上述任一所述引物组合在鉴定待测野豌豆为9种野豌豆属国审品种中的哪一种中的应用也属于本发明的保护范围；所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边或333/A。
上述任一所述试剂盒在鉴定待测野豌豆为9种野豌豆属国审品种中的哪一种中的应用也属于本发明的保护范围；所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边或333/A。
本发明提供的引物组合(SSR引物组合)可用于对野豌豆属品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益。本发明提供的方法具有准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等优点，具有十分广阔的应用前景。
附图说明
图1为引物组VA42对江淮进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图2为引物组VA42对凉山进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图3为引物组VA42对公农进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图4为引物组VA42对兰箭2号进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图5为引物组VA42对川北进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图6为引物组VA42对兰箭3号进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图7为引物组VA42对清水河进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图8为引物组VA42对延边进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图9为引物组VA42对333/A进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图10为引物组VA100对江淮进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图11为引物组VA100对凉山进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图12为引物组VA100对公农进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图13为引物组VA100对兰箭2号进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图14为引物组VA100对川北进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图15为引物组VA100对兰箭3号进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图16为引物组VA100对清水河进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图17为引物组VA100对延边进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图18为引物组VA100对333/A进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图19为引物组VA107对江淮进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图20为引物组VA107对凉山进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图21为引物组VA107对公农进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图22为引物组VA107对兰箭2号进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图23为引物组VA107对川北进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图24为引物组VA107对兰箭3号进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图25为引物组VA107对清水河进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图26为引物组VA107对延边进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图27为引物组VA107对333/A进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图28为引物组VA114对江淮进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图29为引物组VA114对凉山进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图30为引物组VA114对公农进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图31为引物组VA114对兰箭2号进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图32为引物组VA114对川北进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图33为引物组VA114对兰箭3号进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图34为引物组VA114对清水河进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图35为引物组VA114对延边进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图36为引物组VA114对333/A进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图37为引物组VA118对江淮进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图38为引物组VA118对凉山进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图39为引物组VA118对公农进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图40为引物组VA118对兰箭2号进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图41为引物组VA118对川北进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图42为引物组VA118对兰箭3号进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图43为引物组VA118对清水河进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图44为引物组VA118对延边进行PCR扩增的毛细管电泳图。
图45为引物组VA118对333/A进行PCR扩增的毛细管电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，采用改良的CTAB法提取样本的基因组DNA的具体步骤依次如下：
(1)将约500mg样本装入2.0mL离心管中，同时加入一颗钢珠，将离心管放入管架置入泡沫箱中，倒入液氮，冷冻5-10min后取出，置于研磨机中打磨至细小的粉末状备用；
(2)在研磨好的材料中加入700μL预热(65℃)的2％CTAB缓冲液(溶质及其浓度为1.4M NaCl、25mM EDTA、2％(w/v)CTAB和0.2％(v/v)β-巯基乙醇，溶剂为pH8.0、0.1MTris-HCl)，并使其充分混匀；
(3)将离心管放入恒温水浴锅中65℃水浴30-60min，期间倒转混匀2-3次；
(4)在通风橱内向离心管加入700μL氯仿-异戊醇(v:v＝24:1)，轻轻倒转混匀5-10min；
(5)室温、12000g离心10min，用移液枪小心吸取上层水相清液至一个新的1.5mL离心管中，加入-20℃预冷的等体积异丙醇，颠倒混匀后置于-20℃冰箱保存1h以上；
(6)取出冰箱中的离心管，4℃、12000g离心10min，弃上清液，倒置于滤纸上控干液滴，加入100μL的RNase溶液(100mg/L)，37℃保存30min；
(7)在离心管中加入700μL 70％乙醇溶液，弹底混合后离心，弃上清；
(8)重复步骤(7)，将离心管倒立于垫有滤纸的试验台上，室温干燥至无乙醇气味；
(9)加入100-200μL超纯水或1×TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，保存至-20℃冰箱备用。
下述实施例中9个野豌豆属国审品种分别为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A，各个品种的种子均市售获得。
实施例1、利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别9个野豌豆属国审品种的SSR引物组合的开发
1、种植江淮的种子，25℃、光暗交替培养，14天后采集30株幼苗的叶片，等质量混样，得到样本1。
按照上述方法，将江淮分别替换为凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A，其它步骤均相同，依次得到样本2至样本9。
2、采用改良的CTAB法分别提取样本(样本1、样本2、样本3、样本4或样本5)的基因组DNA，得到样本的基因组DNA。
3、将样本(样本1、样本2、样本3、样本4或样本5)的基因组DNA采用超声打断，切胶回收400-600bp的DNA片段，之后利用的建库试剂盒构建500bp大小的文库，再利用Hiseq 4000PE150的测序平台进行测序。对原始reads使用软件SPAdes 3.6.1进行质量控制和contig拼接，最后得到198659个contigs。利用软件MISA(Microsatelliteidentification；网址为：http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)鉴别contig中的SSR位点。SSR位点基本参数设置：重复单位为2个碱基的最少重复数为5次；重复单位为3个碱基的最少重复数为4次；4、5、6个碱基最少重复数为3次。
4、基于筛选的SSRs，运用Primer 3软件进行引物的批量设计。目标扩增片段设置为必须包含SSR起始-3bp，终止+6bp，扩增片段大小为80-300bp。引物的长度设置为18-25bp，最适长度为22bp，引物最大允许有一个不能识别的碱基；引物的退火温度(Tm)设置为55-65℃，最适Tm为60℃，上下游引物间的Tm差异最大允许3℃，引物末端稳定性最大为250。
最终获得了5个SSR引物组，用于9个野豌豆属国审品种的鉴定。5个SSR引物组名称、组成其的引物对名称、引物名称及核苷酸序列见表1。
表1
注：下划线为M13序列；引物名称中含有“F”的引物为正向引物；引物名称中含有“R”的引物为反向引物；引物名称中含有“M13”的引物为M13通用引物，其中FAM为蓝色，NED为黄色，VIC为绿色，ROX为红色。
人工合成表1所示的各条引物并单独包装，然后按照表1组装成引物组VA42、引物组VA100、引物组VA107、引物组VA114和引物组VA118。
SSR引物组合1由引物组VA42、引物组VA100、引物组VA107、引物组VA114和引物组VA118组成。
SSR引物组合2由引物对VA42、引物对VA100、引物对VA107、引物对VA114和引物对VA118组成。
实施例2、运用实施例1开发的SSR引物组合1检测9个野豌豆属国审品种
1、采用改良的CTAB法分别提取实施例1中样本(样本1、样本2、样本3、样本4或样本5)的基因组DNA，得到样本的基因组DNA。
2、TP-M13-SSR PCR扩增
(1)以样本的基因组DNA为模板，用实施例1组装的引物组VA42、引物组VA100、引物组VA107、引物组VA114或引物组VA118进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。
反应体系为10μL，由1μL样本的基因组DNA(浓度为100-500ng/μL)、0.5μL正向引物(引物名称中含有“F”的引物)(浓度为10μM)、0.5μL反向引物(引物名称中含有“R”的引物)(浓度为10μM)、0.5μL M13通用引物(引物名称中含有“M13”的引物)(浓度为10μM)、1μL 10×PCR buffer(上海美吉生物医药科技有限公司)、1μL dNTP水溶液(浓度为10mmol/L)、0.1μL Taq酶(浓度为2.5U/μL)和5.4μLddH2O组成。
反应条件：94℃预变性3min；(94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s)×30个循环；72℃延伸10min。
3、SSR荧光标记毛细管电泳
将PCR扩增产物进行毛细管电泳。具体步骤为：将PCR扩增产物0.3μL、GS-500liz分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×buffer缓冲液上机检测；采用经3730xl自动测序仪(美国ABI)进行毛细管电泳：预电泳15kv下3min；1.6kv下进样15s；电泳15kv下20min。
检测结果见图1-图45(需要注意的是由于Taq酶的滑动可能会导致重复序列中1个或多个碱基的错配，故读峰图时要适时调整)。
4、数据统计分析
运用软件GeneMarker v2.2.0(SoftGenetics，State College，Pennsylvania，美国)进行数据整理和图像分析，根据每个引物组的峰值，组合形成9个野豌豆属国审品种的SSR指纹图谱，实现对9个野豌豆属国审品种的鉴别，具体如下：
(1)采用引物组VA42进行PCR扩增：
如果得到峰值为182的扩增产物，则野豌豆品种为凉山；
如果得到峰值为208的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号、兰箭3号、清水河或333/A；
如果得到峰值为112和134的扩增产物，则野豌豆品种为川北；
如果得到峰值为210和214的扩增产物，则野豌豆品种为延边；
(2)采用引物组VA100进行PCR扩增：
如果得到峰值为232的扩增产物，则野豌豆品种为江淮；
如果得到峰值为248的扩增产物，则野豌豆品种为凉山；
如果得到峰值为238的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河或333/A；
(3)采用引物组VA107进行PCR扩增：
如果得到峰值为448的扩增产物，则野豌豆品种为江淮、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河或333/A；
如果得到峰值为252的扩增产物，则野豌豆品种为公农；
如果得到峰值为250的扩增产物，则野豌豆品种为延边；
(4)采用引物组VA114进行PCR扩增：
如果得到峰值为144的扩增产物，则野豌豆品种为江淮或333/A；
如果得到峰值为240的扩增产物，则野豌豆品种为公农或延边；
如果得到峰值为144和152的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号、川北、兰箭3号或清水河；
(5)采用引物组VA118进行PCR扩增：
如果得到峰值为218和238的扩增产物，则野豌豆品种为江淮或清水河；
如果得到峰值为218和258的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号；
如果得到峰值为218和248的扩增产物，则野豌豆品种为川北、兰箭3号或333/A。
实施例3、运用实施例1开发的SSR引物组合2检测9个野豌豆属国审品种及准确性实验
待测种子a、待测种子b、待测种子c、待测种子d、待测种子e、待测种子f、待测种子g、待测种子h和待测种子i依次为已经表型鉴定的江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A的市售种子。
1、种植待测种子(待测种子a、待测种子b、待测种子c、待测种子d、待测种子e、待测种子f、待测种子g、待测种子h或待测种子i)，25℃、光暗交替培养，14天后采集30株幼苗的叶片，等质量混样，得到待测样本。
2、采用改良的CTAB法提取待测样本的基因组DNA，得到待测样本的基因组DNA。
3、PCR扩增
以待测样本的基因组DNA为模板，用实施例1组装的引物对VA42、引物对VA100、引物对VA107、引物对VA114或引物对VA118进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。
反应体系为10μL，由1μL待测样本的基因组DNA(浓度为100-500ng/μL)、0.5μL正向引物(引物名称中含有“F”的引物)(浓度为10μM)、0.5μL反向引物(引物名称中含有“R”的引物)(浓度为10μM)、1μL 10×PCR buffer(上海美吉生物医药科技有限公司)、1μL dNTP水溶液(浓度为10mmol/L)、0.1μL Taq酶(浓度为2.5U/μL)和5.9μLddH2O组成。
反应条件：94℃预变性3min；(94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s)×30个循环；72℃延伸10min。
4、琼脂糖凝胶电泳
取步骤3得到的PCR扩增产物，在含0.5mg/mL GoodViewTM的琼脂糖凝胶(凝胶浓度为3％-3.5％)上电泳，然后使用G：BOX-Chemi XR2凝胶成像仪(基因有限公司的产品)进行凝胶扫描成像。
重复上述实验3次，将PCR扩增产物的目的特异条带进行测序，测序结果统计的谱带如表2所示。
表2
注：“-”表示没有目的特异条带。
结果表明，PCR扩增产物目的特异条带测序结果与实施例2中9个野豌豆属国审品种的SSR指纹图谱完全一致。
上述结果表明，本发明所提供的SSR引物组合1和SSR引物组合2均可以鉴定待测野豌豆是否属于9个野豌豆属国审品种，从而验证9个野豌豆属国审品种的真实性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 全国畜牧总站
<120> 一种鉴定野豌豆属品种真实性的方法及其专用SSR引物组合
<160>10
<170> PatentIn version 3.5
<210>1
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>1
cacgacgttg taaaacgacc tgctctggta gaaacactgg t 41
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>2
atatggcatg ccccaaggat ag 22
<210>3
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>3
cacgacgttg taaaacgact ccttcataaa ctcccatgaa tgc 43
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>4
accgagaaac catcttctta ggt 23
<210>5
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>5
cacgacgttg taaaacgaca tgtgctcgga atttccctct t 41
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>6
aaagatgaat caggggtggg ac 22
<210>7
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>7
cacgacgttg taaaacgacc tgatgattgg aagggaggtc c 41
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>8
caaggctgcc agaagatgtt tc 22
<210>9
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>9
cacgacgttg taaaacgact gaatttcacc ccgcaagttt c 41
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>10
gtggacaaaa taccccgcaa aa 22

Claims (10)

1.鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的引物组合，为引物组合2或引物组合1；
引物组合2由引物对VA42、引物对VA100、引物对VA107、引物对VA114和引物对VA118组成；
引物对VA42由SEQ ID NO:1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:2所示的单链DNA分子组成；引物对VA100由SEQ ID NO:3所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:4所示的单链DNA分子组成；引物对VA107由SEQ ID NO:5所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:6所示的单链DNA分子组成；引物对VA114由SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子组成；引物对VA118由SEQ ID NO:9所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:10所示的单链DNA分子组成；
引物组合1由引物组VA42、引物组VA100、引物组VA107、引物组VA114和引物组VA118组成；引物组VA42由所述引物对VA42和荧光标记甲修饰的引物M13组成；引物组VA100由所述引物对VA100和荧光标记乙修饰的引物M13组成；引物组VA107由所述引物对VA107和荧光标记丙修饰的引物M13组成；引物组VA114由所述引物对VA114和荧光标记丁修饰的引物M13组成；引物组VA118由所述引物对VA118和荧光标记戊修饰的引物M13组成；
所述引物M13的核苷酸序列如SEQ ID NO:1自5’末端起第1-19位所示；
荧光标记甲、荧光标记乙、荧光标记丙、荧光标记丁和荧光标记戊可以发出相同的荧光，也可以发出不同的荧光；
所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A。
2.用于鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的方法，包括如下步骤：以待测野豌豆的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1中引物对VA42、引物对VA100、引物对VA107、引物对VA114和引物对VA118进行PCR扩增，然后依次按照(标准a1)、(标准a2)、(标准a3)、(标准a4)和/或(标准a5)进行判断：
(标准a1)采用引物对VA42进行PCR扩增：
如果仅得到182bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为凉山；
如果仅得到208bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为兰箭2号、兰箭3号、清水河或333/A；
如果得到112bp和134bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为川北；
如果得到210bp和214bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为延边；
(标准a2)采用引物对VA100进行PCR扩增：
如果仅得到232的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为江淮；
如果仅得到248的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为凉山；
如果仅得到238的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河或333/A；
(标准a3)采用引物对VA107进行PCR扩增：
如果仅得到448bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为江淮、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河或333/A；
如果仅得到252bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为公农；
如果仅得到250bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为延边；
(标准a4)采用引物对VA114进行PCR扩增：
如果仅得到144bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为江淮或333/A；
如果仅得到240bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为为公农或延边；
如果得到144bp和152bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为兰箭2号、川北、兰箭3号或清水河；
(标准a5)采用引物对VA118进行PCR扩增：
如果得到218bp和238bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为江淮或清水河；
如果得到218bp和258bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为兰箭2号；
如果得到218bp和248bp的扩增产物，则待测野豌豆为或候选为川北、兰箭3号或333/A；
所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增产物通过电泳检测或测序检测。
4.用于鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的方法，包括如下步骤：以待测野豌豆的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1中引物组VA42、引物组VA100、引物组VA107、引物组VA114和引物组VA118进行PCR扩增，之后将PCR扩增产物进行毛细管电泳检测，按照(标准b1)、(标准b2)、(标准b3)、(标准b4)和/或(标准b5)进行判断：
(标准b1)采用引物组VA42进行PCR扩增：
如果得到峰值为182的扩增产物，则野豌豆品种为凉山；
如果得到峰值为208的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号、兰箭3号、清水河或333/A；
如果得到峰值为112和134的扩增产物，则野豌豆品种为川北；
如果得到峰值为210和214的扩增产物，则野豌豆品种为延边；
(标准b2)采用引物组VA100进行PCR扩增：
如果得到峰值为232的扩增产物，则野豌豆品种为江淮；
如果得到峰值为248的扩增产物，则野豌豆品种为凉山；
如果得到峰值为238的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河或333/A；
(标准b3)采用引物组VA107进行PCR扩增：
如果得到峰值为448的扩增产物，则野豌豆品种为江淮、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河或333/A；
如果得到峰值为252的扩增产物，则野豌豆品种为公农；
如果得到峰值为250的扩增产物，则野豌豆品种为延边；
(标准b4)采用引物组VA114进行PCR扩增：
如果得到峰值为144的扩增产物，则野豌豆品种为江淮或333/A；
如果得到峰值为240的扩增产物，则野豌豆品种为公农或延边；
如果得到峰值为144和152的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号、川北、兰箭3号或清水河；
(标准b5)采用引物组VA118进行PCR扩增：
如果得到峰值为218和238的扩增产物，则野豌豆品种为江淮或清水河；
如果得到峰值为218和258的扩增产物，则野豌豆品种为兰箭2号；
如果得到峰值为218和248的扩增产物，则野豌豆品种为川北、兰箭3号或333/A；
所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A。
5.用于鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的方法，包括如下步骤：以待测野豌豆的基因组DNA为模板，分别采用引物对进行PCR扩增；以野豌豆属国审品种的基因组DNA为模板，分别采用引物对进行PCR扩增；所述野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边或333/A；然后按照如下标准进行判断：
C1)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与江淮采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为江淮；
C2)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与凉山采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为凉山；
C3)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与公农采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为公农；
C4)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与兰箭2号采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为兰箭2号；
C5)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与川北采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为川北；
C6)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与兰箭3号采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为兰箭3号；
C7)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与清水河采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为清水河；
C8)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与延边采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为延边；
C9)如果待测野豌豆采用所述引物对获得的PCR扩增产物与333/A采用所述引物对获得的PCR扩增产物一致，待测野豌豆为333/A；
所述引物对为权利要求1中引物对VA42、引物对VA100、引物对VA107、引物对VA114或引物对VA118。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增产物通过电泳检测或测序检测。
7.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物组合；所述试剂盒的功能为鉴定待测野豌豆为9种野豌豆属国审品种中的哪一种；
所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边和333/A。
8.权利要求7所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1所述引物组合中的各条引物分别单独包装的步骤。
9.权利要求1所述引物组合在鉴定待测野豌豆为9种野豌豆属国审品种中的哪一种中的应用；
所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边或333/A。
10.权利要求7所述试剂盒在鉴定待测野豌豆为9种野豌豆属国审品种中的哪一种中的应用；
所述9种野豌豆属国审品种为江淮、凉山、公农、兰箭2号、川北、兰箭3号、清水河、延边或333/A。
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